Summary
이 문서는 칸디다 알비칸스 ABC (ATP 결합 카세트) 단백질 Cdr1의 특성화를위한 소규모 플라즈마 막 격리 프로토콜을 제시, 사카로미세스 cerevisiae에서 과발현. 프로테아제-클레이블 C-단말 mGFPCdr1과 태그 사이에 16잔류 링커를 장착한 이중 태그는 Cdr1의 정제 및 세제 스크리닝을 용이하게 하도록 설계되었습니다.
Abstract
ABC 수송기의 성공적인 생화학적 및 생물리적 특성화는 이종발형 발현 시스템의 선택에 크게 좌우됩니다. 지난 2년 동안, 우리는 많은 중요한 곰팡이 막 단백질을 연구하는 데 사용되어 온 효모 막 단백질 발현 플랫폼을 개발했습니다. 발현 숙주 사카로미세스 cerevisiae ADΔΔ는 7개의 주요 내인성 ABC 수송기에서 삭제되고 게놈 PDR5 locus에서 단일 사본으로 안정적으로 통합된 이종막 단백질 유전자의 구성 과잉 발현을 가능하게 하는 게인기능 돌연변이를 가진 전사 인자 Pdr1-3을 함유하고 있다. 다재다능한 플라스미드 벡터를 생성하고 1단계 복제 전략의 최적화를 통해 이종성 ABC 수송기의 신속하고 정확한 복제, 돌연변이 발생 및 표현을 가능하게 합니다. 여기서, 우리는 새로운 프로테아제-클레이블 mGFPHis 이중 태그(즉, 단황 효모강화 녹색 형광 단백질 yEGFP3가 6-히스티딘 친화도 정화 태그에 융합)의 개발 및 사용을 설명하며, 이는 관심있는 단백질로 태그의 간섭가능성을 피하고 그의 태그의 결합 효율을 높이기 위해 고안되었다. mGFP의 융합막 단백질 ORF(오픈 리딩 프레임)는 폴리아크릴아미드 젤의 검사와 mGFPHis 태그를 유지하던 분해 제품의 검출을 통해 단백질의 용정화를 가능하게 한다. 우리는 이 기능이 막 단백질 용해화를 위한 세제 스크리닝을 용이하게 하는 방법을 보여줍니다. C-말단 태그칸디다 알비칸스 다중 약물 efflux 수송기 Cdr1S. cerevisiae ADΔΔ에서 과발현의 소규모 플라즈마 멤브레인 제제의 효율적이고 빠르고 신뢰할 수 있는 절연을 위한 프로토콜이 제시된다. 이 소규모 플라즈마 멤브레인 격리 프로토콜은 단일 작업 일 내에 고품질 플라즈마 멤브레인을 생성합니다. 플라즈마 멤브레인 제제는 Cdr1 및 Cdr1 돌연변이 변이체의 효소 활동을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
그들의 네이티브 지질 환경에서 일체형 막 단백질의 추출은 극적으로 그들의 구조 및 기능1,2,3,4에영향을 미칠 수 있습니다. 생물학적 막5의 복잡한 지질 조성물은 매우 중요한 단백질 지질 상호 작용이6을발생할 수 있도록 보장한다. 지질은 멤브레인 단백질의 구조적 무결성을 유지하므로 멤브레인 구획 대상에서 올바르게 작동할 수 있게 합니다7,8. 따라서 막 단백질 정제의 중요한 첫 번째 단계는 구조 및/또는 기능에 영향을 주지 않고 자국 의 환경으로부터 단백질을 추출하는 것이다.
막 단백질의 구조를 특성화하는 데는 많은 장애물이 있으며, 대부분은 소수성 특성과 관련이 있으며 X선 결정촬영 또는 극저온 전자 현미경(cryo-EM)9,10,11,12에필요한 수량으로 제대로 접히고 기능성 멤브레인 단백질을 표현하는 데 어려움이있다. 멤브레인 단백질 발현 시스템의 세 가지 유형이 있다: 동종9,이종학 13,14,15,및 체외 발현시스템(16,17). 많은 발현 시스템의 발현 수준이 낮거나 막 단백질을 생산하는 데 바람직한 옵션으로 소수의 호스트만 남게 됩니다. 그(것)들은 세균성 숙주, Escherichia 대장균,효모 S. cerevisiae 및 피치아 목회,및 Sf9 곤충 세포 또는 포유류 세포주18와같은 더 높은 진핵생물을 포함합니다. 모든 멤브레인 단백질 발현 기술은 장점과 단점이 있습니다. 그러나, S. cerevisiae는 아마도 가장 잘 연구된 진핵 모델 유기체막 단백질 생산에 적합합니다. 유전공학, 신약개발, 합성생물학, 진핵막 단백질14,19,20,21의발현에 대한적용으로매우 다재다능하다.
이 연구에서는, 특허받은 S. 세레비시아멤브레인 단백질 발현기술(21)이 사용되었고, S. 세레비시아에 ADΔ14 및 ADΔΔ22를 선호하는 호스트(그림1A)로,주요 C. 알비칸스 다중약물 efflux 펌프 Cdr1을 과발형및 연구하였다. S. cerevisiae 균주는 모두 AD1-8u-23의 유도체로 ura3(ADΔ) 또는 ura3 및 his1(ADΔΔ) 유전자가 삭제되어 URA3 또는 HIS1 게놈 소암에서 원치 않는 통합을 통해 발생하는 거짓 양성 우라실 또는 히스티딘 프로토트로프 변혁제를 제거합니다. 도 1A에표시된 7개의 주요 다중 약물 efflux펌프(23)의삭제는 대부분의 제노바이오틱에 ADΔΔ를 절묘하게 민감하게 만듭니다. 기능의 게인 돌연변이 전사 인자 Pdr1-3은 이성엽-ORF 함유 변형 카세트(도 1A)를 통합한 후 Cdr1(도 1A의붉은 팔각형)과 같은 이성막 단백질의 구성적인 과발현을 유발한다(도1A)게놈 PDR5 로큐(blue-recangleus) 2개의 피모를통해. C-말단 mGFP의 적절한 플라즈마 멤브레인 국소화는 공초점 현미경 검사법(도1A)에의해 확인할 수 있으며, 그의 태그는 태그된 단백질의 니켈 친화성 정화에 사용될 수 있다. 일부 곰팡이 ABC 수송기 (예를 들어, 칸디다 크루시 ABC1)를pABC3 유래 플라스미드로 복제하는 것은 세포 독성으로 인해 에샤리치아 대장균에서 전파 될 수 없기 때문에 불가능했습니다. 이로 인해 막단백질(14,24)의 1단계 복제가 다양한 친화성, 에피토프 또는 리포터 태그를 S. cerevisiae ADΔΔ(도1C)로직접 태그한 N-또는 C-종래에 태그되어 있는 것을 촉발시켰다. S. 세레비시아 다양한 CDR1 돌연변이를 과도하게 발현하는 ADΔΔ 균주는 25bp(도1C)로겹치는 최대 5개의 개별 PCR 조각을 사용하여 효율적으로 만들 수 있습니다. 이 프로토콜을 채택하면 많은 ORF가 복제, 표현 및 매우 짧은 시간 내에 저렴한 비용과 고효율로 특성화 될 수 있습니다. 변환 효율성은 추가 PCR 조각마다 ~2배만 줄입니다.
원하는 경우 발현 수준은 프라이머 설계에 의해 쉽게 조작되어 일반적으로 높고 구성적인 식수준(25)의0.1%-50% 사이로 식 수준을 예측 가능한 조정할 수 있다. 최적화된 다기능, pABC314 유도체 복제 벡터, pABC3-XLmGFPHis26 (도 1B)에는HRV-3C 프로테아제 분열 부위(X; 레벨프| GP), 자주 사용되는 담배 에칭 바이러스(TEV)프로테아제(27)보다4°C에서 더 잘 수행되는 프로테아제. L은 5개의 아미노산(GSGGS) 링커이며, mGFP는 단황 돌연변이(A206K)28,29버전의 효모 향상 그린 형광 단백질 변이체 yEGFP330,그리고 그의 3가지 아미노산 링커(GGS)이며, 그 다음으로 6-히스티딘(HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH) 니켈-핀 단백질 태그가 그 뒤를 이다.
