Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הכנת קרום פלזמה בקנה מידה קטן לניתוח קנדידה אלביקנס CDR1-mGFPHis

Published: June 13, 2021 doi: 10.3791/62592
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 3, 1
1Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry, University of Otago, 2Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, 3School of Biological Sciences, University of Auckland
* These authors contributed equally

Summary

מאמר זה מציג פרוטוקול בידוד קרום פלזמה בקנה מידה קטן לאפיון קנדידה albicans ABC (קלטת מחייבת ATP) Cdr1, overexpressed ב Saccharomyces cerevisiae. תג כפול של מסוף C-מחשוף של פרוטאז עם מקשר של 16 שאריות בין Cdr1 לתג תוכנן כדי להקל על הטיהור והקרנת חומר הניקוי של Cdr1.

Abstract

האפיון הביוכימי והביופיסי המוצלח של מובילי ABC תלוי במידה רבה בבחירת מערכת הביטוי ההטרולוגית. במהלך שני העשורים האחרונים, פיתחנו פלטפורמת ביטוי חלבון קרום שמרים ששימשה לחקר חלבונים רבים חשובים ממברנה פטרייתית. מארח הביטוי Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ נמחק בשבעה מובילי ABC אנדוגניים עיקריים והוא מכיל את גורם התמלול Pdr1-3 עם מוטציה רווח-של-פונקציה המאפשרת ביטוי יתר המרכיב של גנים חלבון ממברנה הטרולוגית משולבים ביציבות כעותקים בודדים על locus PDR5 הגנומי. יצירת וקטורים פלסמידים רב-תכליתיים ואופטימיזציה של אסטרטגיות שיבוט של שלב אחד מאפשרים שיבוט מהיר ומדויק, מוטגנזה וביטוי של מובילי ABC הטרולוגיים. כאן, אנו מתארים את הפיתוח והשימוש בתג כפול mGFPHis חדשני הניתן למחשוף פרוטאז (כלומר, שמרים מונומריים משופרים חלבון פלואורסצנטי ירוק yEGFP3 התמזגו לתג טיהור זיקה של שישה היסטידין) שנועד למנוע הפרעה אפשרית של התג עם חלבון העניין ולהגדיל את היעילות המחייבת של התג שלו לשרף זיקה ניקל. ההיתוך של mGFPHis לחלבון הממברנה ORF (מסגרת קריאה פתוחה) מאפשר כימות קל של החלבון על ידי בדיקה של ג'לים polyacrylamide וזיהוי של מוצרי השפלה שמירה על תג mGFPHis. אנו מדגימים כיצד תכונה זו מאפשרת הקרנת דטרגנט עבור solubilization חלבון ממברנה. פרוטוקול לבידוד יעיל, מהיר ואמין של תכשירי קרום הפלזמה בקנה מידה קטן של C-סופני קנדידה albicans רב-דראג שיגור efflux Cdr1 overexpressed ב S. cerevisiae ADΔΔ, מוצג. פרוטוקול בידוד קרום פלזמה בקנה מידה קטן זה מייצר ממברנות פלזמה באיכות גבוהה בתוך יום עבודה אחד. תכשירי קרום הפלזמה יכולים לשמש כדי לקבוע את פעילות האנזים של Cdr1 ו- Cdr1 וריאנטים מוטנטיים.

Introduction

מיצוי חלבונים ממברנה אינטגרליים מסביבת השומנים הטבעית שלהם יכול להשפיע באופן דרמטי על המבנה שלהםותפקוד 1,2,3,4. הרכב השומנים המורכב של ממברנות ביולוגיות5 מבטיח כי אינטראקציות חלבון-שומנים חשובות באופן קריטי יכול להתרחש6. שומנים שומרים על השלמות המבנית של חלבוני הממברנה, ובכך מאפשרים להם לתפקד כראוי ביעד תא הממברנהשלהם(ים) 7,8. לכן, צעד ראשון קריטי בטיהור חלבון הממברנה הוא הפקת החלבון מסביבתו הטבעית מבלי להשפיע על המבנה ו/או תפקודו.

ישנם מכשולים רבים לאפיון המבנה של חלבוני הממברנה, שרובם קשורים לאופי ההידרופובי שלהם, ואת הקשיים של ביטוי חלבוני ממברנה מקופלים כראוי פונקציונלי בכמויות הנדרשות קריסטלוגרפיה רנטגן או מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית (cryo-EM)9,10,11,12. ישנם שלושה סוגים של מערכות ביטוי חלבון ממברנה: הומולוג9, הטרולוגי13,14,15,ומערכות ביטוי במבחנה 16,17. רמות הביטוי הנמוכות לעתים קרובות, או העלויות האסורות, של מערכות ביטוי רבות משאירות רק פונדקאים מעטים כאפשרות המועדפת לייצר חלבוני ממברנה. הם כוללים את המארח החיידקי, Escherichia coli, שמרים S. cerevisiae ו Pichia פסטוריס, ו eukaryotes גבוה יותר כגון תאי חרק Sf9 או קווי תאים יונקים18. לכל טכנולוגיות ביטוי חלבון הממברנה יש יתרונות וחסרונות; עם זאת, S. cerevisiae הוא אולי האורגניזם המודל האוקריוטי הנחקר הטוב ביותר המתאים לייצור חלבון ממברנה. זה מאוד תכליתי עם יישומים בהנדסה גנטית, גילוי סמים, ביולוגיה סינתטית, ואת הביטוי של חלבונים ממברנה eukaryotic14,19,20,21.

במחקר זה, פטנט S. cerevisiae קרום ביטוי טכנולוגיית ביטוי21 שימש, עם S. cerevisiae ADΔ14 ו ADΔΔ22 כמו המארחים המועדפים (איור 1A), כדי להדגיש יתר על המידה וללמוד את משאבת efflux רב-תכליתי C. albicans הגדולה Cdr1. שני זני S. cerevisiae הם נגזרות של AD1-8u- 23 שיש להם גם את ura3 (ADΔ) או שניהם ura3 ו שלו1 (ADΔΔ) גנים שנמחקו כדי לחסל כל uracil חיובי שווא או פרוטוטרופים פרוטוטרופים הנובעים דרך שילוב לא רצוי ב URA3 או LOCI הגנומי HIS1. מחיקת 7 משאבות השפכים הרב-תכליתיות העיקריות23, המצוינות באיור 1A, הופכת את ADΔΔ לרגיש להפליא לרוב הקסנוביוטיים. גורם התמלול המוטנטי של הרווח-של-פונקציה Pdr1-3 גורם לביטוי יתר מהווה של חלבוני קרום הטרולוגיים כגון Cdr1 (מתומנים אדומים באיור 1A)לאחר שילוב של קלטת הטרנספורמציה ההטרולוגית-ORF המכילה (איור 1A) בלוקוס PDR5 הגנומי (מלבן כחול באיור 1A)באמצעות שני אירועי רקומבינציה הומולוגית. לוקליזציה נכונה של קרום פלזמה של חלבונים מתויגים C-סופניHis ניתן לאשר על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 1A), ואת התג שלו יכול לשמש לטיהור ניקל-זיקה של החלבון המתויג. שיבוט כמה מובילי ABC פטרייתיים (למשל, קנדידה krusei ABC1)לתוך pABC3 נגזר plasmids היה, עם זאת, לא אפשרי כי הם לא יכלו להיות מופצים Escherichia קולי בשל רעילות התא. זה הניע את הפיתוח של שיבוט שלב אחד של חלבוני ממברנה14,24 מתויגים ב- N שלהם או C-terminus עם זיקה שונים, אפיטופה, או תגי כתב ישירות לתוך S. cerevisiae ADΔΔ (איור 1C). ס. סרביסיה זני ADΔ מגזים בביטוי יתר של מוטציות CDR1 שונות יכולים גם להיווצר ביעילות בדרך זו באמצעות עד חמישה שברי PCR בודדים החופפים ב- 25 bp (איור 1C). באמצעות פרוטוקול זה, ORFs רבים של עניין ניתן לשכפל, להביע, ומאופיין בעלות נמוכה וביעילות גבוהה בתוך פרק זמן קצר מאוד. יעילות הטרנספורמציה מפחיתה פי 2 בלבד עם כל שבר PCR נוסף.

אם תרצה, ניתן גם לטפל ברמות הביטוי בקלות על-ידי עיצוב פריימר כדי לכוונן את רמות הביטוי כצפוי עד לכל מקום בין 0.1%-50% מרמות הביטוי הגבוהות בדרך כלל25. וקטור השיבוט הנגזר pABC314 הממוטב, pABC3-XLmGFPHis26 (איור 1B) מכיל אתר מחשוף פרוטאז HRV-3C (X; לוולפק| GP), פרוטאז שמבצע טוב יותר ב 4 °C (55 °F) מאשר וירוס תחריט טבק בשימוש תכוף (TEV) פרוטאז27. L הוא מקשר חמש חומצות אמינו (GSGGS), mGFP הוא מוטציה מונומרית (A206K)28,29 גרסה של שמרים משופר ירוק פלואורסצנטי חלבון yEGFP330, שלו הוא שלוש חומצות אמינו מקשר (GGS) ואחריו שישה היסטידין (HHHHHH) ניקל-זיקה חלבון תג.

טכנולוגיית ביטוי זו שימשה בהצלחה בגילוי תרופות ובחקר חלבוני ממברנה. המבנה הראשון עבור יעד תרופה אזול פטרייתי, S. cerevisiae Erg1131, נפתר באמצעות טכנולוגיה זו. זה גם איפשר את האפיון המפורט של C. albicans Cdr132,33,34 ויצירת מולקולת Cdr1 חסר ציסטאין35 מתאים מחקרים ציסטאין crosslinking כדי לאמת כל מבנה ברזולוציה גבוהה בעתיד. מובילים רבים אחרים של ABC מפתוגנים פטרייתיים אנושיים גדולים (כלומר, C. albicans, קנדידה גלברטה, קנדידה אאוריס, קנדידה קרוסיי, קנדידה אוטיליס, קריפטוקוקוס ניאופורמנים, אספרגילוס פומיגאטוס, פניציליום מרנפי ומתחם המינים פוסאריום סולני) נחקרו גם הם בפירוט באמצעות פלטפורמת ביטוי זו24,36,37,38,39. זה איפשר את הדור של פאנל של זני S. cerevisiae overexpressing משאבות שפכים ששימשו במסכי תפוקה גבוהה כדי לגלות את מצע משאבת השפכים הפלואורסצנטית החדשה40 ו41 ספציפית ורחבת טווח14,33,42,43,44 מעכבי משאבת שפכים. השימוש במערכת זו איפשר גם את גילוי קלורגילין כראשון מסוגו מעכב משאבת שפכים רב-תכליתית רב-תכליתית42.

