Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Småskalig plasmamembranpreparat för analys av Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Published: June 13, 2021 doi: 10.3791/62592
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 3, 1
1Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry, University of Otago, 2Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, 3School of Biological Sciences, University of Auckland
* These authors contributed equally

Summary

Denna artikel presenterar ett småskaligt plasmamembran isolering protokoll för karakterisering av Candida albicans ABC (ATP-bindande kassett) protein Cdr1, överuttryckt i Saccharomyces cerevisiae. En proteas-cleavable C-terminal mGFPHis dubbeltagg med en 16-restlänkare mellan Cdr1 och taggen utformades för att underlätta rening och tvättmedelsscreening av Cdr1.

Abstract

Den framgångsrika biokemiska och biofysiska karakteriseringen av ABC-transportörer beror starkt på valet av det heterologa uttryckssystemet. Under de senaste två decennierna har vi utvecklat en plattform för jästmembranproteinuttryck som har använts för att studera många viktiga svampmembranproteiner. Uttrycket värd Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ raderas i sju stora endogena ABC transportörer och det innehåller transkription faktorn Pdr1-3 med en vinst-av-funktion mutation som möjliggör den konstituerande överuttryck av heterologa membran protein gener stabilt integrerad som enskilda kopior vid den genomiska PDR5 locus. Skapandet av mångsidiga plasmidvektorer och optimeringen av enstegskloningsstrategier möjliggör snabb och exakt kloning, mutagenes och uttryck för heterologa ABC-transportörer. Här beskriver vi utvecklingen och användningen av en ny proteas-cleavable mGFPHis dubbel tagg (dvs. den monomeriska jästen förbättrade grönt fluorescerande protein yEGFP3 smält till en sex-histidin affinitet reningstaggg) som var utformad för att undvika eventuell störning av taggen med proteinet av intresse och att öka bindningseffektiviteten hos hans tagg till nickel-affinitet hartser. Fusionen av mGFPHis till membranproteinet ORF (öppen läsram) möjliggör enkel kvantifiering av proteinet genom inspektion av polyakrylamidgeler och detektion av nedbrytningsprodukter som behåller mGFPHis-taggen. Vi visar hur denna funktion underlättar tvättmedel screening för membran protein löslighet. Ett protokoll för effektiv, snabb och tillförlitlig isolering av de småskaliga plasmamembranpreparaten av C-terminally märkta Candida albicans multidrug efflux transportör Cdr1 överuttryckt i S. cerevisiae ADΔΔ, presenteras. Detta småskaliga plasmamembranisoleringsprotokoll genererar högkvalitativa plasmamembran inom en enda arbetsdag. Plasmamembranpreparaten kan användas för att bestämma enzymaktiviteterna hos mutantvarianterna Cdr1 och Cdr1.

Introduction

Extraktionen av integrerade membranproteiner från deras inhemska lipidmiljö kan dramatiskt påverka deras struktur ochfunktion 1,2,3,4. Den komplexa lipidsammansättningen av biologiskamembran 5 säkerställer att kritiskt viktiga protein-lipidinteraktioner kan uppstå6. Lipider upprätthåller membranproteinernas strukturella integritet, vilket gör det möjligt för dem att fungera korrekt i sitt membranfack destination(er)7,8. Därför är ett kritiskt första steg i membranproteinrening extraktionen av proteinet från sin ursprungliga miljö utan att påverka dess struktur och / eller funktion.

Det finns många hinder för att karakterisera strukturen hos membranproteiner, varav de flesta är relaterade till deras hydrofobiska natur, och svårigheterna att uttrycka korrekt vikta och funktionella membranproteiner i de mängder som krävs för röntgenkristallografi eller kryoelektronmikroskopi (cryo-EM)9,10,11,12. Det finns tre typer av membranproteinuttryckssystem: homolog9, heterolog13,14,15och in vitro-uttryckssystem 16,17. De ofta låga uttrycksnivåerna, eller de oöverkomliga kostnaderna, för många uttryckssystem lämnar bara ett fåtal värdar som det föredragna alternativet att producera membranproteiner. De inkluderar bakterievärden, Escherichia coli, jästarna S. cerevisiae och Pichia pastoris, och högre eukaryoter som Sf9 insektsceller eller däggdjurscelllinjer18. Alla membranproteinuttrycksteknik har fördelar och nackdelar; S. cerevisiae är dock kanske den bäst studerade eukaryota modellorganismen som lämpar sig för produktion av membranproteiner. Det är mycket mångsidigt med tillämpningar inom genteknik, läkemedelsupptäckt, syntetisk biologi och uttryck av eukaryota membranproteiner14,19,20,21.

I denna studie användes en patenterad S. cerevisiae membran protein uttryckteknik 21, med S. cerevisiae ADΔ14 och ADΔΔ22 som de föredragna värdarna (Figur 1A), att överuttrycka och studera de stora C. albicans multidrug efflux pump Cdr1. Båda S. cerevisiae stammarna är derivat av AD1-8u- 23 som har antingen ura3 (ADΔ) eller både ura3 och his1 (ADΔΔ) gener raderas för att eliminera eventuella falska positiva uracil eller histidin prototroph transformanter som uppstår genom oönskad integration vid URA3 eller HIS1ic lokus. Borttagningen av de 7 stora multidrogutflödespumparna23, som anges i figur 1A, gör ADΔΔ utsökt känslig för de flesta xenobiotika. Den funktionsförstärkningsfaktorn Pdr1-3 orsakar det konstituerande överuttryck av heterologa membranproteiner som Cdr1 (röda åttagoner i figur 1A) efter integrering av den heterologa ORF-innehållande omvandlingskassetten (figur 1A) vid den genomiska PDR5-locusen (blå rektangel i figur 1A) via två homologa rekombinationshändelser. Korrekt plasmamembranlokalisering av C-terminally mGFPHis märkta proteiner kan bekräftas genom konfokal mikroskopi (Figur 1A), och His-taggen kan användas för nickel-affinitet rening av det märkta proteinet. Kloning av vissa svamp ABC-transportörer (t.ex. Candida krusei ABC1) till pABC3-härledda plasmider var dock inte möjligt eftersom de inte kunde förökas i Escherichia coli på grund av celltoxicitet. Detta föranledde utvecklingen av enstegskloning avmembranproteiner 14,24 märkta vid antingen deras N- eller C-ändstation med olika affinitet, epitop eller reportertaggar direkt i S. cerevisiae ADΔΔ ( Figur1C). S. cerevisiae (S. cerevisiae) ADΔΔ-stammar som överuttrycker olika CDR1-mutanter kan också skapas effektivt på detta sätt genom att använda upp till fem enskilda PCR-fragment som överlappar varandra med 25 bp (Figur 1C). Med hjälp av detta protokoll kan många ORF av intresse klonas, uttryckas och karakteriseras till låg kostnad och med hög effektivitet inom en mycket kort tidsperiod. Omvandlingseffektiviteten minskar endast ~2-faldigt med varje ytterligare PCR-fragment.

Om så önskas kan uttrycksnivåer också lätt manipuleras av primerdesign för att förutsägbart justera uttrycksnivåer ner till någonstans mellan 0,1%-50% av de vanligtvis höga, konstituerande uttrycksnivåerna25. Den optimerade, multifunktionella, pABC314 derivatkloningsvektorn, pABC3-XLmGFPHis26 (Figur 1B) innehåller en HRV-3C proteas klyvningsplats (X; LEVLFQ| GP), en proteas som presterar bättre vid 4 °C än det ofta använda tobaksetsningviruset (TEV) proteas27. L är en fem aminosyra (GSGGS) linker, mGFP är en monomeric mutant (A206K)28,29 version av jästen förbättrad grön-fluorescens protein variant yEGFP330, och Hans är en tre aminosyra linker (GGS) följt av sex-hisoretidin (HHHHHH) nickel-affinitet protein rening tagg.

Denna uttrycksteknik har framgångsrikt använts vid läkemedelsupptäckt och studier av membranproteiner. Den första strukturen för ett svamp azole drog mål, S. cerevisiae Erg1131, löstes med hjälp av denna teknik. Det möjliggjorde också detaljerad karakterisering av C. albicans Cdr132,33,34 och skapandet av en cysteinbrist Cdr1-molekyl35 lämplig för cysteinkorslänkningsstudier för att verifiera framtida högupplöst struktur. Många andra ABC-transportörer från stora mänskliga svamppatogener (dvs. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei och Fusarium solani artkomplex) har också studerats i detalj med hjälp av detta uttryck plattform24,36,37,38,39. Detta har gjort det möjligt för generationen av en panel av S. cerevisiae stammar överuttryckande efflux pumpar som har använts i hög genomströmningsskärmar att upptäcka den nya fluorescerande effluxpumpen substrat Nile röd40 ochspecifika 41 och bredspektrum14,33,42,43,44 efflux pumporer. Användningen av detta system möjliggjorde också upptäckten av clorgyline som den första i sitt slag bredspektrum svamp multidrug efflux pumphämmare42.