이 발현 기술은 약물 발견과 막 단백질 연구에 성공적으로 사용되었습니다. 곰팡이 아졸 약물 표적인 S. 세레비시아에 에르그1131의첫 번째 구조는 이 기술을 사용하여 해결되었다. 또한 C. albicans Cdr132,33,34의 상세한 특성화와 시스테인-십자형 Cdr1 분자35의 생성을 가능하게 하여 미래의 고해상도 구조를 검증하였다. 주요 인간 곰팡이 병원균의 다른 많은 ABC 수송자(즉, C. 알비칸스, 칸디다 글라브라타, 칸디다 오리스, 칸디다 크루세이, 칸디다 활용도, 크립토코커스 네오포만스, 아스퍼질러스 후미가투스, 페니실륨 마르네페이, 푸사리움 솔라니 종 복합체 등도 이 표현 플랫폼24,36, 38, 38, 38,37, 38,37을사용하여 상세히 연구하고 있다. 이를 통해 S. cerevisiae 균주 과잉 발현 efflux 펌프의 생성을 가능하게하여 새로운 형광 효율화 펌프 기질 나일 레드40 및 특정41 및 넓은 스펙트럼14,33,42,43, 44 efflux 펌프 억제제를 발견했습니다. 이 시스템의 사용은 또한 그것의 종류의 광범위 한 스펙트럼 곰 팡이 멀티 드 드 efflux 펌프 억제제의 첫 번째로 clorgyline의 발견을 가능하게(42)
막 단백질의 완전한 용해화와 내인성 지질이 없는 균일한 막 단백질-미켈 제제의 생성은 높은 세제농도(45)가필요하다. 그러나 불행히도, 이것은 또한 종종 막 단백질5,8,45,46을비활성화합니다. 세제 단량제및 용액의 응집특성은 소수성 꼬리의 물리적 특성, 알킬 사슬의 길이 및 분기, 방향족 핵 또는 플루오알킬 측 사슬의 존재 또는 폴리옥세틸렌 단위의 수에 의해 영향을 받습니다. 따라서, 세제 스크리닝은 막 단백질 용용화 및 정제에 가장 적합한 세제를 결정하는 중요한 첫 번째 단계이다.
C. 알비칸스는 중증, 생명을 위협하는 침습적 감염을 유발할 수 있는 면역손상된 개인의 주요 인간 곰팡이 병원체로서47,아졸 항진균제(48,49)에내성이 생길 수 있다. C. albicans 다약물 내성의 주요 메커니즘 중 하나는 Cdr150의과발현이며, 이는 혈장 멤브레인에 위치한 ABCG 서브패밀리의 II ATP 결합 카세트(ABC)수송기(51)이다. 풀 사이즈 곰팡이 ABCG 수송기 (두 개의 뉴클레오티드 결합 도메인 [NBDs]와 두 개의 막개 도메인 [TMd]로 구성) 더 일반적으로 흉골 약물 저항 (PDR) 수송로 알려져 있으며 독특한 반전 도메인 토폴로지 [NBD-TMD]2. PDR 수송기는 식물52,53 및 곰팡이54에서만발견됩니다. 그 중요성에도 불구하고, PDR 수송기를위한 구조는 없다, 인간의 반 크기 ABCG 수송에 대한 구조는 최근 Cdr133에대한 첫 번째 잠정 모델을 만드는 데 도움이 해결되었지만. 우리의 최근 실험적인 증거는, 그러나, 곰팡이 PDR 수송기는 독특한 전송 기계장치에 아주 가능하게 결과로 특징적인 비대칭 NBD가 있기 때문에 이 모형이 아마 결함이 있다는 것을 건의합니다. 따라서 Cdr1의 고해상도 구조는 efflux 매개 약물 내성을 극복하고이 중요한 ABC 수송 가문의 작용 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 데 도움이 될 수있는 새로운 efflux 펌프 억제제의 합리적인 설계모두에 필요합니다.
이 연구의 목적은 Cdr1에 대한 고해상도 구조를 얻는 궁극적 인 목적으로 유전자 변형 S. cerevisiae 발현 호스트에서 Cdr1의 발현, 용해성 및 정제를위한 신뢰할 수있는 프로토콜을 개발하는 것이었습니다. 이 과정의 일환으로, 프로테아제-클레이블 mGFPHis 더블태그(도 1B)는Cdr1의 C-terminus로부터 태그를 분리하는 16잔류 링커로 설계되었으며, 이는 부착된 6x의 결합을 향상시키고 니켈-친화성 수지에 대한 그의 친화성 태그를 개선하고 전체 세포에서 Cdr1 발현 수준을 모니터링할 수 있게 하였다. 약 10% C. albicans Cdr1을 포함하는 소규모 효모 혈장 막 단백질 제제를 위한 재현 가능한 프로토콜(SDS-PAGE 후 쿠마시 염색에 의해 추정된 바와 같이)도 개발되었으며, 이는 Cdr1의 생화학적 특성화에 사용될 수 있다.
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Protocol
1. 변환 유능한 ADΔ 및 ADΔΔ 세포의 신선하거나 냉동 된 주식의 준비
- 2x YPCD의 25mL 접종[즉, 2x YPD; 2% (w/v) 효모 추출물, 2% (w/v) 펩톤, 4% (w/v) 덱스트로스), 0.079% (w/v) CSM (완전한 보충 혼합물)]35 중간 하나 효모 식민지와 함께 하룻밤 (o/n) 30 시간 당 30 °C에서 30 °C에 16 시간 (o/n).
- 25mL o/n 배양시 2x YPCD 배지의 225mL을 접종하고 600nm(OD600)에서세포 광학 밀도를 검사합니다. OD600은 일반적으로 ~0.5-1.0입니다.
참고: 이 단계에서다음 변환 실험에 필요한 모든 재료를 쉽게 사용할 수 있는지 확인합니다. - 세포 밀도가 ~6-8의 OD600에 도달할 때까지 200 rpm에서 흔들림으로 30°C에서 배양을 성장시면 추가로 ~6-8h를 증가시다.
참고: 달리 명시되지 않는 한 다음 단계는 실온(RT)에서 수행됩니다. - 3 분 동안 3,000 x g에서 원심 분리에 의해 이러한 로그산편 상 세포를 수확하십시오.
- 세포를 다시 중단하고 멸균 이중 증류수(ddH2O; 즉, 200mL 및 20mL)로 두 번 세척합니다.
- 3 분 동안 3,000 x g에서 세포를 수확하십시오.
- 천천히 (즉, 30 분 동안 냉동 유능한 셀 (FCC) 용액의 30 동등한 알리쿼트를 추가) FCC의 X mL에서 세포 펠릿을 재일시 [5 % (w / v) 글리세롤, 얼음에 10% (v/v) 디메틸 설프리산화물 (DMSO)] 얼음 (어디 X = OD600;예를 들어, OD600 = 6 mL에서 6 회 중단 하는 경우, 또는 OD600 = 3 mL에서 재중단 하는 경우).
참고: 올바른 FCC 구성은 변환 성공에 매우 중요합니다. - 변환하기 전에 2 시간 동안 얼음에 세포를 유지하거나 필요할 때까지 -80 °C에 알리코를 저장합니다.
참고: ADΔ 및 ADΔΔ 셀은 동결에 매우 민감합니다. 따라서, 세포는 -80°C로 천천히 냉각되어야 합니다: 50-600 μL 셀 알리쿼트를 포함하는 얼음 차가운 마이크로센심분리기 튜브를 플라스틱 저장 상자(RT)에 배치한다. 상자를 더 큰 폴리스티렌 용기(RT)에 넣고 피팅 폴리스티렌 뚜껑으로 용기를 닫습니다. 그런 다음 용기를 -80 °C 냉동고에 넣습니다.
주의: 느린 동결은 세포 생존에 중요합니다.
2. CaCDR1-XLmGFP를 사용하는 ADΔ 및 ADΔΔ의 변환 및 콜로니 PCR 및 DNA 시퀀싱에 의한 올바른 변압제 확인
참고 : 플라스미드 pABC3-CDR1-mGFP는 람핑 등, 201055에 상세히 설명된 기존의 복제 전략을 사용하여 만들어졌으며 도 1B에도시되어 있다. 야생형 C. 알비칸 CDR1은 플라스미드pABC3-CaCDR1A-GFP14로부터 팩I/NotI 단편으로 격리되어 pABC3-XLmGFPHis26으로복제되었다.
- PCR은 pABC3-CaCDR1-XLmGFPHe의 1-10 ng를 사용하여 고충실도 DNA 폴리머라제 및 프라이머 쌍 PDR5-pro/PDR5-ter35로 전체 CDR1 변환 카세트를 증폭하거나, 대안적으로, pABC3-CaCDR1-XLmGFP의 2 μg를 37°C에서 10U 제한 효소 AscI(도1A,B)로완료한다.
참고: CDR1 변환 카세트(도1A)는 PDR5 프로모터-CaCDR1-mGFPHis - PGK1 터미네이터 - URA3 선택 마커 - PDR5 다운스트림 영역으로 구성된다. - 아가로즈 젤 전기포고를 수행하고 젤 추출물 ~8 kb 변환 카세트를 수행한다.
참고: ~8kb CaCDR1 변환 카세트의 겔 정제는 가능한 소화되지 않은 플라스미드 DNA를 제거하여 게놈 PDR5 궤적에 통합된 선형 변환 카세트가 아닌 전체 플라스미드를 갖는 잘못된 변혁제로 이어질 수 있습니다. - 연어 정자 캐리어 DNA (2 mg/mL; 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7.5)의 필요한 양을 끓는 물 욕조에서 10 분 동안 분해하고 얼음을 유지합니다. 뚜껑을 열지 않도록 연어 정자 DNA를 끓이려면 나사로 덮인 튜브를 사용하십시오.
- 변성 연어 정자 DNA 50μL을 변형 카세트(500-2,000 ng)의 14μL과 혼합하고 추가 사용이 이될 때까지 64 μL의 DNA 혼합물을 얼음에 보관합니다.
참고: 대장균-효모셔틀 플라스미드(예를 들어, pYES2)의 10ng을 양성 변환제어(도 2B)로사용한다. - 30°C 수조에서 5분 동안 빠르게 해동된 신선하거나 얼어붙은 유능한 세포를 재연하고 1.5mL 마이크로센티심분리기 튜브에 50 μL 알리쿼트로 나눕니다.
- 최대 속도 (18,000 x g)에서미세 분리기에서 1 분 동안 원심 분리에 의해 세포를 수확하십시오.
- 상체를 제거하고 RT에서 셀 펠릿을 유지합니다.
- 각 변환에 대해, 260 μL 조합(RT)의 50% (w/v) 폴리에틸렌 글리콜(PEG 3350) 및 1M 리튬 아세테이트(LiAc)의 36 μL을 반복하여 얼음냉이 DNA 혼합물의 적절한 64μL을 혼합한다.
- 적절한 혼합물을 50 μL 유능한 셀 펠릿 알리쿼트에 즉시 넣습니다.
- 약 30초 동안 철저하게 소용돌이시킴으로써 PEG-LiAc-DNA 혼합물의 360 μL에서 세포 펠릿을 재연한다.
- 세포 혼합물을 30°C 수조에 1시간 동안 배양한다.
참고: ADΔ 및 ADΔΔ 셀은 42°C35보다30°C에서 더 잘 변형됩니다. - 10 s에 대 한 18,000 x g에서 세포를 수확. 상체를 버리고 ddH2O의 80 μL에서 셀 펠릿을 다시 분리하십시오.
- 세포를 CSM-URA 한천판(35)에 확산시면 아미노산이 없는 효모 질소 베이스(35), 0.077% (w/v) CSM 마이너스 우라실, 2% (w/v) 포도당, 2% (w/v) 한가르].
- 우라실 프로토트로프 변압제가 명확하게 보일 때까지 플레이트를 30°C에서 2-3일 동안 배양합니다.
참고: 선형 ~8kb CaCDR1 변환 카세트의 μg당 ~100개의 변압제를 기대하며 μg pYES2당 ~4 x 104 변압제를 기대합니다. - 5개의 독립적인 변압제를 선택하고 신선한 CSM-URA 플레이트에 퍼져 우라실 프로토트로프 변압제를 변형되지 않은 숙주 세포의 잔재로부터 분리합니다.
- YPG-생가 플레이트에서 변압제를 성장시켜 가능한 쁘띠 돌연변이를 제거 [1% (w/v) 효모 추출물, 2% (w/v) 펩톤, 2% (v/v) 글리세롤, 2% (w/v) 한마고](그림2D).
참고: 몸집이 작은 돌연변이는 결함이 있는 미토콘드리아를 가지고 있으므로 발효되지 않는 탄소 공급원에서 성장할 수 없습니다. 그들은 S. cerevisiae56에서매우 일반적이다 . S. 세레비시아 ADΔ 및 ADΔΔ는 특히 몸집이 작은 표현형을 획득하는 경향이 있다. - 효모 콜로니 PCR을 수행하고 불순한 DNA 템플릿 소스로부터 PCR 제품을 증폭시키는 데 최적화된 특정 DNA 폴리머라아제로 전체 ~8kb CaCDR1 변환 카세트를 증폭시킴으로써 게놈 PDR5 궤적(도1C)에올바르게 통합되는 3개의 독립적인 변압제를 확인한다. 단일 콜로니에서 DNA 템플릿으로 파생된 통합 부위 바로 바깥에 묶는 프라이머 세트와 단일 콜로니에서 파생된 세포 현탁액(ddH2O)의 1μL 알리쿼트를 사용합니다.
참고: 이 특정 DNA 폴리머라제는 그대로 효모 세포로부터 ~8kb PCR 단편을 안정적으로 증폭시다. 그러나, 신뢰할 수 있는 증폭을 위해, 45PCR 사이클이 필요하며, 효모 세포는 ddH2O에서 OD600 1-10에서 재중단되어야 한다. - PCR 반응의 1 μL 부분의 DNA 아가로즈 젤 전기포에 의해 올바른 ~8kb PCR 증폭 생성물을 확인한다.
- PCR 반응의 10 μL 부분에서 단일 가닥 DNA exonuclease및 인산염의 효소 혼합물로부터 과량 증폭 프라이머를 제거한 후 적절한 프라이머로 처리된 DNA 샘플의 일부를 사용하여 전체 ORF를 시퀀싱하기 전에 제조업체의 지시에 따라 인스파타아제.
3. 소규모 효모 플라즈마 멤브레인 격리 프로토콜
- 성장 효모 세포
- YPD의 10mL에서 단일 효모 식민지를 30°C에서 ~7-8h에 대해 200 rpm에서 흔들어 사전 배양한다.
- 10mL 사전 배양시로 YPD 배지의 40mL를 접종하고 세포 밀도가 1-3의 OD600에 도달할 때까지 200 rpm에서 흔들림으로 30°C o/n(~16h)에서 세포를 배양한다.
- 효모 세포 수확
- 40 개의 OD 단위 (ODU; 예를 들어, 4 °C에서 5 분 동안 4,200 x g에서 4,200 x g의 OD600에서 1 mL)를 수확하십시오.
- 얼음 냉간 멸균 ddH2O (즉, 40 mL 및 1 mL; 4 °C에서 5 분 동안 4,200 x g에서 원심 분리로 단계 사이에 있는 수확 세포)로 두 번 세포를 재일시 중단하고 세척하십시오.
- 1mL의 얼음 냉간 멸균 ddH2O로 펠릿을 재연하고 세포 현탁액을 미리 냉각된(얼음) 1.5mL 마이크로센트심분리기 튜브로 옮춥니다.
- 4°C에서 3분 동안 3,300 x g에서 셀을 수확하십시오.
- 상체를 흡인합니다.
- 세포 펠릿을 0.5mL 균질화 버퍼 [HB; 50mM Tris, 0.5 mM EDTA, 20% (v/v) 글리세롤; pH 7.5] 갓 보충한 1 mM 페닐메틸술폰실 불소(PMSF)로 재연한다.
참고: PMSF가 물에 노출되면 신속하게 비활성화되므로 항상 PMSF를 새로 추가하십시오.
주의: PMSF는 혈청 프로테아제 억제제로, 매우 부식성이 뛰어나고 조직에 파괴적입니다. 돌이킬 수 없는 눈 손상을 일으킬 수 있습니다. - 셀 서스펜션을 -80°C에 보관하거나 즉시 사용하십시오.
- 플라즈마 멤브레인의 격리
- 얼어 붙으면 얼음에 세포를 해동하여 ~1h로 해동합니다.
- 0.5mL 셀 서스펜션에 얼음 냉기 0.5mm 직경실리카 구슬을 추가하여 총 1mL의 부피에 도달합니다.
- 얼음에 3 분 냉각 기간산산재 1 분 동안 최대 흔들림 강도에서 소용돌이의 6 사이클과 세포를 깰.
- 가열 된 메스 블레이드로 튜브 바닥에 얇은 구멍을 만듭니다.
- 10s 저속(~200rpm) 스핀으로 또 다른 얼음-차가운 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 장착된 튜브 의 바닥을 통해 깨진 세포 균모를 수집합니다.
참고: 이로하여 실리카 구슬이 원래 튜브에 남아 있습니다. - 원심분리기 세포균질은 세포 이물질, 끊어지지 않은 세포 및 핵을 제거하기 위해 4°C에서 5분 동안 5,156 x g로 동모하게 한다.
- 450 μL의 상체를 얼음 차가운 1.5 mL 마이크로 센심분리기 튜브로 옮기고 신선한 PMSF (1 mM)로 보충된 얼음 차가운 HB 1mL을 추가합니다.
참고: 이 희석 단계는 고품질 플라즈마 멤브레인 단백질 회수에 매우 중요합니다. - 4°C에서 1시간 동안 17,968 x g의 플라즈마 멤브레인을 수확하고, 1mM PMSF로 새롭게 보충된 HB의 100μL에서 반복 파이펫팅을 통해 플라즈마 멤브레인 펠릿을 재연한다. HB의 100 μL 및 상하 파이펫을 방출하기 전에 100 μL 파이펫 끝으로 셀 펠릿을 교반하여 적절한 플라즈마 멤브레인 균질화를 위해 셀 펠릿을 풀어 놓습니다.
- 감소제 및 세제를 함유한 완충제와 호환되는 단백질 분석 키트로 플라즈마 멤브레인 제제의 단백질 농도를 측정합니다.
- 플라즈마 멤브레인을 -80°C에 보관하거나 즉시 사용할 수 있도록 얼음을 유지하십시오.
4. 나트륨 도데딜 황산폴리아크릴라미드 젤 전기포레시스 (SDS-PAGE)
- 폴리아크릴아미드 젤을 준비하기 위한 장치를 조립한다.
- 2개의 분리젤(7% 폴리아크릴아미드)의 경우, 아크릴아미드/비스 아크릴아미드의 2.1mL를 혼합하고, 4x 분리 완충제(1.5M Tris, 0.4% 나트륨 도데실 황산염[SDS] 및 pH 8.8mL 및 ddH2O.의 6.9mL를 추가하면 테트라메틸레틸레틸렌디아민(TEMED) 및 60μL의 10% 암몬 암증(AP)의 10%를 첨가한다.
주의: 아크릴아미드/비스 아크릴아미드는 매우 독성이 있습니다. 그것은 피부 자극, 말초 신경 병증을 일으키는 원인이 되고 발암물질입니다. TEMED는 삼키거나 흡입하면 유해합니다. APS는 삼키면 유해합니다. 그것은 심각한 눈과 피부 자극을 일으키는 원인이 됩니다. - 이 혼합물의 ~4~5mL를 조립된 젤 장치에 부어 위에서 ~ 2cm까지 붓습니다.
- 조심스럽게 층 ~1-2 mL 위에 0.1% SDS의 평면 반월 상 연골을 만듭니다.
- 폴리아크릴아미드가 RT에서 ~60분 동안 설정하도록 허용합니다.
- 아크릴아미드/비스 아크릴아미드의 0.5mL를 혼합하여 2개의 젤에 스태킹 젤 혼합물을 준비하고, 4x 스태킹 버퍼(0.5M Tris, 0.4% SDS(w/v); pH 6.8, ddH2O.의 6.9mL의 1mL은 TEMED 2 μL및 10% APS의 30 μL을 추가하여 아크릴아미드의 중합화를 개시한다.
- SDS의 흔적을 제거하기 위해 중합분리 젤으로부터 0.1% SDS 층을 제거하고 ddH2O로 헹구는다.
- 스태킹 젤 믹스를 분리 젤에 붓습니다.
- 빗을 스태킹 젤에 넣고 빗 주위에서 기포를 제거합니다.
- 스태킹 젤을 RT에서 ~60분 동안 설정하도록 허용합니다.
- 빗을 제거하고 물로 젤 슬롯을 헹구는 다. 젤 탱크에 젤을 넣고 1배 러닝 버퍼(24.8m Tris, 190m 글리신, 0.1% SDS)로 젤 탱크를 상단에 채웁니다.
참고: RT에 저장된 10x 버퍼 스톡(248m Tris, 1.9M 글리신, ddH2O)에서 1% SDS(w/v)에서 1배 의 실행 버퍼를 준비합니다. - 5-10 μL 플라즈마 멤브레인 샘플을 혼합(예: 10-20 μg 단백질) 2배 단백질 로딩 염료[120m Tris-HCl(pH 6.8), 글리세롤 20%, 브로모페놀 블루 0.02%, SDS 4%, 디티오트레이톨(DTT)]의 동일한 볼륨을 가진 개별 젤 슬롯에 즉시 적재되어 있는 개별 젤 슬롯에 적재한다.
주의: DTT는 삼키는 경우 유해합니다. 그것은 심각한 눈과 피부 자극을 일으키는 원인이 됩니다.
참고: 단백질 로딩 염료, 알리쿼트 및 저장 -20°C의 10mL 스톡을 만듭니다. 혼합 샘플을 가열하지 말고 GFP 태그가 변성되지 않도록 개별 젤 슬롯에 즉시 적재하고 인겔 형광 신호를 감지할 수 있습니다. - 단백질 분자량 마커(10-245 kDa 범위)를 별도의 슬롯에 적재하여 개별 단백질 단편의 크기 추정을 가능하게 합니다.
- 200V에서 젤 전기전도를 수행하여 블루 로딩 염료가 젤의 바닥에 도달할 때까지(보통 45-55분).
- 젤 이미징 시스템으로 인겔 GFP-형광에 대한 젤을 검사합니다(여기및 방출 파장은 각각 475-485 nm 및 520 nm입니다).
- 인젤 형광 이미징에 이어 RT에서 15분 동안 ~10-20mL 단백질 젤 고정 솔루션(40% 에탄올, 10% 아세트산)에서 젤의 부드러운 교반으로 단백질을 수정합니다.
- ddH2O의 10mL로 10분 동안 젤을 두 번 헹구고 RT에서 ~1h의 부드러운 흔들림으로 10mL 콜로이드 쿠마시 얼룩액에 젤을 배치하여 단백질 밴드를 시각화합니다.
- 단백질 밴드의 향상된 시각화를 위해 젤 이미징 시스템으로 이미지를 기록하기 전에 ddH2O의 ~20 mL ~20 mL에서 1~20mL에서 젤을 한두 번 염색하여 이미지를 기록합니다.
5. Cdr1 ATPase 활동 57의 결정
- 희석 플라즈마 멤브레인 샘플 > 2.2 mg/mL ~ 1-2 mg/mL HB.
- ATPase 분석 칵테일을 평형 (75 mM MES-Tris, 질산칼륨 75m, mM 암모늄 몰리보테, 7.5m암모늄, pH 7.5) 및 Mg-ATP(28.8m ATP 디나트륨 염, 28.8mM MgCl2;pH 7.0)에서 30°C로 30°C로 30°C에 30°C에 이르는.
주의: 아지드 나트륨은 매우 독성이 있습니다.
참고: 모든 완충제 주식과 병이 인산염이 없는지 확인하십시오. 즉, 1 % (vol /vol) HCl로 유리 제품을 세척하고 ddH2O로 여러 번 헹구는 다. 또한 유리 제품을 세척하는 데 사용되는 세제에 일반적으로 존재하는 인산염의 흔적이 포함 된 다른 유리 제품과 분리하십시오. - Cdr1-ATPase 억제제(올리고마이신의 20μM)의 유골에 96웰 마이크로티터 플레이트의 개별 우물에 분석 칵테일 90μL을 추가합니다.
참고 : 분석은 삼중에서 수행됩니다. - 격리된 플라즈마 멤브레인(~5-10 μg 단백질) 또는 인산염 표준(0-100 nmoles Pi)의 5μL을 미세티터 플레이트의 적절한 우물에 넣습니다.
참고: 두 개의 별도 인산염 표준 집합에 대한 첫 번째 및 마지막 열을 유지합니다. - 개별 우물에 멀티 채널 파이펫을 넣고 30°C에서 30°C에서 배양하여 28.8m Mg-ATP(6m M 최종 농도)의 25μL을 추가하여 분석서를 시작합니다.
- 개발 시약 130 μL(L-ascorbate 나트륨 1.6%, SDS 1%, 6M 황산에서 12% 암모늄 몰리바이트)를 추가하여 반응을 중지합니다.
주의: 농축 황산은 물과 격렬하게 반응합니다. 그것은 부식성이며 피부와 폐 손상을 일으킬 수 있습니다. - 10 분 동안 RT에서 인큐베이션.
- 마이크로티터 플레이트 판독기와 함께 750 nm에서 마이크로티터 플레이트 웰의 흡광도를 읽어보십시오.
참고: 블루 염료 발달(즉, 감소된 인산염 몰리브덴 복합체)을 위한 10분 배양 시간을 고수하는 것은 시간이 지남에 따라 블루 염료 개발이 계속되기 때문에 분석 정확도에 매우 중요합니다. - 올리고마이신이 없는 경우 총 ATPase 활동으로부터 올리고마이신의 존재에서 ATPase 활동을 빼서 Cdr1 특이적 ATPase 활동(즉, 올리고마이신에 민감한 ATPase 활동)을 획득한다.
