Summary
Ulike modeller av mellom cerebral arterie okklusjon (MCAo) brukes i eksperimentell slagforskning. Her er en eksperimentell slagmodell av forbigående MCAo via den eksterne halspulsåren (ECA) beskrevet, som tar sikte på å etterligne menneskelig slag, der cerebrovaskulær trombe fjernes på grunn av spontan blodpropp lysis eller terapi.
Abstract
Hjerneslag er den tredje vanligste årsaken til dødelighet og den ledende årsaken til ervervet voksen funksjonshemming i utviklede land. Til dags dato er terapeutiske alternativer begrenset til en liten andel slagpasienter i løpet av de første timene etter hjerneslag. Nye terapeutiske strategier undersøkes grundig, spesielt for å forlenge det terapeutiske tidsvinduet. Disse nåværende undersøkelsene inkluderer studiet av viktige patofysiologiske veier etter hjerneslag, for eksempel post-stroke betennelse, angiogenese, nevronal plastisitet og regenerering. I løpet av det siste tiåret har det vært økende bekymring for den dårlige reproduserbarheten av eksperimentelle resultater og vitenskapelige funn blant uavhengige forskningsgrupper. For å overvinne den såkalte "replikeringskrisen" er det nødvendig med detaljerte standardiserte modeller for alle prosedyrer. Som et forsøk innen forskningskonsortiet "ImmunoStroke" (https://immunostroke.de/), foreslås en standardisert musemodell av forbigående midtre cerebral arterie okklusjon (MCAo). Denne modellen tillater fullstendig restaurering av blodstrømmen ved fjerning av filamentet, simulerer terapeutisk eller spontan blodpropp lysis som forekommer i en stor andel av menneskelige slag. Den kirurgiske prosedyren for denne "filament" slagmodellen og verktøyene for sin funksjonelle analyse er demonstrert i den medfølgende videoen.
Introduction
Hjerneslag er en av de vanligste årsakene til død og funksjonshemming over hele verden. Selv om det hovedsakelig er to forskjellige former for hjerneslag, iskemisk og hemorragisk, er 80-85% av alle slagtilfeller iskemiske1. For tiden er bare to behandlinger tilgjengelige for pasienter med iskemisk slag: farmakologisk behandling med rekombinant vevsplasminogenaktivator (rtPA) eller mekanisk trombektomi. På grunn av det smale terapeutiske tidsvinduet og flere eksklusjonskriterier, kan imidlertid bare et utvalgt antall pasienter dra nytte av disse spesifikke behandlingsalternativene. I løpet av de siste to tiårene har preklinisk og translasjonell hjerneslagforskning fokusert på studiet av nevrobeskyttende tilnærminger. Imidlertid har alle forbindelser som nådde kliniske studier så langt ikke vist noen forbedringer for pasienten2.
Siden in vitro-modeller ikke nøyaktig kan reprodusere alle hjerneinteraksjoner og patofysiologiske slagmekanismer, er dyremodeller avgjørende for preklinisk slagforskning. Imidlertid er det ikke mulig å etterligne alle aspekter av menneskelig iskemisk slag i en enkelt dyremodell, da iskemisk slag er en svært kompleks og heterogen sykdom. Av denne grunn har forskjellige iskemiske slagmodeller blitt utviklet over tid i forskjellige arter. Fototrombose av cerebral arterioler eller permanent distal okklusjon av den midterste hjernearterien (MCA) er ofte brukte modeller som induserer små og lokalt definerte lesjoner i neocortex3,4. Foruten disse er den mest brukte slagmodellen sannsynligvis den såkalte "filamentmodellen", der en forbigående okklusjon av MCA oppnås. Denne modellen består av en forbigående innføring av en suturfilament til opprinnelsen til MCA, noe som fører til en brå reduksjon av hjerneblodstrømmen og den påfølgende store infarkten av subkortiske og kortikale hjerneregioner5. Selv om de fleste slagmodeller etterligner MCA okklusjoner 6, tillater "filamentmodellen" presis avgrensning av iskemisk tid. Reperfusjon ved fjerning av filament etterligner det menneskelige kliniske scenariet for cerebral blodstrømsrestaurering etter spontan eller terapeutisk (rtPA eller mekanisk trombektomi) blodpropplys. Til dags dato har forskjellige modifikasjoner av denne "filamentmodellen" blitt beskrevet. I den vanligste tilnærmingen, først beskrevet av Longa et al. i 19895, blir en silisiumbelagt filament introdusert via den vanlige halspulsåren (CCA) til opprinnelsen til MCA7. Selv om det er en mye brukt tilnærming, tillater denne modellen ikke fullstendig restaurering av blodstrømmen under reperfusjon, da CCA er permanent ligated etter fjerning av filamentet.
I løpet av det siste tiåret har et økende antall forskningsgrupper vært interessert i modellering av slag hos mus ved hjelp av denne "filamentmodellen". Imidlertid er den betydelige variasjonen av denne modellen og mangelen på standardisering av prosedyrene noen av årsakene til den høye variasjonen og dårlig reproduserbarhet av eksperimentelle resultater og vitenskapelige funn rapportert så langt2,8. En potensiell årsak til den nåværende "replikeringskrisen", med henvisning til den lave reproduserbarheten blant forskningslaboratorier, er de ikke-sammenlignbare slaginfarktvolumene mellom forskningsgrupper som bruker samme eksperimentellemetodikk 9. Faktisk, etter å ha gjennomført den første prekliniske randomiserte kontrollerte multisenterstudien10, kunne vi bekrefte at mangelen på tilstrekkelig standardisering av denne eksperimentelle slagmodellen og de påfølgende utfallsparametrene var hovedårsakene til svikt i reproduserbarhet i prekliniske studier mellom uavhengige laboratorier11. . Disse drastiske forskjellene i de resulterende infarktstørrelsene, til tross for at du bruker samme slagmodell, utgjør med rette ikke bare en trussel mot bekreftende forskning, men også for vitenskapelig samarbeid på grunn av mangel på robuste og reproduserbare modeller.
I lys av disse utfordringene hadde vi som mål å utvikle og beskrive prosedyren for en standardisert forbigående MCAo-modell i detalj som brukes til samarbeidsforskningsarbeidet innen forskningskonsortiet "ImmunoStroke" (https://immunostroke.de/). Dette konsortiet har som mål å forstå hjerneimmune interaksjonene som ligger til grunn for de mekanistiske prinsippene for hjerneslaggjenoppretting. I tillegg presenteres histologiske og relaterte funksjonelle metoder for slagutfallsanalyse. Alle metoder er basert på etablerte standard driftsprosedyrer som brukes i alle forskningslaboratorier i ImmunoStroke-konsortiet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimentene som ble rapportert i denne videoen ble utført etter de nasjonale retningslinjene for bruk av eksperimentelle dyr, og protokollene ble godkjent av de tyske regjeringskomiteene (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland). Ti uker gamle hannmus C57Bl/6J ble brukt og plassert under kontrollert temperatur (22 ± 2 °C), med en 12 timers lys-mørk syklusperiode og tilgang til pelletert mat og vann ad libitum.
1. Tilberedning av materiale og instrumenter
- Koble varmeteppet for å opprettholde temperaturen i operasjonsområdet og musens kroppstemperatur under anestesi ved 37 °C.
- Autoklav saks og tang, lag 70% etanoloppløsning og hold tilgjengelig dekspanthenol øyesalve, flere stykker bomull og 5-0 belagt flettet polyester sutur klar til bruk. Forbered en 1 ml sprøyte med 0,9% saltoppløsning (uten nål) for å holde dyrets snittsted hydrert. Forbered anestesigassen (100% O2 + isofluran).
- Forbered en holder for laseren Doppler-proben ved å kutte spissen på en 10 μL pipetspiss (3-5 mm lengde).
MERK: Alle instrumenter steriliseres ved hjelp av en varm perlesterilisator. Overflater desinfiseres også før og etter operasjonen med en mikrobiell desinfeksjonsspray. Før operasjonen desinfiseres områdene rundt hodet og brystet av mus med en sårdesinfeksjonsspray.
2. Forberedelse av laseren Doppler
- Injiser analgesi til musen 30 min før operasjonen (4 mg/kg Carprofen og 0,1 mg/kg Buprenorfin, intraperitonealt).
- Bedøv musen ved å plassere den i induksjonskammeret med en isofluranstrømningshastighet på 4% til opphør av spontan kroppsbevegelse og vibrissae.
- Plasser musen i en utsatt posisjon i operasjonsområdet med nesen i anestesimasken. Oppretthold isoflurankonsentrasjonen på 4% i et minutt, reduser den deretter og hold den på 2%.
- Still inn den tilhørende feedback-kontrollerte varmeputen for å opprettholde musens kroppstemperatur ved 37 °C, og sett forsiktig inn rektalsonden for å overvåke temperaturen gjennom de kirurgiske prosedyrene.
- Påfør dekspanthenol øyesalve på begge øynene.
- Desinfiser huden og håret rundt venstre øye og øre med 70% etanol.
- Klipp hodebunnen mellom venstre øre og øyet (1 cm langt) for å eksponere skallebenet.
- Klipp og trekk tilbake temporalmuskelen for å visualisere MCA under skallen.
- Fest med lim den ytre delen av spissen holder laseren Doppler sonde / fiber på toppen av venstre MCA med lim. Lim deretter huden for å lukke såret rundt spissholderen. Påfør 2-3 dråper herderlim for å øke hastigheten på prosessen. Pass på at laseren Doppler fiber ikke er limt og lett kan fjernes fra spissholderen når som helst.
3. Forbigående MCAo-modell (okklusjon)
- Vri musen til liggende stilling. Sett snuten i anestesikjeglen og fest potene med tape.
- Desinfiser huden og håret rundt brystet og gjør et 2 cm langt midtlinje snitt i nakken.
- Bruk tang til å trekke huden og submandibulære kjertler fra hverandre. Bruk retraktorer til å holde brystomastoidmuskelen, eksponere det kirurgiske feltet og finne venstre vanlige halspulsåre (CCA). Disseker CCA fri for bindevev og omkringliggende nerver (uten å skade vagalnerven) og utfør en forbigående ligation før bifurkasjonen.
- Disseker den eksterne halspulsåren (ECA) og bind en permanent knute på den mest distale synlige delen. Plasser en ny sutur under ECA, nær bifurkasjonen, og forbered en løs knute som skal brukes senere.
- Disseker den indre halspulsåren (ICA) og legg et mikrovaskulært klips på den, 5 mm over bifurkasjonen. Pass på at du ikke skader vagalnerven.
- Klipp et lite hull i ECA mellom stramt og løs ligations; vær forsiktig så du ikke kutter hele ECA.
- Introduser filamentet og før det mot CCA. Stram den løse ligasjonen i ECA rundt lumen for å kort sikre filamentet i den posisjonen og unngå blødning når du fjerner den mikrovaskulære klipsen.
- Fjern mikrovaskulær klips og sett filamentet gjennom ICA til opprinnelsen til MCA er nådd ved å oppdage en kraftig reduksjon (>80%) i hjerneblodstrømmen målt av laseren Doppler. Fest filamentet i denne posisjonen ved å stramme knuten rundt ECA ytterligere.
MERK: Når filamentet går i riktig retning, går det jevnt frem, og ingen motstand bør overholdes. - Registrer laser Doppler verdier før og etter filament innsetting.
- Fjern retraktoren og flytt sternomastoidmuskelen og submandribulære kjertler før du suturerer såret. Fjern laser Doppler-sonden, og plasser dyret i et gjenopprettingskammer ved 37 °C i 1 time (til filamentfjerning).
4. Forbigående MCAo-modell (reperfusjon)
- Bedøv musen ved å plassere den i induksjonskammeret med en isofluranstrømningshastighet på 4% til opphør av spontan kroppsbevegelse og vibrissae.
- Påfør dekspanthenol øyesalve på begge øynene.
- Plasser musen i en utsatt posisjon i operasjonsområdet med snuten i anestesimasken. Oppretthold isoflurankonsentrasjonen på 4% i et minutt, reduser den deretter og hold den på 2%. Fest dyrets poter med tape.
- Sett laserdopplersonden inn i probeholderen.
- Fjern sår suturen, bruk tang for å trekke huden og submandibulære kjertler fra hverandre. Bruk retraktorer for å forsiktig trekke brystpikemuskelen og eksponere det kirurgiske feltet.
- Løsne ECA-suturen som strammer filamentet, og trekk forsiktig i filamentet. Unngå å skade silikongummibelegget på filamentet under fjerningen.
- Bind ECA-suturen tett.
- Bekreft økningen i hjerneblodstrømmen i laser doppler enheten (>80% av startverdien før reperfusjon).
- Ta opp laser Doppler verdier før og etter filament fjerning.
- Åpne den forbigående ligationen før bifurkasjonen fra CCA.
- Fjern retraktoren, og flytt sternomastoidmuskelen og submandribulære kjertler før du suturerer såret. Plasser dyret i et gjenopprettingskammer ved 37 °C i 1 time for å komme seg etter anestesi.
- Etter utvinning, returner musene til burene sine i et temperaturkontrollert rom.
- Ta vare på dyrene ved å legge til våtmatpellets og hydrogel i små Petri-retter på burgulvet til dag 3 etter operasjonen.
- Injiser analgesi hver 12 h i 3 d etter operasjonen (4 mg/kg Carprofen og 0,1 mg/kg Buprenorfin).
5. Sham-operasjon
- Utfør alle prosedyrer som beskrevet ovenfor, inkludert ligasjon av arteriene og innføring av filamentet (trinn 1-3.7).
- Fjern filamentet umiddelbart etter innsettingen. Plasser deretter dyret i gjenopprettingskammeret i 1 time.
- Plasser dyret i operasjonsområdet igjen, og fjern den forbigående ligasjonen av CCA for å sikre fullstendig restaurering av hjerneblodstrømmen.
- Suturer såret, og plasser dyret i et gjenopprettingskammer ved 37 °C i 1 time for å komme seg etter anestesi. Etter utvinning, returner musene til burene sine i et temperaturkontrollert rom.
- Ta vare på dyrene ved å legge til våtmatpellets og hydrogel i små Petri-retter på burgulvet til dag 3 etter operasjonen.
- Injiser analgesi hver 12 h i 3 d etter operasjonen (4 mg/kg Carprofen og 0,1 mg/kg Buprenorfin).
6. Neuroscore
- Utfør Neuroscore alltid på samme tid på dagen, og bruk kirurgiske klær for å opprettholde en "nøytral lukt" mellom individuelle kirurger.
- La musene hvile i 30 min i rommet med et "åpent" bur før testen.
- Vær oppmerksom på hvert element i tabell 1 og tabell 2 i 30 s.
7. Intrakariac perfusjon
- Forbered en 20 ml sprøyte som inneholder fosfatbufret saltvann (PBS)-heparin (2 U/ml) og plasser den 1 m over benken for å lette tyngdekraftsdrevet perfusjon. (VALGFRITT: Utfør intrakariac perfusjon med 4 % paraformaldehyd (PFA) med en 20 ml sprøyte som inneholder 4 % PFA i PBS, pH 7,4).
- Injiser intrperitoneally 100 μL ketamin og xylazin (henholdsvis 120 og 16 mg/kg kroppsvekt). Vent 5 min og bekreft opphør av spontan kroppsbevegelse og vibrissae.
- Fest dyret i en liggende stilling, og desinfiser bukkroppsoverflaten med 70% etanol.
- Lag et 3 cm langt snitt inn i magen; klipp membranen, ribbeina og brystbenet for å visualisere hjertet helt.
- Lag et lite snitt i høyre atrium, og sett perfusjonskanylene inn i venstre ventrikel.
- Perfuse med 20 ml PBS-heparin.
- Etter perfusjon, halshugge dyret og fjern hjernen.
- Frys hjernen på pulverisert tørris og oppbevar den ved -80 °C til videre bruk.
8. Infarkt
- For kryooseksjon, bruk en kryostat for å kutte hjernen i 20-μm tykke seksjoner hver 400 μm. Plasser seksjonene på lysbildene, og oppbevar lysbildene ved −80 °C til bruk.
- Cresyl fiolett (CV) farging
- Forbered fargingsløsningen ved omrøring og oppvarming (60 °C) 0,5 g CV-acetat i 500 ml H2O til krystallene er oppløst. Etter at løsningen er avkjølt, oppbevar den i en mørk flaske. Oppvarm til 60 °C og filtrer før hver bruk.
- La skliene tørke ved romtemperatur i 30 min. Fordyp dem i 95% etanol i 15 min, i 70% etanol i 1 min, og deretter i 50% etanol i 1 min.
- Senk skliene ned i destillert vann i 2 min; frisk opp det destillerte vannet og legg skliene i vannet i 1 min. Senk deretter skliene ned i den forvarmede fargeløsningen i 10 minutter ved 60 °C. Vask skliene to ganger i destillert vann i 1 min.
- Senk skliene ned i 95% etanol i 2 min. Plasser dem i 100% etanol i 5 min; oppdater 100% etanol og plasser lysbildene igjen i etanol i 2 min. Etterpå dekker du lysbildene med et monteringsmedium.
- Analyse (figur 4C)
- Skann lysbildene og analyser det indirekte infarktvolumet ved hjelp av Swanson-metoden12 for å korrigere for ødem ved hjelp av følgende formel:
(Iskemisk område) = (iskemisk region)-((ipsilateral halvkule)-(kontralateral halvkule))
- Skann lysbildene og analyser det indirekte infarktvolumet ved hjelp av Swanson-metoden12 for å korrigere for ødem ved hjelp av følgende formel:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modellen som er beskrevet her er en modifikasjon av den ofte brukte "filament" slagmodellen, som består av å introdusere en silisiumbelagt filament gjennom ECA for å midlertidig blokkere opprinnelsen til MCA (Figur 1). Etter å ha fjernet filamentet, opphøres bare blodstrømmen i ECA permanent, slik at fullstendig recanalization av CCA og ICA. Dette tillater en tilstrekkelig reperfusjon av hjernen (Figur 2), som ligner på situasjonen som observeres etter vellykket farmakologisk trombolyse eller mekanisk trombektomi hos menneskelige pasienter. Videre beskriver dette arbeidet også en metode for å måle hjerneblodstrømmen under både okklusjons- og reperfusjonsprosedyrer ved å fikse en kanyle koblet til laser Doppler-sonden ved skallen over MCA-territoriet.
Den totale dødeligheten av den kirurgiske prosedyren er <5% når den utføres av en utdannet kirurg. På tidlige tidspunkter etter MCAo presenterer dyr generelt alvorlige posturale og bevegelsesunderskudd, generell svakhet og tap i kroppsvekt13. Disse alvorlige underskuddene er forbigående, og dyrene viser forbedret aktivitet etter ca. 1 uke; Dermed er underskuddene mer spesifikke for fokale nevrologiske symptomer.
Atferdsmessige underskudd etter MCA okklusjon ble vurdert av kompositt Neuroscore14; generelt og fokusunderskudd ble målt 24 timer og 3 d etter operasjonen. Den generelle Neuroscore integrerer 5 elementer (Tabell 1), inkludert evaluering av pels, ører, øyne, holdning og spontan aktivitet, med en maksimal poengsum på 18. Fokal Neuroscore består av 7 elementer (tabell 2), inkludert evaluering av kroppssymmetri, gang, klatring, sirklende oppførsel, forbenssymmetri, obligatorisk sykling og whiskers respons, med en maksimal poengsum på 28. Den sammensatte skalaen varierer fra 0 (ingen underskudd) til 46 (alvorlige nedskrivninger). Slagdyr presenterte en betydelig endring i kompositt og fokal Neuroscore, men ikke i den generelle Neuroscore, sammenlignet med sham dyr (Figur 3).
Infarkt ble også utført ved hjelp av Cresyl Violet farging av koronal seriell hjerne seksjoner 24 h etter hjerneslag induksjon. Det infarktvolumet var 61,69 mm3, som representerer 48 % av den berørte hjernehalvøya (figur 4). Når det utføres av en utdannet kirurg, er den generelle variasjonen av denne slagmodellen lav, med en koeffisient av variasjon av <6%. Lesjonsområdet inkluderer somatosensorisk og motorisk cortex samt subkortiske strukturer som striatum (figur 4).
Figur 1: Skjema for tilgang og intraluminal MCA-okklusjon. Filamentet (stiplet linje) settes inn mellom de proksimale og distale suturknutene i ECA og fremskyndes langs ICA til den når opprinnelsen til MCA (se innfelt). Når ECA er på plass, er den ligated med en sutur for å fikse filamentet. Forkortelser: ACA = fremre cerebral arterie; BA = basilar arterie; CCA = vanlig halspulsåre; ECA = ekstern halspulsåre; ICA = intern halspulsåre; MCA = midterste cerebral arterie; PCA = bakre kommuniserende arterie; PTG = pterygopalatine arterie. Denne figuren er endret fra Jackman et al. 15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Blodstrøm under okklusjon og reperfusjon. Blodstrøm registreres før og etter filamentinnsetting og før og etter fjerning av filament. En reduksjon i blodstrømmen ble observert under okklusjonen og restaureringen av blodstrømmen under reperfusjonen. Hver farge representerer ett dyr. Forkortelser: MCA = midterste cerebral arterie; CBF = cerebral blodstrøm; A.U. = vilkårlige enheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Neuroscore for funksjonelle underskudd etter tMCAo. (A) Total, (B) fokal, og (C) generell Neuroscore før og 24 timer og 3 d etter tMCAo. Åpne barer: sham; Svarte stolper: tMCAo. n=10 per gruppe. *p < 0,05. Forkortelser: tMCAo = forbigående midt cerebral arterie okklusjon; BL = før tMCAo. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Volumetrisk infarktanalyse og infarktutfall 24 timer etter tMCAo. (A) Representativ cresylfiolett-farget koronal hjerneseksjoner hver 400 μm ved 24 timer etter tMCAo. Stiplede linjer avgrenser lesjonsområdet. (B) Analyse av infarktvolum på 10 hjerner (hver prikk som representerer en individuell hjerne) 24 timer etter tMCAo. Den vannrette røde linjen representerer gjennomsnittet (61,69 mm3), feilfelt angir standardavvik (3,78 mm3). (C) Representativt bilde for beregning av infarktvolum fra en cresylfiolett koronaldel. Blå = Kontralateral halvkule; Rød = Ipsilateral halvkule; Blek stripet område = Iskemisk region. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Tidspunkt for poengregning | score | ||
| Generell neuroscore | Hår | 0. Håret pent og rent | |
| 1. Lokalisert piloereksjon og skittent hår i 2 kroppsdeler (nese og øyne) | |||
| 2. Piloerection og skittent hår i >2 kroppsdeler | |||
| Ører (mus på en åpen benkplate) | 0. Normal (ørene strekkes sidelengs og bak, de reagerer ved å rette opp etter støy) | ||
| 1. Strukket sidelengs, men ikke bak (en eller begge), reagerer de på støy | |||
| 2. Samme som 1. NO Reaksjon på støy. | |||
| Øyne (mus på OBT) | 0. Åpne, rengjør og følg raskt omgivelsene | ||
| 1. Åpen og preget av vandig slim. Følg omgivelsene langsomt | |||
| 2. Åpen og preget av mørkt slim | |||
| 3. Ellipsoidal formet og preget av mørkt slim | |||
| 4. Stengt | |||
| Holdning (plasser musen på håndflaten og sving forsiktig) | 0. Musen står oppreist med ryggen parallelt med håndflaten. Under sving står den raskt. | ||
| 1. Musen står pukkelrygget. Under svingen flater den kroppen for å få stabilitet. | |||
| 2. Hodet eller en del av stammen ligger på håndflaten. | |||
| 3. Musen ligger på den ene siden, knapt i stand til å gjenopprette oppreist stilling. | |||
| 4. Musen ligger i en utsatt posisjon, ikke i stand til å gjenopprette oppreist stilling. | |||
| Spontaneos aktivitet (mus på OBT) | 0.Musen er våken og utforsker aktivt. | ||
| 1.Musen virker våken, men den er rolig og treg. | |||
| 2.Musen utforsker periodisk og tregt. | |||
| 3.Musen er somnolent og nummen, få bevegelser på stedet. | |||
| 4.No spontane bevegelser | |||
| Total poengsum for generell poengsum | |||
| (normal=0 maks=18) | |||
Tabell 1: Generell neuroscore. Dyr fikk mellom 0 og 4 poeng, avhengig av alvorlighetsgraden, for hvert av de fem generelle underskuddene som ble målt. Poengsummene på de forskjellige områdene legges deretter til for å gi en total generell poengsum fra 0 til 18. Denne tabellen er endret fra Clark et al.14 . Forkortelse: OBT = åpen benkeplate.
| Tidspunkt for poengregning | score | ||
| Brennvidde Neuroscore | Kroppssymmetri (mus på OBT, observere nesehalelinjen) | 0. Normal (Kropp: normal holdning, stamme forhøyet fra benken, med for- og bakben som lener seg under kroppen. Hale: rett) | |
| 1. Svak asymmetri (Kropp: lener seg på den ene siden med for- og bakben som lener seg under kroppen. Hale: litt bøyd) | |||
| 2. Moderat asymmetri (Kropp: lener seg på den ene siden med for- og bakben strukket ut. Hale: litt bøyd) | |||
| 3. Fremtredende asymmetri (Kropp: bøyd, på den ene siden ligger på OBT. Hale: bøyd) | |||
| 4. Ekstrem asymmetri (Kropp: svært bøyd, på den ene siden ligger hele tiden på OBT. Hale: svært bøyd) | |||
| Gang (mus på OBT. Observert uforstyrret) | 0. Normal (gang er fleksibel, symmetrisk og rask) | ||
| 1. Stiv, ufleksibel (humpbacked walk, langsommere enn vanlig mus) | |||
| 2. Limping, med asymmetriske bevegelser | |||
| 3. Skjelving, drifting, fallende | |||
| 4. Går ikke spontant (når det stimuleres ved å forsiktig skyve musen går ikke lenger enn 3 trinn) | |||
| Klatring (mus på en 45o overflate. Plasser musen i midten av gripeflaten) | 0. Normal (musen klatrer raskt) | ||
| 1. Klatrer med belastning, lem svakhet tilstede | |||
| 2. Holder fast i skråningen, glir ikke eller klatrer | |||
| 3. Sklier ned skråning, mislykket innsats for å forhindre feil | |||
| 4. Lysbilder umiddelbart, ingen anstrengelse for å forhindre feil | |||
| Sirklende oppførsel (mus på OBT, fri observasjon) | 0. Fraværende sirklende oppførsel | ||
| 1. Overveiende svinger på en side | |||
| 2. Sirkler til den ene siden, men ikke hele tiden | |||
| 3. Sirkler hele tiden til den ene siden | |||
| 4. Dreie, svinge eller ingen bevegelse | |||
| Forbenssymmetri (mus suspendert av hale) | 0. Normal | ||
| 1. Lett asymmetri: mild fleksjon av kontralateral forben | |||
| 2. Merket asymmetri: markert fleksjon av kontralateral lem, kroppen bøyer seg litt på den ipsilaterale siden | |||
| 3. Fremtredende asymmetri: kontralateral forben fester seg til bagasjerommet | |||
| 4. Svak asymmetri, ingen kropps-/lembevegelse | |||
| Obligatorisk sirkler (forben på benk, bakben suspendert av halen: det avslører tilstedeværelsen av den kontralaterale lem parese) | 0. Fraværende. Normal forlengelse av begge forbenene | ||
| 1. Tendens til å vende seg til den ene siden (musen strekker seg begge forbenene, men begynner å dreie helst til den ene siden) | |||
| 2. Sirkler til den ene siden (musen vender mot den ene siden med en langsommere bevegelse sammenlignet med sunne mus) | |||
| 3. Dreier til den ene siden tregt (musen vender mot den ene siden unnlater å utføre en komplett sirkel) | |||
| 4. Går ikke frem (den fremre delen av stammen ligger på benken, langsomme og korte bevegelser) | |||
| Whisker respons (mus på OBT) | 0. Normal | ||
| 1. Lett asymmetri (musen trekker seg sakte tilbake når den stimuleres på den kontralaterale siden) | |||
| 2. Fremtredende asymmetri (ingen respons når den stimuleres til den kontralaterale siden) | |||
| 3. Fraværende respons kontralateralt, langsom respons når stimulert ipsilateralt | |||
| 4. Fraværende respons bilateralt | |||
| Samlet skår for fokusunderskudd | |||
| (normal=0 maks=28) | |||
Tabell 2: Fokal Neuroscore. Dyr fikk mellom 0 og 4 poeng avhengig av alvorlighetsgraden for hvert av de syv generelle underskuddene som ble målt. Poengsummene på de forskjellige områdene legges deretter til for å gi en total fokal poengsum fra 0 til 28. Denne tabellen er endret fra Clark et al.14 . Forkortelse: OBT = åpen benkeplate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende protokollen beskriver en eksperimentell slagmodell basert på konsensusavtalen til et tysk multisenter forskningskonsortium ("ImmunoStroke") for å etablere en standardisert forbigående MCAo-modell. Den forbigående MCAo-modellen etablert ved å introdusere en silisiumbelagt filament gjennom ECA til opprinnelsen til MCA er en av de mest brukte slagmodellene for å oppnå arteriell reperfusjon etter en avgrenset okklusjonsperiode. Derfor kan denne prosedyren betraktes som en translasjonelt relevant slagmodell.
"Filamentmodellen" som presenteres i videoen har noen fordeler sammenlignet med andre tidligere beskrevne slagmodeller, for eksempel å ikke kreve kraniotomi og oppnå fullstendig reperfusjon av forbigående det okkluderte fartøyet. Imidlertid kan kompleksiteten i det kirurgiske inngrepet betraktes som en begrensning, da det inkluderer invasiv kirurgi og en presis manipulering av de forskjellige arteriene i nærheten av luftrøret og vagalnerven. Den lange eksponeringen av dyret for bedøvelse kan også være en kritisk faktor å vurdere, da virkningen av bedøvelse på nevrobeskyttelse og slagutfall allerede er godt dokumentert16. Til slutt, til tross for kompleksiteten i denne kirurgiske prosedyren, kan den fullføres på ca. 20 minutter når den utføres av en utdannet kirurg.
I motsetning til de tidligere beskrevne "filament" slagprotokollene17, metoden beskrevet her tillater også måling av cerebral blodstrøm under okklusjons- og reperfusjonsfasene. Blodstrømsovervåking under reperfusjon kan være en viktig parameter for å forhindre slagregenereringsskade18, som er kjent for å forårsake skadelige konsekvenser hos pasienter som gjennomgår farmakologiske eller endovaskulære intervensjoner for recanalization av trombosede kar. Til tross for uoverensstemmelsene mellom konsekvensene av cerebral blodstrømsrestaurering etter MCAo19, kan variasjonen av blodstrømsrestaurering etter hjerneslag påvirke de patofysiologiske og biokjemiske hendelsene i hjernen, samt det infarktvolumet og de nevrologiske underskuddene til slagmus20. Derfor, i denne modellen, er fullstendig restaurering av blodstrømmen og dens registrering krav for å sikre reproduserbare infarkter blant mus, spesielt i translasjonelle slagstudier.
Den totale dødeligheten under kirurgisk prosedyre er mindre enn 5% og skyldes hovedsakelig bedøvelseskomplikasjoner, blødninger eller offer på grunn av forhåndsdefinerte eksklusjonskriterier. Denne slagmodellen presenterer imidlertid en moderat dødelighet i løpet av de første 24-48 h etter hjerneslaginduksjon, noe som kan øke antall dyr som trengs per eksperiment for å oppnå en tilstrekkelig kohort av slagmus. Når det gjelder infarktvolum, induserer denne modellen store infarkter, med lesjoner som omfatter opptil 50% av halvkule. Det produserer også hjerneødem, som påvirker forskjellige hjerneregioner, inkludert kortikale og subkortiske regioner.
For å oppnå lav variasjon og høy reproduserbarhet av slagmodellen, bør det tas hensyn til flere eksklusjonskriterier, inkludert: 1) driftstid > 20 min; 2) >20% av blodstrømsreduksjonen når CCA er ligated (trinn 3.3); 3) reduksjon av blodstrømmen under okklusjon < 80% av den opprinnelige pre-okklusjonsverdien; og 4) blodstrømmen øker 10 min etter reperfusjonshastighet <80% sammenlignet med pre-reperfusjonsverdien. For en erfaren og trent kirurg er ingen dyr utelukket på grunn av operasjonstidskriteriet. Imidlertid viser 10-15% av dyrene en 20% reduksjon i blodstrømmen ved CCA-ligasjon, og 5-10% viser ingen tilstrekkelig reduksjon eller økning i blodstrømmen under henholdsvis okklusjon eller reperfusjon. Derfor er suksessraten etter å ha ekskludert dyr basert på disse kriteriene ca. 75-85%.
I tillegg undersøkes dyr daglig etter MCAo (kroppsvekt, temperatur og grunnleggende fysiologisk oppførsel) for å kontrollere for sykdom, smerte eller ubehagsadferd. I tillegg til denne generelle omsorgen er flere tester utviklet for spesifikk atferdsanalyse etter fokal hjerne iskemi, til tross for alle kjente tester for å evaluere sensorimotorisk dysfunksjon, for eksempel Rotarod-testen21, Sticky label test22, Corner test23eller Sylindertest24. Her ble dyr valgt for etablering av denne slagmodellen evaluert for fokus og generelle underskudd, siden filamentmodellen også induserer cytokin-sykdomsadferd uavhengig av fokal (sensorisk eller motorisk) underskudd25. Samlet sett er "filament" slagmodellen beskrevet her en verdifull modell for grunnleggende og translasjonell slagforskning. Denne modellen foreslås som en standardisert slagmodell som skal brukes til å harmonisere slagmodeller på tvers av laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker alle våre samarbeidspartnere i ImmunoStroke Consortia (FOR 2879, Fra immunceller til hjerneslaggjenoppretting) for forslag og diskusjoner. Dette arbeidet ble finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands Excellence Strategy innenfor rammen av München Cluster for Systems Neurology (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) og under tilskuddene LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 og LL-112/1-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
References
- Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M.
- O'Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Zhang, Z., et al. A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 17 (2), 123-135 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- McNutt, M.
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2084-2097 (2017).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Jackman, K., Kunz, A., Iadecola, C. Modeling focal cerebral ischemia in vivo. Methods in Molecular Biology. 793, 195-209 (2011).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4038 (2012).
- Rha, J. H., Saver, J. L. The impact of recanalization on ischemic stroke outcome: a meta-analysis. Stroke. 38 (3), 967-973 (2007).
- Liu, J., et al. Transient filament occlusion of the middle cerebral artery in rats: does the reperfusion method matter 24 hours after perfusion. BMC Neuroscience. 13, 154 (2012).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 259 (2), 211 (1968).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4 (10), 1560-1564 (2009).
- Zhang, L., et al. A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia. Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 207-214 (2002).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).
- Roth, S., Yang, J., Cramer, J., Malik, R., Liesz, A. Detection of cytokine-induced sickness behavior after ischemic stroke by an optimized behavioral assessment battery. Brain, Behavior, and Immunity. 91, 668-672 (2021).