Fullständig löslighet av membranproteiner och skapandet av ett homogent membranprotein-micelle-preparat utan endogena lipider kräver höga tvättmedelskoncentrationer45. Men tyvärr inaktiverar detta också ofta membranetproteinet 5,8,45,46. Egenskaperna hos tvättmedelsmonomerer och deras aggregering i lösning påverkas av de fysiska egenskaperna hos den hydrofobiska svansen, alkylkedjans längd och förgrening, närvaron av en aromatisk kärna eller fluoralkyl sidokedja eller antalet polyoxyetylenenheter. Således är tvättmedel screening ett viktigt första steg för att bestämma det lämpligaste tvättmedlet för membranproteinlöslighet och rening.

C. albicaner är en stor mänsklig svamppatogen hos immunkomprometterade individer som kan orsaka allvarliga, livshotande invasivainfektioner 47, och det kan bli resistent mot azole antifungalläkemedel48,49. En av de viktigaste mekanismerna för C. albicans multidrogresistens är överuttryck av Cdr150, som är en typ II ATP-bindande kassett (ABC)transportör 51 av ABCG underfamilj belägen i plasmamembranet. Fullstora svamp ABCG transportörer (bestående av två nukleotid bindande domäner [NBDs] och två transmembran domäner [TMDs]) är mer allmänt kända som pleiotropa läkemedelsresistens (PDR) transportörer och kännetecknas av deras unika inverterade domän topologi [NBD-TMD]2. PDR transportörer finns endast i växter52,53 och svampar54. Trots deras betydelse finns det inga strukturer för PDR-transportörer, även om strukturer för mänskliga halvstora ABCG-transportörer nyligen har lösts vilket hjälpte till att skapa den första preliminära modellen för Cdr133. Våra senaste experimentella bevis tyder dock på att denna modell är bristfällig möjligen för att svamp PDR-transportörer har karakteristiska asymmetriska NBDs som möjligen resulterar i en unik transportmekanism. En högupplöst struktur av Cdr1 krävs därför för både rationell design av nya effluxpumphämmare som kan hjälpa till att övervinna spillvattenmedierad läkemedelsresistens och för att ge insikter om verkningsmekanismen för denna viktiga ABC-transportörfamilj.

Syftet med denna studie var att utveckla tillförlitliga protokoll för uttryck, löslighet och rening av Cdr1 i den genetiskt modifierade S. cerevisiae uttryck värd, med det slutliga syftet att få en högupplöst struktur för Cdr1. Som en del av denna process utformades en proteas-klyvbar mGFPHis dubbeltagg (figur 1B) med en 16-restlänkare som separerade taggen från CDR1: s C-ändstation, vilket förbättrade bindningen av den bifogade 6x Hans affinitetsmärke till nickel-affinitethartset och möjliggjorde övervakning av Cdr1-uttrycksnivåer i levande celler och under hela reningsprocessen. Ett reproducerbart protokoll för småskaliga jäst plasmamembran protein preparat som innehåller cirka 10% C. albicans Cdr1 (uppskattas av Coomassie färgning efter SDS-PAGE) utvecklades också, som kunde användas för biokemiska karakterisering av Cdr1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av färska eller frysta lager av omvandlings kompetenta ADΔ- och ADΔΔ-celler

  1. Inokulera 25 ml 2x YPCD [dvs. 2x YPD; 2% (w/v) jästextrakt, 2% (w/v) pepton, 4% (w/v) dextros), 0,079 % (w/v) CSM (komplett tilläggsblandning)]35 medium med en enda jästkoloni och inkubera över natten (o/n) i 16 timmar vid 30 °C med skakningar vid 200 varv per minut (varvtal).
  2. Inokulera 225 ml 2x YPCD-medium med 25 ml o/n-odling och kontrollera cellens optiska densitet vid 600 nm (OD600). OD600 är vanligtvis ~0,5-1,0.
    OBS: Se i detta skede till att alla material som krävs för följande omvandlingsexperiment är lättillgängliga.
  3. Odla kulturen vid 30 °C i ytterligare ~6-8 h med skakningar vid 200 varv/min tills celltätheten når en OD600 på ~6-8.
    OBS: Följande steg utförs vid rumstemperatur (RT) om inget annat anges.
  4. Skörda dessa logaritmiska fasceller genom centrifugering vid 3 000 x g i 3 min.
  5. Återanvänd cellerna och tvätta dem två gånger med sterilt dubbeldestillerat vatten (ddH2O; dvs. 200 ml och sedan 20 ml).
  6. Skörda cellerna vid 3 000 x g i 3 min.
  7. Långsamt (dvs. tillsätt 30 lika många alikvoter av fryst kompetent celllösning (FCC) varje minut i 30 minuter) återanvänd cellpelleten i X ml FCC [5% (w/v) glycerol, 10% (v/v) dimetylsulfoxid (DMSO)] på is (där X = OD600;t.ex. om OD600 = 6 återanvänds i 6 ml, eller om OD600 = 3 återanvänds i 3 ml).
    OBS: Rätt FCC-sammansättning är avgörande för omvandlingsframgången.
  8. Håll cellerna på is i 2 timmar före omvandling eller förvara alikvoterna vid -80 °C tills det behövs.
    OBS: ADΔ- och ADΔΔ-celler är mycket känsliga för frysning. Således måste cellerna kylas ner långsamt till -80 °C: placera iskallt mikrocentrifugrör som innehåller 50-600 μL-cell alikvoter i en plastlagringslåda (RT). Placera lådan i en större polystyrenbehållare (RT) och stäng behållaren med ett passande polystyrenlock. Lägg sedan behållaren i frysen på -80 °C.
    VARNING: Långsam frysning är avgörande för cellöverlevnad.

2. Omvandling av ADΔ och ADΔΔ med CaCDR1-XLmGFPHis och bekräftelse av korrekta transformatorer genom koloni PCR- och DNA-sekvensering

OBS: Plasmid pABC3-CDR1-mGFPHis skapades med konventionella kloningsstrategier beskrivna i detalj i Lamping et al., 201055 och illustreras i figur 1B. Vilda typ C. albicans CDR1 isolerades som en PacI /NotI fragment från plasmid pABC3-CaCDR1A-GFP14 och klonades till pABC3-XLmGFPHis26.