6. 소규모 세제 화면
- Cdr1-mGFPHis를 GTED-20 버퍼 [10mM Tris와 결합한 세포의 플라즈마 멤브레인 제제(즉, 2.5 mg의 플라즈마 멤브레인 단백질)를 결합합니다. 0.5 mM EDTA, 20 % (w /v) 글리세롤; pH 7.5; 1 mM PMSF]로 새롭게 보충 된 5 mg의 시험 세제를 함유하고, 총 부피0.5 mL에 도달하여 1 % (w /v) 세제로 보충하였다.
- 회전 장치와 함께 혼합물을 4-8°C에서 2시간 동안 회전합니다.
- 1시간 동안 4°C에서 141,000 x g의 혼합물원심분리기.
- 용액 물질을 함유한 상체를 신선한 미세원심분리기 튜브로 옮기.
- 0.5mL의 GTED-20 완충제를 2% (w/v) SDS로 보충하여 불용성 펠릿 분획에 넣고 흔들리는 인큐베이터에 30°C o/n에서 배양하여 모든 세제 불용성 막 단백질을 추출합니다.
- SDS-PAGE를 통해 상복부 및 용해성 펠릿 분수를 분석하고 비교합니다.
- 쿠마시가 이미징 시스템을 통해 발현 수준을 염색하고 정량화하기 전에 인겔 GFP-형광을 위한 GFP 태그 단백질을 함유한 사진 젤.
- 형광 크기 배제 크로마토그래피 (FSEC)58과 같은 다운스트림 응용 분야에 용해성 막 단백질 분획을 사용하여 적합한 세제를 식별하십시오.
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Representative Results
S. 세레비시아에 ADΔΔ(~4 x 104 변압제/μg)의 고주파는 pYES2(도2B)로달성되었다. 예상대로, 노 DNA(즉, ddH2O만) 제어는 최적화된 ADΔΔ 변환 프로토콜을 통해 ~50트랜스펜션(도2C)을준 선형 CDR1-mGFPHis변형 카세트(도1A)의변압제를 제공하지 않았고, 1μg을 주지 않았다. CDR1-mGFPHis 변압제는 또한 결함이있는 미토콘드리아와 가능한 몸집이 작은 돌연변이를 제거하기 위해 발효 할 수없는 탄소 공급원에서 성장하는 능력에 대한 테스트되었습니다. 세 개(노란색 원; 도 2D) 테스트된 25개의 우라실-프로토트로프 변압제 중 YPG 한천판에서 성장할 수 없었고 추가 조사에서 폐기되었다. Cdr1-mGFP는 새로 생성된 균주 ADΔΔ-CDR1-mGFP가 플라즈마 멤브레인(도1A)에서적절히 국소화되고 Cdr1(그림3)의구조적 및 기능적 특성화를 위한 충분한 수준으로 발현되었다. 최적화된 이중태그(도 1B)의설계는 또한 Cdr1-mGFP의 니켈 친화성 정화에 따른 mGFPHis 이중 태그의 제거를 가능하게 하여 다운스트림 애플리케이션의 태그로부터의 간섭가능성을 방지한다. 예비 결과, 그러나, Cdr1과 HRV-3C protease 절단 부위 사이의 3 아미노산 링커가 더 빠르고, 더 효과적인, 분열을 달성하기 위해 확장되어야 할 수도 있음을 보여 주었다. 유사한 관측은 최근에 니켈-친화성수지(59)에결합된 세제(DDM)의 효율적인 분단을 위해 원래 설계된 3개의 아미노산 링커가 아닌 15를 필요로 하는 N-말단 태그뉴클레오시드 수송기 에슈리치아 대장균 NupC에 대해 보고되었다. HRV-3C 분열 부위의 5가지 아미노산 링커 C-단말은 이전에 C. utilis ABC 트랜스포터 Cdr139에대해 관찰한 관심 있는 단백질을 가진 mGFPHis 이중 태그의 조잡한 간섭을 방지한다. yEGFP3-A206K 돌연변이는 고단백농도(28)에서인공 GFP-이압을 방지하기 위해 만들어졌으며, mGFP와 그의 니켈 친화성 태그 사이의 추가 3개의 아미노산 링커는 니켈 친화성 수지(data)에 태그된 단백질의 결합 효율을 극대화하기 위해 그의 태그의 적절한 표면 노출을 보장한다.
도 1: 곰팡이 플라즈마 멤브레인 수송기의 효율적인 복제 및 발현을 위한 효모 막 단백질 발현 플랫폼입니다. (A) PDR5 프로모터(블루), CDR1(빨간색) C단말태그XLmGFPHis(녹색), PGK1 종단자(orange), URA3 선택 마커(blue), 및 PDR의 변형 영역(아래쪽)의 변형(아래쪽)의 변형(1) 및 PDR의 변형 영역(fDR) 발현(blue), 및 PDR의 변형 영역(blue) 및 PDR의 변형 영역(blue) 및 PDR)의 변형(1)을 사용하는.cer SDR의 변형 영역(fDR) 및 PDR의 변형 영역(fDR) 및 PDR의 변형 영역(blue) 및 변형영역(blue) 및 PDR의 변형(1) 및 PDR)의 변형 영역(blue) 및 PDR)의 변형(1) 및 PDR)의 변형 영역(blue) 및 PDR)의 변형(blue) 및 PDR)의 변형(blue) 및 및 PDR5 의 변형 마커(blue) 및 PDR5 의 변형(blue) 및 FDR)의 변형(blue), PGK1 종기(orange), 및 PDR5 셀렉션 마커(blue) 및 PDR5 의 변형 영역(blue) 및 PDR5 의 변형 마커(blue), 및 PDR5 의 변형 마커(blue) 및 PDR5 의 변형 영역(blue) 및 PDR5 배현영역( 유전체 PDR5 궤적에서 의 통합에 의해 ADΔΔ를 evisiae. 기능의 게인 돌연변이 전사 인자 Pdr1-3은 혈장 막에서 Cdr1 (빨간 팔각형)의 구성 과발현을 일으킵니다 (아래 공초점 현미경 이미지 참조). (B)기존의 복제 전략이나 변환 카세트를 생성하는 PCR 템플릿으로 사용할 수있는 플라스미드 pABC3-XLmGFPHis. pABC3-GFP14를 통해 플라스미드 pABC3-XLmGFP의 개선은 플라스미드 지도 아래에 나열됩니다. (C)ADΔΔ의 게놈 PDR5 궤적에서 변형 카세트를 통합하는 보다 효율적인 원스텝 복제 전략. ORF(빨간색)는 왼쪽 팔(blue)과 겹침을 만드는 프라이머(화살표)를 사용하여 PCR 증폭될 수 있다. PDR5 프로모터) 및 오른팔(녹색; XLmGFPHis-PGK1-URA3-PDR5 다운스트림) 조각. 돌연변이(black lines)는 필요한 경우 프라이머 설계에 의해 ORF에 도입될 수 있다. PDR5 궤적에서 올바른 통합을 지시하는 동종 재조합 이벤트는 교차된 파선으로 표시됩니다. (D)곰팡이 다중 약물 efflux 펌프의 기능적 특성화에 사용할 수있는 전세포 소사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: CDR1과ADΔΔ의 변환 -mGFPHis 변환 카세트 및 몸집이 작은 ADΔΔ-CDR1-mGFPHis 변환제의 제거. 우라실 프로토트로프 변압제는 3일 동안 30°C에서 CSM-URA 플레이트에 변형된 ADΔΔ 세포를 인큐베이팅하여 선택하였다. (A)음의 대조군(DNA 없음). (B)양수 제어 (pYES2의 10 ng). (C) CDR1-mGFPHis 변압제 (DNA의 1 μg). (D)시험 ADΔΔ-CDR1-mGFPYPG 천판에 몸집이 작은 표현형에 대한 변혁제. 결함이 있는 미토콘드리아로 인해 YPG 천판에서 자랄 수 없었던 몸집이 작은 변압제는 노란색으로 둘러싸여 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
GFP 형광은 Cdr1-mGFPHis(단계 3.3.9) 및 인겔 형광 신호(도 3A)의 양 사이에 선형 관계가 있었기 때문에 Cdr1 발현 수준에 대한 신뢰할 수 있는척도이다. 이 프로젝트에서는 플라즈마 멤브레인 단백질의 생화학적 특성화를 위한 고품질 의 소규모 플라즈마 멤브레인 제제의 신속한 생성을 위해 재현 가능한 최적화 워크플로우가 개발되었습니다. 거의 0.5 mg 의 혈장 막단백질(도 3C;왼쪽 그래프)을 생성하여 가장 높은 Cdr1 ATPase 활성(400 nmol/min/mg)을 나타내는 것이 가능했습니다. 그림 3C; 오른쪽 그래프) 40ODU의 로그산심상(OD600nm 의 1-3mL)을 깨뜨릴 때(0.5mL의 HB로 재장중단) 실리카 구슬의 동일한 부피(즉, 0.5mL)와 최대 흔들림 강도로 1분 동안 소용돌이를 6사이클로, 얼음에서 3분 냉각기간이 3분씩 이어진다. 파손 주기(Step 3.3.3)의 추가 증가는 절연 된 혈장 막 제제의 품질을 감소시켰습니다 (Cdr1 ATPase 활성은 170 nmol /min/mg에서 ~60 nmol/min/mg으로 떨어졌으며, 데이터는 표시되지 않음). 혈장 막 샘플의 SDS-PAGE 단백질 패턴은 더 많은 수의 파손 주기(표시되지 않은 데이터)로 깨진 세포로부터 분리되었지만, 10회 이상의 파손 주기 후 Cdr1 ATPase 활동이 거의 3배 감소했을 가능성이 높습니다: i) Cdr1의 부분 적인 내열량은 높은 온도에 노출로 인한 것이었다; ii) 인산화 또는 탈포식과 같은 번역 후 수정; 또는 iii) 다른 소기관의 막 분수와 격리 된 플라즈마 멤브레인 소포의 교차 오염을 증가. HB의 0.5 mL에서 세포의 40 ODU를 깨는 것은 플라즈마 막의 최고 품질을 산출 (즉, 플라즈마 막 단백질의 10 μg 당 가장 Cdr1; 그림 3B) Cdr1 ATPase 활성이 가장 높은(그림 3C;오른쪽 그래프). 더 높은 (> 40 ODU/0.5 mL 의 HB) 또는 낮은 (20 ODU/0.5 mL HB) 세포 밀도는 격리 된 혈장 멤브레인의 ATPase 활성을 감소(도 3C;오른쪽 그래프), 하지만, 그들의 수율은 세포 밀도 증가에 비례하여 증가(도 3C; 왼쪽 그래프). 따라서, 40 ODU/0.5 mL의 HB는 플라즈마 멤브레인의 최고 품질의 절연을 위한 최적의 세포 밀도였다. 따라서, 플라즈마 멤브레인 제제의 소규모 절연을 위한 최적화된 프로토콜을 사용하여 2-3배 더 높은 Cdr1 특이적 ATPase 활동(~300nmol/min/mg;; 그림 3C; 오른쪽 그래프) 처음에 얻은 Cdr1 특정 ATPase 활동(~100 nmol/min/mg; 데이터가 표시되지 않음)과 비교됩니다. 이러한 ATPase 활동은 또한 이전에 보고된 Cdr1 ATPase 활동(100-200 nmol/min/mg)보다 훨씬 높았으며, 이는 더 많은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되는 대규모 플라즈마 멤브레인 제제 프로토콜14,41,60으로수득되었다.
생물학적 막에서 막 단백질을 추출하는 가장 일반적인 방법은 세제로 용해도입니다. 그러나 문제는 단백질 안정성 및/또는 접이식 특성에 가장 해로운 영향을 미치는 적절한 세제를 찾는 것입니다. mGFP로 단백질을 라벨링하면 단백질 추출을 위한 최고의 세제를 선택하는 스크리닝이 용이합니다. 총 31개의 세제는 재료표에등재되어 있으며, 다양한 특성으로 S. cerevisiae ADΔΔ-CDR1-mGFPHis 세포의 조혈막으로부터 Cdr1을 용해시키는 능력에 대해 테스트되었다. 16개의 시험 세제(A-Q)의 대표적인 세트에 대한 결과는 도 3D로 나타낸다. 레인T, P 및 S는 세제 용해화(단계 6.2) 및 세제 불용성 펠릿(P) 직후 총 (T) 플라즈마 멤브레인 단백질의 10 μL 알리쿼트를 함유하고 있습니다. GTED-20의 0.5mL, 2% SDS; 단계 6.5 및 세제 용해성 중첩(S; step 6.4) 분획에서 141,000 x g에서초원심분리에 의한 분획을 용해시켰다. 원하는 세제는 구조 및/또는 기능을 변경하지 않고 가능한 한 많은 Cdr1-mGFPHis를 용해시켜야 합니다. 상기 조혈막 단백질(5 mg/mL)은 용해성(S)과 불용성(P)의 1%(w/v) 세제(T)와 알리쿼트(T)로 2시간 용용화되었고, 나중에는 형광 검출 크기-크롬-크롬(Fromatography)에 의해 분석되었다. 우리는 Cdr1의 효율적인 용해화를 위해 2:1 (w /w)의 최소 세제 대 단백질 비율이 필요하다고 결정했습니다. 실제로 Cdr1-mGFPHis의 용해화를 위해 요구되는 최적의 세제(DDM) 농도를 결정하기 위해 세제(x CMC)와 세제/멤브레인 단백질 비율(w/w)의 임계 미젤 농도를 조사하였다. Cdr1-mGFPHis의 용해화 효율에 큰 차이는 DDM의 10배 또는 80x CMC의 고정 농도를 사용할 때 관찰되었다. 용해성 화 효율은 다양한 용해도화 실험에 사용되는 원유 플라즈마 멤브레인의 양에 따라 40%와 80% 또는 60%와 90% 사이를 다양하게 조정하였다. 그러나, ≥2(w/w)의 단백질 비율에 세제를 선택하면 Cdr1-mGFP의 >85%가 용해도, 사용되는 플라즈마 막 단백질의 양에 관계없이 유익한 결과를 얻었습니다. 따라서 Cdr1-mGFPHis와 같은 멤브레인 단백질의 용용화를 위해 1% 또는 2% (w/v) 세제를 단순히 선택하는 일반적인 접근법을 사용하는 경우, 세제를 단백질 비에 2(w/w) 이상으로 유지하는 것이 중요하다[즉, 1%(즉, 10 mg.10 mg)를 사용할 때 플라즈마 막 단백질 농도를 5 mg/mL 이하로 유지하는 것이 중요하다.
도 3: Cdr1-mGFPHis 발현 수준, Cdr1-mGFPHis용 소규모 플라즈마 막 격리 프로토콜 및 세제 스크린의 최적화(A) Cdr1-mGFPHis의 정량화 인겔 형광을 통한 정량화; 쿠마시 염색 및 인겔 형광 SDS-PAGE 이미지는 동일한 0.7% 폴리아크릴아미드 겔의 왼쪽에 표시됩니다. 차선 1 에서 6은 ADΔΔ-CDR1-mGFPHis 플라즈마 멤브레인 단백질의 0.75, 1.5, 3, 6, 12 및 24 μg로 로드되었습니다. Cdr1-mGFP는 빨간색 화살표로 표시됩니다. M = 정밀 플러스 단백질 마커. mGFP 형광 강도(오른쪽에 도시됨)는 테스트된 전체 농도 범위 에 선형이 었으며 최소한의 배경 형광이 있었습니다. (b)격리된 혈장 멤브레인의 품질에 대한 파손시 세포 밀도의 효과. Coomassie 염색 폴리 아크라이글라미드 젤 (7%) 플라즈마 막 단백질 샘플의 (10 μg) 및 Cdr1-mGFP의 녹색 형광 신호 쿠마시 염색 하기 전에 동일한 젤의. M = 정밀 플러스 단백질 마커. 차선 1, 3, 5 및 7은 ADΔΔ 및 레인 2, 4, 6 및 8의 플라즈마 막 단백질이며 각각 20, 40, 60 및 80 ODU에서 분리된 ADΔΔ-CDR1-mGFP의 플라즈마 막 단백질이다. Cdr1-mGFP는 빨간색 화살표로 표시됩니다. 녹색 형광 신호의 상대 백분율은 아래에 나열됩니다. (C)Cdr1-mGFPHis의 격리된 혈장 막 및 ATPase 활성의 수율에 대한 파손시 세포 밀도의 효과. 왼쪽에서, ADΔΔ 및 ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (Cdr1) 세포로부터 분리된 혈장 막 단백질의 양에 대한 세포 밀도(ODU/0.5 mL HB)의 효과. 오른쪽에, ADΔΔ-CDR1-mGFPHis 세포로부터 분리된 플라즈마 멤브레인의 Cdr1 ATPase 활성에 대한 세포 밀도의 효과. (D)용해성 혼합물의 10 μL 알리쿼트의 예시적인 SDS-PAGE(T; 0.5 mL), 용해후 펠릿(P; 0.5mL), 및 ADΔΔ-CDR1-mGFPHis(상단) 및 Cdr1-mGFP의 용해성 조혈막 단백질의 용해화(supernatant) 분획(S; 0.5 mL) 및 Cdr1-m.FFP의 겔화(위)와 겔 내 형광(상단)의 겔화(co.kr)가 동일합니다. M = 넓은 MW 사전 스테인드 단백질 사다리 (245, 180, 135, 100, 75, 63 및 48 kDa 밴드; 180 kDa 및 75 kDa 밴드는 각각 빨간색과 녹색 화살표로 표시됩니다). 차선 A에서 L~ Q는 T, S, DM(A), β-DDM(B), α-DDM(C), TDM(D), LMNG(E), OGNG(F), OG(G), LDAO(H), 헤가(I), 메가 (J), 트리톤 X100 (K), CHAPS (L), NM (N), Tween80 (O), 포스 콜린-13 (P) 및 SDS (Q), 각각. 약어는 재료 표에정의됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
세제 스크리닝결과(도 3D),DDM(B 및 C) 및 포스콜린-13(P)에 기초하여 Cdr1-mGFPHis의 용해화를 위한 최고의 세제로 나타났다. 그러나, Fos-choline-13의 사용은 Cdr1-mGFPHis의 부분적인 proteolysis를 일으키는 원인이 되기 위하여 보였습니다 (그림 3D에서P). LMNG (E), PCC-α-M (표시되지 않음) 및 아마도 DM (A)도 다음 최고의 세제였다. 세제 스크린은 또한 글루코시드 OGNG(F) 및 OG(G), CHAPS(L), NM(N), 및 안제르겐트(도시되지 않음)가 Cdr1-mGFPHis의 용용화를 위한 나쁜 선택이었으며, 불용성 펠릿 분획(그림3D)에서상당량의 단백질이 발견되었다는 것을 보여주었다. SDS denatures Cdr1-XLmGFPHis, 그래서 어떤 녹색 형광 신호는 Q 레인에서 볼 수 없습니다(그림 3D).
제대로 접힌 네이티브 Cdr1-mGFPHis 입자의 용용화를 위한 세제의 적합성은 또한 세제 용해 플라즈마 멤브레인 단백질(단계 6.4 상피제)의 FSEC에 의해 평가되었다. ADΔ-CDR1-mGFPHis(2 mg/mL)로부터 100μL 조혈막 단백질을 1% 세제로 용해한 크로마토그램의 예가 도 4에도시된다. 9mL 용출 부피의 피크는 대부분 응집된 Cdr1-mGFP를 나타내며, 공극 부피에서 엘루트하는 반면, 제대로 용해되고 올바르게 접힌 Cdr1-mGFPHis 입자는 가우시안 모양의 피크로 15.5mL 용출 부피로 표현된다. 12mL에서 14mL 용출 부피 사이의 넓은 어깨는 아마도 덜 잘 정의 된 Cdr1-mGFPHis 미셀 입자 및 / 또는 부분 오접기 또는 단백질 응집체를 나타냅니다. 말토사이드와 LMNG 추출 단백질의 크로마토그램은 14mL(그림4A)에서약간 일찍 발동하는 작은 어깨가 있는 15.5mL에서 멋지게 모양의 가우시안 피크로서 Cdr1-mGFPHis의 대부분을 발동하는 것으로 나타났다. 이 견본에는 Cdr1-mGFPHis가 없는 공허 부피에서 용출하지 않았습니다. 빈 샘플은 mGFP 신호를 주지 않은 버퍼+ DDM 컨트롤입니다. 도 4B의 크로마토그램은 세제 용해성 Cdr1-mGFPHis 입자의 품질에 대한 설탕 헤드그룹의 유형의 중요성을 강조합니다. 세제를 함유하는 포도당(OG, NG, OGNG)은 세제(DDS)를 함유한 자당보다 더 나쁜 성과를 거두었으며, 이는 차례로 세제(NM, DMNG, DDM)를 함유하는 말토세보다 더 나빴다. Cdr1-mGFP는 3D로관찰된 GDR1-mGFP의 큰 비율으로부터 예상되는 응집(OG) 또는 광범위한 골재(NG, OGNG)로 용출된 세제를 함유한 포도당으로 용용되었다. 비록 DMNG 크로마토그램 (녹색; 도 4B) DDM 크로마토그램(파란색)과 질적으로 유사했다. 도 4B),DDM에 대한 높은 피크는 DMNG 용해Cdr1-mGFPHis의 상당 부분이 실제로 변성될 수 있음을 나타낸다. 도 4C는 zwitterionic 포스 콜린에 대한 FSEC 크로마토그램을 보여줍니다 (포스 콜린-8, Fos-choline-10, Fos-choline-13 및 2개의 비이온 세제(디지토닌, 트리톤-X100) 및 도 4D는 포스 콜린-8, -10, DM의 크로마토그램의 품질에 눈에 띄는 영향을 미치지 않았다. 디지노닌(주황색; 도 4C) DDM에 유사한 크로마토그램을 주었다 (파란색; 도 4C) 그리고, Fos-choline-13대칭 날카로운 모양의 피크를 주었지만, DDM(15.5mL)보다 훨씬 낮은 용출 부피(14mL)로 다시 한 번 출동했습니다. 전반적으로, 12 또는 13 탄소 잔류물의 더 긴 알리팔리아 측 체인세제에 의한 더 나은 용해도의 명확한 추세가 있었다; 예를 들어, DDM > DM > NM(12, 10, 또는 9탄소), 포스콜린-13 > 10 > 8(13, 10, 또는 8탄소), LMNG > DMNG(12, 10, 또는 8탄소)를 각각 >. 따라서, 12개 미만의 소수성 꼬리를 가진 세제는 12 또는 13개의 탄소의 더 긴 소수성 꼬리를 가진 세제보다는 Cdr1-mGFPHe의 용용화를 위한 훨씬 적게 적합한 세제, 및 비이온 세제(DDM, LMNG)는 일반적으로 zwitterionic 세제(도3D, 도 4)보다Cdr1-mGFPHis의 용용화에 더 적합한 것으로 보였다.
그림 4: Cdr1-mGFP에 대한 세제 스크리닝FSEC를 이용한 용용성. 용해성 ADΔΔ-CDR1-mGFPHis 조혈장 멤브레인(2 mg/mL)의 크로마토그램은 Superose 6-Increase 10/300 GL 크기 배제 열을 사용하여 표시 및 분리된 세제의 1%를 갖는다. 크로마토그램은 수집된 용출 버퍼의 한 컬럼 부피(CV; 25 mL)의 상대적인 mGFP 형광 단위(FU)를 묘사한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
멤브레인 단백질의 구조 적 분석이 최근 진행에도 불구하고 Cdr1 또는 다른 PDR 수송기를 위한 3D 구조는 현재 사용할 수 없습니다. 따라서 Cdr1 구조와 생화학 적 특징에 대한 지식을 얻는 것이 중요합니다.
멤브레인 단백질의 구조적 특성화를 위한 주요 요구 사항 중 하나는 X선 결정학 또는 극저온-EM에 필요한 수량으로 올바르게 접힌 및 그대로 막 단백질의 발현입니다. 발현 시스템을 선택할 때 중요한 기준은 사용의 용이성, 성장 속도 및 비용, 또한 단백질61,62의기능 및/또는 안정성에 중요할 수 있는 번역 후 변형으로 단백질을 표현하는 기능이다.
지난 2년 동안 S. cerevisiae 막 단백질 발현 기술60은 다양한 친화성, 에피토프 또는 리포터 태그와 N-또는 C-terminus에태그된 멤브레인 단백질의 1단계 복제를 용이하게 하기 위해14개의 최적화되었으며, 원하는 경우 발현 수준은 최대 2%로 50% 수준으로 예측 가능한수준으로상향 조정되었습니다. 이 다용도 플라즈마 멤브레인 단백질 발현 플랫폼을 통해 연구자들은 곰팡이 이펙럭스 펌프를 디테일하게 특성화할 수 있습니다. 펌프 기능의 전세포 분석의 개발 및 최적화는 다수의 주요 곰팡이 다약 efflux 펌프의 기판특이성 및 억제제 감도의 성공적인 특성화를 가능하게 했으며, 고처리량 약물 스크린에 채택되어 새로운42,43,44,또는 기존14,33,36,광스펙트럼 efflux 펌프를 개발하거나 개발하도록 확인했습니다. Cdr141에특이적인 새로운 efflux 펌프 억제제.
기존 식 플랫폼은 바시도미코타(C.neoformans Mdr1), P 와 같은14개의 필라멘트 균류를 포함한 다양한 곰팡이에서 곰팡이 ABC 수송기를 표현하는 데 성공적으로 사용되었습니다. marneffei (Abc1)37 및 많은 사카로마이코티나 종 (예를 들어, S. cerevisiae Pdr5, C. glabrata Cdr1 및 Cdr2, C. utilis Cdr1, C. krusei Abc1, Abc11 및 Abc12 및 C. albicans Cdr1) 및 C. albicans Cdr1 및 C. albicans Cdr1 및 C. albicans Cdr1 및 C. albicans Cdr1 및 C. albicans Cdr1 및 C. 14,24,32,36, 39,60,63은 제대로 접힌 인간 ABC 수송기64의높은 수준을 표현하는 적은 성공을 거두었습니다. 예비 결과는 이것이 이러한 수송기가 효모에서 적절한 발현과 기능에 필요한 특정 지질 환경 때문임을 나타냅니다. 이 공장 ABC 수송에 대 한 사실 수 있습니다 표시, 비록 이것은 아직 실험적으로 확인.
최적화된 소규모 플라즈마 멤브레인 격리 프로토콜로 수득된 Cdr1 ATPase 특이적 활동(즉, 오염방지 멤브레인을 이용한 제제)의 주요 이유는 2배입니다. ii) 미토콘드리아 효소의 포도당 억압으로 인한 미토콘드리아 오염을 감소시키는 중간 로그 단계에서 세포의 수확. 6개의 파손 주기 의 각 사이 3 분 냉각 기간은 플라즈마 막의 질에 아무영향 없이 연장될 수 있었습니다. 반복 동결 해동 주기는, 그러나, 격리된 플라즈마 멤브레인의 Cdr1 ATPase 활동이 매 추가 동결 해동 주기마다 ~10% 감소하기 때문에 피해야 한다. 이 때문에 여러 동결 해동 사이클에 대 한 필요성을 줄이기 위해 작은 알리 쿼로 플라즈마 멤브레인 샘플을 분할 하는 것이 좋습니다. mGFPHis 이중 태그는 정제 수율을 향상시키고 효율적인 1단계 세제 스크리닝을 가능하게 합니다. 이 구조를 사용하면 올바른 현지화, 적절한 접이식/인신 매매 및 열안정성을 쉽게 감지할 수 있습니다. 및 이중 태그는 필요한 경우, 시판되는 프로테아제와 함께 분열에 의해 제거될 수 있지만, 관심 있는 단백질과 태그 사이의 3아미노산 링커는 태그를 효율적으로 제거하기 위해 확장되어야 할 수도 있다.
이러한 프로토콜에서 여러 기능의 조합, 즉, 8 kb 변환 카세트의 콜로니 PCR 증폭을 위해 특별히 설계된 DNA 폴리머라제의 사용; 최적화된 고효율 효모 변환 방법; 동결 유능한 효모 주식을 만들 수있는 능력; 최적화된 소규모 플라즈마 멤브레인 제제 프로토콜은 고품질 ABC efflux 펌프의 고처리량 복제, 발현 및 특성화를 위한 최적화된 멤브레인 단백질 발현 플랫폼의 생성을 입증한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 뉴질랜드 마스덴 기금 (그랜트 UOO1305)의 자금 조달을 감사하게 인정하고, 의학 학부에서 블록 보조금을 인정, 출라롱콘 대학, 방콕, 태국 (M. Niimi). 그들은 박사 학위 장학금G. Madani를 제공 오타고 대학에 감사드립니다. 저자는 또한 스테판 라운서 교수와 그의 동료, 아미르 아펠바움 박사, 그리고 데이바야야바라시 비나야감 박사에게 감사를 표하고 싶다. 저자는 또한 G. Madani에게 MPIMP를 방문하는 연구 보조금 (57381332)을 제공 한 독일 학술 교환 서비스 (DAAD)에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) | Merck | 77-86-1 | |
| 2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside | Anatrace | NG310S | LMNG |
| 2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside | Anatrace | NG311S | OGNG (MNG-OG) |
| 2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside | Anatrace | NG322S | DMNG |
| 4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside | Glycon Biochemicals GmbH | D99019-C | PCC-α-M |
| 40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) | Bio-Rad | 1610148 | |
| Acetic acid (glacial) | Merck | 64-19-7 | |
| Agar | Formedium | 009002-18-0 | |
| Ammonium molybdate | Sigma-Aldrich | 13106-76-8 | |
| Ammonium persulphate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
| ATP disodium salt | sigma-Aldrich | A-6419 | |
| Bromophenol blue | SERVA Electrophoresis GmbH | 34725-61-6 | |
| CHAPS | Anatrace | C316S | |
| CHAPSO | Anatrace | C317S | |
| CSM | Formedium | DCS0019 | |
| CSM minus uracil | Formedium | DCS0161 | |
| Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | C324S | CYMAL-4 |
| Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | C327S | CYMAL-7 |
| Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | C321S | CYMAL-1 |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 11024-24-1 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roche Diagnostics | 10197785103 | |
| DMSO | Merck | 67-68-5 | |
| Ethanol | Merck | 459836 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) | Merck | 6381-92-6 | |
| ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent | Applied Biosystems | 78205 | A blend of exonuclease and phosphatase |
| Glucose | Formedium | 50-99-7 | |
| Glycerol | Merck | 56-81-5 | |
| Glycine | Merck | G8898 | |
| HEPES | Formedium | 7365-45-9 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003172510 | |
| KOD Fx Neo | TOYOBO Co | KFX-201 | Use for reliable colony PCR |
| lithium acetate (LiAc) | Sigma-Aldrich | 546-89-4 | |
| Magnesium chloride hexa-hydrate | sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES | Formedium | 145224-94-8 | |
| n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide | Anatrace | H110S | HEGA-10 |
| n-Decanoyl-N-methyl-glucamide | Anatrace | M320S | MEGA-10 |
| n-Decyl-phosphocholine | Anatrace | F304S | Fos-choline-10 |
| n-Decyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D322S | DM |
| n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ312S | Anzergent 3-12 |
| n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide | Anatrace | D360S | LDAO |
| n-Dodecyl-α-D-maltopyranoside | Anatrace | D310HA | α-DDM |
| n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310S | β-DDM |
| n-Nonyl-β-D-glucopyranoside | Anatrace | N324S | NG |
| n-Nonyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | N330S | NM |
| n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ318S | Anzergent 3-18 |
| n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ308S | Anzergent 3-8 |
| n-Octyl-phosphocholine | Anatrace | F300S | Fos-choline-8 |
| n-Octyl-β-D-glucopyranoside | Anatrace | O311S | OG |
| n-Tetradecyl-phosphocholine | Anatrace | F312S | Fos-choline-14 |
| n-Tetradecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | T315S | TDM |
| n-Tridecyl-phosphocholine | Anatrace | F310S | Fos-choline-13 |
| n-Tridecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | T323S | - |
| n-Undecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | U300S | UM (UDM) |
| N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Octylphenoxypolyethoxyethanol | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | TRITON X-100 |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Peptone | Formedium | 3049-73-7 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Diagnostics | 329-98-6 | |
| Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase | New England Biolabs | M0535S | High-fidelity DNA polymerase |
| polyethylene glycol (PEG 3350) | Sigma-Aldrich | 25322-68-3 | |
| polyoxyethylenesorbitan monooleate | Sigma-Aldrich | 9005-65-6 | TWEEN 80 |
| Potassium nitrate | Sigma-Aldrich | P8394 | |
| Protein Assay Kit | Bio-Rad | 5000122 | RC DC Protein Assay Kit II |
| QC Colloidal Coomassie Stain | Bio-Rad | 1610803 | |
| Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) | Abcam | AB116028 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma-Aldrich | 151-21-3 | SDS |
| Sodium L-ascorbate BioXtra | Sigma-Aldrich | 11140 | |
| Sucrose Monododecanoate | Anatrace | S350S | DDS |
| Sulphuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Yeast extract | Formedium | 008013-01-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 | |
| Equipment (type) | |||
| Centrifuge (Eppendorf 5804) | Eppendorf | ||
| Centrifuge (Beckman Ultra) | Beckman | ||
| Centrifuge (Sorvall RC6) | Sorvall | ||
| FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator) | Bio-Rad | ||
| Gel imaging (GelDoc EZ Imager) | Bio-Rad | ||
| Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection) | BioTek Instruments | ||
| PCR thermal cycler (C1000 Touch) | Bio-Rad | ||
| Power supply (PowerPac) | Bio-Rad | ||
| SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) | Bio-Rad | ||
| Shaking incubator (Multitron) | Infors HT, Bottmingen | ||
| Superose 6 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | GE17-5172-01 | |
| UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro) | Amersham BioSciences UK Ltd |
References
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