Summary
Deneysel inme araştırmalarında orta serebral arter tıkanma (MCAo) farklı modelleri kullanılmaktadır. Burada, serebrovasküler trombüsin spontan pıhtı lizisi veya tedavisi nedeniyle çıkarıldığı insan inmesini taklit etmeyi amaçlayan dış karotis arter (ECA) yoluyla geçici MCAo'nun deneysel bir inme modeli tanımlanmıştır.
Abstract
İnme, gelişmiş ülkelerde üçüncü en sık mortalite nedeni ve edinilmiş erişkin sakatlığının önde gelen nedenidir. Bugüne kadar terapötik seçenekler inmeden sonraki ilk saatlerde inme hastalarının küçük bir oranı ile sınırlıdır. Özellikle terapötik zaman penceresini uzatmak için yeni terapötik stratejiler kapsamlı bir şekilde araştırılmaktadır. Bu güncel araştırmalar, inme sonrası inme sonrası inflamasyon, anjiogenez, nöronal plastisite ve rejenerasyon gibi önemli patofizyolojik yolların incelenmesini içerir. Son on yılda, bağımsız araştırma grupları arasında deneysel sonuçların ve bilimsel bulguların zayıf tekrarlanabilirliği konusunda artan bir endişe vardır. "Çoğaltma krizi" olarak adlandırılan krizin üstesinden gelmek için, tüm prosedürler için ayrıntılı standartlaştırılmış modellere acilen ihtiyaç vardır. "ImmunoStroke" araştırma konsorsiyumu (https://immunostroke.de/) içinde bir çaba olarak, geçici orta serebral arter tıkanıklığının (MCAo) standartlaştırılmış bir fare modeli önerildi. Bu model, filamentin çıkarılmasından sonra kan akışının tamamen restorasyonuna izin verir, insan felçlerinin büyük bir kısmında meydana gelen terapötik veya spontan pıhtı lizizini simüle eder. Bu "filament" inme modelinin cerrahi prosedürü ve fonksiyonel analizi için araçlar eşlik eden videoda gösterilmiştir.
Introduction
İnme, dünya çapında en sık görülen ölüm ve sakatlık nedenlerinden biridir. Esas olarak iskemik ve hemorajik olmak üzere iki farklı inme şekli olmasına rağmen, tüm inme vakalarının% 80-85'i iskemik1' dir. Şu anda, iskemik inme hastaları için sadece iki tedavi mevcuttur: rekombinant doku plazminojen aktivatörü (rtPA) veya mekanik trombektomi ile farmakolojik tedavi. Ancak terapötik zaman penceresinin dar ve çoklu dışlama kriterleri nedeniyle bu özel tedavi seçeneklerinden sadece belirli sayıda hasta yararlanabiliyor. Son yirmi yılda preklinik ve çevirisel inme araştırmaları nöroprotektif yaklaşımların incelenmesine odaklanmıştır. Bununla birlikte, klinik çalışmalara ulaşan tüm bileşikler şimdiye kadar hasta için hiçbir iyileşme göstermedi2.
İn vitro modeller inmenin tüm beyin etkileşimlerini ve patofizyolojik mekanizmalarını doğru bir şekilde üretemediğinden, hayvan modelleri preklinik inme araştırmaları için çok önemlidir. Bununla birlikte, tek bir hayvan modelinde insan iskemik inmenin tüm yönlerini taklit etmek mümkün değildir, çünkü iskemik inme son derece karmaşık ve heterojen bir hastalıktır. Bu nedenle farklı türlerde zamanla farklı iskemik inme modelleri geliştirilmiştir. Serebral arterioles fototombozu veya orta serebral arterin (MCA) kalıcı distal tıkanıklığı, neokortekste küçük ve lokal olarak tanımlanmış lezyonlara neden olan yaygın olarak kullanılan modellerdir3,4. Bunların yanı sıra, en sık kullanılan inme modeli muhtemelen MCA'nın geçici bir tıkanıklığının elde edildiği "filament modeli" olarak adlandırılır. Bu model, MCA'nın kökenine geçici bir dikiş filamentinin girişinden oluşur, bu da serebral kan akışının aniden azalmasına ve ardından subkortikal ve kortikal beyin bölgelerinin büyük enfarktürüne yol5. Çoğu kontur modeli MCA oklüzyonlarını taklit etse de 6, "filament modeli" iskemik zamanın hassas bir şekilde sınırlandırılmasına izin verir. Filament giderme ile reperfüzyon, spontan veya terapötik (rtPA veya mekanik trombektomi) pıhtı lizizi sonrası beyin kan akışı restorasyonunun insan klinik senaryosunu taklit eder. Bugüne kadar, bu "filament modelinin" farklı modifikasyonları tanımlanmıştır. En yaygın yaklaşımda, ilk olarak Longa ve ark. 19895yılında, MCA7'ninkökenine ortak karotis arter (CCA) aracılığıyla silikon kaplı bir filament tanıtılır. Yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım olmasına rağmen, bu model reperfüzyon sırasında kan akışının tamamen geri yüklenmesine izin vermez, çünkü CCA filamentin çıkarılmasından sonra kalıcı olarak bağlanır.
Son on yılda, giderek artan sayıda araştırma grubu, bu "filament modelini" kullanarak farelerde inme modellemeye ilgi duyuyor. Bununla birlikte, bu modelin önemli değişkenliği ve prosedürlerin standardizasyonunun olmaması, şimdiye kadar bildirilen deneysel sonuçların ve bilimsel bulguların yüksek değişkenliğinin ve zayıf tekrarlanabilirliğinin nedenlerinden bazılarıdır2,8. Araştırma laboratuvarları arasındaki düşük tekrarlanabilirlik oranına atıfta bulunan mevcut "çoğaltma krizinin" potansiyel bir nedeni, aynı deneysel metodolojiyi kullanan araştırma grupları arasındaki karşılaştırılamaz inme enfarktüs hacimleridir9. Aslında, ilk preklinik randomize kontrollü çok merkezli deneme çalışmasını yaptıktan sonra10, bu deneysel inme modelinin yeterli standardizasyonunun olmamasının ve sonraki sonuç parametrelerinin bağımsız laboratuvarlar arasındaki preklinik çalışmalarda tekrarlanabilirliğin başarısızlığının ana nedenleri olduğunu doğrulayabildik11 . Ortaya çıkan enfarktüs boyutlarındaki bu şiddetli farklılıklar, aynı inme modelini kullanmasına rağmen, sadece doğrulayıcı araştırmalar için değil, aynı zamanda sağlam ve tekrarlanabilir modellerin eksikliği nedeniyle bilimsel işbirlikleri için de haklı bir tehdit oluşturmaktadır.
Bu zorluklar ışığında, "ImmunoStroke" araştırma konsorsiyumu (https://immunostroke.de/) içindeki işbirlikçi araştırma çalışmalarında kullanılan standartlaştırılmış geçici BIR MCAo modeli prosedürünü ayrıntılı olarak geliştirmeyi ve tanımlamayı amaçladık. Bu konsorsiyum, inme iyileşmesinin mekanistik ilkelerinin altında kalan beyin-bağışıklık etkileşimlerini anlamayı amaçlamaktadır. Ayrıca inme sonuç analizi için histolojik ve ilgili fonksiyonel yöntemler sunulmaktadır. Tüm yöntemler, ImmunoStroke konsorsiyumunun tüm araştırma laboratuvarlarında kullanılan yerleşik standart işletim prosedürlerine dayanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu videoda bildirilen deneyler, deney hayvanlarının kullanımına ilişkin ulusal yönergeleri izleyerek yapıldı ve protokoller Alman hükümet komiteleri (Regierung von Oberbayern, Münih, Almanya) tarafından onaylandı. On haftalık erkek C57Bl/6J fareler kullanıldı ve kontrollü sıcaklık (22 ± 2 °C) altında, 12 saat açık-karanlık döngü süresi ve peletlenmiş yiyecek ve su reklam libitum erişimi ile yerleştirildi.
1. Malzeme ve aletlerin hazırlanması
- 37 °C'de anestezi sırasında çalışma bölgesinin sıcaklığını ve fare gövdesi sıcaklığını korumak için ısı battaniyesini bağlayın.
- Otoklav makası ve forseps, % 70 etanol çözeltisi hazırlayın ve mevcut dekpanthenol göz merhemini, birkaç parça pamuğu ve 5-0 kaplamalı örgülü polyester dikişi kullanıma hazır tutun. Hayvanın kesi bölgesini nemli tutmak için% 0,9 tuzlu su çözeltisi (iğnesiz) ile 1 mL şırınga hazırlayın. Anestezi gazını hazırlayın (%100 O2 + izofluran).
- 10 μL pipet ucunun (3-5 mm uzunluk) ucunu keserek lazer Doppler probu için bir tutucu hazırlayın.
NOT: Tüm aletler sıcak boncuk sterilizatörü kullanılarak sterilize edilir. Yüzeyler de mikrobiyal dezenfektan spreyi ile ameliyat öncesi ve sonrası dezenfekte edilir. Ameliyattan önce, farelerin başını ve göğsünü çevreleyen alanlar yara dezenfeksiyon spreyi ile dezenfekte edilir.
2. Lazer Doppler hazırlanması
- Ameliyattan 30 dakika önce fareye analjezi enjekte edin (intraperitoneal olarak 4 mg/kg Carprofen ve 0,1 mg/kg Buprenorfin).
- Fareyi, spontan vücut hareketi ve vibrissae'nin kesilmesine kadar% 4'lük bir izofluran akış hızı ile indüksiyon odasına yerleştirerek uyuşturun.
- Fareyi anestezi maskesinde burnu ile operasyon bölgesinde eğilimli bir konuma getirin. bir dakika daha izofluran konsantrasyonu% 4'te tutun, sonra azaltın ve% 2'de tutun.
- Fare gövdesi sıcaklığını 37 °C'de tutmak için ilgili geri bildirim kontrollü ısıtma yastığını ayarlayın ve cerrahi prosedürler boyunca sıcaklığı izlemek için rektal probu hafifçe takın.
- Her iki göze dekpanthenol göz merhem uygulayın.
- Sol gözü ve kulağı çevreleyen cilt ve saçları %70 etanol ile dezenfekte edin.
- Kafatası kemiğini ortaya çıkarmak için kafa derisini sol kulak ile göz (1 cm uzunluğunda) arasında kesin.
- Kafatasının altındaki MCA'yı görselleştirmek için zamansal kası kesin ve emekli edin.
- Lazer Doppler probunu/lifini sol MCA'nın üstünde tutkalla sabitle. Daha sonra, ucu tutucunun etrafındaki yarayı kapatmak için cildi yapıştırın. İşlemi hızlandırmak için 2-3 damla sertleştirici tutkal uygulayın. Lazer Doppler lifinin yapıştırılmadığını ve uç tutucudan herhangi bir zamanda kolayca çıkarılabildiğinden emin olun.
3. Geçici MCAo modeli (tıkanma)
- Fareyi sırtüstü konumuna getirin. Somurtma anestezi konisine koyun ve pençeleri bantla sabitleyin.
- Göğsü çevreleyen deriyi ve saçları dezenfekte edin ve boyunda 2 cm uzunluğunda bir orta çizgi kesisi yapın.
- Deriyi ve altdbüler bezleri ayırmak için tokalar kullanın. Sternomastoid kası tutmak, cerrahi alanı ortaya çıkarmak ve sol ortak karotis arteri (CCA) bulmak için retraktörler kullanın. CCA'yı bağ dokusundan ve çevresindeki sinirlerden (vagal sinire zarar vermeden) arındırın ve çatallanmadan önce geçici bir ligasyon gerçekleştirin.
- Dış şahdamarını (ECA) parçalara ayırın ve en distal görünür kısımda kalıcı bir düğüm bağlayın. ECA'nın altına çatallamaya yakın bir dikiş daha yerleştirin ve daha sonra kullanılmak üzere gevşek bir düğüm hazırlayın.
- İç şahdamarını (ICA) parçalara ayırın ve üzerine çatallanmanın 5 mm üzerine bir mikrovasküler klips yerleştirin. Vagal sinirine zarar vermediklerden emin olun.
- Sıkı ve gevşek ligasyonlar arasında ECA'ya küçük bir delik açın; tüm ECA'yı kesmemeye dikkat edin.
- Filamenti tanıtın ve CCA'ya doğru ilerletin. Filamenti bu pozisyonda kısa bir süre sabitlemek ve mikrovasküler klipsi çıkarırken kanamayı önlemek için ECA'daki gevşek ligasyonu lümen etrafında sıkın.
- Mikrovasküler klipsi çıkarın ve lazer Doppler tarafından ölçülen beyin kan akışında keskin bir azalma (%>80) tespit ederek MCA'nın kökenine ulaşılana kadar filamenti ICA'dan geçirin. ECA etrafındaki düğümü daha da sıkılaştırarak filamenti bu konumda sabitlayın.
NOT: Filament uygun yöne doğru gittiğinde, sorunsuz bir şekilde ilerler ve direnç gözlenmemelidir. - Filament eklemeden önce ve sonra lazer Doppler değerlerini kaydedin.
- Yarayı dikmeden önce retraktörü çıkarın ve sternomastoid kası ve submandibular bezleri yeniden konumlandırın. Lazer Doppler probını çıkarın ve hayvanı 1 saat boyunca (filament çıkarılana kadar) 37 °C'de bir kurtarma odasına yerleştirin.
4. Geçici MCAo modeli (Reperfüzyon)
- Fareyi, spontan vücut hareketi ve vibrissae'nin kesilmesine kadar% 4'lük bir izofluran akış hızı ile indüksiyon odasına yerleştirerek uyuşturun.
- Her iki göze dekpanthenol göz merhem uygulayın.
- Fareyi anestezi maskesinde snout ile operasyon bölgesinde eğilimli bir konuma getirin. bir dakika daha izofluran konsantrasyonu% 4'te tutun, sonra azaltın ve% 2'de tutun. Hayvanın pençelerini bantla sabitleyin.
- Lazer Doppler probını prob tutucusuna yerleştirin.
- Yara dikişini çıkarın, cildi ve altdbüler bezleri ayırmak için tokalar kullanın. Sternomastoid kası hafifçe çekmek ve cerrahi alanı açığa çıkarmak için retraktörler kullanın.
- Filamenti sıkılaştıran ECA dikişini gevşetin ve filamenti hafifçe çekin. Çıkarma sırasında filamentin silikon kauçuk kaplamasına zarar vermekten kaçının.
- ECA dikişini sıkıca bağlayın.
- Lazer Doppler cihazındaki serebral kan akışındaki artışı onaylayın (>en önceki başlangıç değerinin% 80'i).
- Filament kaldırmadan önce ve sonra lazer Doppler değerlerini kaydedin.
- CCA'dan çatallanmadan önce geçici ligasyonu açın.
- Retraktörü çıkarın ve yarayı dikmeden önce sternomastoid kası ve submandibular bezleri yeniden konumlandırın. Hayvanı anesteziden kurtulmak için 1 saat boyunca 37 °C'de bir iyileşme odasına yerleştirin.
- İyileştikten sonra, fareleri sıcaklık kontrollü bir odada kafeslerine geri koyun.
- Ameliyattan sonraki 3 güne kadar kafes zemininde küçük Petri kaplarına ıslak yiyecek peletleri ve hidrojel ekleyerek hayvanlara iyi bakın.
- Ameliyattan sonra 3 d için her 12 saatte bir analjezi enjekte edin (4 mg/kg Carprofen ve 0.1 mg/kg Buprenorfin).
5. Sham operasyonu
- Arterlerin ligasyonu ve filamentin tanıtımı da dahil olmak üzere yukarıda açıklandığı gibi tüm prosedürleri gerçekleştirin (adım 1-3.7).
- Filamenti yerleştirildikten hemen sonra çıkarın. Daha sonra, hayvanı 1 saat boyunca kurtarma odasına yerleştirin.
- Hayvanı tekrar operasyon bölgesine yerleştirin ve tam beyin kanı akışı restorasyonu sağlamak için CCA'nın geçici ligasyonunu çıkarın.
- Yarayı dikin ve hayvanı anesteziden kurtulmak için 1 saat boyunca 37 ° C'de bir iyileşme odasına yerleştirin. İyileştikten sonra, fareleri sıcaklık kontrollü bir odada kafeslerine geri koyun.
- Ameliyattan sonraki 3 güne kadar kafes zemindeki küçük Petri kaplarına ıslak yiyecek topakları ve hidrojel ekleyerek hayvanlara iyi bakın.
- Ameliyattan sonra 3 d için her 12 saatte bir analjezi enjekte edin (4 mg/kg Carprofen ve 0.1 mg/kg Buprenorfin).
6. Nöroscore
- Neuroscore'u her zaman günün aynı saatinde gerçekleştirin ve bireysel cerrahlar arasında "nötr bir koku" sağlamak için cerrahi kıyafetler kullanın.
- Fareleri testden önce "açık" bir kafesle odada 30 dakika dinlendirin.
- Tablo 1 ve Tablo 2'deki her öğeyi 30 s için gözlemleyin.
7. İntra kardiyak perfüzyon
- Fosfat tamponlu salin (PBS)-heparin (2 U/mL) içeren 20 mL'lik bir şırınna hazırlayın ve yerçekimi tahrikli perfüzyonu kolaylaştırmak için tezgahın 1 m üstüne yerleştirin. (İsteğE BAĞLI: PBS, pH 7.4'te %4 PFA içeren 20 mL şırıng kullanarak %4 paraformaldehit (PFA) ile intra kardiyak perfüzyon gerçekleştirin).
- İntrperitoneally enjekte 100 μL ketamin ve ksilazin (sırasıyla 120 ve 16 mg/kg vücut ağırlığı). 5 dakika bekleyin ve spontan vücut hareketinin ve vibrissae'nin durmasını onaylayın.
- Hayvanı sırtüstü bir pozisyonda sabitlayın ve karın vücut yüzeyini% 70 etanol ile dezenfekte edin.
- Karın içine 3 cm uzunluğunda bir kesi yapın; kalbi tamamen görselleştirmek için diyaframı, kaburgaları ve sternumu kesin.
- Sağ kulakçıkta küçük bir kesi yapın ve perfüzyon kanüllerini sol ventrikül içine yerleştirin.
- 20 mL PBS-heparin ile perfuse.
- Perfüzyondan sonra hayvanın kafasını koparın ve beyni çıkarın.
- Beyni toz kuru buz üzerinde dondurun ve daha fazla kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
8. Enfarktüs hacmi
- Kriyoeksiyon için, beyinleri her 400 μm'de bir 20-μm kalınlığında bölümlere kesmek için bir kriyostat kullanın. Bölümleri slaytlara yerleştirin ve kullanıma kadar slaytları −80 °C'de saklayın.
- Cresyl mor (CV) boyama
- Kristaller çözülene kadar 500 mL H2O'da (60 °C) 0,5 g CV asetat karıştırıp ısıtarak boyama solüsyonunun hazırlanmasını sağlar. Çözelti soğuduktan sonra koyu bir şişede saklayın. Her kullanımdan önce 60 °C'ye ısıtın ve filtreleyin.
- Slaytları oda sıcaklığında 30 dakika kurutun. Onları 15 dakika boyunca% 95 etanol, 1 dakika boyunca% 70 etanol ve ardından 1 dakika boyunca% 50 etanol içine daldır.
- Slaytları damıtılmış suya 2 dakika daldırın; damıtılmış suyu yenileyin ve slaytları 1 dakika boyunca suya yerleştirin. Daha sonra, slaytları önceden ısıtılmış boyama çözeltisine 60 °C'de 10 dakika daldırın. Slaytları damıtılmış suda iki kez 1 dakika yıkayın.
- Slaytları 2 dakika boyunca% 95 etanol içine daldırın. Onları 5 dakika boyunca% 100 etanol içine yerleştirin; % 100 etanol tazeleyin ve slaytları tekrar etanol içine 2 dakika yerleştirin. Daha sonra, slaytları bir montaj ortamı ile örtün.
- Analiz (Şekil 4C)
- Slaytları tarayın ve aşağıdaki denklemi kullanarak ödemi düzeltmek için Swanson yöntemi12 ile dolaylı enfarktüs hacmini analiz edin:
(İskemik alan) = (iskemik bölge)-((ipsilateral yarımküre)-(kontrallateral yarımküre))
- Slaytları tarayın ve aşağıdaki denklemi kullanarak ödemi düzeltmek için Swanson yöntemi12 ile dolaylı enfarktüs hacmini analiz edin:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan model, MCA'nın kökenini geçici olarak engellemek için ECA aracılığıyla silikon kaplı bir filamentin tanıtılmasından oluşan yaygın olarak kullanılan "filament" inme modelinin bir modifikasyonudur (Şekil 1). Filament çıkarıldıktan sonra, sadece ECA'daki kan akışı kalıcı olarak durdurulur ve CCA ve ICA'nın tamamen yeniden dengelenmesine izin verir. Bu, insan hastalarında başarılı farmakolojik tromboliz veya mekanik trombektomi sonrası gözlenen duruma benzer şekilde beynin yeterli bir şekilde reperfüzyonunu sağlar (Şekil 2). Ayrıca, bu çalışma aynı zamanda MCA bölgesi üzerindeki kafatasındaki lazer Doppler probuna bağlı bir kanül sabitleyerek hem tıkanma hem de reperfüzyon prosedürleri sırasında serebral kan akışını ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır.
Eğitimli bir cerrah tarafından gerçekleştirilen cerrahi işlemin genel ölüm oranı %<5'tir. MCAo'dan sonra erken zaman noktalarında, hayvanlar genellikle ciddi postüral ve hareket açıkları, genel zayıflık ve vücut ağırlığında kayıpgösterir 13. Bu ciddi açıklar geçicidir ve hayvanlar yaklaşık 1 hafta sonra aktivitede iyileşme gösterir; bu nedenle, eksiklikler odak nörolojik semptomlar için daha spesifiktir.
MCA tıkanıklığı sonrası davranışsal açıklar kompozit Neuroscore14tarafından değerlendirildi; genel ve odak açıkları ameliyat sonrası 24 saat 3 d ölçüldü. Genel Neuroscore, kürk, kulak, göz, duruş ve spontan aktivitenin değerlendirilmesi dahil olmak üzere5öğeyi ( Tablo 1 ) maksimum 18 puanla entegre eder. Odak Nöroscore, vücut simetrisi, yürüyüş, tırmanma, daire davranışı, ön ayak simetrisi, zorunlu bisiklet ve bıyık tepkisinin değerlendirilmesi dahil olmak üzere maksimum 28 puanla 7 maddeden(Tablo2) oluşur. Kompozit ölçek 0 (açık yok) ile 46 (ciddi bozukluklar) arasında değişmektedir. İnme hayvanları kompozit ve fokal Nöroscore'da önemli bir değişiklik gösterdi, ancak genel Neuroscore'da değil, sham hayvanlarla karşılaştırıldığında (Şekil 3).
İnfarktüs hacimliliği inme indüksiyonu sonrası 24 saat koronal seri beyin bölümlerinin Cresyl Violet lekelemesi kullanılarak da gerçekleştirildi. Enfarktüs hacim ortalaması 61.69 mm3idi , etkilenen beyin yarımküresinin% 48'ini temsil ediyordu (Şekil 4). Eğitimli bir cerrah tarafından gerçekleştirildiğinde, bu inme modelinin genel değişkenliği düşüktür ve değişim katsayısı % <6'dır. Lezyon alanı somatosensör ve motor korteksin yanı sıra striatum gibi subkortikal yapıları içerir (Şekil 4).
Şekil 1: Erişim ve intralüminal MCA tıkanıklığı şeması. Filament (noktalı çizgi) ECA'daki proksimal ve distal dikiş düğümleri arasına yerleştirilir ve MCA'nın kökenine ulaşana kadar ICA boyunca ilerletilir (bkz. Bir kez yerleştikten sonra, ECA filamenti düzeltmek için bir dikişle bağlanır. Kısaltmalar: ACA = anterior serebral arter; BA = basilar arter; CCA = yaygın şahdamar; ECA = dış şahdamar; ICA = iç karotis arter; MCA = orta serebral arter; PCA = arka iletişim atardamarı; PTG = pterygopalatine arter. Bu rakam Jackman veark. 15. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tıkanma ve reperfüzyon sırasında kan akışı. Kan akışı filament takılmadan önce ve sonra ve filament çıkarılmasından önce ve sonra kaydedilir. Tıkanıklık sırasında kan akışında azalma ve reperfüzyon sırasında kan akışının restorasyonu gözlendi. Her renk bir hayvanı temsil eder. Kısaltmalar: MCA = orta serebral arter; CBF = beyin kan akışı; A.U. = rasgele birimler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: TMCAo sonrası fonksiyonel açıklar için nöroscore. (A) Total, (B) odak ve (C) genel Neuroscore önce ve 24 saat ve 3 d sonra tMCAo. Açık çubuklar: sham; Siyah çubuklar: tMCAo. n=Grup başına 10. *p < 0.05. Kısaltmalar: tMCAo = geçici orta serebral arter tıkanma; BL = tMCAo'dan önce. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hacimsel enfarktüs analizi ve enfarktüs sonucu tMCAo'dan 24 saat sonra. (A) Temsilci cresyl mor lekeli koronal beyin bölümleri her 400 μm'de 24 saat tMCAo'dan sonra. Kesik çizgiler lezyon bölgesini çizer. (B) 10 beynin enfarktüs hacminin analizi (her bir beyin bir ayrı beyni temsil eden nokta) tMCAo'dan 24 saat sonra. Yatay kırmızı çizgi ortalamayı temsil eder (61,69 mm3),hata çubukları standart sapmayı gösterir (3,78 mm3). (C) Cresyl violet koronal bölümünden enfarktüs hacim hesaplaması için temsili görüntü. Mavi = Kontralteral yarımküre; Kırmızı = Ipsilateral yarımküre; Soluk çizgili alan = İskemik bölge. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Puanlamanın zaman noktası | Puan | ||
| Genel Neuroscore | Saç | 0. Saçlar temiz ve temiz | |
| 1. 2 vücut parçasında lokalize piloerection ve kirli saçlar (burun ve gözler) | |||
| 2. piloerection ve kirli saç >2 vücut parçaları | |||
| Kulaklar (açık bir tezgah üstünde fare) | 0. Normal (kulaklar yanal ve arkada gerilir, gürültüyü takip ederek düzelterek tepki verirler) | ||
| 1. Yanal olarak gerilir, ancak arkasında değil (bir veya her ikisi de), gürültüye tepki verirler | |||
| 2. 1 ile aynıdır. GÜRÜLTÜYE Tepkİ YOK. | |||
| Gözler (OBT'de fare) | 0. Çevreyi açın, temizleyin ve hızlı bir şekilde takip edin | ||
| 1. Açık ve sulu mukus ile karakterize. Çevreyi yavaşça takip edin | |||
| 2. Açık ve karanlık mukus ile karakterize | |||
| 3. Elipsoidal şekilli ve koyu mukus ile karakterize | |||
| 4. Kapalı | |||
| Duruş (fareyi avuç içine yerleştirin ve hafifçe sallayın) | 0. Fare, sırtı avuç içine paralel olarak dik konumda durur. Salıncak sırasında hızla durur. | ||
| 1. Fare kambur durur. Salıncak sırasında, stabilite kazanmak için vücudu düzleştirmektedir. | |||
| 2. Gövdenin başı veya bir kısmı avuç içinde uzanır. | |||
| 3. Fare bir tarafta uzanır, dik pozisyonu zar zor kurtarabilir. | |||
| 4. Fare, dik pozisyonu kurtaramayan eğilimli bir konumda uzanır. | |||
| Spontaneos etkinliği (OBT'de fare) | 0.Fare uyanıktır ve aktif olarak keşfeder. | ||
| 1.Fare uyanık görünüyor, ancak sakin ve halsiz. | |||
| 2.Fare aralıklı ve halsiz bir şekilde keşfeder. | |||
| 3. Fare somnolent ve numb, yerinde birkaç hareket. | |||
| 4.No spontan hareketler | |||
| Genel puanlama için toplam puan | |||
| (normal=0 maks=18) | |||
Tablo 1: Genel Neuroscore. Hayvanlar, ölçülen beş genel açığın her biri için ciddiyete bağlı olarak 0 ila 4 puan aldı. Daha sonra farklı alanlardaki puanlar, 0 ile 18 arasında değişen toplam genel bir puan sağlamak için eklenir. Bu tablo Clark ve ark.14'ten değiştirilmiştir. Kısaltma: OBT = açık tezgah üstü.
| Puanlamanın zaman noktası | Puan | ||
| Odak Nöroscore | Vücut simetrisi (OBT'de fare, burun-kuyruk çizgisini gözlemleyin) | 0. Normal (Vücut: normal duruş, gövde kürsüden yükseltilmiş, ön ayak ve arka ayakları vücudun altına yaslanmış. Kuyruk: düz) | |
| 1. Hafif asimetri (Gövde: ön ayak ve vücudun altına yaslanmış arka ayakları ile bir tarafa yaslanır. Kuyruk: hafifçe bükülmüş) | |||
| 2. Orta asimetri (Gövde: ön ayak ve arka ayakları gerilmiş bir tarafa yaslanır. Kuyruk: hafifçe bükülmüş) | |||
| 3. Belirgin asimetri (Gövde: bükülmüş, bir tarafta OBT üzerinde yatmış. Kuyruk: bükülmüş) | |||
| 4. Aşırı asimetri (Gövde: son derece bükülmüş, bir tarafta sürekli OBT üzerinde yatıyor. Kuyruk: son derece bükülmüş) | |||
| Yürüyüş (OBT'de fare. Rahatsız edilmeden gözlemlendi) | 0. Normal (yürüyüş esnek, simetrik ve hızlı) | ||
| 1. Sert, esnek olmayan (kambur yürüyüş, normal fareden daha yavaş) | |||
| 2. Asimetrik hareketlerle topallama | |||
| 3. Titreme, sürüklenme, düşme | |||
| 4. Kendiliğinden yürümez (fareyi hafifçe iterek uyarıldığında 3 adımdan uzun yürümez) | |||
| Tırmanma (45o yüzeyde fare. Fareyi kavrama yüzeyinin ortasına yerleştirin) | 0. Normal (fare hızlı bir şekilde tırmanır) | ||
| 1. Gerginlik, uzuv zayıflığı ile tırmanır | |||
| 2. Eğime tutunur, kaymaz veya tırmanmaz | |||
| 3. Eğimden aşağı kayar, arızayı önlemek için başarısız çaba | |||
| 4. Slaytlar hemen, arızayı önlemek için hiçbir çaba | |||
| Daire çizici davranış (OBT'de fare, serbest gözlem) | 0. Daire çizici davranış yok | ||
| 1. Ağırlıklı olarak tek taraflı dönüşler | |||
| 2. Sürekli olmasa da bir tarafa daireler | |||
| 3. Sürekli bir tarafa daireler | |||
| 4. Döndürme, sallama veya hareket yok | |||
| Ön ayak simetrisi (fare kuyruk tarafından askıya alındı) | 0. Normal | ||
| 1. Hafif asimetri: kontralateral ön ayağın hafif fleksiyonu | |||
| 2. İşaretli asimetri: kontralateral uzuv belirgin fleksiyon, vücut ipsilateral tarafta hafifçe bükülür | |||
| 3. Belirgin asimetri: kontralateral ön ayak gövdeye yapışır | |||
| 4. Hafif asimetri, vücut / uzuv hareketi yok | |||
| Zorunlu daire (bankta ön ayaklar, kuyruk tarafından askıya alınan arka gözler: karşıt uzuv felcinin varlığını ortaya koymaktadır) | 0. Yok. Her iki ön ayak için normal uzantı | ||
| 1. Bir tarafa dönme eğilimi (fare her iki ön ayak için de uzanır, ancak tercihen bir tarafa dönmeye başlar) | |||
| 2. Bir tarafa daireler çizer (fare sağlıklı farelere kıyasla daha yavaş bir hareketle bir tarafa doğru döner) | |||
| 3. Bir tarafa yavaşça döner (fare tam bir daire gerçekleştiremeyince bir tarafa doğru döner) | |||
| 4. İlerlemez (bagajın ön kısmı bankta, yavaş ve kısa hareketlerde uzanır) | |||
| Bıyık yanıtı (OBT'deki fare) | 0. Normal | ||
| 1. Işık asimetrisi (fare karşıt tarafta uyarıldığında yavaşça çekilir) | |||
| 2. Belirgin asimetri (kontralatör tarafına uyarıldığında yanıt yok) | |||
| 3. Yok yanıt kontraseterally, yavaş yanıt uyarılmış zaman ipsilaterally | |||
| 4. İki taraflı yanıt yok | |||
| Odak açıkları için toplam puan | |||
| (normal=0 maks=28) | |||
Tablo 2: Odak Nöroscore. Hayvanlar, ölçülen yedi genel açığın her birinin şiddetine bağlı olarak 0 ila 4 puan aldı. Daha sonra farklı alanlardaki puanlar, 0 ile 28 arasında değişen toplam odak puanı sağlamak için eklenir. Bu tablo Clark ve ark.14'ten değiştirilmiştir. Kısaltma: OBT = açık tezgah üstü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut protokol, standartlaştırılmış geçici bir MCAo modeli oluşturmak için bir Alman çok merkezli araştırma konsorsiyumunun ("ImmunoStroke") konsensüs anlaşmasına dayanan deneysel bir inme modelini tanımlamaktadır. MCA'nın kökenine ECA üzerinden silikon kaplı bir filament getirilerek kurulan geçici MCAo modeli, sınırlandırılmış bir tıkanıklık döneminden sonra arteriyel reperfüzyon elde etmek için en yaygın kullanılan inme modellerinden biridir. Bu nedenle, bu yordam çeviriyle ilgili bir kontur modeli olarak kabul edilebilir.
Videoda sunulan "filament modeli", kraniyotomi gerektirmemek ve geçici olarak tıkalı damarın tamamen reperfüzyonunu sağlamak gibi daha önce tanımlanmış diğer kontur modellerine kıyasla bazı avantajlara sahiptir. Bununla birlikte, cerrahi müdahalenin karmaşıklığı, invaziv cerrahiyi ve trakea ve vagal sinire yakın farklı arterlerin hassas bir manipülasyonu içerdiğinden bir sınırlama olarak düşünülebilir. Hayvanın anesteziye uzun süre maruz kalması da dikkate alınması gereken kritik bir faktör olabilir, çünkü anesteziklerin nöroproteksyon ve inme sonucu üzerindeki etkisi zaten iyi belgelenmiştir16. Son olarak, bu cerrahi prosedürün karmaşıklığına rağmen, eğitimli bir cerrah tarafından gerçekleştirildiğinde yaklaşık 20 dakika içinde tamamlanabilir.
Daha önce açıklanan "filament" inme protokollerinin aksine17Burada açıklanan yöntem, tıkanıklık ve reperfüzyon aşamalarında serebral kan akışının ölçülmesine de izin verir. Reperfüzyon sırasında kan akışı takibi inme reperfüzyon yaralanmasını önlemek için önemli bir parametre olabilir18Trombose damarların yeniden canlandırılması için farmakolojik veya endovasküler müdahaleler gören hastalarda zararlı sonuçlara neden olduğu bilinmektedir. MCAo19'dansonra serebral kan akışı restorasyonunun sonuçları arasındaki tutarsızlıklara rağmen, inmeden sonra kan akışı restorasyonunun değişkenliği beyindeki patofizyolojik ve biyokimyasal olayların yanı sıra enfarktüs hacmini ve inme farelerinin nörolojik açıklarını etkileyebilir20. Bu nedenle, bu modelde, kan akışının tamamen restorasyonu ve kaydedilmesi, özellikle çevirisel inme çalışmalarında fareler arasında tekrarlanabilir enfarktüsleri sağlamak için gerekliliklerdir.
Cerrahi işlem sırasında genel mortalite% 5'ten azdır ve esas olarak önceden tanımlanmış dışlama kriterleri nedeniyle anestezik komplikasyonlar, kanamalar veya fedakarlıktan kaynaklanır. Bununla birlikte, bu inme modeli, inme indüksiyonu sonrası ilk 24-48 saat içinde orta derecede bir ölüm oranı sunar ve bu da yeterli bir inme faresi kohortunu elde etmek için deney başına ihtiyaç duyulan hayvan sayısını artırabilir. Enfarktüs hacmi açısından, bu model yarımkürenin% 50'sine kadar lezyonları kapsayan büyük enfarktüslere neden olan. Ayrıca kortikal ve subkortikal bölgeler de dahil olmak üzere farklı beyin bölgelerini etkileyen beyin ödemi üretir.
İnme modelinin düşük değişkenliğini ve yüksek tekrarlanabilirliğini elde etmek için, aşağıdakiler dahil olmak üzere çeşitli dışlama kriterleri dikkate alınmalıdır: 1) çalışma süresi > 20 dk; 2) >CCA lige edildiğinde kan akışı azalmasının% 20'si (adım 3.3); 3) tıkanıklık sırasında kan akışının azaltılması, ilk tıkanıklık öncesi değerin% 80'ini <; ve 4) kan akışı, reperfüzyon oranı <80% sonra ön reperfüzyon değerine kıyasla 10 dakika artar. Deneyimli ve eğitimli bir cerrah için, operasyon süresi kriteri nedeniyle hiçbir hayvan hariç tutulmaz. Bununla birlikte, hayvanların% 10-15'i CCA ligasyonunda kan akışında% 20 azalma gösterir ve% 5-10'unda oklüzyon veya reperfüzyon sırasında kan akışında yeterli azalma veya artış göstermez. Bu nedenle, bu kriterlere göre hayvanlar hariç tutulduktan sonra başarı oranı yaklaşık% 75-85'tir.
Ek olarak, hayvanlar hastalık, ağrı veya rahatsızlık davranışını kontrol etmek için MCAo'dan (vücut ağırlığı, sıcaklık ve temel fizyolojik davranış) sonra günlük olarak incelenir. Bu genel bakıma ek olarak, odak beyin iskemisi sonrası spesifik davranış analizi için çeşitli testler geliştirilmiştir, rotarod testi21, Yapışkan etiket testi 22 , Köşe testi 23 veya Silindir testi24gibi sensorimotor disfonksiyonu değerlendirmek için bilinen tüm testlere rağmen . Burada, bu inme modelinin kurulması için seçilen hayvanlar odak ve genel açıklar için değerlendirildi, çünkü filament modeli ayrıca odak (duyusal veya motor) açıklardan bağımsız sitokin-hastalık davranışına neden olur25. Birlikte ele alındığında, burada açıklanan "filament" inme modeli temel ve çevirisel inme araştırmaları için değerli bir modeldir. Bu model, laboratuvarlar arasında kontur modellerini uyumlu hale getirmek için kullanılacak standart bir inme modeli olarak önerildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak rakip çıkarları yoktur.
Acknowledgments
ImmunoStroke Konsorsiyumu'nun (FOR 2879, For immune cells to stroke recovery) tüm işbirliği ortaklarımıza öneriler ve tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı), Münih Sistem Nörolojisi Kümesi (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) çerçevesinde ve LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 ve LL-112/1-1 hibeleri kapsamında Almanya'nın Mükemmellik Stratejisi kapsamındadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
References
- Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M.
- O'Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Zhang, Z., et al. A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 17 (2), 123-135 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- McNutt, M.
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2084-2097 (2017).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Jackman, K., Kunz, A., Iadecola, C. Modeling focal cerebral ischemia in vivo. Methods in Molecular Biology. 793, 195-209 (2011).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4038 (2012).
- Rha, J. H., Saver, J. L. The impact of recanalization on ischemic stroke outcome: a meta-analysis. Stroke. 38 (3), 967-973 (2007).
- Liu, J., et al. Transient filament occlusion of the middle cerebral artery in rats: does the reperfusion method matter 24 hours after perfusion. BMC Neuroscience. 13, 154 (2012).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 259 (2), 211 (1968).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4 (10), 1560-1564 (2009).
- Zhang, L., et al. A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia. Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 207-214 (2002).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).
- Roth, S., Yang, J., Cramer, J., Malik, R., Liesz, A. Detection of cytokine-induced sickness behavior after ischemic stroke by an optimized behavioral assessment battery. Brain, Behavior, and Immunity. 91, 668-672 (2021).
