Summary
Olika modeller av mellersta cerebrala gatan ocklusion (MCAo) används i experimentell stroke forskning. Här beskrivs en experimentell stroke modell av transienta MCAo via den externa halsartären (ECA) som syftar till att efterlikna mänskliga stroke, där cerebrovaskulära tromb tas bort på grund av spontan blodpropp lys eller terapi.
Abstract
Stroke är den tredje vanligaste dödsorsaken och den främsta orsaken till förvärvad vuxen invaliditet i utvecklade länder. Hittills är terapeutiska alternativ begränsade till en liten andel strokepatienter inom de första timmarna efter stroke. Nya terapeutiska strategier undersöks i stor utsträckning, särskilt för att förlänga det terapeutiska tidsfönstret. Dessa aktuella undersökningar inkluderar studier av viktiga patofysiologiska vägar efter stroke, såsom post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticitet och regenerering. Under det senaste decenniet har oron ökat för den dåliga reproducerbarheten hos experimentella resultat och vetenskapliga rön bland oberoende forskargrupper. För att övervinna den så kallade "replikeringskrisen" behövs det ett trängande behov av detaljerade standardiserade modeller för alla förfaranden. Som ett försök inom forskningskonsortiet "ImmunoStroke" (https://immunostroke.de/) föreslås en standardiserad musmodell av transienta mellersta cerebrala arteriell ocklusion (MCAo). Denna modell möjliggör fullständig restaurering av blodflödet vid avlägsnande av filamentet, simulerar den terapeutiska eller spontana blodpropplysen som förekommer i en stor andel mänskliga stroke. Det kirurgiska ingreppet i denna "filament" stroke modell och verktyg för dess funktionella analys visas i den medföljande videon.
Introduction
Stroke är en av de vanligaste orsakerna till dödsfall och funktionshinder i världen. Även om det huvudsakligen finns två distinkta former av stroke, ischemisk och hemorragisk, är 80-85% av alla strokefall ischemiska1. För närvarande finns endast två behandlingar tillgängliga för patienter med ischemisk stroke: farmakologisk behandling med rekombinant vävnad plasminogen aktivator (rtPA) eller mekanisk trombectomy. På grund av det snäva terapeutiska tidsfönstret och flera uteslutningskriterier kan dock endast ett utvalt antal patienter dra nytta av dessa specifika behandlingsalternativ. Under de senaste två decennierna har preklinisk och translationell strokeforskning fokuserat på studier av neuroprotektiva metoder. Emellertid, alla föreningar som nått kliniska prövningar har hittills visat inga förbättringar för patienten2.
Eftersom in vitro-modeller inte exakt kan reproducera alla hjärninteraktioner och patofysiologiska mekanismer för stroke, är djurmodeller avgörande för preklinisk strokeforskning. Att efterlikna alla aspekter av mänsklig ischemisk stroke i en enda djurmodell är dock inte genomförbart, eftersom ischemisk stroke är en mycket komplex och heterogen sjukdom. Av denna anledning har olika ischemiska strokemodeller utvecklats över tid hos olika arter. Fototrobosis av cerebrala arterioles eller permanent distala ocklusion av den mellersta cerebrala artären (MCA) är vanliga modeller som inducerar små och lokalt definierade skador i neocortex3,4. Förutom dessa är den vanligaste slagmodellen förmodligen den så kallade "filamentmodellen", där en övergående ocklusion av MCA uppnås. Denna modell består av en övergående introduktion av en suturglödtråd till MCA: s ursprung, vilket leder till en plötslig minskning av det cerebrala blodflödet och den efterföljande stora hjärtinfarkten av subkortikala och när hjärnregioner5. Även om de flesta strokemodeller efterliknar MCA-ocklusioner 6, tillåter "filamentmodellen" exakt avgränsning av den skandinaviska tiden. Reperfusion genom filament borttagning efterliknar det mänskliga kliniska scenariot av cerebrala blodflöde restaurering efter spontana eller terapeutiska (rtPA eller mekaniska thrombectomy) blodpropp lys. Hittills har olika modifieringar av denna "filamentmodell" beskrivits. I det vanligaste tillvägagångssättet, först beskrivet av Longa et al. År 19895införs en kiselbelagd filament via den gemensamma halspulsådern (CCA) till ursprunget till MCA7. Även om det är ett allmänt använt tillvägagångssätt, tillåter denna modell inte fullständig restaurering av blodflödet under reperfusion, eftersom CCA är permanent ligerad efter avlägsnande av filamentet.
Under det senaste decenniet har ett ökande antal forskargrupper varit intresserade av att modellera stroke hos möss med hjälp av denna "filamentmodell". Den avsevärda variationen i denna modell och bristen på standardisering av förfarandena är dock några av orsakerna till den höga variabiliteten och den dåliga reproducerbarheten hos de experimentella resultat och vetenskapliga rön som rapporterats hittills2,8. En potentiell orsak till den nuvarande "replikeringskrisen", med hänvisning till den låga reproducerbarheten bland forskningslaboratorier, är de icke-jämförbara slagfarktvolymerna mellan forskargrupper med samma experimentella metod9. Faktum är att efter att ha genomfört den första prekliniska randomiserade kontrollerade multicenterstudiestudien10, kunde vi bekräfta att bristen på tillräcklig standardisering av denna experimentella strokemodell och de efterföljande utfallsparametrarna var de främsta orsakerna till reproducerbarhetsfelet i prekliniska studier mellan oberoende laboratorier11 . Dessa drastiska skillnader i de resulterande infarktstorlekarna, trots att man använder samma strokemodell, utgör med rätta inte bara ett hot mot bekräftande forskning, utan också för vetenskapliga samarbeten på grund av bristen på robusta och reproducerbara modeller.
Mot bakgrund av dessa utmaningar ville vi utveckla och beskriva i detalj förfarandet för en standardiserad transient MCAo-modell som används för forskningsinsatserna inom forskningskonsortiet "ImmunoStroke" (https://immunostroke.de/). Detta konsortium syftar till att förstå de hjärn-immun interaktioner som ligger till grund för de mekanistiska principerna för stroke återhämtning. Dessutom presenteras histologiska och relaterade funktionella metoder för stroke resultat analys. Alla metoder bygger på etablerade standardrutiner som används i alla forskningslaboratorier i ImmunoStroke-konsortiet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experiment som rapporterades i denna video utfördes enligt de nationella riktlinjerna för användning av försöksdjur, och protokollen godkändes av de tyska statliga kommittéerna (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland). Tio veckor gamla hane C57Bl/6J möss användes och inrymd under kontrollerad temperatur (22 ± 2 °C), med en 12 h ljus-mörk cykel period och tillgång till pelleterad mat och vatten ad libitum.
1. Beredning av material och instrument
- Anslut värmetäcket för att bibehålla temperaturen i operationsområdet och musens kroppstemperatur under anestesi vid 37 °C.
- Autoklav sax och tång, förbered 70% etanollösning och håll tillgänglig dexpanthenol ögonsalva, flera bitar bomull och 5-0 belagd flätad polyester sutur redo för användning. Förbered en 1 ml-spruta med 0,9% saltlösning (utan nål) för att hålla djurets snittställe hydratiserat. Förbered anestesigasen (100% O2 + isofluran).
- Förbered en hållare för laserdopplersonden genom att skära spetsen på en 10 μL rörspets (3-5 mm längd).
OBS: Alla instrument steriliseras med hjälp av en varmpärlasteriliserare. Ytor desinficeras också före och efter operationen med en mikrobiell desinfektionsspray. Före operationen desinficeras områdena kring mössens huvud och bröst med en sårdesinfektionsspray.
2. Förberedelse av laser doppler
- Injicera analgesi i musen 30 min före operationen (4 mg/kg Carprofen och 0,1 mg/kg Buprenorfin, intraperitoneally).
- Bedöva musen genom att placera den i induktionskammaren med en isofluranflödeshastighet på 4% tills spontan kroppsrörelse och vibrissa upphör.
- Placera musen i ett benägen läge i operationsområdet med näsan i anestesimasken. Behåll isoflurankoncentrationen vid 4% i ytterligare en minut, minska den och håll den på 2%.
- Ställ in den tillhörande återkopplingsstyrda värmeplattan för att hålla musens kroppstemperatur vid 37 °C och sätt försiktigt in rektalsonden för att övervaka temperaturen under de kirurgiska ingreppen.
- Applicera dexpanthenol ögonsalva på båda ögonen.
- Desinficera huden och håret som omger vänster öga och öra med 70% etanol.
- Skär hårbotten mellan vänster öra och ögat (1 cm långt) för att exponera skallbenet.
- Klipp och dra tillbaka tidsmuskeln för att visualisera MCA under skallen.
- Fixera med lim den yttre delen av spetsen som håller laser Dopplersonden / fibern ovanpå vänster MCA med lim. Limma sedan huden för att stänga såret runt spetshållaren. Applicera 2-3 droppar härdningslim för att påskynda processen. Se till att laser dopplerfibern inte är limmad och lätt kan tas bort från spetshållaren när som helst.
3. Transient MCAo-modell (ocklusion)
- Förvandla musen till den bakre positionen. Sätt nosen i anestesikonen och fixa tassarna med tejp.
- Desinficera huden och håret som omger bröstet och gör ett 2 cm långt mittlinjesnitt i nacken.
- Använd tång för att dra isär huden och undermandibulära körtlarna. Använd upprullningsdon för att hålla sternomastoid muskeln, exponera det kirurgiska fältet och hitta den vänstra gemensamma halsartären (CCA). Dissekera CCA fri från bindväv och omgivande nerver (utan att skada vagal nerven) och utföra en övergående ligatur före bifurcation.
- Dissekera den yttre halsartären (ECA) och knyt en permanent knut vid den mest distala synliga delen. Placera en annan sutur under revisionsrätten, nära bifurcationen, och förbered en lös knut som ska användas senare.
- Dissekera den inre halsartären (ICA) och placera ett mikrovaskulärt klipp på den, 5 mm över bifurcationen. Se till att inte skada vagalnerven.
- Skär ett litet hål i revisionsrätten mellan de täta och de lösa ligationerna; Var försiktig så att du inte skär av hela revisionsrätten.
- Introducera glödtråden och för den mot CCA. Dra åt den lösa ligaturen i revisionsrätten runt lumen för att inom kort säkra filamentet i det läget och undvik blödning när du tar bort mikrovaskulära klämman.
- Ta bort det mikrovaskulära klämman och för in filamentet genom ICA tills MCA:s ursprung uppnås genom att detektera en kraftig minskning (>80%) i cerebralt blodflöde mätt med laserdopplern. Fixera glödtråden i detta läge genom att ytterligare dra åt knuten runt revisionsrätten.
OBS: När glödtråden går i rätt riktning går den smidigt framåt och inget motstånd bör observeras. - Registrera laser dopplervärden före och efter filamentinsättning.
- Ta bort upprullningsdonet och flytta sternomastoidmuskeln och submandibularkörtlarna innan du suturing såret. Ta bort laserdopplersonden och placera djuret i en återhämtningskammare vid 37 °C i 1 h (tills filamentborttagningen).
4. Transient MCAo-modell (Reperfusion)
- Bedöva musen genom att placera den i induktionskammaren med en isofluranflödeshastighet på 4% tills spontan kroppsrörelse och vibrissa upphör.
- Applicera dexpanthenol ögonsalva på båda ögonen.
- Placera musen i ett benägen läge i operationsområdet med nosen i anestesimasken. Behåll isoflurankoncentrationen vid 4% i ytterligare en minut, minska den och håll den på 2%. Fixa djurets tassar med tejp.
- För in laserdopplersonden i sondens hållare.
- Ta bort sårsyssen, använd tång för att dra isär huden och undermandibulära körtlarna. Använd upprullningsdon för att försiktigt dra i sternomastoidmuskeln och exponera det kirurgiska fältet.
- Lossa ECA-suturen som drar åt glödtråden och dra försiktigt glödtråden. Undvik att skada filamentets silikongummibeläggning under borttagningen.
- Bind fast revisionsrättens sutur.
- Bekräfta ökningen av cerebralt blodflöde i laser doppler-enheten (>80% av det ursprungliga värdet före reperfusion).
- Registrera laser dopplervärden före och efter filamentborttagning.
- Öppna den tillfälliga ligaturen före bifurcation från CCA.
- Ta bort upprullningsdonet och flytta sternomastoid muskeln och submandibular körtlar innan suturing såret. Placera djuret i en återhämtningskammare vid 37 °C i 1 timme för att återhämta sig från anestesi.
- Efter återhämtning, returnera mössen till sina burar i ett temperaturkontrollerat rum.
- Ta hand om djuren genom att tillsätta våt matpellets och hydrogel i små Petri-rätter på burgolvet fram till dag 3 efter operationen.
- Injicera analgesi var 12:e timme i 3 d efter operation (4 mg/kg Carprofen och 0, 1 mg/kg Buprenorfin).
5. Skenoperation
- Utför alla procedurer enligt beskrivningen ovan, inklusive artärernas ligatur och införandet av filamentet (steg 1-3,7).
- Ta bort glödtråden omedelbart efter dess insättning. Placera sedan djuret i återhämtningskammaren i 1 h.
- Placera djuret i operationsområdet igen och ta bort den övergående ligaturen av CCA för att säkerställa fullständig cerebralt blodflöde restaurering.
- Suturera såret och placera djuret i en återhämtningskammare vid 37 °C i 1 h för att återhämta sig från anestesi. Efter återhämtning, returnera mössen till sina burar i ett temperaturkontrollerat rum.
- Ta hand om djuren genom att tillsätta våt matpellets och hydrogel i små Petri-rätter på burgolvet fram till dag 3 efter operationen.
- Injicera analgesi var 12:e timme i 3 d efter operation (4 mg/kg Carprofen och 0, 1 mg/kg Buprenorfin).
6. Neuroscore
- Utför Neuroscore alltid vid samma tid på dagen och använd kirurgiska kläder för att upprätthålla en "neutral lukt" mellan enskilda kirurger.
- Låt mössen vila i 30 minuter i rummet med en "öppen" bur före testet.
- Observera varje punkt i tabell 1 och tabell 2 för 30 s.
7. Intracardiac perfusion
- Förbered en 20 ml spruta som innehåller fosfatbuffrad saltlösning (PBS)-heparin (2 U/ml) och placera den 1 m ovanför bänken för att underlätta gravitationsdriven perfusion. (VALFRITT: Utför intrakarkiacperfusion med 4% paraformaldehyd (PFA) med en 20 ml spruta innehållande 4% PFA i PBS, pH 7, 4).
- Injicera intrperitoneally 100 μL ketamin och xylazin (120 respektive 16 mg/kg kroppsvikt). Vänta 5 min och bekräfta upphörandet av spontan kroppsrörelse och vibrissae.
- Fixera djuret i en supin position och desinficera bukkroppens yta med 70% etanol.
- Gör ett 3 cm långt snitt i buken; skär membranet, revbenen och bröstbenet för att visualisera hjärtat helt.
- Gör ett litet snitt i höger förmak och sätt in perfusions cannula i vänster ventrikel.
- Perfuse med 20 ml PBS-heparin.
- Efter perfusion, halshugga djuret och ta bort hjärnan.
- Frys hjärnan på pulveriserad torris och förvara vid -80 °C tills vidare.
8. Infarct volumetry
- För kryosektion, använd en kryostat för att skära hjärnan i 20-μm tjocka sektioner var 400 μm. Placera sektionerna på bilder och förvara bilderna vid −80 °C tills de används.
- Cresylviolett (CV) färgning
- Förbered färgningslösningen genom omrörning och uppvärmning (60 °C) 0,5 g CV-acetat i 500 ml H2O tills kristallerna är upplösta. När lösningen har svalnat, förvara den i en mörk flaska. Värm upp till 60 °C och filtrera före varje användning.
- Låt rutschkanorna torka i rumstemperatur i 30 min. Sänk ner dem i 95% etanol i 15 min, i 70% etanol i 1 min och sedan i 50% etanol i 1 min.
- Sänk ned rutschkanorna i destillerat vatten i 2 minuter; uppdatera det destillerade vattnet och placera rutschkanorna i vattnet i 1 min. Sänk sedan ned rutschkanorna i den förvärmda färgningslösningen i 10 min vid 60 °C. Tvätta rutschkanorna två gånger i destillerat vatten i 1 min.
- Sänk ned rutschkanorna i 95% etanol i 2 min. Placera dem i 100% etanol i 5 min; uppdatera 100% etanol och placera bilderna igen i etanolen i 2 min. Täck sedan bilderna med ett monteringsmedium.
- Analys(figur 4C)
- Skanna bilderna och analysera den indirekta infarktvolymen med Swanson-metoden12 för att korrigera för ödem med hjälp av följande ekvation:
(Ischemiskt område) = (ischemisk region)-((ipsilateral halvklotet)-(kontralateralt halvklot))
- Skanna bilderna och analysera den indirekta infarktvolymen med Swanson-metoden12 för att korrigera för ödem med hjälp av följande ekvation:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modellen som beskrivs här är en ändring av den vanliga "filament" strokemodellen, som består av att införa en kiselbelagd filament genom revisionsrätten för att tillfälligt blockera mcaens ursprung (figur 1). Efter avlägsnande av filamentet upphör endast blodflödet i revisionsrätten permanent, vilket möjliggör fullständig recanalisering av CCA och ICA. Detta möjliggör en adekvat reperfusion av hjärnan (figur 2), liknande den situation som observerats efter framgångsrik farmakologisk trombolys eller mekanisk trombektomi hos mänskliga patienter. Dessutom beskriver detta arbete också en metod för att mäta cerebralt blodflöde under både ocklusion och reperfusion förfaranden genom att fixa en kanyl ansluten till laser Doppler sonden vid skallen över MCA territorium.
Den totala dödligheten i det kirurgiska ingreppet är <5% när den utförs av en utbildad kirurg. Vid tidiga tidpunkter efter MCAo, djur i allmänhet presenterar allvarliga posturala och rörelse underskott, allmän svaghet, och förlust i kroppsvikt13. Dessa allvarliga underskott är övergående, och djuren visar förbättrad aktivitet efter ungefär 1 vecka; således är underskotten mer specifika för fokala neurologiska symtom.
Beteendemässiga underskott efter MCA ocklusion bedömdes av sammansatta Neuroscore14; allmänna och fokala underskott mättes 24 h och 3 d efter kirurgi. Den allmänna Neuroscore integrerar 5 objekt (tabell 1), inklusive utvärdering av päls, öron, ögon, hållning och spontan aktivitet, med en maximal poäng på 18. Fokal neuroscore består av 7 punkter (tabell 2), inklusive utvärdering av kroppssymmetri, gång, klättring, cirklingsbeteende, förbenssymmetri, obligatorisk cykling och whiskers svar, med en maximal poäng på 28. Den sammansatta skalan varierar från 0 (inga underskott) till 46 (allvarliga nedskrivningar). Strokedjur presenterade en betydande förändring i komposit och fokal Neuroscore, men inte i den allmänna Neuroscore, jämfört med sham djur (figur 3).
Infarct volumetry utfördes också med hjälp av Cresyl Violet färgning av koronal seriell hjärnan avsnitt 24 h efter stroke induktion. Det infarkta volym medelvärdet var 61,69 mm3, vilket motsvarar 48% av den drabbade hjärnhalvan (figur 4). När den utförs av en utbildad kirurg är den totala variationen i denna strokemodell låg, med en variationskoefficient på <6%. Lesionsområdet omfattar somatosensory och motor cortex samt subkortikala strukturer som striatum (figur 4).
Figur 1: System för åtkomst och intraluminal MCA-ocklusion. Filamentet (prickad linje) sätts in mellan de proximala och distala suturknutarna i revisionsrätten och avanceras längs ICA tills den når MCA:s ursprung (se infälld). Väl på plats är revisionsrätten ligerad med en sutur för att fixa filamentet. Förkortningar: ACA = främre cerebral artär; BA = basilarartär; CCA = vanlig halspulsåder; Revisionsrätten = yttre halspulsåder; ICA = inre halspulsåder; MCA = mellersta cerebral artär; PCA = bakre kommunicerande artär; PTG = pterygopalatin gatan. Denna siffra har ändrats från Jackman et al. 15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Blodflöde under ocklusion och reperfusion. Blodflödet registreras före och efter filamentinsättning och före och efter filamentborttagning. En minskning av blodflödet observerades under ocklusion och återställande av blodflödet under reperfusionen. Varje färg representerar ett djur. Förkortningar: MCA = mellersta cerebral artär; CBF = cerebralt blodflöde; A.U. = godtyckliga enheter. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Neuroscore för funktionella underskott efter tMCAo. (A) Totalt, (B) brännfokus och (C) allmän Neuroscore före och 24 h och 3 d efter tMCAo. Öppna barer: sham; Svarta staplar: tMCAo. n=10 per grupp. *p < 0,05. Förkortningar: tMCAo = transient middle cerebral artery ocklusion; BL = före tMCAo. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Volymetrisk infarktanalys och infarktresultat 24 h efter tMCAo. (A) Representativa cresylviolettfärgade koronalhjärnsektioner var 400 μm vid 24 timmar efter tMCAo. Streckade linjer avgränsar lesionsområdet. (B) Analys av infarktvolym på 10 hjärnor (varje punkt som representerar en enskild hjärna) 24 h efter tMCAo. Den horisontella röda linjen representerar medelvärdet (61,69 mm3), felstaplar anger standardavvikelse (3,78 mm3). (C) Representativ bild för infarktvolymberäkning från en cresylviolett koronalsektion. Blå = Kontralateral halvklot; Röd = Ipsilateral halvklotet; Blekrandigt område = Ischemisk region. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Tidspunkt för poängsättning | tjog | ||
| Allmänna Neuroscore | Hår | 0. Håret snyggt och rent | |
| 1. Lokaliserad piloerection och smutsigt hår i 2 kroppsdelar (näsa och ögon) | |||
| 2. Piloerection och smutsigt hår i >2 kroppsdelar | |||
| Öron (mus på öppen bänkskiva) | 0. Normalt (öronen sträcks i sidled och bakom, de reagerar genom att räta upp efter ljud) | ||
| 1. Sträckt i sidled men inte bakom (en eller båda), de reagerar på buller | |||
| 2. Samma som 1. Ingen reaktion på buller. | |||
| Ögon (mus på OBT) | 0. Öppna, rengör och följ snabbt den omgivande miljön | ||
| 1. Öppen och kännetecknad av vattenhaltig slem. Följ långsamt den omgivande miljön | |||
| 2. Öppen och kännetecknad av mörk slem | |||
| 3. Ellipsoidal formad och kännetecknad av mörk slem | |||
| 4. Stängt | |||
| Hållning (placera musen på handflatan och sväng försiktigt) | 0. Musen står i upprätt läge med baksidan parallellt med handflatan. Under gungan står den snabbt. | ||
| 1. Musen står puckelryggad. Under gungan plattar det kroppen för att få stabilitet. | |||
| 2. Huvudet eller delen av stammen ligger på handflatan. | |||
| 3. Musen ligger på ena sidan, knappt kan återställa upprätt läge. | |||
| 4. Musen ligger i ett benägen läge, inte kan återställa upprätt läge. | |||
| Spontaneos aktivitet (mus på OBT) | 0.Musen är alert och utforskar aktivt. | ||
| 1.Musen verkar alert, men det är lugnt och trögt. | |||
| 2.Musen utforskar intermittent och trögt. | |||
| 3.Musen är somnolent och bedövad, få rörelser på plats. | |||
| 4.No spontana rörelser | |||
| Totalpoäng för allmän poängsättning | |||
| (normal=0 max=18) | |||
Tabell 1: Allmänt Neuroscore. Djuren fick mellan 0 och 4 poäng, beroende på svårighetsgraden, för vart och ett av de fem allmänna underskott som mättes. Poängen på de olika områdena läggs sedan till för att ge en total allmän poäng från 0 till 18. Tabellen har ändrats från Clark etal.14 . Förkortning: OBT = öppen bänkskiva.
| Tidspunkt för poängsättning | tjog | ||
| Focal Neuroscore | Kroppssymmetri (mus på OBT, observera nos-svanslinjen) | 0. Normal (Kropp: normal hållning, bål upphöjd från bänken, med fram- och bakben som lutar under kroppen. Svans: rak) | |
| 1. Liten asymmetri (Kropp: lutar sig på ena sidan med fram- och baklimbs som lutar under kroppen. Svans: något böjd) | |||
| 2. Måttlig asymmetri (Kropp: lutar sig på ena sidan med fram- och baklimbs utsträckta. Svans: något böjd) | |||
| 3. Framträdande asymmetri (Kropp: böjd, på ena sidan ligger på OBT. Svans: böjd) | |||
| 4. Extrem asymmetri (Kropp: mycket böjd, på ena sidan ligger ständigt på OBT. Svans: mycket böjd) | |||
| Gång (mus på OBT. Observerad ostört) | 0. Normal (gång är flexibel, symmetrisk och snabb) | ||
| 1. Styv, oflexibel (knölvalad promenad, långsammare än vanlig mus) | |||
| 2. Limping, med asymmetriska rörelser | |||
| 3. Darrande, drifting, fallande | |||
| 4. Går inte spontant (när stimuleras genom att försiktigt trycka på musvandringarna inte längre än 3 steg) | |||
| Klättring (mus på en 45o yta. Placera musen i mitten av gripytan) | 0. Normalt (musen klättrar snabbt) | ||
| 1. Klättrar med stam, lemsvaghet närvarande | |||
| 2. Håller fast, halkar inte eller klättrar | |||
| 3. Glider nerför sluttning, misslyckad ansträngning för att förhindra misslyckande | |||
| 4. Bilder omedelbart, ingen ansträngning för att förhindra misslyckande | |||
| Cirklingsbeteende (mus på OBT, fri observation) | 0. Frånvarande cirklingsbeteende | ||
| 1. Huvudsakligen ensidessvängar | |||
| 2. Cirklar åt ena sidan, men inte ständigt | |||
| 3. Cirklar ständigt åt ena sidan | |||
| 4. Svängning, svängning eller ingen rörelse | |||
| Förbenssymmetri (musen upphängd av svansen) | 0. Normalt | ||
| 1. Lätt asymmetri: mild böjning av kontralateral framben | |||
| 2. Markerad asymmetri: markerad böjning av kontralateral lem, kroppen böjer sig något på den ipsilateral sidan | |||
| 3. Framträdande asymmetri: kontralateral förben fäster vid stammen | |||
| 4. Lätt asymmetri, ingen rörelse mellan kropp och lem | |||
| Obligatorisk cirkling (framben på bänken, baklimbs upphängda av svansen: det avslöjar närvaron av kontralateral lem pares) | 0. Frånvarande. Normal förlängning av båda frambenen | ||
| 1. Tendens att vända sig åt ena sidan (musen sträcker sig båda förbenen, men börjar helst vända sig till ena sidan) | |||
| 2. Cirklar åt ena sidan (musen vänder sig mot ena sidan med en långsammare rörelse jämfört med friska möss) | |||
| 3. Vrider sig långsamt åt ena sidan (musen vänder sig mot ena sidan utan att utföra en komplett cirkel) | |||
| 4. Avancerar inte (den främre delen av stammen ligger på bänken, långsamma och korta rörelser) | |||
| Whisker svar (mus på OBT) | 0. Normalt | ||
| 1. Lätt asymmetri (musen drar sig långsamt tillbaka när den stimuleras på kontralateral sida) | |||
| 2. Framträdande asymmetri (inget svar när den stimuleras till den kontralaterala sidan) | |||
| 3. Frånvarande svar kontralateerally, långsam reaktion när stimuleras ipsilaterally | |||
| 4. Frånvarande svar bilateralt | |||
| Totalpoäng för fokala underskott | |||
| (normal=0 max=28) | |||
Tabell 2: Focal Neuroscore. Djuren fick mellan 0 och 4 poäng beroende på svårighetsgraden för vart och ett av de sju allmänna underskott som mättes. Poängen på de olika områdena läggs sedan till för att ge en total brännpoäng från 0 till 28. Tabellen har ändrats från Clark etal.14 . Förkortning: OBT = öppen bänkskiva.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en experimentell stroke modell baserat på konsensus överenskommelsen av ett tyskt multicenter forskningskonsortium ("ImmunoStroke") att upprätta en standardiserad transient MCAo modell. Den övergående MCAo-modellen som upprättats genom att införa en kiselbelagd filament genom revisionsrätten till ursprunget till MCA är en av de mest använda slagmodellerna för att uppnå arteriell reperfusion efter en avgränsad ocklusionsperiod. Därför kan denna procedur betraktas som en översättningsrelevant linjemodell.
Den "filament modell" presenteras i videon har vissa fördelar jämfört med andra tidigare beskrivna stroke modeller, såsom att inte kräva craniotomy och uppnå fullständig reperfusion av transiently det ockluserade fartyget. Komplexiteten i det kirurgiska ingreppet kan dock betraktas som en begränsning, eftersom det inkluderar invasiv kirurgi och en exakt manipulering av de olika artärerna i närheten av luftstrupen och vagalnerven. Djurets långa exponering för bedövningsmedel kan också vara en kritisk faktor att överväga, eftersom anestetikas inverkan på neuroprotektion och strokeutfall redan har dokumenterats väl16. Slutligen, trots komplexiteten i detta kirurgiska ingrepp, kan det slutföras på ca 20 min när det utförs av en utbildad kirurg.
I motsats till de tidigare beskrivna "filament" stroke protokoll17, den metod som beskrivs här tillåter också mätning av cerebralt blodflöde under ocklusion och reperfusion faser. Blodflödesövervakning under reperfusion kan vara en viktig parameter för att förhindra stroke reperfusion skada18, som är känd för att orsaka skadliga konsekvenser hos patienter som genomgår farmakologiska eller endovaskulära ingrepp för recanalization av de tromboserade kärlen. Trots skillnaderna mellan konsekvenserna av cerebral blodflöde restaurering efter MCAo19, variabiliteten i blodflöde restaurering efter stroke kan påverka patofysiologiska och biokemiska händelser i hjärnan, liksom den infarkt volymen och de neurologiska underskotten av stroke möss20. Därför är i denna modell fullständig återställning av blodflödet och dess registrering krav för att säkerställa reproducerbara infarkter bland möss, särskilt i translationella strokestudier.
Den totala dödligheten under det kirurgiska ingreppet är mindre än 5% och orsakas främst av anestesikomplikationer, blödningar eller offer på grund av fördefinierade uteslutningskriterier. Denna stroke modell presenterar dock en måttlig dödlighet inom de första 24-48 h efter stroke induktion, vilket kan öka antalet djur som behövs per experiment för att uppnå en adekvat kohort av stroke möss. När det gäller infarkt volym inducerar denna modell stora infarkter, med skador som omfattar upp till 50% av halvklotet. Det producerar också hjärnödem, som påverkar olika hjärnregioner, inklusive när och subkortikala regioner.
För att uppnå en låg variabilitet och hög reproducerbarhet av strokemodellen bör flera uteslutningskriterier beaktas, inklusive: 1) driftstid > 20 min; 2) >20% av blodflödesminskningen när CCA är ligerad (steg 3,3); 3) blodflödesminskning under ocklusion < 80% av det ursprungliga preocklusionsvärdet; och 4) blodflödet ökar 10 min efter reperfusionshastighet <80% jämfört med förreperfusionsvärdet. För en erfaren och utbildad kirurg utesluts inga djur på grund av driftstidskriteriet. 10–15% av djuren visar dock en 20% minskning av blodflödet vid CCA ligatur, och 5-10% visar ingen adekvat minskning eller ökning av blodflödet under ocklusion respektive reperfusion. Därför är framgångsgraden efter att ha uteslutit djur baserat på dessa kriterier cirka 75-85%.
Dessutom undersöks djur dagligen efter MCAo (kroppsvikt, temperatur och grundläggande fysiologiskt beteende) för att kontrollera för sjukdom, smärta eller obehagsbeteende. Förutom denna allmänna vård har flera tester utvecklats för specifik beteendeanalys efter fokal hjärn ischemi, trots alla kända tester för att utvärdera sensorimotorisk dysfunktion, såsom Rotarod-testet21, Klibbig etiketttest22, Corner test23eller Cylindertest24. Här utvärderades djur som valts för upprättandet av denna strokemodell för fokala och allmänna underskott, eftersom filamentmodellen också inducerar cytokinsjuka beteende oberoende av fokala (sensoriska eller motoriska) underskott25. Sammantaget är den "filament" strokemodell som beskrivs här en värdefull modell för grundläggande och translationell strokeforskning. Denna modell föreslås som en standardiserad strokemodell som ska användas för att harmonisera strokemodeller mellan laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande intressen att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar alla våra samarbetspartners till ImmunoStroke Consortia (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) för förslag och diskussioner. Detta arbete finansierades av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Tyska forskningsstiftelsen) inom ramen för Tysklands excellencestrategi inom ramen för Münchenklustret för systemneuri (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) och under bidragen LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 och LL-112/1-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
References
- Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M.
- O'Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Zhang, Z., et al. A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 17 (2), 123-135 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- McNutt, M.
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2084-2097 (2017).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Jackman, K., Kunz, A., Iadecola, C. Modeling focal cerebral ischemia in vivo. Methods in Molecular Biology. 793, 195-209 (2011).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4038 (2012).
- Rha, J. H., Saver, J. L. The impact of recanalization on ischemic stroke outcome: a meta-analysis. Stroke. 38 (3), 967-973 (2007).
- Liu, J., et al. Transient filament occlusion of the middle cerebral artery in rats: does the reperfusion method matter 24 hours after perfusion. BMC Neuroscience. 13, 154 (2012).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 259 (2), 211 (1968).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4 (10), 1560-1564 (2009).
- Zhang, L., et al. A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia. Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 207-214 (2002).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).
- Roth, S., Yang, J., Cramer, J., Malik, R., Liesz, A. Detection of cytokine-induced sickness behavior after ischemic stroke by an optimized behavioral assessment battery. Brain, Behavior, and Immunity. 91, 668-672 (2021).