  1. PCR förstärker hela CDR1-omvandlingskassetten med en DNA-polymeras med hög återgivning och primerpar pdr5-pro/PDR5-ter35 med 1-10 ng pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis som DNA-mall eller, alternativt, smälta 2 μg pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis till slutförande med 10 U begränsningsenzym AscI vid 37 °C (Figur 1A,B).
    OBS: CDR1-omvandlingskassetten (Figur 1A) består av PDR5-promotorn - CaCDR1-mGFPHis - PGK1 terminator - URA3-markeringsmarkör - PDR5 nedströmsregionen.
  2. Utför agarose gel elektrofores och gel extrakt ~ 8 kb omvandlingskassett.
    OBS: Gelrening av ~8 kb CaCDR1 omvandlingskassett tar bort alla möjliga osmält plasmid-DNA, vilket kan leda till felaktiga transformatorer som har hela plasmiden, snarare än den linjära omvandlingskassetten, integrerad vid den genomiska PDR5-locusen.
  3. Denature den erforderliga mängden lax spermabärare DNA (2 mg/ml; 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7.5) i 10 min i ett kokande vattenbad och hålla på is. Använd skruvbeklädda rör för kokande laxsperma-DNA för att undvika att locket öppnas.
  4. Blanda 50 μL denaturerat laxsperma-DNA med 14 μL av omvandlingskassetten (500-2 000 ng) och håll 64 μL DNA-blandningen på is tills vidare.
    OBS: Använd 10 ng av en E.coli-jästfärja plasmid (t.ex. pYES2) som en positiv omvandlingskontroll (figur 2B).
  5. Återanvända färska eller frysta kompetenta celler som snabbt tinats upp i 5 minuter i ett vattenbad på 30 °C och dela upp dem i 50 μL alikvoter i 1,5 ml mikrocentrifugrör.
  6. Skörda celler genom centrifugering i 1 min i en mikrofugering vid maximal hastighet (18 000 x g).
  7. Ta bort supernaten och behåll cellpelleten på RT.
  8. För varje omvandling, blanda 296 μL kombinationer (RT) på 260 μL 50% (w/v) polyetylenglykol (PEG 3350) och 36 μL 1 M litiumacetat (LiAc), genom upprepad pipetting, med lämpliga 64 μL iskalla DNA-blandningar.
  9. Tillsätt omedelbart lämplig blandning till en 50 μL kompetent cellpellets alikvot.
  10. Återanvänd cellpelleten i 360 μL PEG-LiAc-DNA-blandningen genom att noggrant virvla i ca 30 s.
  11. Inkubera cellblandningen i ett 30 °C vattenbad i 1 timme.
    OBS: ADΔ- och ADΔΔ-celler omvandlas bättre vid 30 °C än vid 42 °C35.
  12. Skörda cellerna på 18 000 x g i 10 s. Kassera supernatanten och återanvänd cellpelleten i 80 μL ddH2O.
  13. Sprid cellerna på en CSM-URAagarplatta 35 [dvs. 0,67% (w/v) jäst kvävebas utan aminosyror, 0,077% (w/v) CSM minus uracil, 2% (w/v) glukos och 2% (w/v) agar].
  14. Inkubera plattorna i 2-3 dagar vid 30 °C tills uracil prototroftransformatorerna är tydligt synliga.
    OBS: Förvänta dig ~100 transformatorer per μg linjär ~8 kb CaCDR1 omvandlingskassett och ~4 x 104 transformatorer per μg pYES2.
  15. Välj fem oberoende transformanter och sprid dem på en färsk CSM-URA-platta för att separera uracil prototroftransformanterna från rester av icke-omvandlade värdceller.
  16. Ta bort eventuella petite mutanter genom att odla transformatorerna på YPG-agarplattor [1% (w/v) jästextrakt, 2% (w/v) pepton, 2% (v/v) glycerol och 2% (w/v) agar] (Figur 2D).
    OBS: Petite mutanter har defekta mitokondrier och kan därför inte växa på icke-fermenterbara kolkällor. De är ganska vanliga i S. cerevisiae56. S. cerevisiae (S. cerevisiae) ADΔ och ADΔΔ är särskilt benägna att förvärva den petite fenotypen.
  17. Utför jästkoloni PCR och bekräfta att minst tre oberoende transformatorer är korrekt integrerade i den genomiska PDR5-locusen (Figur 1C) genom att förstärka hela ~ 8 kb CaCDR1 omvandlingskassett med en specifik DNA-polymeras som är optimerad för att förstärka PCR-produkter från orena DNA-mallkällor. Använd en uppsättning primers som binder strax utanför integrationsplatsen och 1 μL alikvoter av cellupphängningar (i ddH2O) som härrör från enstaka kolonier som DNA-mallar.
    OBS: Just detta DNA-polymeras förstärker tillförlitligt ~8 kb PCR-fragment från intakta jästceller. För tillförlitlig förstärkning krävs dock 45 PCR-cykler, och jästcellerna måste återanvändas vid OD600 1-10 i ddH2O.
  18. Bekräfta rätt ~8 kb PCR-förstärkningsprodukt med DNA-agarose gelelektrofores av en 1 μL del av PCR-reaktionen.
  19. Ta bort överflödiga förstärkare från en 10 μL-del av PCR-reaktionen med en enzymblandning av en dna-exonukleas med en enda sträng och ett fosfatas enligt tillverkarens instruktioner innan du sekvenserar hela ORF med hjälp av delar av det behandlade DNA-provet med lämpliga primers.

3. Protokoll för isolering av jästplasmamembran i liten skala

  1. Växande jästceller
    1. Förkultur en enda jästkoloni i 10 ml YPD vid 30 °C i ~7-8 h med skakningar vid 200 varv/min.
    2. Inokulera 40 ml YPD-medium med 10 ml förkultur och inkubera cellerna vid 30 °C o/n (~16 h) med skakningar vid 200 varv/min tills celltätheten når en OD600 av 1-3.
  2. Skörda jästceller
    1. Skörda 40 OD-enheter (ODU, t.ex. 1 ml vid en OD600 av 1 = 1 ODU) logaritmiska fasceller vid 4 200 x g i 5 min vid 4 °C.
    2. Återanvända och tvätta celler två gånger med iskallt sterilt ddH2O (dvs. 40 ml och sedan 1 ml; skörda celler mellan steg genom centrifugering vid 4 200 x g i 5 min vid 4 °C).
    3. Återanvänd pelleten i 1 ml iskallt sterilt ddH2O och överför cellfjädringen till ett förkylt (på is) 1,5 ml mikrocentrifugrör.
    4. Skörda celler vid 3 300 x g i 3 min vid 4 °C.
    5. Aspirera supernaten.
    6. Återanvänd cellpelleten i 0,5 ml homogeniserande buffert [HB; 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20% (v/v) glycerol; pH 7,5] nykompanjerat med 1 mM fenylmethylerulfonylfluorid (PMSF).
      OBS: Tillsätt alltid PMSF färskt eftersom PMSF inaktiveras snabbt vid exponering för vatten.
      VARNING: PMSF är en serinproteashämmare, som är extremt frätande och destruktiv för vävnader. Det kan orsaka irreversibel ögonskada.
    7. Förvara cellfjädringen vid -80 °C eller använd omedelbart.
  3. Isolering av plasmamembran
    1. Om de är frysta, tina cellerna på is i ~1 h.
    2. Tillsätt iskalla kiseldioxidpärlor med diametern 0,5 mm till 0,5 ml-cellfjädringen för att nå en total volym på 1 ml.
    3. Bryt celler med 6 cykler av virvel vid maximal skakningsintensitet i 1 min varvat med 3 min kylperioder på is.
    4. Gör ett tunt hål i botten av röret med ett uppvärmt skalpellblad.
    5. Samla den trasiga cellen homogenisera genom botten av röret monterad i ett annat iskallt 1,5 ml mikrocentrifugrör med en 10-s låghastighetsspinn (~ 200 rpm).
      OBS: Detta säkerställer att kiseldioxidpärlorna förblir i det ursprungliga röret.
    6. Centrifugera cellen homogent vid 5,156 x g i 5 min vid 4 °C för att avlägsna cellskräp, obrutna celler och atomkärnor.
    7. Överför 450 μL supernatant till ett iskallt 1,5 ml mikrocentrifugrör och tillsätt ytterligare 1 ml iskallt HB kompletterat med färsk PMSF (1 mM).
      OBS: Detta utspädningssteg är avgörande för den högkvalitativa återhämtningen av plasmamembranprotein.
    8. Skörda plasmamembran vid 17 968 x g i 1 timme vid 4 °C och återanvänd plasmamembranpelletsen genom upprepad pipetting i 100 μL HB som nyligen kompletterats med 1 mM PMSF. Lossa cellpelleten för korrekt plasmamembranhom homogenisering genom att omröra cellpelleten med pipettspetsen på 100 μL innan du släpper 100 μL HB och upp och ner pipettering.
    9. Mät proteinkoncentrationen i plasmamembranberedningen med ett proteintestkit som är kompatibelt med buffertar som innehåller reducerande medel och tvättmedel.
    10. Förvara plasmamembranen vid -80 °C eller förvara dem på is för omedelbar användning.

4. Natriumdcylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE)

  1. Montera apparaten för beredning av polyakrylamidgeler.
  2. För två separerande geler (7% polyakrylamid), blanda 2,1 ml 40% akrylamid/bis-akrylamid, 3 ml 4x avskiljande buffert (1,5 M Tris, 0,4% natriumdiddecylsulfat [SDS] (w/v); pH 8,8) och 6,9 ml ddH2O. Tillsätt 8 μL tetrametetyletylendiamin (TEMED) och 60 μL 10% ammoniumpersulfat (APS) för att initiera polymerisation av akrylamid.
    VARNING: Akrylamid/bis-akrylamid är mycket giftigt. Det orsakar hudirritation, perifer neuropati och är cancerframkallande. TEMED är skadligt vid förtätning eller inandning. APS är skadligt vid förtätningar. Det orsakar allvarliga ögon- och hudirritationer.
  3. Häll ~4-5 ml av denna blandning i den monterade gelapparaten, upp till ~ 2 cm från toppen.
  4. Lager försiktigt ~1-2 ml 0,1% SDS på toppen för att skapa en planar menisk.
  5. Låt polyakrylamiden ställas in på ~60 min på RT.
  6. Förbered en staplingsgelblandning för två geler genom att blanda 0,5 ml 40% akrylamid/bis-akrylamid, 1 ml 4x staplingsbuffert (0,5 M Tris, 0,4% SDS (w/v); pH 6,8) och 6,9 ml ddH2O. Tillsätt 2 μL TEMED och 30 μL 10% APS för att initiera polymerisation av akrylamid.
  7. Ta bort 0,1% SDS-skiktet från den polymeriserade separationsgelen och skölj med ddH2O för att ta bort spår av SDS.
  8. Häll staplingsgelblandningen på avskiljgelen.
  9. Placera en kam i staplingsgelen och ta bort eventuella luftbubblor runt kammen.
  10. Låt staplingsgelen ställas in på ~60 min på RT.
  11. Ta bort kammen och skölj gelspåren med vatten. Lägg gelén i geltanken och fyll geltanken till toppen med 1x löpbuffert (24,8 mM Tris, 190 mM glycin, 0,1% SDS).
    OBS: Förbered 1x löpbuffert från ett 10x buffertlager (248 mM Tris, 1,9 M glycin, 1% SDS (w/v) i ddH2O) lagrat på RT.
  12. Blanda 5-10 μL plasmamembranprover (dvs. 10-20 μg protein) med lika stora volymer 2x proteinbelastningsfärg [120 mM Tris-HCl (pH 6,8), 20% glycerol, 0,02% bromofenolblå, 4% SDS, 200 mMMMhiothreitol (DTT)] och lasta omedelbart i enskilda gelplatser nedsänkta i löpbuffert.
    VARNING: DTT är skadligt vid förtätning. Det orsakar allvarliga ögon- och hudirritationer.
    OBS: Gör ett 10 ml lager av 2x proteinbelastningsfärg, alikvot och förvara vid -20 °C. Värm inte de blandade proverna utan ladda dem omedelbart i enskilda gelspår så att GFP-taggen inte denatureras och fluorescenssignalerna i gel kan detekteras.
  13. Ladda proteinmolekylviktsmarkörer (10-245 kDa-intervall) i en separat spår för att möjliggöra storleksuppskattning av enskilda proteinfragment.
  14. Utför gelelektrofores vid 200 V tills det blå belastningsfärgämnet når botten av gelén (vanligtvis 45-55 min).
  15. Undersök gelén för GFP-fluorescens i gel med ett gelavbildningssystem (excitations- och emissionsvåglängder är 475-485 nm respektive 520 nm).
  16. Efter fluorescensavbildning i gel, fixera proteiner genom mild agitation av gelén i ~ 10-20 mL Protein Gel Fixing Solution (40% etanol, 10% ättiksyra) i 15 min vid RT.
  17. Skölj gelén två gånger i 10 min med 10 ml ddH2O och visualisera proteinbanden genom att placera gelén i 10 ml kolloidal Coomassie-fläcklösning med skonsam skakning i ~1 h på RT.
  18. För förbättrad visualisering av proteinband, avfläcka gelén en eller två gånger i ~20 ml ddH2O i ~1 h innan du spelar in bilder med gelavbildningssystemet.

5. Bestämning av Cdr1 ATPase-aktiviteter 57

  1. Utspädda plasmamembranprover >2,2 mg/ml till 1-2 mg/ml i HB.
  2. Jämvikta ATPase-analyscocktailen (75 mM MES-Tris, 75 mM kaliumnitrat, 0,3 mM ammoniummolybdat, 7,5 mM natriumazid; pH 7,5) och Mg-ATP (28,8 mM ATP disodiumsalt, 28,8 mM MgCl2; pH 7,0) till 30 °C i en 30 °C inkubator.
    VARNING: Natriumazid är mycket giftigt.
    OBS: Se till att alla buffertlager och flaskor är fosfatfria; t.ex. tvätta glasvaror med 1% (vol/vol) HCl och skölj det flera gånger med ddH2O. Håll det också separat från andra glas som sannolikt innehåller spår av fosfat som vanligtvis finns i tvättmedel som används för att tvätta glas.
  3. Tillsätt 90 μL analyscocktail med eller utan Cdr1-ATPase-hämmare (20 μM oligomycin) i enskilda brunnar av en 96-brunns mikrotiterplatta.
    OBS: Analysen utförs i tre exemplar.
  4. Tillsätt 5 μL av de isolerade plasmamembranen (~5-10 μg protein) eller fosfatstandarder (0-100 nmoles Pi) i mikrotiterplattans lämpliga brunnar.
    OBS: Behåll den första och sista kolumnen för två separata uppsättningar fosfatstandarder.
  5. Börja analysen genom att tillsätta 25 μL förvärmd 28,8 mM Mg-ATP (6 mM slutlig koncentration) med en flerkanalspipett i enskilda brunnar och inkubera vid 30 °C i 30 min.
  6. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 130 μL utvecklingsreagens (1,6% natrium L-ascorbat, 1% SDS, 12% ammoniummolybdat i 6 M svavelsyra).
    VARNING: Koncentrerad svavelsyra reagerar våldsamt med vatten. Det är frätande och kan orsaka hud- och lungskador.
  7. Inkubera på RT i 10 min.
  8. Läs mikrotiterplattans absorbans vid 750 nm med en mikrotiterplatta.
    OBS: Att hålla sig till inkubationstiden på 10 min för utveckling av blått färgämne (dvs. ett reducerat fosformolybdenkomplex) är avgörande för analysnoggrannheten eftersom utvecklingen av blått färgämne fortsätter med tiden.
  9. Erhåll den Cdr1-specifika ATPase-aktiviteten (dvs. den oligomycinkänsliga ATPase-aktiviteten) genom att subtrahera ATPase-aktiviteten i närvaro av oligomycin från den totala ATPase-aktiviteten i avsaknad av oligomycin.

6. Småskalig tvättmedelsskärm

  1. Kombinera plasmamembranpreparat (dvs. 2,5 mg plasmamembranprotein) av celler som överuttrycker Cdr1-mGFPHis med GTED-20-buffert [10 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20 % (w/v) glycerol; pH 7,5; nykomponerad med 1 mM PMSF] innehållande 5 mg testtvättmedel, för att nå en total volym på 0,5 ml kompletterad med 1% (w/v) tvättmedel.
  2. Rotera blandningen vid 4-8 °C i 2 timmar, med en rotationsanordning.
  3. Centrifugera blandningen vid 141 000 x g vid 4 °C i 1 timme.
  4. Överför supernatanten som innehåller lösligt material till ett färskt mikrocentrifugrör.
  5. Tillsätt 0,5 ml GTED-20-buffert kompletterad med 2% (w/v) SDS till den olösliga pelletsfraktionen och inkubera vid 30 °C o/n i en skakande inkubator för att extrahera allt tvättmedelslösligt membranprotein.
  6. Analysera och jämför de supernata och lösliga pelletsfraktionerna med SDS-PAGE.
  7. Fotografera geler som innehåller GFP-märkta proteiner för GFP-fluorescens i gel före Coomassie-färgning och kvantifiera uttrycksnivåer med bildsystemet.
  8. Använd den lösliga membranproteinfraktionen för nedströmstillämpningar såsom fluorescensstorleksuteslutningskromatografi (FSEC)58 för att identifiera lämpliga tvättmedel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En hög omvandlingsfrekvens av S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 transformanter/μg) uppnåddes med pYES2 (Figur 2B). Som förväntat gav kontrollen nr DNA (dvs. ddH2O) inga transformatorer, och 1 μg linjär CDR1-mGFPHis omvandlingskassett (Figur 1A) gav ~ 50 transformanter (figur 2C) med det optimerade ADΔΔ-omvandlingsprotokollet. CDR1-mGFPHis transformatorer testades också för deras förmåga att växa på en icke-fermenterbar kolkälla för att eliminera eventuella petite mutanter med defekta mitokondrier. Tre (gula cirklar; Figur 2D) av de 25 uracil-prototrof transformatorer som testats kunde inte växa på YPG agar plattor och kasserades från ytterligare undersökningar. Cdr1-mGFPHis uttryckt av den nyskapade stammen ADΔΔ-CDR1-mGFPHis är korrekt lokaliserad i plasmamembranet (Figur 1A) och uttrycktes på tillräckliga nivåer för strukturell och funktionell karakterisering av Cdr1 (Figur 3). Utformningen av den optimerade dubbeltaggen (Figur 1B) gör det också möjligt att ta bort mGFPHis dubbeltagg efter nickel-affinitet rening av Cdr1-mGFPHis för att förhindra eventuella störningar från taggen i nedströms applikationer. Preliminära resultat har dock visat att 3 aminosyra linker mellan Cdr1 och HRV-3C protease klyvning webbplats kan behöva förlängas för att uppnå snabbare, effektivare, klyvning. Liknande observationer rapporterades nyligen för N-terminally taggade nukleosid transportören Escherichia coli NupC, som krävde en 15 snarare än den ursprungligen utformade 3 aminosyra linker för effektiv klyvning av tvättmedel (DDM) löslig NupC bunden till Nickel-affinity harts59. 5 aminosyralänkaren C-terminalen på HRV-3C klyvningsplatsen förhindrar sterisk interferens av mGFPHis dubbeltagg med det bifogade proteinet av intresse, som vi tidigare har observerat för C. använd ABC transportör Cdr139. YEGFP3-A206K mutationen skapades för att förhindra artificiell GFP-dimerization vid höga protein koncentrationer28, och den ytterligare 3 aminosyra linker mellan mGFP och Hans Nickel-affinitet tagg säkerställer korrekt ytexponering av Hans tagg för att maximera bindning effektiviteten av taggade proteinet till nickel affinitet harts (data visas inte).

Figure 1
Figur 1:En plattform för proteinuttryck av jästmembran för effektiv kloning och uttryck av svampplasmamembrantransportörer. (A) En omvandlingskassett bestående av PDR5-promotorn (blå), CDR1 (röd) C-terminalt märkt med XLmGFPHis (grön), PGK1-terminatorn (orange), URA3-markeringsmarkören (ljusblå) och en bit av PDR5 nedströmsregionen (blå) används för att omvandla uttrycksvärden S.cer evisiae ADΔΔ genom integration vid den genomiska PDR5-locusen. Den funktionsförstärkta mutanta transkriptionsfaktorn Pdr1-3 orsakar den konstituerande överuttryck av Cdr1 (röda åttkantiga) i plasmamembranet (se confocal mikroskopibild under). (B) Plasmid pABC3-XLmGFPHis, som kan användas i en traditionell kloningsstrategi eller som en PCR-mall för att generera en omvandlingskassett. Förbättringar av plasmid pABC3-XLmGFPHis över pABC3-GFP14 listas under plasmidkartan. C)En alternativ effektivare kloningsstrategi i ett steg för att integrera omvandlingskassetten vid ADΔΔ:s genomiska PDR5-locus. En ORF (röd) kan PCR förstärkas med primers (pilar) som skapar överlappningar med vänster arm (blå; PDR5-promotor) och höger arm (grön; XLmGFPHis-PGK1-URA3-PDR5 nedströms) fragment. Mutationer (svarta linjer) kan introduceras i ORF genom primer design om det behövs. Homologa rekombinationshändelser som styr rätt integration vid PDR5-locus indikeras av de korsade streckade linjerna. (D) Hela cellanalyser som kan användas för funktionell karakterisering av svamp multidrogutflödespumpar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2:Omvandling av ADΔΔ med CDR1-mGFPHis omvandlingskassett och eliminering av petite ADΔΔ-CDR1-mGFPHis transformatorer. Uracil prototroph transformanter valdes genom inkubation omvandlade ADΔΔ celler på CSM-URA plattor vid 30 °C i 3 dagar. A)Negativ kontroll (inget DNA). B)Positiv kontroll (10 ng pYES2). (C) CDR1-mGFPHis transformatorer (1 μg DNA). D)Testning av ADΔΔ-CDR1-mGFPHis transformatorer för en liten fenotyp på YPG-agarplattor. Petite transformanter som inte kunde växa på YPG agarplattor på grund av defekta mitokondrier är omgiven i gult. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

GFP-fluorescensen är ett tillförlitligt mått för Cdr1-uttrycksnivåer eftersom det fanns ett linjärt samband mellan mängden Cdr1-mGFPHis (steg 3.3.9) och fluorescenssignaler i gel (figur 3A). I detta projekt utvecklades ett reproducerbart optimerat arbetsflöde för snabb generering av högkvalitativa småskaliga plasmamembranpreparat för biokemisk karakterisering av plasmamembranproteiner. Det var möjligt att generera nästan 0,5 mg plasmamembranprotein(figur 3C; vänster graf) som visar den högsta Cdr1 ATPase-aktiviteten ( ́400 nmol / min / mg; Figur 3C. höger graf) vid brytning av 40 ODU logaritmiska fasceller (OD600nm av 1-3) celler (återanvänds i 0,5 ml HB) med samma volym (dvs. 0,5 ml) kiseldioxidpärlor och 6 cykler virvlande i 1 min vid maximal skakningsintensitet följt av 3 min kylperioder på is. Ytterligare ökning av antalet brott cykler (steg 3.3.3) minskade kvaliteten på den isolerade plasmamembranpreparatet (Cdr1 ATPase aktivitet sjönk från 170 nmol/min/mg till ~60 nmol/min/mg; data visas inte). Även om det bara fanns mindre skillnader i SDS-PAGE proteinmönster i plasmamembranproverna isolerade från celler som brutits med högre antal brott cykler (data som inte visas), är det troligt att den nästan 3-faldiga reducerade Cdr1 ATPase aktiviteter efter 10 eller fler brott cykler orsakades av antingen: i) partiell denaturation av Cdr1 på grund av exponering för förhöjd temperatur; ii) Ändringar efter översättning, såsom fosforylering eller defosforylering. eller genom iii) ökad korskontaminering av de isolerade plasmamembranen med membranfraktioner av andra organeller. Att bryta 40 ODU av celler i 0,5 ml HB gav högsta kvalitet på plasmamembran (dvs. mest Cdr1 per 10 μg plasmamembranprotein; Figur 3B) med högsta CDR1 ATPase-aktivitet (Figur 3C; höger graf). Högre (> 40 ODU/0,5 ml HB) eller lägre (20 ODU/0,5 ml HB) celltäthet minskade ATPase-aktiviteten hos de isolerade plasmamembranen(figur 3C;höger graf), även om deras utbyte ökade i proportion till ökande celltäthet(figur 3C; vänster graf). Således var 40 ODU/0,5 ml HB den optimala celltätheten för isolering av plasmamembranens högsta kvalitet. Så med hjälp av det optimerade protokollet för småskalig isolering av plasmamembranpreparat ledde till 2-3 gånger högre Cdr1-specifika ATPase-aktiviteter (~ 300 nmol / min / mg; Figur 3C. höger graf) jämfört med de Cdr1-specifika ATPase-aktiviteter som ursprungligen erhölls (~100 nmol/min/mg; data som inte visades). Dessa ATPase aktiviteter var också betydligthögre 35 än någon tidigare rapporterade Cdr1 ATPase aktiviteter (100-200 nmol/min/mg) som hade erhållits med en mer arbetsintensiv och tidskrävande storskalig plasma membran förberedelseprotokoll 14,41,60.

Den vanligaste metoden för att extrahera membranproteiner från biologiska membran är löslighet med tvättmedel. Utmaningen är dock att hitta ett lämpligt tvättmedel som har minst skadlig effekt på proteinstabilitet och/eller vikegenskaper. Märkning av proteinet med mGFPHis underlättar screening för att välja det bästa tvättmedlet(erna) för proteinutvinning. Totalt testades 31 tvättmedel, listade i materialförteckningen, med olika egenskaper för deras förmåga att löslighet cdr1 från råa plasmamembran av S. cerevisiae ADΔΔ-CDR1-mGFPHis celler. Resultaten för en representativ uppsättning med 16 testtvättmedel (A-Q) visas i figur 3D. Körfälten T, P och S innehåller 10 μL alikvoter av totalt (T) plasmamembranprotein omedelbart efter löslighet av tvättmedel (steg 6.2) och tvättmedlet olöslig pellet (P; lösligt o/n i 0,5 ml GTED-20, 2% SDS; steg 6,5) och tvättmedlet lösligt övernatanter (S; steg 6,4) fraktioner efter separation genom ultracentrifugering vid 141 000 x g. Det önskade tvättmedlet bör lösliggöra så mycket Cdr1-mGFPHis som möjligt utan att ändra dess struktur och / eller funktion. Råplasmamembranproteinerna (5 mg/ml) lösligas i 2 timmar med 1% (w/v) tvättmedel (T) och alikvoter av lösliga (S) och olösliga (P) fraktioner analyserades av SDS-PAGE (Figur 3D) och senare även av fluorescensdetektering storleksuteslutning kromatografi (FSEC)58 (Figur 4). Vi fastställde att ett minsta tvättmedel till protein förhållandet 2:1 (w/w) krävdes för effektiv löslighet av Cdr1. För att bestämma den optimala DDM-koncentrationen (Detergent) som krävs för löslighet av Cdr1-mGFPHis undersöktes den kritiska micellekoncentrationen av tvättmedlet (x CMC) och förhållandet mellan tvättmedel/membranprotein (w/w). Stora skillnader i löslighet effektivitet av Cdr1-mGFPHis observerades när man använder fasta koncentrationer av 10x eller 80x CMC av DDM. Löslighetseffektiviteten varierade mellan 40% och 80% eller 60% och 90% beroende på mängden råa plasmamembran som används i de olika löslighetsexperimenten. Valet av förhållandet mellan tvättmedel och protein på ≥2 (w/w) gav dock reproducerbart goda resultat med >85% av Cdr1-mGFPHis som lösliggörs, oavsett mängden plasmamembranprotein som används. Så om du använder det vanligare tillvägagångssättet att helt enkelt välja 1% eller 2% (w/ v) tvättmedel för löslighet av membranproteiner som Cdr1-mGFPHis, är det viktigt att hålla tvättmedel till proteinförhållandet över 2 (w/ w) [dvs. hålla plasmamembranproteinkoncentrationen under 5 mg / mL när du använder 1% (dvs. 10 mg / mL) tvättmedel].

Figure 3
Figur 3:Kvantifiering av Cdr1-mGFPHis uttrycksnivåer, optimering av ett småskaligt protokoll för isolering av plasmamembran och tvättmedelsskärm för Cdr1-mGFPHis. (A) Kvantifiering av Cdr1-mGFPHis med fluorescens i gel; Coomassie-färgade och in-gel fluorescens SDS-PAGE bilder av samma 0,7% polyakrylamid gel visas till vänster. Körfält 1 till 6 laddades med 0,75, 1,5, 3, 6, 12 och 24 μg ADΔΔ-CDR1-mGFPHis plasmamembranprotein. Cdr1-mGFPHis indikeras med en röd pil. M = Precision Plus ProteinMarkör. MGFP fluorescens intensiteter (visas till höger) var linjära över hela koncentrationsområdet testas och det fanns minimal bakgrund fluorescens. B)Effekten av celltäthet vid brott på kvaliteten på isolerade plasmamembran. Coomassie färgade polyakrylamid gel (7%) av plasma membran protein prover (10 μg) och gröna fluorescens signaler av Cdr1-mGFPHis av samma gel före Coomassie färgning. M = Precision Plus ProteinMarkör. Körfälten 1, 3, 5 och 7 är plasmamembranproteiner av ADΔΔ och körfälten 2, 4, 6 och 8 är plasmamembranproteiner av ADΔΔ-CDR1-mGFPHis isolerade från 20, 40, 60 respektive 80 ODU av celler. Cdr1-mGFPHis indikeras med en röd pil. De relativa procentsatserna för de gröna fluorescerande signalerna listas under. (C) Effekten av celltäthet vid brott på utbytet av isolerade plasmamembran och CDR1-mGFPHis ATPase-aktivitet. Till vänster effekten av celltätheten (ODU/0,5 ml HB) på mängden plasmamembranprotein isolerat från ADΔΔ- och ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (Cdr1) celler. Till höger effekten av celltätheten på Cdr1 ATPase-aktiviteten hos plasmamembranen isolerade från ADΔΔ-CDR1-mGFPHis-celler. D)Exemplarisk SDS-PAGE på 10 μL alikvoter av löslighetsblandningen (T; 0,5 ml), pelleten efter löslighet (P; 0,5 ml) och de lösliga (supernatanta) fraktionerna (S; 0,5 ml) av tvättmedelslösliga råplasmamembranproteiner av ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (överst) och fluorescens i gel av Cdr1-mGFPHis före Coomassie-färgning av samma gel (botten). M = bred MW förfärgad proteinstege (245, 180, 135, 100, 75, 63 och 48 kDa band; 180 kDa respektive 75 kDa band indikeras med röda respektive gröna pilar). Körfält A till L och N till Q är T, S, och P-fraktioner för DM (A), β-DDM (B), α-DDM (C), TDM (D), LMNG (E), OGNG (F), OG (G), LDAO (H), Hega (I), Mega (J), Triton-X100 (K), CHAPS (L), NM (N), Tween80 (O), Fos-choline-13 (P) respektive SDS (Q). Förkortningar definieras i materialförteckningen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Baserat på resultaten av screeningen avtvättmedel (figur 3D),DDM (B och C) och Fos-kolin-13 (P) verkade vara de bästa tvättmedjan för löslighet av Cdr1-mGFPHis. Användningen av Fos-kolin-13 tycktes dock orsaka partiell proteolys av Cdr1-mGFPHis (P i figur 3D). LMNG (E), PCC-α-M (visas inte) och eventuellt även DM (A) var de näst bästa tvättmedel. Tvättmedelsskärmen visade också att glukosiderna OGNG (F) och OG (G), CHAPS (L), NM (N) och Anzergents (ej visade) var dåliga val för löslighet av Cdr1-mGFPHis eftersom betydande mängder av proteinet hittades i de olösliga pelletsfraktionerna (figur 3D). SDS denatures Cdr1-XLmGFPHis, varför inga gröna fluorescenssignaler är synliga i Q-körfälten (Figur 3D).

Lämpligheten av ett tvättmedel för löslighet av korrekt vikta inhemska Cdr1-mGFPHis partiklar bedömdes också av FSEC av tvättmedel lösliga plasmamembran protein (steg 6,4 supernatant). Exempel på kromatogram som erhållits för 100 μL råplasmamembranprotein från ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (2 mg/ml) lösligt med 1% tvättmedel visas i figur 4. Toppen vid 9 ml elueringsvolym representerar mestadels aggregerade Cdr1-mGFPHis som eluerar i tomrumsvolymen, medan korrekt lösliga och korrekt vikta Cdr1-mGFPHis-partiklar representeras av den gaussiska formade toppen vid 15,5 mL elueringsvolym. Den breda axeln mellan 12 och 14 ml elueringsvolym innehåller möjligen mindre väldefinierade Cdr1-mGFPHis micellepartiklar och/eller indikerar partiell felvecka eller proteinaggregat. Kromatogram av maltosides och LMNG extraherade proteiner visade de flesta cdr1-mGFPHis eluering som en snyggt formad gaussisk topp på 15,5 mL med en liten axel som eluerar något tidigare vid 14 ml (Figur 4A). Dessa prover hade ingen Cdr1-mGFPHis eluting i tomrummet volymen. Det tomma exemplet är bufferten plus DDM-kontrollen som inte gav någon mGFP-signal. Kromatogrammen i figur 4B belyser vikten av typen av sockerhuvudgrupp för kvaliteten på de lösliga Cdr1-mGFPHis-partiklarna. Glukoshaltiga tvättmedel (OG, NG, OGNG) presterade sämre än sackaroshaltiga tvättmedel (DDS), som i sin tur presterade sämre än maltoshaltiga tvättmedel (NM, DMNG, DDM). Cdr1-mGFPHis lösliga med glukoshaltiga tvätt- och rengöringsmedel som eluteds som aggregerad (OG) eller bred aggregerad topp (NG, OGNG), vilket kunde förväntas av den stora andelen Cdr1-mGFPHis fällning i pelletsfraktionerna för OGNG (F) och OG (G) som observerats i figur 3D. Även om DMNG-kromatogrammet (grön; Figur 4B) var kvalitativt likt DDM-kromatogrammet (blått; Figur 4B), de högre topparna för DDM indikerar att en stor del av DMNG-lösliga Cdr1-mGFPHis faktiskt kan denatureras. Figur 4C visar FSEC-kromatogrammen för de zwitterioniska fos-cholines (Fos-kolin-8, Fos-kolin-10, Fos-kolin-13) och två icke-joniska tvättmedel (digitonin, Triton-X100) och figur 4D visar hur lastning dubbelt så mycket (200 μL) tvättmedel lösligt protein inte hade någon märkbar effekt på kvaliteten på kromatogrammet för Fos-kolin-8, -10 och -13 och DDM. Endast digitonin (orange; Figur 4C) gav ett liknande kromatogram till DDM (blå; Figur 4C) och även om Fos-kolin-13 gav en symmetrisk skarpformad topp, eluterade den igen med en betydligt lägre elueringsvolym (14 ml) än den för DDM (15,5 ml). Sammantaget fanns det en tydlig trend med bättre löslighet av tvätt- och rengöringsmedel med längre alifatiska sidokedjor på 12 eller 13 kolrester. T.ex. DDM > DM > NM (12, 10 eller 9 kol), Fos-kolin-13 > 10 > 8 (13, 10 eller 8 kol) respektive LMNG > DMNG > OGNG (12, 10 eller 8 kol). Tvätt- och rengöringsmedel med hydrofoba svansar på mindre än 12 kol var således mycket mindre lämpliga rengöringsmedel för löslighet av Cdr1-mGFPHis än tvättmedel med längre hydrofoba svansar på 12 eller 13 kol. och icke-joniska tvättmedel (DDM, LMNG) verkade i allmänhet mer lämpliga för löslighet av Cdr1-mGFPHis än zwitterioniska rengöringsmedel(figur 3D, figur 4).

Figure 4
Bild 4:Rengöringsmedelsscreening för Cdr1-mGFPHis löslighet med FSEC. Kromatogram på 100 μL lösligt ADΔΔ-CDR1-mGFPHis råplasmamembran (2 mg/ml) med 1% av de angivna och separerade tvätt- och rengöringsmedel som anges och separeras med hjälp av en Superose 6-ökning 10/300 GL storlek uteslutningskolonn. Kromatogrammen visar de relativa mGFP fluorescensenheterna (FU) i en kolumnvolym (CV; 25 ml) av den insamlade elueringsbufferten. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Trots de senaste framstegen i den strukturella analysen av membranproteiner finns det för närvarande ingen 3D-struktur för Cdr1, eller någon annan PDR-transportör. Så att få kunskap om Cdr1-strukturen och dess biokemiska egenskaper är viktigt, eftersom detta inte bara kommer att ge insikt i rationell design av nya läkemedel för att övervinna spillflödesmedierad läkemedelsresistens, men också i funktionsmekanismen hos en viktig underfamilj av ABC-proteiner.

Ett av de viktigaste kraven för strukturell karakterisering av membranproteiner är uttrycket av korrekt vikt och intakt membranprotein i mängder som krävs för röntgenkristallografi eller kryo-EM. Viktiga kriterier vid val av uttryckssystem är användarvänlighet, tillväxthastigheter och kostnader, och även förmågan att uttrycka proteiner med post-translationella modifieringar som kan vara avgörande för funktionen och/eller stabiliteten hos ett protein61,62.

Under de senaste två decennierna har en S. cerevisiae membranproteinuttrycksteknik60 optimerats14 för att underlätta enstegskloning av membranproteiner av intresse24 taggade vid antingen deras N- eller C-ändstation med olika affinitets-, epitop- eller reportertaggar och, om så önskas, deras uttrycksnivåer förutspår förträngda till någonstans mellan 50% till så lågt som 0,1% av den maximala uttrycksnivån25. Denna mångsidiga plattform för plasmamembranproteinuttryck gör det möjligt för forskare att karakterisera svamputflödespumpar i detalj. Utvecklingen och optimeringen av hela cellanalyser av pumpfunktionen möjliggjorde en framgångsrik karakterisering av substratspecifikiteten24 och hämmarkänsligheten hos ett antal stora svamp multidrogutflödespumpar, och de användes i höggenomströmningsläkemedelsskärmar för att identifieranya 42,43,44, eller bekräftabefintliga 14,33,36, bredspektrum effluxpumphämmare eller för att utveckla nya effluxpumphämmare som är specifika för Cdr141.

Även om den befintliga uttrycksplattformen har använts framgångsrikt för att uttrycka svamp ABC transportörer från en rad svampar, inklusive Basidomycota (C. neoformans Mdr1),14 filamentösa svampar som P. marneffei (Abc1)37 och många Saccharomycotina arter (t.ex. S. cerevisiae Pdr5, C. glabrata Cdr1 och Cdr2, C. använda Cdr1, C. krusei Abc1, Abc11 och Abc12 och C. albicans Cdr1 och Cdr2), 14,24,32,36,39,60,63 det har varit mindre framgång som uttrycker höga nivåer av korrekt vikta mänskliga ABC transportörer64. Preliminära resultat tyder på att detta beror på den specifika lipidmiljön som dessa transportörer kräver för korrekt uttryck och funktion i jäst. Indikationer är att detta också kan gälla för anläggningar ABC transportörer, även om detta ännu inte har bekräftats experimentellt.

De främsta orsakerna till de betydligt högre Cdr1 ATPase-specifika aktiviteterna (dvs. preparat med mindre förorenande membran) som erhållits med det optimerade protokollet för isolering av plasmamembran i är tvåfaldiga: i) den mildare manuella cellbrytningen jämfört med att använda en pärl-visp för storskaliga plasmamembranberedningar; ii) skörd av celler i mitten av stockfasen, vilket minskar eventuell mitokondriell kontaminering på grund av glukosförtryck av mitokondriella enzymer. De 3 min kylningsperioderna mellan var och en av de sex brott cyklerna kunde förlängas utan någon märkbar effekt på kvaliteten på plasmamembranen. Upprepa frys-tina cykler ska dock undvikas eftersom Cdr1 ATPase aktiviteter av isolerade plasmamembran minskat med ~ 10% med varje ytterligare frys-tina cykel. Det är därför det rekommenderas att dela upp plasmamembranproverna i mindre alikvoter för att minska behovet av flera frys-tina cykler. MGFPHis dubbeltagg förbättrar reningsutbytet och möjliggör effektiv rengöringsscreening i ett steg. Genom att använda denna konstruktion kan korrekt lokalisering, korrekt vikning / handel och termostabilitet lätt upptäckas; och dubbelmärket kan vid behov avlägsnas genom klyvning med ett kommersiellt tillgängligt proteas, även om 3 aminosyralänkaren mellan proteinet av intresse och taggen kan behöva förlängas för effektivt avlägsnande av taggen.

Kombinationen av flera funktioner i dessa protokoll, nämligen användningen av ett DNA-polymeras speciellt utformat för kolonins PCR-förstärkning av 8 kb omvandlingskassetten; den optimerade högeffektiva jästomvandlingsmetoden; Förmågan att skapa frysta kompetenta jästlager. och det optimerade småskaliga plasmamembranberedningsprotokollet visar skapandet av en optimerad membranproteinuttrycksplattform som är mottaglig för hög genomströmningskloning, uttryck och karakterisering av svamp ABC-utflödespumpar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna erkänner tacksamt finansiering från Nya Zeeland Marsden Fund (Grant UOO1305), och ett blockbidrag från Medicinska fakulteten, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand (M. Niimi). De vill tacka Universitetet i Otago för att ha gett G. Madani ett doktorandstipendium. Författarna vill också uttrycka sin tacksamhet till professor Stefan Raunser och hans kollegor, Dr Amir Apelbaum, och Dr Deivanayagabarathy Vinayagam, för deras stöd och övervakning under ett 6-månaders besök av G. Madani vid Max Planck Institute of Molecular Physiology (MPIMP), Dortmund, Tyskland. Författarna tackar också den tyska akademiska utbytestjänsten (DAAD) för att ge G. Madani ett forskningsanslag (57381332) för att besöka MPIMP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES) Sigma-Aldrich M3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) Merck 77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG310S LMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside Anatrace NG311S OGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG322S DMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside Glycon Biochemicals GmbH D99019-C PCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) Bio-Rad 1610148
Acetic acid (glacial) Merck 64-19-7
Agar Formedium  009002-18-0
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich 13106-76-8
Ammonium persulphate (APS) Bio-Rad 1610700
ATP disodium salt sigma-Aldrich A-6419
Bromophenol blue SERVA Electrophoresis GmbH 34725-61-6
CHAPS Anatrace C316S
CHAPSO Anatrace C317S
CSM Formedium DCS0019
CSM minus uracil Formedium DCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C324S CYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C327S CYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C321S CYMAL-1
Digitonin Sigma-Aldrich 11024-24-1
Dithiothreitol (DTT) Roche Diagnostics 10197785103
DMSO Merck 67-68-5
Ethanol Merck 459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) Merck 6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent Applied Biosystems 78205 A blend of exonuclease and phosphatase
Glucose Formedium 50-99-7
Glycerol Merck 56-81-5
Glycine Merck G8898
HEPES Formedium 7365-45-9
Hydrochloric acid Merck 1003172510
KOD Fx Neo TOYOBO Co KFX-201 Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc) Sigma-Aldrich 546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydrate sigma-Aldrich M2393
MES Formedium 145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide Anatrace H110S HEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamide Anatrace M320S MEGA-10
n-Decyl-phosphocholine Anatrace F304S Fos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D322S DM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ312S Anzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide Anatrace D360S LDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranoside Anatrace D310HA α-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310S β-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Nonyl-β-D-maltopyranoside Anatrace N330S NM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ318S Anzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ308S Anzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholine Anatrace F300S Fos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranoside Anatrace O311S OG
n-Tetradecyl-phosphocholine Anatrace F312S Fos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T315S TDM
n-Tridecyl-phosphocholine Anatrace F310S Fos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T323S -
n-Undecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace U300S UM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Octylphenoxypolyethoxyethanol Sigma-Aldrich 9002-93-1 TRITON X-100
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351
Peptone Formedium 3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Diagnostics 329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase New England Biolabs M0535S High-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350) Sigma-Aldrich 25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleate Sigma-Aldrich 9005-65-6 TWEEN 80
Potassium nitrate Sigma-Aldrich P8394
Protein Assay Kit Bio-Rad 5000122 RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie Stain Bio-Rad 1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) Abcam AB116028
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sodium dodecyl sulphate Sigma-Aldrich 151-21-3 SDS
Sodium L-ascorbate BioXtra Sigma-Aldrich 11140
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350S DDS
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 339741
Yeast extract Formedium 008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804) Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra) Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6) Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator) Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager) Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection) BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch) Bio-Rad
Power supply (PowerPac) Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron) Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences GE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro) Amersham BioSciences UK Ltd

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  2. Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or complexes prepared in detergents. Crystals (Basel). 10 (2), 86 (2020).
  3. Lewinson, O., Orelle, C., Seeger, M. A. Structures of ABC transporters: handle with care. FEBS Letters. 594 (23), 3799-3814 (2020).
  4. Luckey, M. Membrane Structural Biology: With Biochemical and Biophysical Foundations. , Cambridge University Press. Ch. 4 69-105 (2014).
  5. Opekarova, M., Tanner, W. Specific lipid requirements of membrane proteins--a putative bottleneck in heterologous expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1610 (1), 11-22 (2003).
  6. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  7. Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids. Annual Review of Biochemistry. 66, 199-232 (1997).
  8. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1612 (1), 1-40 (2003).
  9. Ahn, J. H., Pan, J. G., Rhee, J. S. Homologous expression of the lipase and ABC transporter gene cluster, tliDEFA, enhances lipase secretion in Pseudomonas spp. Applied and Environmental Microbiology. 67 (12), 5506-5511 (2001).
  10. Newby, Z. E., et al. A general protocol for the crystallization of membrane proteins for X-ray structural investigation. Nature Protocols. 4 (5), 619-637 (2009).
  11. Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 61-72 (2016).
  12. Wiener, M. C. A pedestrian guide to membrane protein crystallization. Methods. 34 (3), 364-372 (2004).
  13. Grisshammer, R. Understanding recombinant expression of membrane proteins. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 337-340 (2006).
  14. Lamping, E., et al. Characterization of three classes of membrane proteins involved in fungal azole resistance by functional hyperexpression in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 6 (7), 1150-1165 (2007).
  15. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  16. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  17. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  18. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  19. Harvey, C. J. B., et al. HEx: A heterologous expression platform for the discovery of fungal natural products. Science Advances. 4 (4), (2018).
  20. Kingsman, S. M., Kingsman, A. J., Dobson, M. J., Mellor, J., Roberts, N. A. Heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 3, 377-416 (1985).
  21. Monk, B. C., et al. Yeast membrane protein expression system and its application in drug screening. US patent. , 8728797 NZ 513755, AU 2002330796, US 8728797 patent NZ 513755, AU 2002330796 (2002).
  22. Sagatova, A. A., Keniya, M. V., Wilson, R. K., Monk, B. C., Tyndall, J. D. Structural insights into binding of the antifungal drug fluconazole to Saccharomyces cerevisiae lanosterol 14alpha-demethylase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (8), 4982-4989 (2015).
  23. Decottignies, A., et al. ATPase and multidrug transport activities of the overexpressed yeast ABC protein Yor1p. The Journal of Biological Chemistry. 273 (20), 12612-12622 (1998).
  24. Lamping, E., Zhu, J. Y., Niimi, M., Cannon, R. D. Role of ectopic gene conversion in the evolution of a Candida krusei pleiotropic drug resistance transporter family. Genetics. 205 (4), 1619-1639 (2017).
  25. Lamping, E., Niimi, M., Cannon, R. D. Small, synthetic, GC-rich mRNA stem-loop modules 5' proximal to the AUG start-codon predictably tune gene expression in yeast. Microbial Cell Factories. 12, 74 (2013).
  26. James, J. E., Lamping, E., Santhanam, J., Cannon, R. D. PDR transporter ABC1 is involved in the innate azole resistance of the human fungal pathogen Fusarium keratoplasticum. Frontiers in Microbiology. , (2021).
  27. Ullah, R., et al. Activity of the human rhinovirus 3C protease studied in various buffers, additives and detergent solutions for recombinant protein production. PLoS One. 11 (4), 0153436 (2016).
  28. von Stetten, D., Noirclerc-Savoye, M., Goedhart, J., Gadella, T. W., Royant, A. Structure of a fluorescent protein from Aequorea victoria bearing the obligate-monomer mutation A206K. Acta Crystallographica Section F. Structural Biology and Crystalization Communications. 68, Pt 8 878-882 (2012).
  29. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  30. Cormack, B. P., et al. Yeast-enhanced green fluorescent protein (yEGFP): a reporter of gene expression in Candida albicans. Microbiology (Reading). 143, Pt 2 303-311 (1997).
  31. Monk, B. C., et al. Architecture of a single membrane spanning cytochrome P450 suggests constraints that orient the catalytic domain relative to a bilayer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3865-3870 (2014).
  32. Holmes, A. R., et al. ABC transporter Cdr1p contributes more than Cdr2p does to fluconazole efflux in fluconazole-resistant Candida albicans clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (11), 3851-3862 (2008).
  33. Tanabe, K., et al. FK506 resistance of Saccharomyces cerevisiae Pdr5 and Candida albicans Cdr1 involves mutations in the transmembrane domains and extracellular loops. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (1), 01146 (2019).
  34. Tanabe, K., et al. Chimeras of Candida albicans Cdr1p and Cdr2p reveal features of pleiotropic drug resistance transporter structure and function. Molecular Microbiology. 82 (2), 416-433 (2011).
  35. Madani, G., Lamping, E., Cannon, R. D. Engineering a cysteine-deficient functional Candida albicans Cdr1 molecule reveals a conserved region at the cytosolic apex of ABCG transporters important for correct folding and frafficking of Cdr1. mSphere. 6 (1), (2021).
  36. Lamping, E., et al. Abc1p is a multidrug efflux transporter that tips the balance in favor of innate azole resistance in Candida krusei. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 354-369 (2009).
  37. Panapruksachat, S., et al. Identification and functional characterization of Penicillium marneffei pleiotropic drug resistance transporters ABC1 and ABC2. Medical Mycology. 54 (5), 478-491 (2016).
  38. Wada, S., et al. Phosphorylation of Candida glabrata ATP-binding cassette transporter Cdr1p regulates drug efflux activity and ATPase stability. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 94-103 (2005).
  39. Watanasrisin, W., et al. Identification and characterization of Candida utilis multidrug efflux transporter CuCdr1p. FEMS Yeast Research. 16 (4), (2016).
  40. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  41. Niimi, K., et al. Specific interactions between the Candida albicans ABC transporter Cdr1p ectodomain and a D-octapeptide derivative inhibitor. Molecular Microbiology. 85 (4), 747-767 (2012).
  42. Holmes, A. R., et al. The monoamine oxidase A inhibitor clorgyline is a broad-spectrum inhibitor of fungal ABC and MFS transporter efflux pump activities which reverses the azole resistance of Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (3), 1508-1515 (2012).
  43. Reis de Sa, L. F., et al. Synthetic organotellurium compounds sensitize drug-resistant Candida albicans clinical isolates to fluconazole. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (1), 01231 (2017).
  44. Tanabe, K., et al. Inhibition of fungal ABC transporters by unnarmicin A and unnarmicin C, novel cyclic peptides from marine bacterium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 364 (4), 990-995 (2007).
  45. le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
  46. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  47. Pfaller, M. A. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs, and modes of transmission. Clinical Infectious Diseases. 22, Suppl 2 89-94 (1996).
  48. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clinical Microbiology Reviews. 22 (2), 291-321 (2009).
  49. Sanglard, D., et al. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (11), 2378-2386 (1995).
  50. Prasad, R., De Wergifosse, P., Goffeau, A., Balzi, E. Molecular cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple resistance to drugs and antifungals. Current Genetics. 27 (4), 320-329 (1995).
  51. Lamping, E., Madani, G., Lee, H. J., Niimi, M., Cannon, R. D. Candida albicans: Cellular and Molecular Biology. Prasad, R. , Chapter 18 379-406 (2017).
  52. Crouzet, J., Trombik, T., Fraysse, A. S., Boutry, M. Organization and function of the plant pleiotropic drug resistance ABC transporter family. FEBS Letters. 580 (4), 1123-1130 (2006).
  53. Kang, J., et al. Plant ABC Transporters. Arabidopsis Book. 9, 0153 (2011).
  54. Lamping, E., et al. Fungal PDR transporters: phylogeny, topology, motifs and function. Fungal Genetics and Biology. 47 (2), 127-142 (2010).
  55. Lamping, E., Cannon, R. D. Use of a yeast-based membrane protein expression technology to overexpress drug resistance efflux pumps. Methods in Molecular Biology. 666, 219-250 (2010).
  56. Day, M. Yeast petites and small colony variants: for everything there is a season. Advances in Applied Microbiology. 85, 1-41 (2013).
  57. Niimi, K., et al. Chemosensitization of fluconazole resistance in Saccharomyces cerevisiae and pathogenic fungi by a D-octapeptide derivative. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (4), 1256-1271 (2004).
  58. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  59. Hao, Z., et al. A novel and fast purification method for nucleoside transporters. Frontiers in Molecular Biosciences. 3, 23 (2016).
  60. Nakamura, K., et al. Functional expression of Candida albicans drug efflux pump Cdr1p in a Saccharomyces cerevisiae strain deficient in membrane transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3366-3374 (2001).
  61. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), 29191 (2011).
  62. Byrne, B. Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 32, 9-17 (2015).
  63. Holmes, A. R., et al. Heterozygosity and functional allelic variation in the Candida albicans efflux pump genes CDR1 and CDR2. Molecular Microbiology. 62 (1), 170-186 (2006).
  64. Keniya, M. V., et al. Drug resistance is conferred on the model yeast Saccharomyces cerevisiae by expression of full-length melanoma-associated human ATP-binding cassette transporter ABCB5. Molecular Pharmaceutics. 11 (10), 3452-3462 (2014).

Tags

Biologi nummer 172
Småskalig plasmamembranpreparat för analys av <em>Candida albicans</em> Cdr1-mGFPHis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., … More

Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., Niimi, M., Mitra, A. K., Cannon, R. D. Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis. J. Vis. Exp. (172), e62592, doi:10.3791/62592 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter