Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Маломасштабная плазматическая мембранная подготовка для анализа Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Published: June 13, 2021 doi: 10.3791/62592
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 3, 1
1Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry, University of Otago, 2Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, 3School of Biological Sciences, University of Auckland
* These authors contributed equally

Summary

В данной статье представлен маломасштабный протокол изоляции плазматической мембраны для характеристики белка Candida albicans ABC (АТФ-связывающая кассета) Cdr1, сверхэкспрессированного в Saccharomyces cerevisiae. Расщепленная протеаза C-концевая двойная метка mGFPHis с 16-остатчным линкером между Cdr1 и меткой была разработана для облегчения очистки и моющего скрининга Cdr1.

Abstract

Успешная биохимическая и биофизическая характеристика АВС-транспортеров в значительной степени зависит от выбора гетерологии системы экспрессии. За последние два десятилетия мы разработали платформу экспрессии белка дрожжевой мембраны, которая использовалась для изучения многих важных белков грибковых мембран. Экспрессия хозяина Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ удалена в семи основных эндогенных переносчиках ABC и содержит транскрипционный фактор Pdr1-3 с мутацией усиления функции, которая позволяет конститутивную сверхэкспрессию генов гетерологийного мембранного белка, стабильно интегрированных в виде одиночных копий в геномном локусе PDR5. Создание универсальных плазмидных векторов и оптимизация одноэтапных стратегий клонирования позволяет быстро и точно клонировать, мутагенез и экспрессию гетерологийных ABC-транспортеров. Здесь мы описываем разработку и использование новой протеазно-расщепляемой двойной метки mGFPHis (т.е. мономерного дрожжевого усиленного зеленого флуоресцентного белка yEGFP3, сплавленного с шестигистидиновой меткой очистки с аффинностью), которая была разработана, чтобы избежать возможного вмешательства метки в интересующий белок и повысить эффективность связывания метки His с никель-аффинными смолами. Слияние mGFPHis с мембранным белком ORF (открытая рамка считывания) позволяет легко количественно оценить белок путем проверки полиакриламидных гелей и обнаружения продуктов деградации, сохраняющих метку mGFPHis. Мы демонстрируем, как эта функция облегчает скрининг моющих средств для солюбилизации мембранного белка. Представлен протокол эффективной, быстрой и надежной изоляции мелкомасштабных плазматических мембранных препаратов C-терминально помеченного мультилекарственного транспортера излияния Candida albicans Cdr1, переэкспрессированного в S. cerevisiae ADΔΔ. Этот маломасштабный протокол изоляции плазматических мембран генерирует высококачественные плазматические мембраны в течение одного рабочего дня. Препараты плазматической мембраны могут быть использованы для определения ферментной активности мутантных вариантов Cdr1 и Cdr1.

Introduction

Извлечение интегральных мембранных белков из их родной липидной среды может резко повлиять на их структуру и функцию1,2,3,4. Комплексный липидный состав биологических мембран5 обеспечивает возможность критически важных белково-липидных взаимодействий6. Липиды поддерживают структурную целостность мембранных белков, что позволяет им правильно функционировать в своем мембранном отсеке назначения (назначениях)7,8. Поэтому критическим первым шагом в очистке мембранного белка является извлечение белка из его родной среды без влияния на его структуру и / или функцию.

Существует множество препятствий для характеристики структуры мембранных белков, большинство из которых связаны с их гидрофобной природой, а также трудностями экспрессии правильно свернутых и функциональных мембранных белков в количествах, необходимых для рентгеновской кристаллографии или криоэлектроновой микроскопии (крио-ЭМ)9,10,11,12. Существует три типа мембранных белковых экспрессии систем: гомологичные9,гетерологичные13,14,15и системы экспрессии in vitro 16,17. Часто низкие уровни экспрессии или непомерно низкие затраты многих систем экспрессии оставляют только несколько хозяев в качестве предпочтительного варианта для производства мембранных белков. Они включают бактериального хозяина, Escherichia coli,дрожжи S. cerevisiae и Pichia pastorisи высшие эукариоты, такие как клетки насекомых Sf9 или клеточные линии млекопитающих18. Все технологии экспрессии мембранных белков имеют свои преимущества и недостатки; однако S. cerevisiae является, пожалуй, наиболее изученным эукариотическим модельным организмом, пригодным для производства мембранного белка. Он очень универсален с приложениями в генной инженерии, открытии лекарств, синтетической биологии и экспрессии белков эукариотической мембраны14,19,20,21.