סולוביליזציה מלאה של חלבונים ממברנה ויצירת קרום הומוגני חלבון-micelle הכנה נטולת שומנים אנדוגניים, דורש ריכוזי דטרגנט גבוהים45. אבל למרבה הצער, זה גם לעתים קרובות מנטרל את חלבון הממברנה5,8,45,46. המאפיינים של מונומרים דטרגנט וצבירה שלהם בפתרון מושפעים המאפיינים הפיזיים של הזנב ההידרופובי, האורך והסתעפות של שרשרת אלקיל, נוכחות של גרעין ארומטי או שרשרת צד פלואורואלקיל, או מספר יחידות פוליאוקסיאתילן. לכן, הקרנת דטרגנט היא צעד ראשון חשוב כדי לקבוע את חומר הניקוי המתאים ביותר עבור solubilization חלבון ממברנה וטיהור.

C. albicans הוא פתוגן פטרייתי אנושי גדול של אנשים אימונוקום כי יכול לגרום לזיהומים חמורים, סכנת חיים פולשניות47, וזה יכול להיות עמיד בפני תרופות נגד פטריות אזול48,49. אחד המנגנונים העיקריים של התנגדות multidrug C. albicans הוא ביטוי יתר של Cdr150, שהוא סוג II ATP מחייב טרנספורטר (ABC) טרנספורטר51 של ABCG subfamily הממוקם בקרום הפלזמה. מובילי ABCG פטרייתיים בגודל מלא (המורכבים משני תחומים מחייבים נוקלאוטידים [NBDs] ושני תחומים טרנס-מברניים [TMDs]) ידועים יותר בשם מובילי התנגדות לתרופות פליוטרופיות (PDR) ומאופיינים בטופולוגיית הדומיין ההפוכה הייחודית שלהם [NBD-TMD]2. מובילי PDR נמצאים רק בצמחים52,53 ופטריות54. למרות חשיבותם, אין מבנים עבור מובילי PDR, אם כי מבנים עבור מובילי ABCG בגודל חצי אדם נפתרו לאחרונה אשר סייע ליצור את המודל ההססני הראשון עבור Cdr133. הראיות הניסיוניות האחרונות שלנו מצביעות, עם זאת, כי מודל זה פגום אולי בגלל מובילי PDR פטרייתי יש NBDs אסימטרי אופייני וכתוצאה מכך ייתכן מאוד במנגנון תחבורה ייחודי. מבנה ברזולוציה גבוהה של Cdr1 נדרש, אם כן, הן עבור העיצוב הרציונלי של מעכבי משאבת שפכים חדשניים שעשויים לסייע להתגבר על עמידות לתרופות בתיווך שפכים, והן כדי לספק תובנות על מנגנון הפעולה של משפחת טרנספורטר חשובה זו של ABC.

מטרת מחקר זה הייתה לפתח פרוטוקולים אמינים לביטוי, סולוביליזציה וטיהור של Cdr1 במארח הביטוי S. cerevisiae מהונדס גנטית, במטרה הסופית להשיג מבנה ברזולוציה גבוהה עבור Cdr1. כחלק מתהליך זה, תג כפול mGFPHis באורך פרוטאז (איור 1B) תוכנן עם מקשר של 16 שאריות המפריד בין התג לבין מסוף C של Cdr1, אשר שיפר את הכריכה של תג הזיקה שלו 6x המצורף לשרף זיקת ניקל ואיפשר ניטור של רמות הביטוי Cdr1 בתאים חיים ובמהלך כל תהליך הטיהור. פרוטוקול לשחזור עבור תכשירי חלבון פלזמה שמרים בקנה מידה קטן המכיל כ 10% C. albicans Cdr1 (כפי שהוערך על ידי כתמי Coomassie לאחר SDS-PAGE) פותח גם, אשר יכול לשמש לאפיון הביוכימי של Cdr1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מלאי טרי או קפוא של תאי ADΔ ו- ADΔΔ

  1. לחסן 25 מ"ל של 2x YPCD [כלומר, 2x YPD; 2% (w/v) תמצית שמרים, 2% (w/v) פפטון, 4% (w/v) דקסטרוז), 0.079 % (w/v) CSM (תערובת תוספת מלאה)]35 בינוני עם מושבת שמרים אחת ודגרה לילה (o/n) עבור 16 שעות ב 30 °C עם רועד ב 200 מהפכות לדקה (סל"ד).
  2. לחסן 225 מ"ל של 2x YPCD בינוני עם 25 מ"ל o / n תרבות ולבדוק את הצפיפות האופטית של התא ב 600 ננומטר (OD600); OD600 הוא בדרך כלל ~ 0.5-1.0.
    הערה: בשלב זה ודא כי כל החומרים הנדרשים לניסוי הטרנספורמציה הבא זמינים בקלות.
  3. לגדל את התרבות ב 30 °C (6-8 שעות) עם רעד ב 200 סל"ד עד צפיפות התא מגיע OD600 של ~ 6-8.
    הערה: השלבים הבאים מבוצעים בטמפרטורת החדר (RT) אלא אם צוין אחרת.
  4. קציר תאים אלה שלב לוגריתמי על ידי צנטריפוגה ב 3,000 x g במשך 3 דקות.
  5. resuspend התאים לשטוף אותם פעמיים עם מים סטריליים מזוקקים כפולים (ddH2O; כלומר, 200 מ"ל ולאחר מכן 20 מ"ל).
  6. לקצור את התאים ב 3,000 x g במשך 3 דקות.
  7. לאט (כלומר, להוסיף 30 aliquots שווה של תא מוסמך קפוא (FCC) פתרון כל דקה במשך 30 דקות) resuspend גלולה התא ב X mL של FCC [5% (w/ v) גליצרול, 10% (v / v) דימתיל סולפוקסיד (DMSO)] על קרח (שם X = OD600; למשל, אם OD600 = 6 resuspend ב 6 מ"ל, או אם OD600 = 3 resuspend ב 3 מ"ל).
    הערה: הרכב ה- FCC הנכון הוא קריטי להצלחת הטרנספורמציה.
  8. שמור על תאים על קרח במשך 2 שעות לפני ההמרה או לאחסן aliquots ב -80 °C (70 °F) עד הצורך.
    הערה: תאי ADΔ ו- ADΔΔ רגישים מאוד להקפאה. לכן, יש לקרר תאים לאט עד -80 °C (80 °F): למקם צינורות microcentrifuge קר כקרח המכיל 50-600 aliquots תא μL לתוך תיבת אחסון פלסטיק (RT). מניחים את הקופסה במיכל פוליסטירן גדול יותר (RT) וסוגרים את המיכל עם מכסה פוליסטירן מתאים. לאחר מכן, לשים את המיכל לתוך -80 °C מקפיא.
    זהירות: הקפאה איטית היא קריטית להישרדות התא.

2. טרנספורמציה של ADΔ ו- ADΔΔ עם CaCDR1-XLmGFPHis ואישור של טרנספורמטורים נכונים על ידי PCR המושבה ורצף DNA

הערה: Plasmid pABC3-CDR1-mGFPHis נוצר באמצעות אסטרטגיות שיבוט קונבנציונליות המתוארות בפירוט ב Lamping et al., 201055 והוא מאויר באיור 1B. סוג פראי C. albicans CDR1 היה מבודד כמו PacI /לאאני שבר מ plasmid pABC3-CaCDR1A-GFP14 משובט לתוך pABC3-XLmGFPHis26.

  1. PCR להגביר את כל קלטת טרנספורמציה CDR1 עם פולימראז DNA בנאמנות גבוהה וזוג פריימר PDR5-pro /PDR5-ter35 באמצעות 1-10 ננוגרם של pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis כתבנית DNA או, לחלופין, לעכל 2 מיקרוגרם של pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis כדי להשלים עם אנזים הגבלת U AscI ב 37 °C (איור 1A, B).
    הערה: קלטת הטרנספורמציה CDR1 (איור 1A) כוללת את מקדם PDR5 - CaCDR1-mGFPHis - שליחות קטלנית PGK1 - סמן בחירה URA3 - אזור PDR5 במורד הזרם.
  2. בצע אלקטרופורזה ג'ל אגרוז ולחלץ את קלטת טרנספורמציה ~ 8 kb.
    הערה: טיהור ג'ל של קלטת הטרנספורמציה של ~8 kb CaCDR1 מסיר כל דנ"א פלסמיד לא מעוקל אפשרי, מה שעלול להוביל לשינויים שגויים שיש להם את כל הפלסמיד, ולא את קלטת הטרנספורמציה הליניארית, המשולבת בלוקוס PDR5 הגנומי.
  3. דנטורה את הכמות הנדרשת של DNA נושא זרע סלמון (2 מ"ג / מ"ל; 10 mM טריס, 1 mM EDTA; pH 7.5) במשך 10 דקות באמבט מים רותחים ולשמור על קרח. השתמש בצינורות בורג לדנ"א זרע סלמון רותח כדי למנוע פתיחת המכסה.
  4. מערבבים 50 μL של DNA זרע סלמון דנטורי עם 14 μL של קלטת טרנספורמציה (500-2,000 ננוגרם) ולשמור את 64 μL של תערובת DNA על קרח עד לשימוש נוסף.
    הערה: השתמש 10 ננוגרם של E. coli- שמרים מעבורת plasmid (למשל, pYES2) כבקרת טרנספורמציה חיובית (איור 2B).
  5. תאים מוסמכים טריים או קפואים מחדש מופשרים במהירות במשך 5 דקות באמבט מים של 30 מעלות צלזיוס ומחלקים אותם ל-50 עליקוטים של μL בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  6. קציר תאים על ידי צנטריפוגה במשך 1 דקות במיקרופוגה במהירות מקסימלית (18,000 x גרם).
  7. הסר את supernatant ולשמור את גלולה התא ב RT.
  8. עבור כל טרנספורמציה, לערבב 296 שילובי μL (RT) של 260 μL של 50% (w / v) פוליאתילן גליקול (PEG 3350) ו 36 μL של 1 M ליתיום אצטט (LiAc), על ידי pipetting חוזר, עם 64 μL המתאים של תערובות DNA קר כקרח.
  9. מוסיפים את התערובת המתאימה מיד ל- aliquot גלולה תא מוסמך 50 μL.
  10. resuspend גלולה התא ב 360 μL של תערובת PEG-LiAc-DNA על ידי מערבולת ביסודיות במשך כ -30 s.
  11. לדגור על תערובת התא באמבט מים 30 °C במשך 1 שעה.
    הערה: תאי ADΔ ו- ADΔΔ הופכים טובים יותר ב 30 °C (55 °F) מאשר ב 42 °C(35 °F).
  12. לקצור את התאים ב 18,000 x g עבור 10s. להשליך את supernatant ו resuspend גלולה התא ב 80 μL של ddH2O.
  13. יש למרוח את התאים על צלחת אגר CSM-URA35 [כלומר, 0.67% (w/v) בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 0.077% (w/v) CSM פחות אורסיל, 2% (w/v) גלוקוז ו-2% (w/v) אגר].
  14. לדגור על הצלחות במשך 2-3 ימים ב 30 °C (50 °F) עד uracil פרוטוטרופים טרנספורמטים נראים בבירור.
    הערה: צפו ~100 טרנספורמטים לμg של קלטת הטרנספורמציה ליניארית ~ 8 kb CaCDR1 ו- ~ 4 x 104 טרנספורמטים ל- μg pYES2.
  15. בחרו חמישה טרנספורמטים עצמאיים ופרחו אותם על צלחת CSM-URA טרייה כדי להפריד את טרנספורמטורי הפרוטוטרופים של אורסיל לבין שרידים של תאים מארחים שלא השתנו.
  16. הסר כל מוטציות קטנות אפשריות על ידי גידול הטרנספורמטים על צלחות YPG-אגר [1% (w/v) תמצית שמרים, 2% (w/v) פפטונה, 2% (v/v) גליסול, ו 2% (w/v) אגר](איור 2D).
    הערה: למוטנטים הקטנים יש מיטוכונדריה פגומה, ולכן הם אינם יכולים לגדול על מקורות פחמן שאינם ניתנים לתסיסה. הם נפוצים למדי ב S. cerevisiae56. ס. סרביסיה ADΔ ו ADΔΔ נוטים במיוחד לרכוש את הפנוטיפ הקטן.
  17. בצעו PCR של מושבת שמרים ואשרו לפחות שלושה טרנספורמטורים עצמאיים שישולבו כראוי בלוקוס PDR5 הגנומי (איור 1C) על-ידיגברת כל קלטת הטרנספורמציה של CaCDR1 בגודל ~8 kb עם פולימראז DNA ספציפי הממוטב להגברת מוצרי PCR ממקורות תבנית DNA טמאים. השתמש קבוצה של פריימרים שנקשרים ממש מחוץ לאתר האינטגרציה ו- 1 μL aliquots של השעיות תאים (ב- ddH2O) הנגזר ממושבות בודדות כתבניות DNA.
    הערה: זה פולימראז DNA מסוים מגביר באופן אמין ~ 8 kb שברי PCR מתאי שמרים שלמים. עם זאת, עבור הגברה אמינה, 45 מחזורי PCR נדרשים, ואת תאי שמרים חייב להיות resuspended ב OD600 1-10 ב ddH2O.
  18. אשר את מוצר הגברה PCR הנכון ~ 8 kb על ידי DNA agarose ג'ל אלקטרופורזה של חלק 1 μL של תגובת PCR.
  19. הסר פריימרים להגברה עודפת מחלק 10 μL של תגובת PCR עם תערובת אנזימים של exonuclease DNA גדיל יחיד ופוספטאז בעקבות הוראות היצרן לפני רצף ORF כולו באמצעות חלקים של דגימת ה- DNA המטופל עם פריימרים מתאימים.

3. פרוטוקול בידוד פלזמה שמרים בקנה מידה קטן

  1. גידול תאי שמרים
    1. טרום תרבות מושבת שמרים אחת ב 10 מ"ל של YPD ב 30 °C (7-8 שעות עם רועד ב 200 סל"ד.
    2. לחסן 40 מ"ל של בינוני YPD עם 10 מ"ל טרום תרבית ולדגירה את התאים ב 30 °C /n (~ 16 שעות) עם רועד ב 200 סל"ד עד צפיפות התא מגיע OD600 של 1-3.
  2. קצירת תאי שמרים
    1. קציר 40 יחידות OD (ODU; למשל, 1 מ"ל ב OD600 של 1 = 1 ODU) של תאים לוגריתמיים פאזה ב 4,200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F).
    2. resuspend ולשטוף תאים פעמיים עם ddH קר כקרח סטרילי2O (כלומר, 40 מ"ל ולאחר מכן 1 מ"ל; תאי קציר בין צעדים על ידי צנטריפוגה ב 4,200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F).
    3. resuspend הכדור ב 1 מ"ל של ddH קר קר קר ddH2O ולהעביר את השעיית התא לתוך מקורר מראש (על קרח) 1.5 מ"ל צינור microcentrifuge.
    4. קציר תאים ב 3,300 x g במשך 3 דקות ב 4 °C (70 °F).
    5. שאף את סופר-טבעי.
    6. Resuspend גלולה התא ב 0.5 מ"ל חיץ הומוגניזציה [HB; 50 mM טריס, 0.5 mM EDTA, 20% (v/ v) גליצרול; pH 7.5] טרי בתוספת 1 mM פנילמתילסולפוניל פלואוריד (PMSF).
      הערה: הוסף תמיד PMSF טרי מכיוון ש- PMSF אינו מופעל במהירות עם החשיפה למים.
      זהירות: PMSF הוא מעכב פרוטאז סרין, שהוא מאכל מאוד והרסני לרקמות. זה עלול לגרום לנזק בלתי הפיך לעיניים.
    7. לאחסן את ההשעיה התא ב -80 °C (80 °F) או להשתמש מיד.
  3. בידוד של ממברנות פלזמה
    1. אם קפוא, להפשיר את התאים על קרח עבור ~ 1 שעה.
    2. הוסף חרוזי סיליקה בקוטר 0.5 מ"מ קרים כקרח להשעיית תאי 0.5 מ"ל כדי להגיע לנפח כולל של 1 מ"ל.
    3. לשבור תאים עם 6 מחזורים של מערבולת בעוצמה רועדת מקסימלית במשך 1 דקות שזורות עם 3 דקות תקופות קירור על קרח.
    4. הפוך חור דק בתחתית הצינור עם להב אזמל מחומם.
    5. לאסוף את התא השבור הומוגנט דרך החלק התחתון של הצינור מצויד עוד צינור microcentrifuge קר כקרח עם ספין 10 s במהירות נמוכה (~ 200 סל"ד).
      הערה: זה מבטיח כי חרוזי סיליקה להישאר בצינור המקורי.
    6. צנטריפוגות התא הומוגנט ב 5,156 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F) כדי להסיר פסולת תאים, תאים רצוף, גרעין.
    7. העבר 450 μL של supernatant לתוך קר כקרח 1.5 מ"ל microcentrifuge צינור ולהוסיף 1 מ"ל נוספים של HB קר כקרח בתוספת PMSF טרי (1 mM).
      הערה: שלב דילול זה הוא קריטי להתאוששות חלבון קרום פלזמה באיכות גבוהה.
    8. קציר קרום פלזמה ב 17,968 x g עבור 1 שעות ב 4 °C (4 °C) ו resuspend גלולה קרום פלזמה, על ידי pipetting חוזר, ב 100 μL של HB טרי בתוספת 1 mM PMSF. לשחרר את גלולה התא עבור הומוגניזציה קרום פלזמה נכונה על ידי ערבוב גלולה התא עם קצה 100 μL pipette לפני שחרור 100 μL של HB וצינורות למעלה ולמטה.
    9. מדוד את ריכוז החלבון של הכנת קרום הפלזמה עם ערכת בדיקת חלבון התואמת למאגרים המכילים חומר הפחתת חומר וחומר ניקוי.
    10. לאחסן את ממברנות הפלזמה ב -80 °C (80 °F) או לשמור על קרח לשימוש מיידי.

4. נתרן דודסיל סולפט פולאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE)

  1. להרכיב את המנגנון להכנת ג'לים polyacrylamide.
  2. עבור שני ג'לים מפרידים (7% פוליאקרילמיד), יש לערבב 2.1 מ"ל של 40% אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד, 3 מ"ל של 4x הפרדת חוצץ (1.5 M טריס, 0.4% נתרן דודסיל סולפט [SDS] (w/v); pH 8.8), ו 6.9 מ"ל של ddH2O. להוסיף 8 μL של tetramethyl אתילנדיאמין (TEMED) ו 60 μL של 10% אמוניום פרסולפט (APS) ליזום פילמור של אקרילאמיד.
    זהירות: אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד רעיל מאוד. זה גורם לגירוי בעור, נוירופתיה היקפית והוא מסרטן. TEMED מזיק אם הוא נבלע או נשאף. APS מזיק אם נבלע. זה גורם לגירויים חמורים בעין ובעור.
  3. יוצקים ~ 4-5 מ"ל של תערובת זו לתוך מנגנון הג'ל המורכב, עד ~ 2 ס"מ מלמעלה.
  4. שכבה בזהירות ~ 1-2 מ"ל של 0.1% SDS למעלה כדי ליצור מניסקוס מנדר.
  5. אפשר לפוליאקרילמיד להגדיר במשך ~ 60 דקות ב RT.
  6. הכן תערובת ג'ל לערום עבור שני ג'לים על ידי ערבוב 0.5 מ"ל של 40% אקרילאמיד / ביס-אקרילאמיד, 1 מ"ל של 4x buffer לערום (0.5 M טריס, 0.4% SDS (w / v); pH 6.8), ו 6.9 מ"ל של ddH2O. הוסף 2 μL של TEMED ו 30 μL של 10% APS ליזום פילמור של אקרילאמיד.
  7. הסר את שכבת ה-SDS 0.1% מהג'ל המפריד הפולימרי ושטוף עם ddH2O כדי להסיר עקבות של SDS.
  8. יוצקים את תערובת ג'ל הערימה על ג'ל ההפרדה.
  9. מניחים מסרק לתוך ג'ל הערימה ולהסיר את כל בועות האוויר מסביב מסרק.
  10. אפשר ג'ל לערום להגדיר במשך ~ 60 דקות ב RT.
  11. הסר את המסרק ולשטוף את חריצי הג'ל במים. שים את הג'ל במיכל הג'ל ומלא את מיכל הג'ל למעלה עם חוצץ ריצה 1x (24.8 מ"מ טריס, 190 mM גליצין, 0.1% SDS).
    הערה: הכן מאגר פועל 1x ממלאי חיץ 10x (248 mM Tris, 1.9 M גליצין, 1% SDS (w/v) ב- ddH2O) המאוחסן ב- RT.
  12. ערבבו דגימות קרום פלזמה 5-10 מיקרו-מילימטר (כלומר, 10-20 מיקרוגרם חלבון) עם נפחים שווים של 2x צבע טעינת חלבון [120 mM Tris-HCl (pH 6.8), 20% גליצריול, 0.02% ברומופנול כחול, 4% SDS, 200 mM dithiothreitol (DTT)] ומיד לטעון לחריצי ג'ל בודדים שקועים במאגר פועל.
    אזהרה: DTT מזיק אם נבלע. זה גורם לגירויים חמורים בעין ובעור.
    הערה: הפוך מלאי 10 מ"ל של צבע טעינת חלבון 2x, aliquot ולאחסן ב -20 °C (70 °F). אין לחמם את הדגימות המעורבות אלא לטעון אותן מיד לחריצי ג'ל בודדים, כך שתג GFP אינו נגח, וניתן לזהות את אותות הפלואורסצנטיות של הג'ל.
  13. טען סמני משקל מולקולריים של חלבון (טווח 10-245 kDa) לחריץ נפרד כדי לאפשר הערכת גודל של שברי חלבון בודדים.
  14. בצע אלקטרופורזה ג'ל ב 200 V עד צבע הטעינה הכחול מגיע לתחתית הג'ל (בדרך כלל 45-55 דקות).
  15. בדוק את הג'ל עבור in-gel GFP-פלואורסצנטיות עם מערכת הדמיה ג'ל (עירור ואורכי גל פליטה הם 475-485 ננומטר ו 520 ננומטר, בהתאמה).
  16. לאחר הדמיית פלואורסצנטיות בג'ל, לתקן חלבונים על ידי עצבנות עדינה של הג'ל בתמיסת תיקון ג'ל חלבון ~ 10-20 מ"ל (40% אתנול, 10% חומצה אצטית) למשך 15 דקות ב- RT.
  17. יש לשטוף את הג'ל פעמיים למשך 10 דקות עם 10 מ"ל של ddH2O ולדמיין רצועות חלבון על ידי הצבת הג'ל בתמיסת כתמי קומאסי קולואידית בגודל 10 מ"ל עם רעד עדין למשך שעה ב-RT.
  18. להדמיה משופרת של רצועות חלבון, דה-מכתים את הג'ל פעם או פעמיים ב- ~ 20 מ"ל של ddH2O למשך ~ 1 שעות לפני הקלטת תמונות עם מערכת הדמיית הג'ל.

5. קביעת פעילויות ATPase CDR1 57

  1. לדלל דגימות קרום פלזמה >2.2 מ"ג / מ"ל ל 1-2 מ"ג / מ"ל ב- HB.
  2. יש להקפיד על קוקטייל ה-ATPase assay (75 mM MES-Tris, 75 mM אשלגן חנקתי, 0.3 מ"מ אמוניום מוליבידאט, 7.5 מ"מ נתרן אזיד; pH 7.5) ו-Mg-ATP (28.8 מ"מ מלח דיסודיום ATP, 28.8 מ"מ MgCl2; pH 7.0) עד 30 °C בחממה של 30 °C.
    זהירות: נתרן אזיד רעיל מאוד.
    הערה: ודא שכל מלאי המאגר והבקבוקים הם ללא פוספט; כלומר, לשטוף כלי זכוכית עם 1% (vol/vol) HCl ולשטוף אותו מספר פעמים עם ddH2O. כמו כן, לשמור אותו בנפרד מכלי זכוכית אחרים כי סביר להניח מכיל עקבות של פוספט בדרך כלל נוכח דטרגנטים המשמשים לשטוף כלי זכוכית.
  3. הוסף 90 μL של קוקטייל אסאי עם או בלי מעכב Cdr1-ATPase (20 מיקרומטר של אוליגומיצין) לתוך בארות בודדות של צלחת microtiter 96 טוב.
    הערה: ההסתה מבוצעת במשולש.
  4. הוסף 5 μL של קרום הפלזמה המבודד (~ 5-10 מיקרוגרם חלבון) או תקני פוספט (0-100 נמול פאי) לתוך בארות המתאימות של צלחת microtiter.
    הערה: שמור את העמודות הראשונות והאחרונות עבור שתי ערכות נפרדות של תקני פוספט.
  5. התחל את ההסתערות על ידי הוספת 25 μL של 28.8 מ"מ מ"מ Mg-ATP (ריכוז סופי של 6 מ"מ) עם פיפטה רב ערוצית לבארות בודדות ודגרה ב 30 °C (30 °F) במשך 30 דקות.
  6. עצרו את התגובה על ידי הוספת 130 מיקרו-אל של ריאגנט פיתוח (1.6% נתרן L-אסקורבאט, 1% SDS, 12% אמוניום מוליבאדאט ב-6 M חומצה גופרתית).
    זהירות: חומצה גופרתית מרוכזת מגיבה באלימות במים. זה מאכל ועלול לגרום נזק לעור ולריאות.
  7. דגירה ב RT במשך 10 דקות.
  8. קרא את הספיגה של בארות צלחת microtiter ב 750 ננומטר עם קורא לוחות microtiter.
    הערה: היצמדות לזמן הדגירה של 10 דקות לפיתוח צבע כחול (כלומר, קומפלקס זרחן-מוליבדן מופחת) היא קריטית לדיוק ה- assay מכיוון שהתפתחות הצבע הכחול נמשכת עם הזמן.
  9. להשיג את פעילות ATPase ספציפי CDr1 (כלומר, פעילות ATPase רגיש אוליגומיצין) על ידי הפחתה של פעילות ATPase בנוכחות אוליגומיצין מכלל פעילות ATPase בהיעדר אוליגומיצין.

6. מסך דטרגנט בקנה מידה קטן

  1. שלב את תכשירי קרום הפלזמה (כלומר, 2.5 מ"ג של חלבון קרום פלזמה) של תאים המשמידים יתר על המידה Cdr1-mGFPHis עם חיץ GTED-20 [10 mM Tris, 0.5 mM EDTA, 20 % (w/v) גלצל; pH 7.5; תוספת טרייה עם 1 mM PMSF] המכיל 5 מ"ג של חומר ניקוי הבדיקה, כדי להגיע לנפח כולל של 0.5 מ"ל בתוספת 1% (w/v) דטרגנט.
  2. לסובב את התערובת ב 4-8 °C (5 °F) במשך 2 שעות, עם התקן סיבוב.
  3. צנטריפוגות התערובת ב 141,000 x גרם ב 4 °C (50 °F) במשך 1 שעה.
  4. מעבירים את חומר העל המכיל חומר סולובילי לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי.
  5. הוסיפו 0.5 מ"ל של חיץ GTED-20 בתוספת 2% (w/v) SDS לשבר הכדור המסיס ודגרה ב-30 °C o/n באינקובטור רועד כדי לחלץ את כל חלבון הממברנה החדיר לדטרגנט.
  6. נתח והשווה את שברי הכדורים השופע והסולובילים על-ידי SDS-PAGE.
  7. ג'ל צילום המכיל חלבונים מתויגים GFP עבור in-gel GFP-פלואורסצנטיות לפני כתמי קומאסי וכימות רמות הביטוי עם מערכת ההדמיה.
  8. השתמש בשבר חלבון הממברנה המסיס עבור יישומים במורד הזרם כגון כרומטוגרפיה של אי-הכללה בגודל פלואורסצנטי (FSEC)58 כדי לזהות חומרי ניקוי מתאימים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תדירות גבוהה של טרנספורמציה של S. cerevisiae ADΔΔ (~ 4 x 104 טרנספורמטורים / מיקרוגרם) הושגה עם pYES2 (איור 2B). כצפוי, בקרת השינוי ללא DNA (כלומר, ddH2O בלבד) לא נתנה טרנספורמטורים, ו- 1 מיקרוגרם של קלטת הטרנספורמציה הליניארית של CDR1-mGFPHis (איור 1A) העניקה ~ 50 טרנספורמטורים (איור 2C) עם פרוטוקול הטרנספורמציה הממוטב של ADΔΔ. טרנספורמטורים CDR1-mGFPHis נבדקו גם על יכולתם לגדול על מקור פחמן שאינו מותסס כדי לחסל כל מוטציות קטניות אפשריות עם מיטוכונדריה פגומה. שלושה (עיגולים צהובים; איור 2D) מתוך 25 טרנספורמטורי אורסיל-פרוטוטרופים שנבדקו לא יכלו לגדול על לוחות אגר YPG והושלכו מחקירות נוספות. Cdr1-mGFPHis שבא לידי ביטוי על ידי הזן החדש שנוצר ADΔΔ-CDR1-mGFPHis הוא לוקליזציה כראוי בקרום הפלזמה (איור 1A) ובא לידי ביטוי ברמות מספיקות עבור האפיון המבני והתפקודי של Cdr1 (איור 3). העיצוב של התג הכפול הממוטב (איור 1B) מאפשר גם הסרה של התג הכפול mGFPHis לאחר טיהור זיקת ניקל של Cdr1-mGFPHis כדי למנוע הפרעות אפשריות מהתג ביישומים במורד הזרם. תוצאות ראשוניות, עם זאת, הראו כי 3 חומצות אמינו מקשר בין Cdr1 ואתר מחשוף פרוטאז HRV-3C ייתכן שיהיה צריך להיות מורחב כדי להשיג מחשוף מהיר יותר, יעיל יותר. תצפיות דומות דווחו לאחרונה עבור טרנספורטר הנוקלאוזיד N-סופני Escherichia coli NupC, אשר דרש 15 ולא מקשר חומצות אמינו 3 שתוכנן במקור עבור מחשוף יעיל של NupC solubilized חומר ניקוי (DDM) קשור שרף ניקל-זיקה59. 5 חומצות אמינו מקשר C-מסוף של אתר מחשוף HRV-3C מונע הפרעה סטרית של תג כפול mGFPHis עם חלבון מצורף של עניין, אשר ראינו בעבר עבור C. utilis ABC טרנספורטר Cdr139. המוטציה yEGFP3-A206K נוצרה כדי למנוע עמעום GFP מלאכותי בריכוזים גבוהים של חלבון28, ואת המקשר 3 חומצות אמינו נוספות בין mGFP ואת תג זיקת ניקל שלו מבטיח חשיפה משטח נכונה של התג His כדי למקסם את היעילות הכריכה של החלבון המתויג לשרף זיקת ניקל (נתונים לא הראו).

Figure 1
איור 1: פלטפורמת ביטוי חלבון קרום שמרים עבור שיבוט יעיל וביטוי של מובילי קרום פלזמה פטרייתי. (A)קלטת טרנספורמציה הכוללת את מקדם PDR5 (כחול), CDR1 (אדום) C-מתויג עם XLmGFPHis (ירוק), המחסל PGK1 (כתום), סמן הבחירה URA3 (כחול בהיר) וחתיכה מאזור PDR5 במורד הזרם (כחול) משמשת לשינוי מארח הביטוי S.cer evisiae ADΔΔ BY INTEGRATION at the genomic PDR5 locus. גורם התמלול המוטנטי של הרווח-של-פונקציה Pdr1-3 גורם לביטוי יתר של Cdr1 (מתומנים אדומים) בקרום הפלזמה (ראה תמונת מיקרוסקופיה קונפוקלית מתחת). (B)Plasmid pABC3-XLmGFPHis, אשר ניתן להשתמש בו באסטרטגיית שיבוט מסורתית או כתבנית PCR כדי ליצור קלטת טרנספורמציה. שיפורים של pABC3-XLmGFPHis על פני pABC3-GFP14 מפורטים מתחת למפת הפלסמיד. (C)אסטרטגיית שיבוט יעילה יותר לשלב את קלטת הטרנספורמציה בלוקוס PDR5 הגנומי של ADΔΔ. ניתן להגביר את ה-PCR באמצעות פריימרים (חצים) היוצרים חפיפה עם הזרוע השמאלית (כחולה; מקדם PDR5) וזרוע ימין (ירוק; XLmGFPHis-PGK1-URA3-PDR5 במורד הזרם) שברים. מוטציות (קווים שחורים) ניתן להכניס לתוך ORF על ידי עיצוב פריימר במידת הצורך. אירועי רקומבינציה הומולוגית המכווים את האינטגרציה הנכונה בלוקוס PDR5 מסומנים על-ידי הקווים המקווקוים החוצים. (D)בדיקות תאים שלמים שניתן להשתמש בהן לאפיון פונקציונלי של משאבות שפכים רב-דראג פטרייתיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: טרנספורמציה של ADΔΔ עם CDR1- קלטת טרנספורמציהmGFPHis וחיסול של טרנספורמטורים של ADΔ-CDR1-mGFPHis. אורציל פרוטוטרופים טרנספורמטים נבחרו על ידי דגירה של תאי ADΔΔ שעברו טרנספורמציה על לוחות CSM-URA ב 30 °C (50 °F) במשך 3 ימים. (A)שליטה שלילית (ללא דנ"א). (B)שליטה חיובית (10 ננוגרם של pYES2). (C) CDR1-mGFPHis transformants (1 מיקרוגרם של DNA). (D)בדיקת ADΔ-CDR1-mGFPHis transformants עבור פנוטיפ קטן על לוחות אגר YPG. טרנספורמטים פטיט שלא יכלו לגדול על לוחות אגר YPG עקב מיטוכונדריה פגומה מוקפים בצהוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

פלואורסצנטיות GFP היא מדד אמין עבור רמות הביטוי Cdr1 שכן היה קשר ליניארי בין כמות Cdr1-mGFPHis (שלב 3.3.9) לבין אותות פלואורסצנטיות בתוך ג'ל (איור 3A). בפרויקט זה, זרימת עבודה ממוטבת לשחזור פותחה לדור מהיר של תכשירי קרום פלזמה בקנה מידה קטן באיכות גבוהה לאפיון הביוכימי של חלבוני קרום פלזמה. ניתן היה לייצר כמעט 0.5 חלבון קרום פלזמה מ"ג(איור 3C;גרף שמאלי) המציג את פעילות ATPase CDr1 הגבוהה ביותר ( ̃400 נמול / דקה / מ"ג; איור 3C; גרף ימני) בעת שבירת 40 ODU של שלב לוגריתמי (OD600nm של 1-3) תאים (resuspended ב 0.5 מ"ל של HB) עם אותו נפח (כלומר, 0.5 מ"ל) של חרוזי סיליקה ו 6 מחזורים של מערבולת במשך 1 דקות בעוצמה רועדת מקסימלית ואחריו 3 דקות תקופות קירור על קרח. עלייה נוספת במספר מחזורי השבירה (שלב 3.3.3) הפחיתה את איכות הכנת קרום הפלזמה המבודדת (פעילות ATPase Cdr1 ירדה מ 170 נמול / דקה / מ"ג ~ 60 נמול / דקה / מ"ג; נתונים לא הראו). למרות שהיו רק הבדלים קלים בדפוסי החלבון SDS-PAGE של דגימות קרום הפלזמה המבודדות מתאים שבורים עם מספרים גבוהים יותר של מחזורי שבירה (נתונים לא הראו), סביר להניח כי פעילויות ATPase CDr1 מופחת כמעט פי 3 לאחר 10 מחזורי שבירה או יותר נגרמו על ידי או: i) denaturation חלקית של Cdr1 עקב חשיפה לטמפרטורה גבוהה; ii) שינויים לאחר תרגום כגון זרחן או dephosphorylation; או על ידי iii) זיהום צולב מוגבר של שלל קרום פלזמה מבודד עם שברי ממברנה של אברונים אחרים. שבירת 40 ODU של תאים ב 0.5 מ"ל של HB הניב את האיכות הגבוהה ביותר של ממברנות פלזמה (כלומר, Cdr1 ביותר לכל 10 מיקרוגרם של חלבון קרום פלזמה; איור 3B) עם פעילות ATPase CDR1 הגבוהה ביותר (איור 3C; גרף ימני). גבוה יותר (> 40 ODU/0.5 מ"ל של HB) או נמוך יותר (20 ODU/0.5 מ"ל של HB) צפיפות תאים הפחיתה את פעילות ה- ATPase של ממברנות הפלזמה המבודדות(איור 3C; גרף ימני), אם כי, התשואה שלהם גדלה ביחס להגדלת צפיפות התאים (איור 3C; גרף שמאלי). לכן, 40 ODU / 0.5 מ"ל של HB היה צפיפות התא האופטימלית לבידוד של האיכות הגבוהה ביותר של קרום פלזמה. לכן, באמצעות פרוטוקול ממוטב לבידוד בקנה מידה קטן של תכשירי קרום פלזמה הוביל 2-3 פעמים גבוה יותר Cdr1 פעילויות ATPase ספציפיות (~ 300 nmol / דקה / מ"ג; איור 3C; גרף ימני) בהשוואה לפעילויות ATPase ספציפיות Cdr1 שהושגו בתחילה (~ 100 נמול / דקה / מ"ג; נתונים לא מוצגים). פעילויות ATPase אלה היו גם גבוהות משמעותית35 מכל פעילות ATPase CDr1 שדווחו בעבר (100-200 נמול / דקה / מ"ג) שהושגו עם עבודה אינטנסיבית יותר זמן רב פלזמה קרום פרוטוקול הכנה14,41,60.

השיטה הנפוצה ביותר להפקת חלבוני ממברנה מממברנות ביולוגיות היא solubilization עם דטרגנט. האתגר, עם זאת, הוא למצוא חומר ניקוי מתאים בעל ההשפעה הפחות מזיקה על יציבות החלבון ו/או המאפיינים המתקפלים. סימון החלבון באמצעות mGFPHis מאפשר סינון לבחירת חומרי הניקוי הטובים ביותר להפקת חלבונים. בסך הכל, 31 דטרגנטים, המפורטים בטבלת החומרים, עם תכונות שונות נבדקו על יכולתם solubilize Cdr1 מקרום פלזמה גולמי של S. cerevisiae ADΔΔ-CDR1-mGFPHis תאים. התוצאות עבור ערכה מייצגת של 16 חומרי ניקוי לבדיקה (A-Q) מוצגות באיור 3D. נתיבים T, P ו- S מכילים 10 עליקוטים של חלבון קרום פלזמה כולל (T) מיד לאחר solubilization דטרגנט (שלב 6.2) ואת גלולה מסיסים דטרגנט (P; solubilized o /n ב 0.5 מ"ל של GTED-20, 2% SDS; שלב 6.5) ואת חומר ניקוי מסיס supernatant (S; שלב 6.4) שברים לאחר ההפרדה על ידי אולטרהcentrifugation ב 141,000 x g. חומר הניקוי הרצוי צריך solubilize כמה שיותר Cdr1-mGFPHis ככל האפשר מבלי לשנות את המבנה שלה ו / או פונקציה. חלבוני קרום הפלזמה הגולמי (5 מ"ג/מ"ל) נותחו על ידי SDS-PAGE(איור 3D)ומאוחר יותר גם על ידי כרומטוגרפיה בגודל של גילוי פלואורסצנטיות (FSEC)58 (איור 4). קבענו כי נדרש יחס חומר ניקוי מינימלי לחלבון של 2:1 (w/w) לסולוביליזציה יעילה של Cdr1. למעשה, כדי לקבוע את ריכוז חומר הניקוי האופטימלי (DDM) הנדרש עבור solubilization של Cdr1-mGFPHis, ריכוז המיסל הקריטי של חומר הניקוי (x CMC) ואת יחס חלבון דטרגנט / ממברנה (w / w) נחקרו. הבדלים גדולים ביעילות solubilization של Cdr1-mGFPHis נצפו בעת שימוש בריכוזים קבועים של 10x או 80x CMC של DDM. יעילות הסולוביליזציה השתנתה בין 40% ל -80% או 60% ו -90% בהתאם לכמויות של ממברנות פלזמה גולמיות המשמשות בניסויי solubilization השונים. עם זאת, בחירת דטרגנט ליחסי חלבון של ≥2 (w/w) נתנה תוצאות טובות לשחזור עם >85% של Cdr1-mGFPHis להיות solubilized, לא משנה את כמות חלבון קרום פלזמה בשימוש. לכן, אם באמצעות הגישה הנפוצה יותר של פשוט בחירה 1% או 2% (w /v) דטרגנט עבור solubilization של חלבונים ממברנה כגון Cdr1-mGFPHis, שמירה על חומר ניקוי ליחס חלבון מעל 2 (w /w) חשוב [כלומר, לשמור על ריכוז חלבון קרום הפלזמה מתחת 5 מ"ג / מ"ל בעת שימוש 1% (כלומר, 10 מ"ג / מ"ל) דטרגנט].

Figure 3
איור 3: כימות רמות הביטוי Cdr1-mGFPHis, אופטימיזציה של פרוטוקול בידוד קרום פלזמה בקנה מידה קטן ומסך דטרגנט עבור Cdr1-mGFPHis. (A)כימות Cdr1-mGFPHis עם פלואורסצנטיות in-gel; תמונות SDS-PAGE מוכתמות ומוכתמות של קומאסי וג'ל של אותו ג'ל פוליאקרילמיד 0.7% מוצגות בצד שמאל. נתיבים 1 עד 6 היו טעונים עם 0.75, 1.5, 3, 6, 12, ו 24 מיקרוגרם של חלבון קרום פלזמה ADΔΔ-CDR1-mGFPHis. Cdr1-mGFPHis מצוין בחץ אדום. M = דיוק פלוס סמן חלבון. עוצמות הפלואורסצנטיות של mGFP (המוצגות מימין) היו ליניאריות על פני כל טווח הריכוז שנבדק והיה פלואורסצנטיות רקע מינימלית. (B)השפעת צפיפות התאים על איכות ממברנות פלזמה מבודדות. ג'ל פוליאקרילמיד מוכתם של קומאסי (7%) של דגימות חלבון קרום פלזמה (10 מיקרוגרם) ואותות פלואורסצנטיות ירוקה של Cdr1-mGFPHis של אותו ג'ל לפני כתמי קומאסי. M = דיוק פלוס סמן חלבון. נתיבים 1, 3, 5 ו-7 הם חלבוני קרום פלזמה של ADΔΔ ונתיבים 2, 4, 6 ו-8 הם חלבוני קרום פלזמה של ADΔ-CDR1-mGFPHis המבודדים מ-20, 40, 60 ו-80 ODU של תאים, בהתאמה. Cdr1-mGFPHis מצוין בחץ אדום. האחוזים היחסיים של אותות הפלואורסצנטיים הירוקים מפורטים מתחת. (C)ההשפעה של צפיפות התאים על שבירה על התשואה של ממברנות פלזמה מבודדות ופעילות ATPase של Cdr1-mGFPHis. בצד שמאל, ההשפעה של צפיפות התא (ODU/0.5 mL HB) על כמות חלבון קרום פלזמה מבודד ADΔΔ ו ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (Cdr1) תאים. מימין, ההשפעה של צפיפות התא על פעילות ATPase Cdr1 של קרום הפלזמה מבודד מתאי ADΔΔ-CDR1-mGFPHis. (D)SDS-PAGE למופת של 10 עליקוטים μL של תערובת solubilization (T; 0.5 מ"ל), הכדור לאחר solubilization (P; 0.5 מ"ל), ואת שברים solubilized (supernatant) (S; 0.5 מ"ל) של חלבוני קרום פלזמה גולמיים solubilized של ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (למעלה) ופלואורסצנטיות ג'ל של Cdr1-mGFPHis לפני כתמי קומאסי של אותו ג'ל (למטה). סולם חלבונים רחב מוכתם מראש של MW (245, 180, 135, 100, 75, 63 ו-48 רצועות kDa; רצועות 180 kDa ו- 75 kDa מסומנות בחצים אדומים וירוקים, בהתאמה). נתיבים A עד L ו- N ל- Q הם שברי T, S ו- P עבור DM (A), β-DDM (B), α-DDM (C), TDM (D), LMNG (E), OGNG (F), OG (G), LDAO (H), Hega (I), מגה (J), טריטון-X100 (K), CHAPS (L), NM (N), Tween80 (O), Fos-כולין-13 (P) ו- SDS (Q), בהתאמה. קיצורים מוגדרים בטבלת החומרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

בהתבסס על תוצאות הקרנת דטרגנט(איור 3D),DDM (B ו- C) ו- Fos-כולין-13 (P) נראו כמדכאים הטובים ביותר עבור solubilization של Cdr1-mGFPHis. עם זאת, נראה שהשימוש בפוס-כולין-13 גרם לפרוטוליזה חלקית של Cdr1-mGFPHis (P באיור 3D). LMNG (E), PCC-α-M (לא מוצג) ואולי גם DM (A) היו חומרי הניקוי הטובים ביותר הבאים. מסך דטרגנט גם הראה כי glucosides OGNG (F) ו OG (G), CHAPS (L), NM (N) ו Anzergents (לא מוצג) היו בחירות רעות עבור solubilization של Cdr1-mGFPHis כמו כמויות משמעותיות של החלבון נמצאו שברי גלולה מסיסים(איור 3D). SDS denatures Cdr1-XLmGFPHis, ולכן לא נראים אותות פלואורסצנטיות ירוקים בנתיבי Q(איור 3D).

ההתאמה של חומר ניקוי עבור solubilization של חלקיקי Cdr1-mGFPHis מקומי מקופל כראוי הוערך גם על ידי FSEC של חלבון קרום פלזמה solubilized דטרגנט (שלב 6.4 supernatant). דוגמאות לכרומטוגרמה המתקבלת עבור 100 חלבון קרום פלזמה גולמי μL מ ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (2 מ"ג / מ"ל) solubilized עם 1% חומר ניקוי מוצגים באיור 4. השיא בנפח אלוטיון של 9 מ"ל מייצג בעיקר Cdr1-mGFPHis צבור המתחמק בנפח הריק, ואילו חלקיקי Cdr1-mGFPHis המצטברים כראוי מיוצגות על ידי פסגת ה- Gaussian בצורת 15.5 מ"ל. הכתף הרחבה בין נפח ההצטמקות של 12 ל-14 מ"ל מכילה אולי חלקיקי Cdr1-mGFPHis micelle מוגדרים פחות ו/או מצביעים על טעות חלקית או אגרגטים של חלבונים. כרומטוגרמה של מלטוזידים וחלבונים המופקים על ידי LMNG הראו שרוב Cdr1-mGFPHis מתחמקים כפסגה גאוסית מעוצבת יפה ב-15.5 מ"ל עם כתף קטנה המריאה מעט מוקדם יותר ב-14 מ"ל(איור 4A). דגימות אלה לא היה Cdr1-mGFPHis eluting באמצעי האחסון הריק. הדוגמה הריקה היא המאגר בתוספת פקד DDM שלא נתן אות mGFP. הכרומטוגרמה באיור 4B מדגישה את החשיבות של סוג קבוצת הראש של הסוכר לאיכות חלקיקי Cdr1-mGFPHis של חומר ניקוי. גלוקוז המכיל דטרגנטים (OG, NG, OGNG) ביצע גרוע יותר סוכרוז המכיל חומרי ניקוי (DDS), אשר בתורו ביצע גרוע יותר מאשר maltose המכיל דטרגנטים (NM, DMNG, DDM). Cdr1-mGFPHis solubilized עם גלוקוז המכיל דטרגנטים המצטברים כשיא מצטבר (OG) או צבירה רחבה (NG, OGNG), שהיה צפוי מהחלק הגדול של Cdr1-mGFPHis משקעים בשברירי הכדור עבור OGNG (F) ו- OG (G) שנצפו באיור 3D. למרות הכרומטוגרמה DMNG (ירוק; איור 4ב) היה דומה באופן איכותי לכרומטוגרמה DDM (כחול; איור 4B, הפסגות הגבוהות יותר עבור DDM מצביעות על כך שחלק גדול מה-DMNG solubilized Cdr1-mGFPHis עשוי למעשה להיות מפונק. איור 4C מציג את הכרומטוגרמה FSEC עבור fos-cholines zwitterionic (Fos-choline-8, Fos-כולין-10, Fos-choline-13) ושני דטרגנטים לא יוניים (דיגיטונין, טריטון-X100), ואיור 4D מראה כיצד טעינה כפולה (200 μL) חלבון דולובילן לא הייתה השפעה ניכרת על איכות הכרומטוגרמה עבור Fos-כולין-8, -10, ו -13 ו- DDM. רק דיגיטונין (כתום; איור 4C) נתן כרומטוגרמה דומה ל- DDM (כחול; איור 4C) ולמרות ש-Fos-choline-13 העניק שיא בצורת חד סימטרי, הוא שוב התפוגג עם נפח אלוטציה נמוך משמעותית (14 מ"ל) מזה של DDM (15.5 מ"ל). בסך הכל, הייתה מגמה ברורה של סולוביליזציה טובה יותר על ידי דטרגנטים עם שרשראות צדדיות אליפטיות ארוכות יותר של 12 או 13 שאריות פחמן; למשל, DDM > DM > NM (12, 10 או 9 פחמנים), Fos-כולין-13 > 10 > 8 (13, 10, או 8 פחמנים), ו- LMNG > DMNG > OGNG (12, 10, או 8 פחמנים), בהתאמה. לפיכך, חומרי ניקוי עם זנבות הידרופוביים של פחות מ-12 פחמנים היו הרבה פחות מתאימים לדטרגנטים מתאימים לסולוביליזציה של Cdr1-mGFPHis מאשר דטרגנטים עם זנבות הידרופוביים ארוכים יותר של 12 או 13 פחמנים, וחומרי ניקוי לא יוניים (DDM, LMNG) נראו בדרך כלל מתאימים יותר לסולוביליזציה של Cdr1-mGFPHis מאשר דטרגנטים זוטריוניים(איור 3D, איור 4).

Figure 4
איור 4: הקרנת חומר ניקוי עבור Cdr1-mGFPHis solubilization באמצעות FSEC. כרומטוגרמה של 100 μL של ADΔΔ-CDR1-mGFPHis קרום פלזמה גולמי (2 מ"ג / מ"ל) עם 1% של חומרי ניקוי המצוינים ומופרדים באמצעות Superose 6-להגדיל 10/300 GL גודל עמוד אי הכלל. הכרומטוגרמה מתארת את יחידות הפלואורסצנטיות היחסיות של mGFP (FU) של נפח עמודה אחד (CV; 25 מ"ל) של מאגר אילוטיון שנאסף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות ההתקדמות האחרונה בניתוח המבני של חלבוני ממברנה, אין מבנה תלת-ממדי עבור Cdr1, או כל טרנספורטר PDR אחר, זמין כעת. לכן, רכישת ידע על מבנה Cdr1 ואת התכונות הביוכימיות שלה חשוב, כמו זה לא רק לספק תובנה על עיצוב רציונלי של תרופות חדשניות כדי להתגבר על עמידות לתרופות בתיווך שפכים, אלא גם לתוך מנגנון התפקוד של תת-משפחה חשובה של חלבוני ABC.

אחת הדרישות העיקריות לאפיון המבני של חלבוני הממברנה היא הביטוי של חלבון ממברנה מקופל ושלם בכמויות הנדרשות לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או קריו-EM. קריטריונים חשובים בעת בחירת מערכת ביטוי הם קלות השימוש, שיעורי הצמיחה והעלויות, וגם היכולת לבטא חלבונים עם שינויים לאחר התרגום שיכולים להיות קריטיים לתפקוד ו / או יציבות של חלבון61,62.

במהלך שני העשורים האחרונים טכנולוגיית ביטוי חלבון ממברנה S. cerevisiae 60 כבראופטימיזציה 14 כדי להקל על שיבוט צעד אחד של חלבונים ממברנה של עניין24 מתויגים או N שלהם או C-terminus עם זיקה שונים, epitope, או תגי כתב, ואם תרצה, רמות הביטוי שלהם נדחו כצפוי לכל מקום בין 50% עד נמוך ככל 0.1% של רמת הביטויהמרבית 25. פלטפורמת ביטוי חלבון קרום פלזמה רב-תכליתית זו מאפשרת לחוקרים לאפיין משאבות שפכים פטרייתיות בפירוט רב. הפיתוח והאופטימיזציה של בדיקות תאים שלמים של פונקציית המשאבה אפשרו את האפיון המוצלח של הספציפיות המצע24 ואת הרגישות המעכבת של מספר משאבות פולחן רב-תכליתיות גדולות, והם הועסקו במסכי תרופות בעלי תפוקה גבוהה כדי לזהות רומן42,43,44, או לאשר קיימים14,33,36, מעכבי משאבת שפכים רחבת טווח או לפתח מעכבי משאבת שפכים חדשניים ספציפיים עבור Cdr141.

למרות שפלטפורמת הביטוי הקיימת שימשה בהצלחה כדי לבטא מובילי ABC פטרייתיים ממגוון פטריות, כולל בסידום-קוקוטה(C. neoformans Mdr1),14 פטריות נימיות כגון P. marneffei (Abc1)37 ומינים רבים של סכרומיקוטינה (למשל, ס. סרביסיה Pdr5, C. glabrata Cdr1 ו- Cdr2, C. utilis Cdr1, C. krusei Abc1, Abc11 ו- Abc12 ו- C. albicans Cdr1 ו- Cdr2), 14,24,32,36,39,60,63 יש כבר פחות הצלחה להביע רמות גבוהות של מובילי ABC אנושי מקופל כראוי64. תוצאות ראשוניות מצביעות על כך שזה נובע מסביבת השומנים הספציפית כי מובילים אלה דורשים ביטוי ותפקוד תקין שמרים. אינדיקציות הן כי זה עשוי להיות נכון גם עבור מובילי ABC צמח, אם כי זה עדיין לא אושר באופן ניסיוני.

הסיבות העיקריות לפעילויות ספציפיות CDr1 ATPase גבוהות משמעותית (כלומר, תכשירים עם ממברנות מזהמות פחות) המתקבלות עם פרוטוקול בידוד קרום פלזמה בקנה מידה קטן ממוטב הם כפולים: i) שבירה ידנית עדינה יותר של תאים לעומת שימוש מקצף חרוזים עבור תכשירים קרום פלזמה בקנה מידה גדול יותר; ו- ii) קצירת תאים בשלב אמצע היומן, אשר מפחית זיהום מיטוכונדריאלי אפשרי עקב דיכוי גלוקוז של אנזימים מיטוכונדריאליים. ניתן להאריך את תקופות הקירור של 3 דקות בין כל אחד מששת מחזורי השבירה ללא כל השפעה ניכרת על איכות ממברנות הפלזמה. מחזורי הפשרת הקפאה חוזרים הם, עם זאת, להימנע כי פעילויות ATPase Cdr1 של ממברנות פלזמה מבודד מופחת על ידי ~ 10% עם כל מחזור הפשרת הקפאה נוספת. זו הסיבה מדוע מומלץ לפצל את דגימות קרום הפלזמה לתוך aliquots קטן יותר כדי להפחית את הצורך מחזורי הפשרת הקפאה מרובים. התג הכפול mGFPHis משפר את תפוקת הטיהור ומאפשר הקרנת חומר ניקוי יעילה בצעד אחד. באמצעות מבנה זה, לוקליזציה נכונה, קיפול נאות / סחר ותרמוסיות ניתן לזהות בקלות; ואת התג הכפול ניתן להסיר, במידת הצורך, על ידי מחשוף עם פרוטאז זמין מסחרית, אם כי 3 חומצות אמינו-מקשר בין חלבון עניין ואת התג ייתכן שיהיה צורך להרחיב להסרת יעיל של התג.

השילוב של מספר תכונות בפרוטוקולים אלה, כלומר, השימוש בפולימראז DNA שתוכנן במיוחד עבור הגברת PCR המושבה של קלטת טרנספורמציה 8 kb; שיטת טרנספורמציית שמרים יעילות גבוהה ממוטבת; היכולת ליצור מלאי שמרים מוכשר קפוא; ופרוטוקול הכנת קרום פלזמה בקנה מידה קטן ממוטב מדגים את יצירת פלטפורמת ביטוי חלבון הממברנה ממוטבת המקובלת לשיבוט, ביטוי ואפיון של משאבות שפכים פטרייתיות של ABC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים במימון מקרן מרסדן בניו זילנד (Grant UOO1305), ומענק בלוק מהפקולטה לרפואה, אוניברסיטת צ'ולאלונגקורן, בנגקוק, תאילנד (M. Niimi). הם מבקשים להודות לאוניברסיטת אוטגו על שהעניקה לג' מדאני מלגת דוקטורט. המחברים מבקשים גם להביע את תודתם לפרופסור סטפן ראונסר ועמיתיו, ד"ר אמיר אפלבאום, וד"ר דיבאנאיאגבארתי ויניאגאם, על תמיכתם ופיקוחם במהלך ביקור בן 6 חודשים של ג' מדאני במכון מקס פלנק לפיזיולוגיה מולקולרית (MPIMP), דורטמונד, גרמניה. המחברים מודים גם לשירות חילופי האקדמיה הגרמנית (DAAD) על כך שהעניק לג'י מדאני מענק מחקר (57381332) לביקור ב- MPIMP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES) Sigma-Aldrich M3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) Merck 77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG310S LMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside Anatrace NG311S OGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG322S DMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside Glycon Biochemicals GmbH D99019-C PCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) Bio-Rad 1610148
Acetic acid (glacial) Merck 64-19-7
Agar Formedium  009002-18-0
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich 13106-76-8
Ammonium persulphate (APS) Bio-Rad 1610700
ATP disodium salt sigma-Aldrich A-6419
Bromophenol blue SERVA Electrophoresis GmbH 34725-61-6
CHAPS Anatrace C316S
CHAPSO Anatrace C317S
CSM Formedium DCS0019
CSM minus uracil Formedium DCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C324S CYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C327S CYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C321S CYMAL-1
Digitonin Sigma-Aldrich 11024-24-1
Dithiothreitol (DTT) Roche Diagnostics 10197785103
DMSO Merck 67-68-5
Ethanol Merck 459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) Merck 6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent Applied Biosystems 78205 A blend of exonuclease and phosphatase
Glucose Formedium 50-99-7
Glycerol Merck 56-81-5
Glycine Merck G8898
HEPES Formedium 7365-45-9
Hydrochloric acid Merck 1003172510
KOD Fx Neo TOYOBO Co KFX-201 Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc) Sigma-Aldrich 546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydrate sigma-Aldrich M2393
MES Formedium 145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide Anatrace H110S HEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamide Anatrace M320S MEGA-10
n-Decyl-phosphocholine Anatrace F304S Fos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D322S DM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ312S Anzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide Anatrace D360S LDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranoside Anatrace D310HA α-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310S β-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Nonyl-β-D-maltopyranoside Anatrace N330S NM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ318S Anzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ308S Anzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholine Anatrace F300S Fos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranoside Anatrace O311S OG
n-Tetradecyl-phosphocholine Anatrace F312S Fos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T315S TDM
n-Tridecyl-phosphocholine Anatrace F310S Fos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T323S -
n-Undecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace U300S UM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Octylphenoxypolyethoxyethanol Sigma-Aldrich 9002-93-1 TRITON X-100
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351
Peptone Formedium 3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Diagnostics 329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase New England Biolabs M0535S High-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350) Sigma-Aldrich 25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleate Sigma-Aldrich 9005-65-6 TWEEN 80
Potassium nitrate Sigma-Aldrich P8394
Protein Assay Kit Bio-Rad 5000122 RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie Stain Bio-Rad 1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) Abcam AB116028
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sodium dodecyl sulphate Sigma-Aldrich 151-21-3 SDS
Sodium L-ascorbate BioXtra Sigma-Aldrich 11140
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350S DDS
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 339741
Yeast extract Formedium 008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804) Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra) Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6) Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator) Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager) Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection) BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch) Bio-Rad
Power supply (PowerPac) Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron) Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences GE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro) Amersham BioSciences UK Ltd

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  2. Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or complexes prepared in detergents. Crystals (Basel). 10 (2), 86 (2020).
  3. Lewinson, O., Orelle, C., Seeger, M. A. Structures of ABC transporters: handle with care. FEBS Letters. 594 (23), 3799-3814 (2020).
  4. Luckey, M. Membrane Structural Biology: With Biochemical and Biophysical Foundations. , Cambridge University Press. Ch. 4 69-105 (2014).
  5. Opekarova, M., Tanner, W. Specific lipid requirements of membrane proteins--a putative bottleneck in heterologous expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1610 (1), 11-22 (2003).
  6. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  7. Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids. Annual Review of Biochemistry. 66, 199-232 (1997).
  8. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1612 (1), 1-40 (2003).
  9. Ahn, J. H., Pan, J. G., Rhee, J. S. Homologous expression of the lipase and ABC transporter gene cluster, tliDEFA, enhances lipase secretion in Pseudomonas spp. Applied and Environmental Microbiology. 67 (12), 5506-5511 (2001).
  10. Newby, Z. E., et al. A general protocol for the crystallization of membrane proteins for X-ray structural investigation. Nature Protocols. 4 (5), 619-637 (2009).
  11. Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 61-72 (2016).
  12. Wiener, M. C. A pedestrian guide to membrane protein crystallization. Methods. 34 (3), 364-372 (2004).
  13. Grisshammer, R. Understanding recombinant expression of membrane proteins. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 337-340 (2006).
  14. Lamping, E., et al. Characterization of three classes of membrane proteins involved in fungal azole resistance by functional hyperexpression in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 6 (7), 1150-1165 (2007).
  15. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  16. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  17. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  18. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  19. Harvey, C. J. B., et al. HEx: A heterologous expression platform for the discovery of fungal natural products. Science Advances. 4 (4), (2018).
  20. Kingsman, S. M., Kingsman, A. J., Dobson, M. J., Mellor, J., Roberts, N. A. Heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 3, 377-416 (1985).
  21. Monk, B. C., et al. Yeast membrane protein expression system and its application in drug screening. US patent. , 8728797 NZ 513755, AU 2002330796, US 8728797 patent NZ 513755, AU 2002330796 (2002).
  22. Sagatova, A. A., Keniya, M. V., Wilson, R. K., Monk, B. C., Tyndall, J. D. Structural insights into binding of the antifungal drug fluconazole to Saccharomyces cerevisiae lanosterol 14alpha-demethylase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (8), 4982-4989 (2015).
  23. Decottignies, A., et al. ATPase and multidrug transport activities of the overexpressed yeast ABC protein Yor1p. The Journal of Biological Chemistry. 273 (20), 12612-12622 (1998).
  24. Lamping, E., Zhu, J. Y., Niimi, M., Cannon, R. D. Role of ectopic gene conversion in the evolution of a Candida krusei pleiotropic drug resistance transporter family. Genetics. 205 (4), 1619-1639 (2017).
  25. Lamping, E., Niimi, M., Cannon, R. D. Small, synthetic, GC-rich mRNA stem-loop modules 5' proximal to the AUG start-codon predictably tune gene expression in yeast. Microbial Cell Factories. 12, 74 (2013).
  26. James, J. E., Lamping, E., Santhanam, J., Cannon, R. D. PDR transporter ABC1 is involved in the innate azole resistance of the human fungal pathogen Fusarium keratoplasticum. Frontiers in Microbiology. , (2021).
  27. Ullah, R., et al. Activity of the human rhinovirus 3C protease studied in various buffers, additives and detergent solutions for recombinant protein production. PLoS One. 11 (4), 0153436 (2016).
  28. von Stetten, D., Noirclerc-Savoye, M., Goedhart, J., Gadella, T. W., Royant, A. Structure of a fluorescent protein from Aequorea victoria bearing the obligate-monomer mutation A206K. Acta Crystallographica Section F. Structural Biology and Crystalization Communications. 68, Pt 8 878-882 (2012).
  29. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  30. Cormack, B. P., et al. Yeast-enhanced green fluorescent protein (yEGFP): a reporter of gene expression in Candida albicans. Microbiology (Reading). 143, Pt 2 303-311 (1997).
  31. Monk, B. C., et al. Architecture of a single membrane spanning cytochrome P450 suggests constraints that orient the catalytic domain relative to a bilayer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3865-3870 (2014).
  32. Holmes, A. R., et al. ABC transporter Cdr1p contributes more than Cdr2p does to fluconazole efflux in fluconazole-resistant Candida albicans clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (11), 3851-3862 (2008).
  33. Tanabe, K., et al. FK506 resistance of Saccharomyces cerevisiae Pdr5 and Candida albicans Cdr1 involves mutations in the transmembrane domains and extracellular loops. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (1), 01146 (2019).
  34. Tanabe, K., et al. Chimeras of Candida albicans Cdr1p and Cdr2p reveal features of pleiotropic drug resistance transporter structure and function. Molecular Microbiology. 82 (2), 416-433 (2011).
  35. Madani, G., Lamping, E., Cannon, R. D. Engineering a cysteine-deficient functional Candida albicans Cdr1 molecule reveals a conserved region at the cytosolic apex of ABCG transporters important for correct folding and frafficking of Cdr1. mSphere. 6 (1), (2021).
  36. Lamping, E., et al. Abc1p is a multidrug efflux transporter that tips the balance in favor of innate azole resistance in Candida krusei. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 354-369 (2009).
  37. Panapruksachat, S., et al. Identification and functional characterization of Penicillium marneffei pleiotropic drug resistance transporters ABC1 and ABC2. Medical Mycology. 54 (5), 478-491 (2016).
  38. Wada, S., et al. Phosphorylation of Candida glabrata ATP-binding cassette transporter Cdr1p regulates drug efflux activity and ATPase stability. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 94-103 (2005).
  39. Watanasrisin, W., et al. Identification and characterization of Candida utilis multidrug efflux transporter CuCdr1p. FEMS Yeast Research. 16 (4), (2016).
  40. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  41. Niimi, K., et al. Specific interactions between the Candida albicans ABC transporter Cdr1p ectodomain and a D-octapeptide derivative inhibitor. Molecular Microbiology. 85 (4), 747-767 (2012).
  42. Holmes, A. R., et al. The monoamine oxidase A inhibitor clorgyline is a broad-spectrum inhibitor of fungal ABC and MFS transporter efflux pump activities which reverses the azole resistance of Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (3), 1508-1515 (2012).
  43. Reis de Sa, L. F., et al. Synthetic organotellurium compounds sensitize drug-resistant Candida albicans clinical isolates to fluconazole. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (1), 01231 (2017).
  44. Tanabe, K., et al. Inhibition of fungal ABC transporters by unnarmicin A and unnarmicin C, novel cyclic peptides from marine bacterium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 364 (4), 990-995 (2007).
  45. le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
  46. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  47. Pfaller, M. A. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs, and modes of transmission. Clinical Infectious Diseases. 22, Suppl 2 89-94 (1996).
  48. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clinical Microbiology Reviews. 22 (2), 291-321 (2009).
  49. Sanglard, D., et al. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (11), 2378-2386 (1995).
  50. Prasad, R., De Wergifosse, P., Goffeau, A., Balzi, E. Molecular cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple resistance to drugs and antifungals. Current Genetics. 27 (4), 320-329 (1995).
  51. Lamping, E., Madani, G., Lee, H. J., Niimi, M., Cannon, R. D. Candida albicans: Cellular and Molecular Biology. Prasad, R. , Chapter 18 379-406 (2017).
  52. Crouzet, J., Trombik, T., Fraysse, A. S., Boutry, M. Organization and function of the plant pleiotropic drug resistance ABC transporter family. FEBS Letters. 580 (4), 1123-1130 (2006).
  53. Kang, J., et al. Plant ABC Transporters. Arabidopsis Book. 9, 0153 (2011).
  54. Lamping, E., et al. Fungal PDR transporters: phylogeny, topology, motifs and function. Fungal Genetics and Biology. 47 (2), 127-142 (2010).
  55. Lamping, E., Cannon, R. D. Use of a yeast-based membrane protein expression technology to overexpress drug resistance efflux pumps. Methods in Molecular Biology. 666, 219-250 (2010).
  56. Day, M. Yeast petites and small colony variants: for everything there is a season. Advances in Applied Microbiology. 85, 1-41 (2013).
  57. Niimi, K., et al. Chemosensitization of fluconazole resistance in Saccharomyces cerevisiae and pathogenic fungi by a D-octapeptide derivative. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (4), 1256-1271 (2004).
  58. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  59. Hao, Z., et al. A novel and fast purification method for nucleoside transporters. Frontiers in Molecular Biosciences. 3, 23 (2016).
  60. Nakamura, K., et al. Functional expression of Candida albicans drug efflux pump Cdr1p in a Saccharomyces cerevisiae strain deficient in membrane transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3366-3374 (2001).
  61. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), 29191 (2011).
  62. Byrne, B. Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 32, 9-17 (2015).
  63. Holmes, A. R., et al. Heterozygosity and functional allelic variation in the Candida albicans efflux pump genes CDR1 and CDR2. Molecular Microbiology. 62 (1), 170-186 (2006).
  64. Keniya, M. V., et al. Drug resistance is conferred on the model yeast Saccharomyces cerevisiae by expression of full-length melanoma-associated human ATP-binding cassette transporter ABCB5. Molecular Pharmaceutics. 11 (10), 3452-3462 (2014).

Tags

ביולוגיה גיליון 172
הכנת קרום פלזמה בקנה מידה קטן לניתוח <em>קנדידה אלביקנס</em> CDR1-mGFPHis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., … More

Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., Niimi, M., Mitra, A. K., Cannon, R. D. Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis. J. Vis. Exp. (172), e62592, doi:10.3791/62592 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter