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Preparación de membrana plasmática a pequeña escala para el análisis de Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Published: June 13, 2021 doi: 10.3791/62592
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 3, 1
1Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry, University of Otago, 2Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, 3School of Biological Sciences, University of Auckland
* These authors contributed equally

Summary

Este artículo presenta un protocolo de aislamiento de membrana plasmática a pequeña escala para la caracterización de la proteína Cdr1 cdr1 de Candida albicans ABC (casete de unión a ATP), sobreexpresada en Saccharomyces cerevisiae. Se diseñó una doble etiqueta mGFPHis C-terminal escindible con una etiqueta doble de 16 residuos entre Cdr1 y la etiqueta para facilitar la purificación y la detección de detergente de Cdr1.

Abstract

El éxito de la caracterización bioquímica y biofísica de los transportadores ABC depende en gran medida de la elección del sistema de expresión heteróloga. En las últimas dos décadas, hemos desarrollado una plataforma de expresión de proteínas de membrana de levadura que se ha utilizado para estudiar muchas proteínas importantes de membrana fúngica. El huésped de expresión Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ se elimina en siete transportadores ABC endógenos principales y contiene el factor de transcripción Pdr1-3 con una mutación de ganancia de función que permite la sobreexpresión constitutiva de genes de proteínas de membrana heterólogas integradas de manera estable como copias individuales en el locus genómico PDR5. La creación de vectores plásmidos versátiles y la optimización de estrategias de clonación en un solo paso permiten la clonación, mutagénesis y expresión rápidas y precisas de transportadores ABC heterólogos. Aquí, describimos el desarrollo y el uso de una nueva etiqueta doble mGFPHis escindible con proteasa (es decir, la proteína fluorescente verde mejorada con levadura monomérica yEGFP3 fusionada a una etiqueta de purificación de afinidad de seis histidinas) que fue diseñada para evitar la posible interferencia de la etiqueta con la proteína de interés y para aumentar la eficiencia de unión de la etiqueta His a las resinas de afinidad de níquel. La fusión de mGFPHis a la proteína de membrana ORF (marco de lectura abierto) permite una fácil cuantificación de la proteína mediante la inspección de geles de poliacrilamida y la detección de productos de degradación conservando la etiqueta mGFPHis. Demostramos cómo esta característica facilita el cribado con detergente para la solubilización de proteínas de membrana. Se presenta un protocolo para el aislamiento eficiente, rápido y confiable de las preparaciones de membrana plasmática a pequeña escala del transportador de eflujo multifármaco Cdr1 marcado con C-terminalmente marcado como Candida albicans Cdr1 sobreexpresado en S. cerevisiae ADΔΔ. Este protocolo de aislamiento de membranas plasmáticas a pequeña escala genera membranas plasmáticas de alta calidad en un solo día laborable. Las preparaciones de membrana plasmática se pueden utilizar para determinar las actividades enzimáticas de las variantes mutantes Cdr1 y Cdr1.

Introduction

La extracción de proteínas de membrana integral de su entorno lipídico nativo puede afectar dramáticamente su estructura y función1,2,3,4. La compleja composición lipídica de las membranas biológicas5 asegura que puedan ocurrir interacciones proteína-lípido de importancia crítica6. Los lípidos mantienen la integridad estructural de las proteínas de membrana, lo que les permite funcionar correctamente en su(s) destino(s) compartimental(es) de membrana7,8. Por lo tanto, un primer paso crítico en la purificación de proteínas de membrana es la extracción de la proteína de su entorno nativo sin afectar su estructura y / o función.

Existen muchos obstáculos para caracterizar la estructura de las proteínas de membrana, la mayoría de los cuales están relacionados con su naturaleza hidrofóbica, y las dificultades de expresar proteínas de membrana correctamente plegadas y funcionales en las cantidades requeridas para la cristalografía de rayos X o la microscopía crio-electrónica (crio-EM)9,10,11,12. Existen tres tipos de sistemas de expresión de proteínas de membrana:homólogos 9,heterólogos13,14,15y sistemas de expresión in vitro 16,17. Los niveles de expresión a menudo bajos, o los costos prohibitivos, de muchos sistemas de expresión dejan solo unos pocos huéspedes como la opción preferida para producir proteínas de membrana. Incluyen el huésped bacteriano, Escherichia coli,las levaduras S. cerevisiae y Pichia pastoris,y eucariotas superiores como las células de insectos Sf9 o las líneas celulares de mamíferos18. Todas las tecnologías de expresión de proteínas de membrana tienen ventajas y desventajas; sin embargo, S. cerevisiae es quizás el organismo modelo eucariota mejor estudiado adecuado para la producción de proteínas de membrana. Es altamente versátil con aplicaciones en ingeniería genética, descubrimiento de fármacos, biología sintética y la expresión de proteínas de membrana eucariota14,19,20,21.

En este estudio, se utilizó una tecnología patentada de expresión de proteínas de membrana S. cerevisiae 21, con S. cerevisiae ADΔ14 y ADΔΔ22 como los huéspedes preferidos(Figura 1A),para sobreexpresar y estudiar la principal bomba de eflujo multifármaco de C. albicans Cdr1. Ambas cepas de S. cerevisiae son derivados de AD1-8u-23 que tienen los genes ura3 (ADΔ) o ura3 e his1 (ADΔΔ) eliminados para eliminar cualquier falso positivo de uracilo o prototrofo de histidina que surja a través de la integración no deseada en los loci genómicos URA3 o HIS1. La eliminación de las 7 principales bombas de eflujo multifármaco23,indicadas en la Figura 1A, hace que ADΔΔ sea exquisitamente sensible a la mayoría de los xenobióticos. El factor de transcripción mutante de ganancia de función Pdr1-3 causa la sobreexpresión constitutiva de proteínas de membrana heterólogas como Cdr1 (octógonos rojos en la Figura 1A)después de la integración del casete de transformación heterólogo-ORF -contiene (Figura 1A) en el locus genómico PDR5 (rectángulo azul en la Figura 1A) a través de dos eventos de recombinación homólogos. La localización adecuada de la membrana plasmática de las proteínas marcadas con C-terminal mGFPHis se puede confirmar mediante microscopía confocal(Figura 1A),y la etiqueta His se puede utilizar para la purificación de afinidad de níquel de la proteína marcada. Sin embargo, la clonación de algunos transportadores de ABC fúngicos (por ejemplo, Candida krusei ABC1)en plásmidos derivados de pABC3 no fue posible porque no pudieron propagarse en Escherichia coli debido a la toxicidad celular. Esto provocó el desarrollo de la clonación de un solo paso de proteínas de membrana14,24 etiquetadas en su terminal N o C con varias etiquetas de afinidad, epítopo o reportero directamente en S. cerevisiae ADΔΔ(Figura 1C). S. cerevisiae Las cepas ADΔΔ que sobreexpresan varios mutantes CDR1 también se pueden crear de manera eficiente mediante el uso de hasta cinco fragmentos individuales de PCR que se superponen en 25 pb(Figura 1C). Empleando este protocolo, muchos ORF de interés pueden ser clonados, expresados y caracterizados a bajo costo y con alta eficiencia en un lapso de tiempo muy corto. La eficiencia de transformación se reduce solo ~ 2 veces con cada fragmento de PCR adicional. 

Si se desea, los niveles de expresión también pueden manipularse fácilmente mediante el diseño de imprimación para ajustar de manera predecible los niveles de expresión a cualquier lugar entre el 0,1% y el 50% de los niveles de expresión constitutiva generalmente altos25. El vector de clonación derivado pABC314 optimizado, multifuncional, pABC3-XLmGFPHis26 (Figura 1B) contiene un sitio de escisión de la proteasa HRV-3C (X; LEVLFQ| GP), una proteasa que funciona mejor a 4 °C que la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) de uso frecuente27. L es un enlazador de cinco aminoácidos (GSGGS), mGFP es un mutante monomérico (A206K)28,29 versión de la variante de proteína de fluorescencia verde mejorada por levadura yEGFP330,y el suyo es un enlazador de tres aminoácidos (GGS) seguido de la etiqueta de purificación de proteína de afinidad de níquel de seis histidinas (HHHHHH).

Esta tecnología de expresión se ha utilizado con éxito en el descubrimiento de fármacos y el estudio de proteínas de membrana. La primera estructura para un fármaco azol fúngico diana, S. cerevisiae Erg1131, se resolvió utilizando esta tecnología. También permitió la caracterización detallada de C. albicans Cdr132 , 33,34y la creación de una molécula de Cdr1 deficiente en cisteína35 adecuada para estudios de reticulación de cisteína para verificar cualquier estructura futura de alta resolución. Muchos otros transportadores ABC de los principales patógenos fúngicos humanos (es decir, C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei y el complejo de especies Fusarium solani) también se han estudiado en detalle utilizando esta plataforma de expresión24,36,37,38,39. Esto ha permitido la generación de un panel de cepas de S. cerevisiae que sobreexpresan bombas de eflujo que se ha utilizado en pantallas de alto rendimiento para descubrir el nuevo sustrato de bomba de eflujo fluorescente Rojo del Nilorojo 40 y específico41 y de amplio espectro14,33,42,43,44 inhibidores de la bomba de eflujo. El uso de este sistema también permitió el descubrimiento de la clorgirina como el primer inhibidor de la bomba de eflujo multifármaco fúngico de amplio espectro de su tipo42.

La solubilización completa de las proteínas de membrana y la creación de una preparación homogénea de proteína-micela de membrana desprovista de lípidos endógenos, requiere altas concentraciones de detergente45. Pero desafortunadamente, esto también a menudo inactiva la proteína de membrana5,8,45,46. Las propiedades de los monómeros detergentes y su agregación en solución se ven afectadas por las propiedades físicas de la cola hidrofóbica, la longitud y ramificación de la cadena alquilo, la presencia de un núcleo aromático o cadena lateral de fluoroalquilo, o el número de unidades de polioxietileno. Por lo tanto, el cribado de detergente es un primer paso importante para determinar el detergente más adecuado para la solubilización y purificación de proteínas de membrana.

C. albicans es un importante patógeno fúngico humano de individuos inmunocomprometidos que puede causar infecciones invasivas graves y potencialmente mortales47, y puede volverse resistente a los medicamentos antimicóticos azoles48,49. Uno de los principales mecanismos de la resistencia a múltiples medicamentos de C. albicans es la sobreexpresión de Cdr150,que es untransportador de casete de unión a ATP (ABC) tipo II de la subfamilia ABCG ubicado en la membrana plasmática. Los transportadores ABCG fúngicos de tamaño completo (que consisten en dos dominios de unión a nucleótidos [NBD] y dos dominios transmembrana [TMD]) se conocen más comúnmente como transportadores de resistencia a medicamentos pleiotrópicos (PDR) y se caracterizan por su topología única de dominio invertido [NBD-TMD]2. Los transportadores PDR solo se encuentran en las plantas52,53 y hongos54. A pesar de su importancia, no hay estructuras para los transportadores PDR, aunque recientemente se han resuelto estructuras para transportadores ABCG humanos de tamaño medio, lo que ayudó a crear el primer modelo tentativo para Cdr133. Nuestra evidencia experimental reciente sugiere, sin embargo, que este modelo es defectuoso posiblemente porque los transportadores de PDR de hongos tienen NBD asimétricos característicos que resultan muy posiblemente en un mecanismo de transporte único. Por lo tanto, se requiere una estructura de alta resolución de Cdr1 tanto para el diseño racional de nuevos inhibidores de la bomba de eflujo que puedan ayudar a superar la resistencia a los medicamentos mediados por el eflujo, como para proporcionar información sobre el mecanismo de acción de esta importante familia de transportadores ABC.

El objetivo de este estudio fue desarrollar protocolos fiables para la expresión, solubilización y purificación de Cdr1 en el huésped de expresión de S. cerevisiae modificado genéticamente, con el objetivo final de obtener una estructura de alta resolución para Cdr1. Como parte de este proceso, se diseñó una doble etiqueta mGFPHis escindible con proteasa(Figura 1B)con un enlazador de 16 residuos que separa la etiqueta del extremo C de Cdr1, lo que mejoró la unión de la etiqueta de afinidad 6x His adjunta a la resina de afinidad de níquel y permitió el monitoreo de los niveles de expresión de Cdr1 en células vivas y durante todo el proceso de purificación. También se desarrolló un protocolo reproducible para preparaciones de proteínas de membrana plasmática de levadura a pequeña escala que contienen aproximadamente un 10% de C. albicans Cdr1 (según lo estimado por la tinción de Coomassie después de SDS-PAGE), que podría usarse para la caracterización bioquímica de Cdr1.

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Protocol

1. Preparación de existencias frescas o congeladas de células ADΔ y ADΔΔ competentes para la transformación

  1. Inocular 25 ml de 2x YPCD [es decir, 2x YPD; 2% (p/v) de extracto de levadura, 2% (p/v) de peptona, 4% (p/v) dextrosa), 0,079 % (p/v) CSM (mezcla completa de suplemento)]35 medio con una sola colonia de levadura e incubar durante la noche (o/n) durante 16 h a 30 °C con agitación a 200 revoluciones por minuto (rpm).
  2. Inocular 225 mL de 2x medio YPCD con el cultivo de 25 mL o/n y comprobar la densidad óptica celular a 600 nm (OD600); el OD600 suele ser ~0.5-1.0.
    NOTA: En esta etapa, asegúrese de que todos los materiales necesarios para el siguiente experimento de transformación estén fácilmente disponibles.
  3. Cultive el cultivo a 30 °C durante otras ~6-8 h con agitación a 200 rpm hasta que la densidad celular alcance un OD600 de ~6-8.
    NOTA: Los siguientes pasos se realizan a temperatura ambiente (RT) a menos que se indique lo contrario.
  4. Cosechar estas células de fase logarítmica por centrifugación a 3.000 x g durante 3 min.
  5. Resusped las células y lávelas dos veces con agua estéril de doble destilación (ddH2O; es decir, 200 ml y luego 20 ml).
  6. Cosecha las células a 3.000 x g durante 3 min.
  7. Lentamente (es decir, agregue 30 alícuotas iguales de solución de células competentes congeladas (FCC) cada minuto durante 30 minutos) resuspenda el pellet celular en X ml de FCC [5% (p/v) glicerol, 10% (v/v) dimetilsulfóxido (DMSO)] en hielo (donde X = OD600;por ejemplo, si OD600 = 6 resuspend en 6 mL, o si OD600 = 3 resuspend en 3 mL).
    NOTA: La composición correcta de FCC es fundamental para el éxito de la transformación.
  8. Mantenga las células en hielo durante 2 h antes de la transformación o guarde las alícuotas a -80 °C hasta que sea necesario.
    NOTA: Las células ADΔ y ADΔΔ son muy sensibles a la congelación. Por lo tanto, las células deben enfriarse lentamente a -80 ° C: coloque tubos de microcentrífuga helados que contengan alícuotas de células de 50-600 μL en una caja de almacenamiento de plástico (RT). Coloque la caja en un recipiente de poliestireno (RT) más grande y cierre el recipiente con una tapa de poliestireno adecuada. Luego, coloque el recipiente en el congelador de -80 ° C.
    PRECAUCIÓN: La congelación lenta es fundamental para la supervivencia celular.

2. Transformación de ADΔ y ADΔΔ con CaCDR1-XLmGFPHis y confirmación de los transformadores correctos mediante PCR de colonias y secuenciación de ADN

NOTA: El plásmido pABC3-CDR1-mGFPHis fue creado utilizando estrategias de clonación convencionales descritas en detalle en Lamping et al., 201055 y se ilustra en la Figura 1B. C. albicans CDR1 de tipo salvaje se aisló como un fragmento de PacI /NotI del plásmido pABC3-CaCDR1A-GFP14 y se clonó en pABC3-XLmGFPHis26.

  1. La PCR amplifica todo el casete de transformación CDR1 con una ADN polimerasa de alta fidelidad y un par de cebadores PDR5-pro/PDR5-ter35 utilizando 1-10 ng de pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis como plantilla de ADN o, alternativamente, digerir 2 μg de pABC3-CaCDR1-XLmGFPSa hasta completar con la enzima de restricción de 10 U AscI a 37 °C (Figura 1A,B).
    NOTA: El casete de transformación CDR1 (Figura 1A)comprende el promotor PDR5 - CaCDR1-mGFPHis - terminador PGK1 - marcador de selección URA3 - pdr5 región descendente.
  2. Realice la electroforesis en gel de agarosa y extraiga en gel el cassette de transformación de ~8 kb.
    NOTA: La purificación en gel del cassette de transformación CaCDR1 de ~8 kb elimina cualquier posible ADN plásmido no digerido, lo que podría conducir a transformadores incorrectos que tienen todo el plásmido, en lugar del cassette de transformación lineal, integrado en el locus genómico PDR5.
  3. Desnaturalizar la cantidad requerida de ADN portador de esperma de salmón (2 mg / ml; 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7.5) durante 10 minutos en un baño de agua hirviendo y mantener en hielo. Use tubos tapados con tornillo para hervir el ADN del esperma de salmón para evitar la apertura de la tapa.
  4. Mezcle 50 μL de ADN de espermatozoides de salmón desnaturalizos con 14 μL del cassette de transformación (500-2,000 ng) y mantenga los 64 μL de mezcla de ADN en hielo hasta su uso posterior.
    NOTA: Utilice 10 ng de un plásmido lanzadera de levadura E. coli(por ejemplo, pYES2) como control de transformación positiva(Figura 2B).
  5. Resuspónda de células competentes frescas o congeladas descongeladas rápidamente durante 5 min en un baño de agua a 30 °C y divídalas en alícuotas de 50 μL en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
  6. Cosechar células por centrifugación durante 1 min en una microfuge a velocidad máxima (18.000 x g).
  7. Retire el sobrenadante y mantenga la bolita celular en RT.
  8. Para cada transformación, mezcle combinaciones de 296 μL (RT) de 260 μL de polietilenglicol al 50% (p/v) (PEG 3350) y 36 μL de acetato de litio de 1 M (LiAc), mediante pipeteo repetido, con los 64 μL apropiados de mezclas de ADN heladas.
  9. Añadir la mezcla apropiada inmediatamente a una alícuota de pellet celular competente de 50 μL.
  10. Resuspend el pellet celular en los 360 μL de mezcla PEG-LiAc-DNA mediante el vórtice completo durante unos 30 s.
  11. Incubar la mezcla celular en un baño de agua a 30 °C durante 1 h.
    NOTA: Las células ADΔ y ADΔΔ se transforman mejor a 30 °C que a 42 °C35.
  12. Cosecha las células a 18.000 x g durante 10 s. Deseche el sobrenadante y vuelva a colocar el pellet celular en 80 μL de ddH2O.
  13. Extienda las células en una placa de agar CSM-URA35 [es decir, 0.67% (p/ v) base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos, 0.077% (p/ v) CSM menos uracilo, 2% (p / v) glucosa y 2% (p / v) agar].
  14. Incubar las placas durante 2-3 días a 30 °C hasta que los transformadores prototrofos de uracilo sean claramente visibles.
    NOTA: Espere ~ 100 transformadores por μg del casete de transformación lineal ~8 kb CaCDR1 y ~4 x 104 transformadores por μg pYES2.
  15. Elija cinco transformadores independientes y extiéndalos en una placa CSM-URA fresca para separar los transformadores prototrofos de uracilo de los restos de células huésped no transformadas.
  16. Elimine cualquier posible mutante pequeño cultivando los transformadores en placas de agar YPG [1% (p/v) de extracto de levadura, 2% (p/v) de peptona, 2% (v/v) de glicerol y 2% (p/v) de agar](Figura 2D).
    NOTA: Los mutantes pequeños tienen mitocondrias defectuosas y, por lo tanto, no pueden crecer en fuentes de carbono no fermentables. Son bastante comunes en S. cerevisiae56. S. cerevisiae ADΔ y ADΔΔ son particularmente propensos a adquirir el fenotipo pequeño.
  17. Realice pcr de colonias de levadura y confirme que al menos tres transformadores independientes se integran correctamente en el locus genómico PDR5 (Figura 1C)amplificando todo el casete de transformación CaCDR1 de ~ 8 kb con una ADN polimerasa específica que está optimizada para amplificar productos de PCR a partir de fuentes de plantillas de ADN impuras. Utilice un conjunto de cebadores que se unan justo fuera del sitio de integración y alícuotas de 1 μL de suspensiones celulares (en ddH2O) derivadas de colonias individuales como plantillas de ADN.
    NOTA: Esta ADN polimerasa en particular amplifica de manera confiable ~ 8 kb fragmentos de PCR de células de levadura intactas. Sin embargo, para una amplificación confiable, se requieren 45 ciclos de PCR, y las células de levadura deben resuspendérse a OD600 1-10 en ddH2O.
  18. Confirme el producto de amplificación de PCR correcto de ~ 8 kb mediante electroforesis en gel de agarosa de ADN de una porción de 1 μL de la reacción de PCR.
  19. Elimine el exceso de cebadores de amplificación de una porción de 10 μL de la reacción de PCR con una mezcla enzimática de una exonucleasa de ADN de una sola cadena y una fosfatasa siguiendo las instrucciones del fabricante antes de secuenciar todo el ORF utilizando porciones de la muestra de ADN tratada con los cebadores apropiados.

3. Protocolo de aislamiento de membrana plasmática de levadura a pequeña escala

  1. Células de levadura en crecimiento
    1. Precultra una sola colonia de levadura en 10 mL de YPD a 30 °C durante ~7-8 h con agitación a 200 rpm.
    2. Inocular 40 mL de medio YPD con el preculto de 10 mL e incubar las células a 30 °C o/n (~16 h) con agitación a 200 rpm hasta que la densidad celular alcance un OD600 de 1-3.
  2. Cosecha de células de levadura
    1. Cosechar 40 unidades OD (ODU; por ejemplo, 1 mL a un OD600 de 1 = 1 ODU) de células de fase logarítmica a 4.200 x g durante 5 min a 4 °C.
    2. Resusped y lave las células dos veces con ddH2O estéril helada (es decir, 40 ml y luego 1 ml; cosechar las células entre pasos por centrifugación a 4.200 x g durante 5 min a 4 °C).
    3. Vuelva a colocar el pellet en 1 ml de ddH2O estéril helado y transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml preenfriado (sobre hielo).
    4. Cosechar células a 3.300 x g durante 3 min a 4 °C.
    5. Aspirar el sobrenadante.
    6. Resusped el pellet celular en tampón homogeneizador de 0,5 ml [HB; 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20% (v/v) glicerol; pH 7,5] recién suplementado con 1 mM de fenilmetilsulfonilo fluoruro (PMSF).
      NOTA: Siempre agregue PMSF fresco porque PMSF se inactiva rápidamente al exponerse al agua.
      PRECAUCIÓN: PMSF es un inhibidor de la serina proteasa, que es extremadamente corrosivo y destructivo para los tejidos. Puede causar daño ocular irreversible.
    7. Guarde la suspensión celular a -80 °C o úselo inmediatamente.
  3. Aislamiento de membranas plasmáticas
    1. Si está congelado, descongele las células en hielo durante ~ 1 h.
    2. Agregue perlas de sílice heladas de 0,5 mm de diámetro a la suspensión de celda de 0,5 ml para alcanzar un volumen total de 1 ml.
    3. Romper celdas con 6 ciclos de vórtice a máxima intensidad de agitación durante 1 min intercalado con períodos de enfriamiento de 3 min sobre hielo.
    4. Haga un agujero delgado en la parte inferior del tubo con una cuchilla de bisturí calentada.
    5. Recoja el homogeneizado de células rotas a través de la parte inferior del tubo instalado en otro tubo de microcentrífuga de 1,5 ml helado con un giro de baja velocidad de 10 s (~ 200 rpm).
      NOTA: Esto asegura que las perlas de sílice permanezcan en el tubo original.
    6. Centrifugar la célula homogeneizar a 5.156 x g durante 5 min a 4 °C para eliminar restos celulares, células intactas y núcleos.
    7. Transfiera 450 μL de sobrenadante a un tubo de microcentrífuga helado de 1,5 ml y agregue 1 ml adicional de HB helada complementada con PMSF fresco (1 mM).
      NOTA: Este paso de dilución es crítico para la recuperación de proteínas de membrana plasmática de alta calidad.
    8. Cosechar membranas plasmáticas a 17.968 x g durante 1 h a 4 °C y resuspender el pellet de membrana plasmática, mediante pipeteo repetido, en 100 μL de HB recién suplementado con 1 mM PMSF. Afloje el pellet celular para una homogeneización adecuada de la membrana plasmática agitando el pellet celular con la punta de la pipeta de 100 μL antes de liberar los 100 μL de HB y el pipeteo hacia arriba y hacia abajo.
    9. Mida la concentración de proteínas de la preparación de la membrana plasmática con un kit de ensayo de proteínas que sea compatible con tampones que contengan agente reductor y detergente.
    10. Guarde las membranas plasmáticas a -80 °C o manténgalos en hielo para su uso inmediato.

4. Electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE)

  1. Ensamble el aparato para preparar geles de poliacrilamida.
  2. Para dos geles separadores (poliacrilamida al 7%) mezclar 2,1 ml de acrilamida al 40%/bisacrilamida, 3 ml de tampón separador 4x (1,5 M Tris, dodecil sulfato de sodio al 0,4% [SDS] (p/v); pH 8,8) y 6,9 ml de ddH2O. Añadir 8 μL de tetrametilendiamina (TEMED) y 60 μL de persulfato de amonio al 10% (APS) para iniciar la polimerización de la acrilamida.
    PRECAUCIÓN: La acrilamida/bis-acrilamida es muy tóxica. Causa irritación de la piel, neuropatía periférica y es un carcinógeno. TEMED es perjudicial si se ingiere o inhala. APS es perjudicial si se ingiere. Causa irritaciones graves en los ojos y la piel.
  3. Vierta ~ 4-5 ml de esta mezcla en el aparato de gel ensamblado, hasta ~ 2 cm desde la parte superior.
  4. Coloque cuidadosamente ~ 1-2 ml de 0.1% SDS en la parte superior para crear un menisco plano.
  5. Deje que la poliacrilamida se establezca durante ~ 60 minutos en RT.
  6. Prepare una mezcla de gel de apilamiento para dos geles mezclando 0.5 mL de acrilamida al 40% / bis-acrilamida, 1 mL de tampón de apilamiento 4x (0.5 M Tris, 0.4% SDS (p/ v); pH 6.8) y 6.9 mL de ddH2O. Agregue 2 μL de TEMED y 30 μL de APS al 10% para iniciar la polimerización de acrilamida.
  7. Retire la capa de SDS al 0,1% del gel separador polimerizado y enjuague con ddH2O para eliminar los rastros de SDS.
  8. Vierta la mezcla de gel de apilamiento sobre el gel de separación.
  9. Coloque un peine en el gel de apilamiento y retire las burbujas de aire de alrededor del peine.
  10. Deje que el gel de apilamiento se establezca durante ~ 60 minutos en RT.
  11. Retire el peine y enjuague las ranuras de gel con agua. Coloque el gel en el tanque de gel y llene el tanque de gel hasta la parte superior con 1x tampón de funcionamiento (24.8 mM Tris, 190 mM de glicina, 0.1% SDS).
    NOTA: Prepare 1x búfer en ejecución a partir de un buffer stock 10x (248 mM Tris, 1,9 M de glicina, 1% SDS (p/v) en ddH2O) almacenado en RT.
  12. Mezcle muestras de membrana plasmática de 5-10 μL (es decir, 10-20 μg de proteína) con volúmenes iguales de colorante de carga de proteína 2x [120 mM Tris-HCl (pH 6.8), glicerol al 20%, azul de bromofenol al 0.02%, SDS al 4%, ditiothreitol (TDT) de 200 mM] y cargue inmediatamente en ranuras de gel individuales sumergidas en el tampón en funcionamiento.
    PRECAUCIÓN: La TDT es dañina si se ingiere. Causa irritaciones graves en los ojos y la piel.
    NOTA: Haga un caldo de 10 ml de 2x colorante de carga de proteínas, alícuota y guárdelo a -20 ° C. No caliente las muestras mezcladas, sino que las cargue inmediatamente en ranuras de gel individuales para que la etiqueta GFP no se desnaturaliza y se puedan detectar las señales de fluorescencia en el gel.
  13. Cargue los marcadores de peso molecular de la proteína (rango de 10-245 kDa) en una ranura separada para permitir la estimación del tamaño de fragmentos de proteínas individuales.
  14. Realice la electroforesis en gel a 200 V hasta que el tinte de carga azul llegue al fondo del gel (generalmente 45-55 min).
  15. Examine el gel para la fluorescencia GFP en gel con un sistema de imágenes en gel (las longitudes de onda de excitación y emisión son 475-485 nm y 520 nm, respectivamente).
  16. Después de las imágenes de fluorescencia en gel, fije las proteínas mediante una agitación suave del gel en ~ 10-20 ml de solución fijadora de gel de proteína (40% de etanol, 10% de ácido acético) durante 15 min a RT.
  17. Enjuague el gel dos veces durante 10 min con 10 ml de ddH2O y visualice las bandas de proteínas colocando el gel en una solución de tinción coloidal de Coomassie de 10 ml con agitación suave durante ~ 1 h en RT.
  18. Para una mejor visualización de las bandas de proteínas, desmanche el gel una o dos veces en ~ 20 ml de ddH2O durante ~ 1 h antes de grabar imágenes con el sistema de imágenes en gel.

5. Determinación de las actividades de CDR1 ATPasa 57

  1. Las muestras diluidas de membrana plasmática >2,2 mg/ml a 1-2 mg/ml en HB.
  2. Equilibrar el cóctel de ensayo ATPasa (75 mM MES-Tris, 75 mM de nitrato de potasio, 0,3 mM de molibdato de amonio, 7,5 mM de azida de sodio; pH 7,5) y Mg-ATP (28,8 mM de sal disódica atp, 28,8 mM MgCl2;pH 7,0) a 30 °C en una incubadora de 30 °C.
    PRECAUCIÓN: La azida de sodio es altamente tóxica.
    NOTA: Asegúrese de que todas las existencias tampón y botellas estén libres de fosfato; es decir, lavar la cristalería con 1% (vol/vol) HCl y enjuagar varias veces con ddH2O. Además, manténgalo separado de otros artículos de vidrio que probablemente contengan trazas de fosfato comúnmente presentes en los detergentes utilizados para lavar la cristalería.
  3. Añadir 90 μL de cóctel de ensayo con o sin inhibidor de la Cdr1-ATPasa (20 μM de oligomicina) en pozos individuales de una placa de microtitulación de 96 pozos.
    NOTA: El ensayo se realiza por triplicado.
  4. Agregue 5 μL de las membranas plasmáticas aisladas (~ 5-10 μg de proteína) o estándares de fosfato (0-100 nmoles Pi) en los pozos apropiados de la placa de microtitulación.
    NOTA: Mantenga la primera y la última columna para dos conjuntos separados de estándares de fosfato.
  5. Comience el ensayo agregando 25 μL de Mg-ATP de 28,8 mM precalentados (concentración final de 6 mM) con una pipeta multicanal en pozos individuales e incube a 30 °C durante 30 min.
  6. Detenga la reacción agregando 130 μL de reactivo de desarrollo (L-ascorbato de sodio al 1,6%, 1% SDS, molibdato de amonio al 12% en ácido sulfúrico 6 M).
    PRECAUCIÓN: El ácido sulfúrico concentrado reacciona violentamente con el agua. Es corrosivo y puede causar daño en la piel y los pulmones.
  7. Incubar en RT durante 10 min.
  8. Lea la absorbancia de los pozos de la placa de microtitulación a 750 nm con un lector de placas de microtitulación.
    NOTA: Apegarse al tiempo de incubación de 10 minutos para el desarrollo del tinte azul (es decir, un complejo reducido de fósforo-molibdeno) es fundamental para la precisión del ensayo porque el desarrollo del tinte azul continúa con el tiempo.
  9. Obtener la actividad atPasa específica de Cdr1 (es decir, la actividad ATPasa sensible a la oligomicina) restando la actividad atPasa en presencia de oligomicina de la actividad total de la ATPasa en ausencia de oligomicina.

6. Pantalla de detergente a pequeña escala

  1. Combinar las preparaciones de membrana plasmática (es decir, 2,5 mg de proteína de membrana plasmática) de células que sobreexpresan Cdr1-mGFPHis con tampón GTED-20 [10 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20 % (p/v) glicerol; pH 7,5; recién suplementado con 1 mM PMSF] que contenga 5 mg del detergente de prueba, para alcanzar un volumen total de 0,5 ml suplementado con detergente al 1% (p/v).
  2. Gire la mezcla a 4-8 °C durante 2 h, con un dispositivo de rotación.
  3. Centrifugar la mezcla a 141.000 x g a 4 °C durante 1 h.
  4. Transfiera el sobrenadante que contiene material solubilizado a un tubo de microcentrífuga fresco.
  5. Agregue 0,5 ml de tampón GTED-20 suplementado con SDS al 2% (p/v) a la fracción de pellet insoluble e incube a 30 °C o/n en una incubadora de agitación para extraer toda la proteína de membrana insoluble en detergente.
  6. Analizar y comparar las fracciones de pellets sobrenadantes y solubilizadas por SDS-PAGE.
  7. Fotografíe geles que contengan proteínas marcadas con GFP para la fluorescencia de GFP en gel antes de la tinción de Coomassie y cuantifique los niveles de expresión con el sistema de imágenes.
  8. Utilice la fracción de proteína de membrana soluble para aplicaciones posteriores, como la cromatografía de exclusión de tamaño de fluorescencia (FSEC)58 para identificar detergentes adecuados.

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Representative Results

Se logró una alta frecuencia de transformación de S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x10 4 transformadores/μg) con pYES2(Figura 2B). Como era de esperar, el control sin ADN (es decir, ddH2O solamente) no dio transformadores, y 1 μg del casete de transformación lineal CDR1-mGFPHis (Figura 1A)dio ~ 50 transformadores(Figura 2C)con el protocolo de transformación ADΔΔ optimizado. Los transformadores CDR1-mGFPHis también se probaron por su capacidad de crecer en una fuente de carbono no fermentable para eliminar cualquier posible mutante pequeño con mitocondrias defectuosas. Tres (círculos amarillos; Figura 2D) de los 25 transformadores de uracilo-prototrofo probados no pudieron crecer en placas de agar YPG y fueron descartados de investigaciones posteriores. El Cdr1-mGFPHis expresado por la cepa recién creada ADΔΔ-CDR1-mGFPHis está correctamente localizado en la membrana plasmática (Figura 1A) y se expresó a niveles suficientes para la caracterización estructural y funcional de Cdr1 (Figura 3). El diseño de la doble etiqueta optimizada(Figura 1B)también permite la eliminación de la doble etiqueta mGFPHis después de la purificación de afinidad de níquel de Cdr1-mGFPHis para evitar posibles interferencias de la etiqueta en aplicaciones posteriores. Los resultados preliminares, sin embargo, han demostrado que el enlazador de 3 aminoácidos entre Cdr1 y el sitio de escisión de la proteasa HRV-3C puede tener que extenderse para lograr una escisión más rápida y efectiva. Recientemente se informaron observaciones similares para el transportador de nucleósidos marcado N-terminalmente escherichia coli NupC, que requería un enlazador de 15 aminoácidos en lugar del diseñado originalmente para una escisión eficiente del detergente (DDM) solubilizado NupC unido a la resina de afinidad de níquel59. El enlazador de 5 aminoácidos C-terminal del sitio de escisión HRV-3C evita la interferencia estérica de la doble etiqueta mGFPHis con la proteína adjunta de interés, que hemos observado previamente para C. utilizar el transportador ABC Cdr139. La mutación yEGFP3-A206K fue creada para prevenir la dimerización artificial de GFP a altas concentraciones de proteínas28, y el enlazador adicional de 3 aminoácidos entre mGFP y la etiqueta de afinidad de níquel de His garantiza la exposición adecuada de la superficie de la etiqueta His para maximizar la eficiencia de unión de la proteína etiquetada a la resina de afinidad de níquel (datos no mostrados).

Figure 1
Figura 1: Una plataforma de expresión de proteínas de membrana de levadura para la clonación y expresión eficientes de transportadores de membrana plasmática fúngica. (A) Un casete de transformación que comprende el promotor PDR5 (azul), CDR1 (rojo) C-terminalmente etiquetado con XLmGFPHis (verde), el terminador PGK1 (naranja), el marcador de selección URA3 (azul claro) y una pieza de la región aguas abajo PDR5 (azul) se utiliza para transformar el huésped de expresión S.cer evisiae ADΔΔ por integración en el locus genómico PDR5. El factor de transcripción mutante de ganancia de función Pdr1-3 causa la sobreexpresión constitutiva de Cdr1 (octógonos rojos) en la membrana plasmática (ver imagen de microscopía confocal debajo). (B) Plásmido pABC3-XLmGFPHis, que se puede utilizar en una estrategia de clonación tradicional o como plantilla de PCR para generar un casete de transformación. Las mejoras del plásmido pABC3-XLmGFPHis sobre pABC3-GFP14 se enumeran debajo del mapa de plásmidos. (C) Una estrategia alternativa de clonación en un solo paso más eficiente para integrar el casete de transformación en el locus genómico PDR5 de ADΔΔ. Un ORF (rojo) puede ser amplificado por PCR usando cebadores (flechas) que crean superposiciones con el brazo izquierdo (azul; Promotor PDR5) y brazo derecho (verde; XLmGFPHis-PGK1-URA3-PDR5 downstream) fragmentos. Las mutaciones (líneas negras) se pueden introducir en el ORF mediante el diseño de imprimación si es necesario. Los eventos de recombinación homólogos que dirigen la integración correcta en el locus PDR5 se indican mediante las líneas discontinuas cruzadas. (D) Ensayos de células enteras que pueden utilizarse para la caracterización funcional de bombas de eflujo multifármacas fúngicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Transformación de ADΔΔ con el casete de transformación CDR1-mGFPHis y eliminación de pequeños transformadores ADΔΔ-CDR1-mGFPHis. Los transformadores prototrofos de uracilo se seleccionaron incubando células ADΔΔ transformadas en placas CSM-URA a 30 °C durante 3 días. (A) Control negativo (sin ADN). (B) Control positivo (10 ng de pYES2). (C) CDR1-mGFPHis transformadores (1 μg de ADN). (D) Prueba de los transformadores ADΔΔ-CDR1-mGFPHis para un fenotipo pequeño en placas de agar YPG. Los pequeños transformadores que no pudieron crecer en las placas de agar YPG debido a mitocondrias defectuosas están rodeados de amarillo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La fluorescencia GFP es una medida confiable para los niveles de expresión de Cdr1, ya que hubo una relación lineal entre la cantidad de Cdr1-mGFPHis (paso 3.3.9) y las señales de fluorescencia en gel(Figura 3A). En este proyecto, se desarrolló un flujo de trabajo optimizado reproducible para la generación rápida de preparaciones de membranas plasmáticas a pequeña escala de alta calidad para la caracterización bioquímica de proteínas de membrana plasmática. Fue posible generar casi 0,5 mg de proteína de membrana plasmática (Figura 3C;gráfico izquierdo) mostrando la mayor actividad de Cdr1 ATPasa ( ̃400 nmol/min/mg; Figura 3C; gráfico derecho) al romper 40 ODU de células de fase logarítmica (OD600nm de 1-3) (resuspendidas en 0,5 mL de HB) con el mismo volumen (es decir, 0,5 mL) de perlas de sílice y 6 ciclos de vórtice durante 1 min a máxima intensidad de agitación seguido de períodos de enfriamiento de 3 min sobre hielo. Un aumento adicional en el número de ciclos de rotura (paso 3.3.3) redujo la calidad de la preparación de la membrana plasmática aislada (la actividad de la CDr1 ATPasa se redujo de 170 nmol / min / mg a ~ 60 nmol / min / mg; datos no mostrados). Aunque solo hubo diferencias menores en los patrones de proteínaS SDS-PAGE de las muestras de membrana plasmática aisladas de células rotas con un mayor número de ciclos de rotura (datos no mostrados), es probable que las actividades de Cdr1 ATPasa casi 3 veces reducidas después de 10 o más ciclos de rotura fueran causadas por: i) desnaturalización parcial de Cdr1 debido a la exposición a temperaturas elevadas; ii) modificaciones post-traslacionales como fosforilación o desfosforilación; o por iii) aumento de la contaminación cruzada de las vesículas aisladas de la membrana plasmática con fracciones de membrana de otros orgánulos. La ruptura de 40 ODU de células en 0,5 ml de HB produjo la más alta calidad de las membranas plasmáticas (es decir, la mayor cantidad de Cdr1 por 10 μg de proteína de membrana plasmática; Figura 3B) con mayor actividad de Cdr1 ATPasa(Figura 3C;gráfico derecho). Las densidades celulares más altas (> 40 ODU/0,5 mL de HB) o inferiores (20 ODU/0,5 mL de HB) redujeron la actividad atPasa de las membranas plasmáticas aisladas(Figura 3C;gráfico derecho), aunque, su rendimiento aumentó en proporción al aumento de las densidades celulares(Figura 3C;gráfico izquierdo). Así, 40 ODU/0,5 mL de HB fue la densidad celular óptima para el aislamiento de las membranas plasmáticas de la más alta calidad. Por lo tanto, el uso del protocolo optimizado para el aislamiento a pequeña escala de preparaciones de membrana plasmática condujo a actividades de ATPasa específicas de Cdr1 2-3 veces mayores (~ 300 nmol / min / mg; Figura 3C; gráfico derecho) en comparación con las actividades específicas de LA ATPasa Cdr1 que se obtuvieron inicialmente (~100 nmol/min/mg; datos no mostrados). Estas actividades de ATPasa también fueron significativamente más altas35 que cualquier actividad de ATPasa Cdr1 reportada anteriormente (100-200 nmol / min / mg) que se había obtenido con un protocolo de preparación de membrana plasmática a gran escala más intensivo en mano de obra y que consumía más tiempo14,41,60.

El método más común para extraer proteínas de membrana de membranas biológicas es la solubilización con detergente. El desafío, sin embargo, es encontrar un detergente adecuado que tenga el menor efecto perjudicial sobre la estabilidad de la proteína y / o las características de plegamiento. El etiquetado de la proteína con mGFPHis facilita la detección para seleccionar el mejor detergente para la extracción de proteínas. En total, se probaron 31 detergentes, enumerados en la Tabla de Materiales,con diversas propiedades por su capacidad para solubilizar Cdr1 a partir de membranas plasmáticas crudas de células S. cerevisiae ADΔΔ-CDR1-mGFPHis. Los resultados de un conjunto representativo de 16 detergentes de prueba (A-Q) se muestran en la Figura 3D. Los carriles T, P y S contienen 10 μL alícuotas de proteína total (T) de membrana plasmática inmediatamente después de la solubilización del detergente (paso 6.2) y el pellet insoluble en detergente (P; o/n solubilizado en 0,5 mL de GTED-20, 2% SDS; paso 6.5) y las fracciones de sobrenadante soluble en detergente (S; paso 6.4) después de la separación por ultracentrifugación a 141.000 x g. El detergente deseado debe solubilizar tanto Cdr1-mGFPHis como sea posible sin alterar su estructura y/o función. Las proteínas crudas de la membrana plasmática (5 mg/mL) se solubilizaron durante 2 h con detergente al 1% (p/v) (T) y las alícuotas de las fracciones solubles (S) e insolubles (P) fueron analizadas por SDS-PAGE(Figura 3D)y posteriormente también por cromatografía de exclusión de tamaño de detección de fluorescencia (FSEC)58 (Figura 4). Se determinó que se requería una proporción mínima de detergente a proteína de 2:1 (p/p) para una solubilización eficiente de Cdr1. De hecho, para determinar la concentración óptima de detergente (DDM) requerida para la solubilización de Cdr1-mGFPHis, se investigó la concentración crítica de micelas del detergente (x CMC) y la relación detergente/proteína de membrana (p/p). Se observaron grandes diferencias en las eficiencias de solubilización de Cdr1-mGFPHis cuando se utilizaron concentraciones fijas de 10x u 80x CMC de DDM. Las eficiencias de solubilización variaron entre el 40% y el 80% o el 60% y el 90% dependiendo de las cantidades de membranas plasmáticas crudas utilizadas en los diversos experimentos de solubilización. Sin embargo, la elección de proporciones de detergente a proteína de ≥2 (p/ p) dio resultados reproduciblemente buenos con >85% de Cdr1-mGFPIs solubilizado, sin importar la cantidad de proteína de membrana plasmática utilizada. Por lo tanto, si se utiliza el enfoque más común de simplemente elegir un detergente al 1% o 2% (p/v) para la solubilización de proteínas de membrana como Cdr1-mGFPHis, es importante mantener la relación detergente/proteína por encima de 2 (p/p) [es decir, mantener la concentración de proteínas de membrana plasmática por debajo de 5 mg/mL cuando se usa detergente al 1% (es decir, 10 mg/mL)].

Figure 3
Figura 3: Cuantificación de los niveles de expresión de Cdr1-mGFPHis, optimización de un protocolo de aislamiento de membrana plasmática a pequeña escala y cribador de detergente para Cdr1-mGFPHis. (A) Cuantificación de Cdr1-mGFPHis con fluorescencia en gel; a la izquierda se muestran las imágenes SDS-PAGE de fluorescencia coomassie y en gel del mismo gel de poliacrilamida al 0,7%. Los carriles 1 a 6 se cargaron con 0,75, 1,5, 3, 6, 12 y 24 μg de proteína de membrana plasmática ADΔΔ-CDR1-mGFPHis. Cdr1-mGFPHis se indica con una flecha roja. M = Marcador de proteína precisión más. Las intensidades de fluorescencia mGFP (que se muestran a la derecha) fueron lineales en todo el rango de concentración probado y hubo una fluorescencia de fondo mínima. (B) Efecto de la densidad celular en la rotura sobre la calidad de las membranas plasmáticas aisladas. Gel de poliacrilamida teñido con coomassie (7%) de muestras de proteína de membrana plasmática (10 μg) y señales de fluorescencia verde de Cdr1-mGFPHis del mismo gel antes de la tinción de Coomassie. M = Marcador de proteína precisión más. Los carriles 1, 3, 5 y 7 son proteínas de membrana plasmática de ADΔΔ y los carriles 2, 4, 6 y 8 son proteínas de membrana plasmática de ADΔΔ-CDR1-mGFPHis aisladas de 20, 40, 60 y 80 ODU de células, respectivamente. Cdr1-mGFPHis se indica con una flecha roja. Los porcentajes relativos de las señales fluorescentes verdes se enumeran debajo. (C) Efecto de la densidad celular en la rotura sobre el rendimiento de las membranas plasmáticas aisladas y la actividad ATPasa de Cdr1-mGFPHis. A la izquierda, efecto de la densidad celular (ODU/0,5 mL HB) sobre la cantidad de proteína de membrana plasmática aislada de células ADΔΔ y ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (Cdr1). A la derecha, efecto de la densidad celular sobre la actividad de la CDr1 ATPasa de las membranas plasmáticas aisladas de las células ADΔΔ-CDR1-mGFPHis. (D) SDS-PAGE ejemplar de 10 μL de alícuotas de la mezcla de solubilización (T; 0,5 mL), el pellet después de la solubilización (P; 0,5 mL) y las fracciones solubilizadas (sobrenadantes) (S; 0,5 mL) de proteínas de membrana plasmática bruta solubilizadas con detergente de ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (arriba) y la fluorescencia en gel de Cdr1-mGFPHis antes de la tinción coomassie del mismo gel (abajo). M = amplia escalera de proteínas pre-teñidas mw (bandas de 245, 180, 135, 100, 75, 63 y 48 kDa; las bandas de 180 kDa y 75 kDa se indican con flechas rojas y verdes, respectivamente). Los carriles A a L y N a Q son las fracciones T, S y P para DM (A), β-DDM (B), α-DDM (C), TDM (D), LMNG (E), OGNG (F), OG (G), LDAO (H), Hega (I), Mega (J), Triton-X100 (K), CHAPS (L), NM (N), Tween80 (O), Fos-colina-13 (P) y SDS (Q), respectivamente. Las abreviaturas se definen en la Tabla de Materiales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Según los resultados del cribado de detergentes(Figura 3D),DDM (B y C) y Fos-colina-13 (P) parecieron ser los mejores detergentes para la solubilización de Cdr1-mGFPHis. Sin embargo, el uso de Fos-colina-13 pareció causar proteólisis parcial de Cdr1-mGFPHis (P en la Figura 3D). LMNG (E), PCC-α-M (no se muestra) y posiblemente también DM (A) fueron los siguientes mejores detergentes. La pantalla de detergente también mostró que los glucósidos OGNG (F) y OG (G), CHAPS (L), NM (N) y Anzergents (no mostrados) fueron malas opciones para la solubilización de Cdr1-mGFPHis ya que se encontraron cantidades significativas de la proteína en las fracciones de pellets insolubles(Figura 3D). SDS desnaturaliza Cdr1-XLmGFPHis, por lo que no se ven señales de fluorescencia verde en los carriles Q(Figura 3D).

La idoneidad de un detergente para la solubilización de partículas nativas cdr1-mGFPHis correctamente plegadas también fue evaluada por FSEC de la proteína de membrana plasmática solubilizada con detergente (sobrenadante paso 6.4). En la Figura 4se muestran ejemplos de cromatogramas obtenidos para proteína bruta de membrana plasmática de 100 μL de ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (2 mg/mL) solubilizada con detergente al 1%. El pico a 9 mL de volumen de elución representa principalmente Cdr1-mGFPHis agregado que eluyen en el volumen vacío, mientras que las partículas de Cdr1-mGFPHis correctamente solubilizadas y correctamente plegadas están representadas por el pico en forma de gaussiano a un volumen de elución de 15.5 mL. El hombro ancho entre 12 y 14 ml de volumen de elución posiblemente contenga partículas de micela Cdr1-mGFPHis menos bien definidas y/o indique un mal plegamiento parcial o agregados de proteínas. Los cromatogramas de maltósidos y proteínas extraídas de LMNG mostraron que la mayor parte de Cdr1-mGFPHis se eluía como un pico gaussiano de buena forma a 15,5 mL con un pequeño hombro que se liberaba ligeramente antes a 14 mL(Figura 4A). Estas muestras no tenían Cdr1-mGFPHis eluyendo en el volumen vacío. La muestra en blanco es el búfer más el control DDM que no dio señal mGFP. Los cromatogramas de la Figura 4B resaltan la importancia del tipo de cabezal de azúcar para la calidad de las partículas de detergente solubilizadas Cdr1-mGFPHis. Los detergentes que contienen glucosa (OG, NG, OGNG) tuvieron un peor desempeño que los detergentes que contienen sacarosa (DDS), que a su vez tuvieron un peor desempeño que los detergentes que contienen maltosa (NM, DMNG, DDM). Cdr1-mGFPS Se solubilizó con detergentes que contienen glucosa eluido como un pico agregado (OG) o agregado amplio (NG, OGNG), lo que era de esperar de la gran proporción de precipitado de Cdr1-mGFPHis en las fracciones de pellets para OGNG (F) y OG (G) observadas en la Figura 3D. Aunque el cromatograma DMNG (verde; Figura 4B) fue cualitativamente similar al cromatograma DDM (azul; Figura 4B), los picos más altos para DDM indican que una gran parte de DMNG solubilizado Cdr1-mGFPHis en realidad puede ser desnaturalizado. La Figura 4C muestra los cromatogramas FSEC para las fos-colinas zwitteriónicas (Fos-colina-8, Fos-colina-10, Fos-colina-13) y dos detergentes no iónicos (digitonina, Tritón-X100), y la Figura 4D muestra cómo la carga del doble (200 μL) de proteína solubilizada con detergente no tuvo un efecto notable en la calidad del cromatograma para Fos-colina-8, -10 y -13 y DDM. Sólo digitonina (naranja; Figura 4C) dio un cromatograma similar a DDM (azul; Figura 4C) y, aunque Fos-colina-13 dio un pico simétrico de forma afilada, nuevamente eluyó con un volumen de elución significativamente menor (14 ml) que el de DDM (15,5 ml). En general, hubo una clara tendencia a una mejor solubilización por parte de detergentes con cadenas laterales alifáticas más largas de 12 o 13 residuos de carbono; por ejemplo, DDM > DM > NM (12, 10 o 9 carbonos), Fos-colina-13 > 10 > 8 (13, 10 u 8 carbonos) y LMNG > DMNG > OGNG (12, 10 u 8 carbonos), respectivamente. Por lo tanto, los detergentes con colas hidrofóbicas de menos de 12 carbonos eran detergentes mucho menos adecuados para la solubilización de Cdr1-mGFPHis que los detergentes con colas hidrofóbicas más largas de 12 o 13 carbonos, y los detergentes no iónicos (DDM, LMNG) parecían generalmente más adecuados para la solubilización de Cdr1-mGFPHis que los detergentes zwitteriónicos(Figura 3D, Figura 4).

Figure 4
Figura 4: Cribado con detergente para la solubilización de Cdr1-mGFPS mediante FSEC. Cromatogramas de 100 μL de ADΔΔ-CDR1-mGFPS solubilizadosSu membrana plasmática bruta (2 mg/mL) con el 1% de los detergentes indicados y separados mediante una columna de exclusión de tamaño Superose 6-increase 10/300 GL. Los cromatogramas representan las unidades de fluorescencia (FU) mGFP relativas de un volumen de columna (CV; 25 ml) del tampón de elución recolectado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

A pesar del progreso reciente en el análisis estructural de proteínas de membrana, actualmente no se dispone de una estructura 3D para Cdr1, o cualquier otro transportador PDR. Por lo tanto, obtener conocimiento de la estructura de Cdr1 y sus características bioquímicas es importante, ya que esto no solo proporcionará información sobre el diseño racional de nuevos medicamentos para superar la resistencia a los medicamentos mediada por el eflujo, sino también sobre el mecanismo de función de una importante subfamilia de proteínas ABC.

Uno de los principales requisitos para la caracterización estructural de las proteínas de membrana es la expresión de proteínas de membrana correctamente plegadas e intactas en cantidades requeridas para la cristalografía de rayos X o crio-EM. Los criterios importantes a la hora de seleccionar un sistema de expresión son la facilidad de uso, las tasas de crecimiento y los costes, así como la capacidad de expresar proteínas con modificaciones post-traslacionales que pueden ser críticas para la función y/o estabilidad de una proteína61,62.

En las últimas dos décadas se ha optimizado una tecnología de expresión de proteínas de membrana S. cerevisiae 60 14 para facilitar la clonación en un solo paso de proteínas de membrana de interés24 etiquetadas en su terminal N o C con varias etiquetas de afinidad, epítopo o reportero y, si se desea, sus niveles de expresión previsiblemente reprimidos a cualquier lugar entre el 50% y tan bajo como el 0,1% del nivel máximo de expresión25. Esta versátil plataforma de expresión de proteínas de membrana plasmática permite a los investigadores caracterizar las bombas de eflujo fúngico con gran detalle. El desarrollo y la optimización de ensayos de células enteras de la función de la bomba permitieron la caracterización exitosa de la especificidad del sustrato24 y la sensibilidad al inhibidor de una serie de bombas de eflujo multifármaco fúngico principales, y se emplearon en pantallas de drogas de alto rendimiento para identificar nuevos42,43,44,o confirmarlos 14,33, 36inhibidores de bombas de eflujo de amplio espectro existentes o para desarrollar nuevos inhibidores de la bomba de eflujo específicos para Cdr141.

Aunque la plataforma de expresión existente se ha utilizado con éxito para expresar transportadores de ABC fúngicos de una variedad de hongos, incluyendo Basidomycota (C. neoformans Mdr1),14 hongos filamentosos como P. marneffei (Abc1)37 y muchas especies de Saccharomycotina (por ejemplo, S. cerevisiae Pdr5, C. glabrata Cdr1 y Cdr2, C. utilizan Cdr1, C. krusei Abc1, Abc11 y Abc12 y C. albicans Cdr1 y Cdr2), 14,24,32,36,39,60,63 ha habido menos éxito expresando altos niveles de transportadores ABC humanos debidamente plegados64. Los resultados preliminares indican que esto se debe al ambiente lipídico específico que estos transportadores requieren para una correcta expresión y función en la levadura. Hay indicios de que esto también puede ser cierto para los transportadores ABC de plantas, aunque esto aún no se ha confirmado experimentalmente.

Las principales razones de las actividades específicas de cdr1 ATPasa significativamente más altas (es decir, preparaciones con membranas menos contaminantes) obtenidas con el protocolo optimizado de aislamiento de membranas plasmáticas a pequeña escala son dos: i) la rotura manual más suave de las células en comparación con el uso de un batidor de perlas para preparaciones de membranas plasmáticas a mayor escala; y ii) la recolección de células a mitad de la fase logarítmica, lo que reduce la posible contaminación mitocondrial debido a la represión de la glucosa de las enzimas mitocondriales. Los períodos de enfriamiento de 3 minutos entre cada uno de los seis ciclos de rotura podrían extenderse sin ningún efecto notable en la calidad de las membranas plasmáticas. Sin embargo, se deben evitar los ciclos repetidos de congelación-descongelación porque las actividades de cdr1 ATPasa de las membranas plasmáticas aisladas se reducen en ~ 10% con cada ciclo adicional de congelación-descongelación. Es por eso que se recomienda dividir las muestras de membrana plasmática en alícuotas más pequeñas para reducir la necesidad de múltiples ciclos de congelación-descongelación. La doble etiqueta mGFPHis mejora el rendimiento de purificación y permite un cribado eficiente de detergente en un solo paso. Mediante el uso de esta construcción, se puede detectar fácilmente la localización correcta, el plegado / tráfico adecuado y la termoestabilidad; y la doble etiqueta se puede eliminar, si es necesario, mediante escisión con una proteasa disponible comercialmente, aunque el enlazador de 3 aminoácidos entre la proteína de interés y la etiqueta puede tener que extenderse para una eliminación eficiente de la etiqueta.

La combinación de varias características en estos protocolos, a saber, el uso de una ADN polimerasa diseñada específicamente para la amplificación de la colonia por PCR del casete de transformación de 8 kb; el método optimizado de transformación de levadura de alta eficiencia; la capacidad de crear existencias de levadura competentes congeladas; y el protocolo optimizado de preparación de membranas plasmáticas a pequeña escala demuestra la creación de una plataforma optimizada de expresión de proteínas de membrana susceptible de clonación, expresión y caracterización de alto rendimiento de bombas de eflujo ABC fúngico.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen la financiación del Fondo Marsden de Nueva Zelanda (Subvención UOO1305), y una subvención en bloque de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chulalongkorn, Bangkok, Tailandia (M. Niimi). Desean agradecer a la Universidad de Otago por proporcionar a G. Madani una beca de doctorado. Los autores también desean expresar su gratitud al profesor Stefan Raunser y sus colegas, el Dr. Amir Apelbaum y el Dr. Deivanayagabarathy Vinayagam, por su apoyo y supervisión durante una visita de 6 meses de G. Madani al Instituto Max Planck de Fisiología Molecular (MPIMP), Dortmund, Alemania. Los autores también agradecen al Servicio Alemán de Intercambio Académico (DAAD) por proporcionar a G. Madani una beca de investigación (57381332) para visitar el MPIMP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES) Sigma-Aldrich M3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) Merck 77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG310S LMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside Anatrace NG311S OGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG322S DMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside Glycon Biochemicals GmbH D99019-C PCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) Bio-Rad 1610148
Acetic acid (glacial) Merck 64-19-7
Agar Formedium  009002-18-0
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich 13106-76-8
Ammonium persulphate (APS) Bio-Rad 1610700
ATP disodium salt sigma-Aldrich A-6419
Bromophenol blue SERVA Electrophoresis GmbH 34725-61-6
CHAPS Anatrace C316S
CHAPSO Anatrace C317S
CSM Formedium DCS0019
CSM minus uracil Formedium DCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C324S CYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C327S CYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C321S CYMAL-1
Digitonin Sigma-Aldrich 11024-24-1
Dithiothreitol (DTT) Roche Diagnostics 10197785103
DMSO Merck 67-68-5
Ethanol Merck 459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) Merck 6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent Applied Biosystems 78205 A blend of exonuclease and phosphatase
Glucose Formedium 50-99-7
Glycerol Merck 56-81-5
Glycine Merck G8898
HEPES Formedium 7365-45-9
Hydrochloric acid Merck 1003172510
KOD Fx Neo TOYOBO Co KFX-201 Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc) Sigma-Aldrich 546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydrate sigma-Aldrich M2393
MES Formedium 145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide Anatrace H110S HEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamide Anatrace M320S MEGA-10
n-Decyl-phosphocholine Anatrace F304S Fos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D322S DM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ312S Anzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide Anatrace D360S LDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranoside Anatrace D310HA α-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310S β-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Nonyl-β-D-maltopyranoside Anatrace N330S NM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ318S Anzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ308S Anzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholine Anatrace F300S Fos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranoside Anatrace O311S OG
n-Tetradecyl-phosphocholine Anatrace F312S Fos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T315S TDM
n-Tridecyl-phosphocholine Anatrace F310S Fos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T323S -
n-Undecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace U300S UM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Octylphenoxypolyethoxyethanol Sigma-Aldrich 9002-93-1 TRITON X-100
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351
Peptone Formedium 3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Diagnostics 329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase New England Biolabs M0535S High-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350) Sigma-Aldrich 25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleate Sigma-Aldrich 9005-65-6 TWEEN 80
Potassium nitrate Sigma-Aldrich P8394
Protein Assay Kit Bio-Rad 5000122 RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie Stain Bio-Rad 1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) Abcam AB116028
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sodium dodecyl sulphate Sigma-Aldrich 151-21-3 SDS
Sodium L-ascorbate BioXtra Sigma-Aldrich 11140
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350S DDS
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 339741
Yeast extract Formedium 008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804) Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra) Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6) Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator) Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager) Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection) BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch) Bio-Rad
Power supply (PowerPac) Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron) Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences GE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro) Amersham BioSciences UK Ltd

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References

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Biología Número 172
Preparación de membrana plasmática a pequeña escala para el análisis de <em>Candida albicans</em> Cdr1-mGFPHis
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Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., … More

Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., Niimi, M., Mitra, A. K., Cannon, R. D. Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis. J. Vis. Exp. (172), e62592, doi:10.3791/62592 (2021).

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