В этом исследовании была использована запатентованная технология экспрессии мембранного белка S. cerevisiae 21, с S. cerevisiae ADΔ14 и ADΔΔ22 в качестве предпочтительных хозяев(фиг.1A),для сверхэкспрессии и изучения основного мультилекарственного эффлюксного насоса Cr1. Оба штамма S. cerevisiae являются производными AD1-8u-23, которые имеют либо ura3 (ADΔ), либо оба гена ura3 и his1 (ADΔΔ), удаленные для устранения любых ложноположительных прототрофных трансформантов урацила или гистидина, возникающих в результате нежелательной интеграции в геномных локусах URA3 или HIS1. Удаление 7 основных мультилекарственных эффлюксных насосов23,указанных на фиг.1A, делает ADΔΔ чрезвычайно чувствительным к большинству ксенобиотиков. Мутантный транскрипционный фактор усиления функции Pdr1-3 вызывает конститутивную сверхэкспрессию гетерологичных мембранных белков, таких как Cdr1 (красные восьмиугольники на фиг.1A)после интеграции гетерологично-ORF-содержащей кассеты трансформации(рисунок 1A)в геномном локусе PDR5 (синий прямоугольник на фиг.1A)посредством двух гомологичных событий рекомбинации. Правильная локализация плазматической мембраны С-концевых mGFPHis помеченных белков может быть подтверждена конфокальной микроскопией(рисунок 1А),а метка His может быть использована для никель-аффинной очистки помеченного белка. Однако клонирование некоторых грибковых транспортеров ABC (например, Candida krusei ABC1)в плазмиды, полученные из pABC3, было невозможным, поскольку они не могли быть распространены в кишечной палочке из-за клеточной токсичности. Это побудило к разработке одноэтапного клонирования мембранных белков14,24, помеченных либо на их N-, либо на C-конце с различным сродством, эпитопом или репортерными метками непосредственно в S. cerevisiae ADΔΔ(рисунок 1C). S. cerevisiae Штаммы ADΔΔ, чрезмерно экспрессирующие различные мутанты CDR1, также могут быть эффективно созданы таким образом, используя до пяти отдельных фрагментов ПЦР, которые перекрываются на 25 bp(рисунок 1C). Используя этот протокол, многие интересующие ORF могут быть клонированы, выражены и охарактеризованы с низкой стоимостью и высокой эффективностью в течение очень короткого промежутка времени. Эффективность трансформации снижается всего в ~2 раза с каждым дополнительным фрагментом ПЦР. 

При желании уровнями выражений также можно легко манипулировать с помощью праймерного дизайна, чтобы предсказуемо настроить уровни выражений до 0,1%-50% от обычно высоких, конститутивных уровней выражения25. Оптимизированный, многофункциональный вектор клонированияpABC3 14, pABC3-XLmGFPHis26 (рисунок 1B)содержит участок расщепления протеазы HRV-3C (X; ЛЕВЛЬФК| GP), протеаза, которая работает лучше при 4 ° C, чем часто используемая протеаза вируса травля табака (TEV)27. L представляет собой линкер с пятью аминокислотами (GSGGS), mGFP представляет собой мономерный мутант (A206K)28,29 версию дрожжевого усиленного зеленофлуоресцентного варианта белка yEGFP330,а His представляет собой трехаломиновый линкер (GGS), за которым следует шестигистидинная (HHHHHH) никель-аффинная белковая очистка метка.

Эта технология экспрессии была успешно использована в открытии лекарств и изучении мембранных белков. Первая структура грибкового азолового препарата-мишени, S. cerevisiae Erg1131,была решена с использованием этой технологии. Это также позволило детально охарактеризовать C. albicans Cdr132, 33,34и создать молекулу Cdr1с дефицитом цистеина35, подходящую для исследований сшивания цистеина для проверки любой будущей структуры с высоким разрешением. Многие другие abc-транспортеры из основных грибковых патогенов человека (например, C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei и видовой комплекс Fusarium solani) также были подробно изучены с использованием этой платформы экспрессии24,36,37,38,39. Это позволило создать панель штаммов S. cerevisiae, чрезмерно экспрессирующих эфлюксные насосы, которые были использованы в высокопроизводительных экранах, чтобы обнаружить новую флуоресцентную подложку эфлюксного насоса Nile red40 и 41 и широкого спектра действия ингибиторов эфлюксного насоса14,33,43,44. Использование этой системы также позволило обнаружить клоргилин в качестве первого в своем роде грибкового ингибитора мультилекарственного эфлюксного насоса широкого спектра действия42.

Полная солюбилизация мембранных белков и создание однородного мембранного белково-мицеллевого препарата, лишенного эндогенных липидов, требует высоких концентраций детергентов45. Но, к сожалению, это также часто инактивирует мембранный белок5,8,45,46. На свойства моющих мономеров и их агрегацию в растворе влияют физические свойства гидрофобного хвоста, длина и ветвление алкильной цепи, наличие ароматического ядра или фторалкильной боковой цепи или количество полиоксиэтиленовых единиц. Таким образом, скрининг моющих средств является важным первым шагом для определения наиболее подходящего моющего средства для солюбилизации и очистки мембранного белка.

C. albicans является основным грибковым патогеном человека лиц с ослабленным иммунитетом, который может вызывать серьезные, опасные для жизни инвазивные инфекции47,и он может стать устойчивым к азоловым противогрибковым препаратам48,49. Одним из основных механизмов мультилекарственности C. albicans является сверхэкспрессия Cdr150,который является ПЕРЕНОСЧИКОМ51 подсемейства ABCG типа II, расположенным в плазматической мембране. Полноразмерные грибковые транспортеры ABCG (состоящие из двух нуклеотидсвязывающих доменов [NBD] и двух трансмембранных доменов [TMD]) более известны как переносчики плейотропной лекарственной устойчивости (PDR) и характеризуются их уникальной инвертированной доменной топологией [NBD-TMD]2. Транспортеры PDR встречаются только в растениях52,53 и грибах54. Несмотря на их важность, нет никаких конструкций для транспортеров PDR, хотя недавно были решены конструкции для транспортеров ABCG половинного размера, что помогло создать первую предварительную модель для Cdr133. Однако наши недавние экспериментальные данные свидетельствуют о том, что эта модель является ошибочной, возможно, потому, что грибковые транспортеры PDR имеют характерные асимметричные NBD, что, вполне возможно, приводит к уникальному транспортному механизму. Таким образом, структура Cdr1 с высоким разрешением необходима как для рационального проектирования новых ингибиторов эфлюксного насоса, которые могут помочь преодолеть опосредованную из потоком лекарственную устойчивость, так и для понимания механизма действия этого важного семейства транспортеров ABC.

Целью данного исследования была разработка надежных протоколов экспрессии, солюбилизации и очистки Cdr1 в генетически модифицированном хозяине экспрессии S. cerevisiae с конечной целью получения структуры высокого разрешения для Cdr1. В рамках этого процесса была разработана протеазно-расщепляемая двойная метка mGFPHis(рисунок 1B)с 16-остаточной линкером, отделяющей метку от C-конца Cdr1, что улучшило связывание прикрепленной 6x его метки сродства с никелем-аффинной смолой и позволило контролировать уровни экспрессии Cdr1 в живых клетках и во время всего процесса очистки. Также был разработан воспроизводимый протокол для мелкомасштабных дрожжевых препаратов белка плазматической мембраны, содержащих около 10% C. albicans Cdr1 (по оценкам окрашивания Кумасси после SDS-PAGE), который может быть использован для биохимической характеристики Cdr1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка свежих или замороженных запасов трансформационных компетентных ADΔ и ADΔΔ клеток

  1. Инокулировать 25 мл 2x YPCD [т.е. 2x YPD; 2% (мас./об.) дрожжевого экстракта, 2% (мас./об.) пептона, 4% (мас./об.) декстрозы), 0,079% (мас./об.) CSM (полная смесь добавок)]35 среды с одной дрожжевой колонией и инкубата в течение ночи (o/n) в течение 16 ч при 30 °C с встряхиванием при 200 оборотах в минуту (об/мин).
  2. Инокулировать 225 мл 2x YPCD среды 25 мл o/n культурой и проверить оптическую плотность клеток при 600 нм (OD600); OD600 обычно составляет ~0,5-1,0.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе убедитесь, что все материалы, необходимые для следующего эксперимента по преобразованию, легко доступны.
  3. Выращивайте культуру при 30 °C в течение еще ~6-8 ч с встряхиванием при 200 об/мин до тех пор, пока плотность клеток не достигнет OD600 ~ 6-8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги выполняются при комнатной температуре (RT), если не указано иное.
  4. Собирают эти логарифмически-фазовые ячейки путем центрифугирования при 3000 х г в течение 3 мин.
  5. Повторно суспендировать клетки и дважды промыть их стерильной двойной дистиллированной водой (ddH2O; т.е. 200 мл, а затем 20 мл).
  6. Соберите клетки при 3000 х г в течение 3 мин.
  7. Медленно (т.е. добавляйте 30 равных аликвот замороженного раствора компетентных клеток (FCC) каждую минуту в течение 30 мин) повторно суспендируют гранулу ячейки в X мл FCC [5% (мас./об.) глицерина, 10% (v/v) диметилсульфоксида (DMSO)] на льду (где X = OD600;например, если OD600 = 6 повторное суспендирование в 6 мл или если OD600 = 3 повторное суспендирование в 3 мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная композиция FCC имеет решающее значение для успеха трансформации.
  8. Держите клетки на льду в течение 2 ч перед трансформацией или храните аликвоты при -80 °C до тех пор, пока это не потребуется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки ADΔ и ADΔΔ очень чувствительны к замораживанию. Таким образом, ячейки необходимо медленно охлаждать до -80 °C: поместить ледяные микроцентрифужные трубки, содержащие 50-600 мкл клеточных аликвот, в пластиковый ящик для хранения (RT). Поместите коробку в контейнер из полистирола большего размера (RT) и закройте контейнер фитинговой полистирольной крышкой. Затем поместите контейнер в морозильную камеру -80 °C.
    ВНИМАНИЕ: Медленное замораживание имеет решающее значение для выживания клеток.

2. Трансформация ADΔ и ADΔΔ с CaCDR1-XLmGFPHis и подтверждение правильных трансформантов путем колонии ПЦР и секвенирования ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида pABC3-CDR1-mGFPHis была создана с использованием обычных стратегий клонирования, подробно описанных в Lamping et al., 201055 и проиллюстрированных на рисунке 1B. Дикий тип C. albicans CDR1 был выделен как фрагмент PacI/NotI из плазмиды pABC3-CaCDR1A-GFP14 и клонирован в pABC3-XLmGFPHis26.

  1. ПЦР амплируют всю кассету трансформации CDR1 высокоточной ДНК-полимеразой и праймерной парой PDR5-pro/PDR5-ter35 с использованием 1-10 нг pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis в качестве шаблона ДНК или, альтернативно, переваривают 2 мкг pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis до завершения с 10 U рестрикционным ферментом AscI при 37 °C(Рисунок 1A,B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кассета преобразования CDR1 (рисунок 1A)содержит промоутер PDR5 - CaCDR1-mGFPHis - терминатор PGK1 - маркер выбора URA3 - нисходящую область PDR5.
  2. Выполните электрофорез агарозного геля и экстракт геля на кассете трансформации ~8 kb.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гелевая очистка кассеты трансформации CaCDR1 ~8 кб удаляет любую возможную непереваренную плазмидную ДНК, что может привести к неправильным трансформантам, которые имеют всю плазмиду, а не кассету линейного преобразования, интегрированную в геномный локус PDR5.
  3. Денектура необходимого количества ДНК носителя спермы лосося (2 мг/мл; 10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА; рН 7,5) в течение 10 мин на кипящей водяной бане и держать на льду. Используйте завинчивающиеся трубки для кипячения ДНК сперматозоидов лосося, чтобы избежать открытия крышки.
  4. Смешайте 50 мкл денатурированной ДНК сперматозоидов лосося с 14 мкл кассеты трансформации (500-2000 нг) и держите 64 мкл смеси ДНК на льду до дальнейшего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 10 нг плазмиды E. coli-дрожжевого челночного челночного (например, pYES2) в качестве положительного контроля трансформации(рисунок 2B).
  5. Повторно суспендировать свежие или замороженные грамотные клетки, быстро размораживают в течение 5 мин на водяной бане 30 °C и делят их на 50 мкл аликвот в микроцентрифужных трубках объемом 1,5 мл.
  6. Заготавливайте клетки центрифугированием в течение 1 мин в микрофуге на максимальной скорости (18 000 х г).
  7. Удалите супернатант и сохраните ячейку гранулы на RT.
  8. Для каждой трансформации смешайте 296 мкл комбинаций (RT) 260 мкл 50% (мас./об.) полиэтиленгликоля (PEG 3350) и 36 мкл 1 М ацетата лития (LiAc) путем повторного пипетирования с соответствующими 64 мкл ледяных смесей ДНК.
  9. Немедленно добавьте соответствующую смесь в 50 мкл компетентную ячейку гранулы аликвоты.
  10. Повторно суспендируют клеточную гранулу в 360 мкл смеси PEG-LiAc-ДНК путем тщательного вихря в течение примерно 30 с.
  11. Инкубировать клеточную смесь на водяной бане при 30 °C в течение 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки ADΔ и ADΔΔ лучше преобразуются при 30 °C, чем при 42 °C35.
  12. Собирайте клетки при 18 000 х г в течение 10 с. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендьте ячейку гранулы в 80 мкл ddH2O.
  13. Распределите клетки на агаровую пластинуCSM-URA 35 [т.е. 0,67% (мас./об.) дрожжевого азотного основания без аминокислот, 0,077% (мас./об.) CSM минус урацил, 2% (мас./об.) глюкозы и 2% (мас./об.) агара].
  14. Инкубировать пластины в течение 2-3 дней при 30 °C до тех пор, пока не будут хорошо видны прототрофные трансфоранты урацила.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидайте ~100 трансформаторов на мкг линейной кассеты преобразования CaCDR1 ~8 кб и ~4 x 104 трансформаторов на мкг pYES2.
  15. Выберите пять независимых трансформантов и распределите их на свежую пластину CSM-URA, чтобы отделить прототрофные трансформанты урацила от остатков нетрансформированных клеток-хозяев.
  16. Удалите все возможные миниатюрные мутанты, вырастив трансформанты на пластинах YPG-агара [1% (мас./об.) дрожжевого экстракта, 2% (мас./об.) пептона, 2% (в/об.) глицерина и 2% (мас./об.) агара](рисунок 2D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Маленькие мутанты имеют дефектные митохондрии и, таким образом, не могут расти на неферментируемых источниках углерода. Они довольно распространены у S. cerevisiae56. S. cerevisiae ADΔ и ADΔΔ особенно склонны к приобретению петитфенотипа.
  17. Выполните ПЦР колонии дрожжей и подтвердите, что по крайней мере три независимых трансформанта правильно интегрированы в геномный локус PDR5 (рисунок 1C),амплифицировка всей кассеты трансформации CaCDR1 ~8 кб специфической ДНК-полимеразой, оптимизированной для амплиации продуктов ПЦР из нечистых источников шаблона ДНК. Используйте набор праймеров, которые связываются непосредственно за пределами места интеграции, и 1 мкл аликвот клеточных суспензий (в ddH2O), полученных из отдельных колоний, в качестве шаблонов ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта конкретная ДНК-полимераза надежно усиливает ~ 8 кб фрагментов ПЦР из неповрежденных дрожжевых клеток. Однако для надежной амплификации требуется 45 циклов ПЦР, и дрожжевые клетки должны быть повторно суспендированы при OD600 1-10 в ddH2O.
  18. Подтвердите правильный продукт амплификации ПЦР ~8 кб электрофорезом ДНК-агарозного геля 1 мкл части реакции ПЦР.
  19. Удалите избыточные амплификационные праймеры из 10-мкл-секции реакции ПЦР ферментной смесью одноцепочечной ДНК-экзонуклеазы и фосфатазы в соответствии с инструкциями производителя перед секвенированием всего ОВФ с использованием частей обработанного образца ДНК с соответствующими праймерами.

3. Протокол изоляции плазматической мембраны маломасштабных дрожжей

  1. Выращивание дрожжевых клеток
    1. Предварительно культивировали одну колонию дрожжей в 10 мл СС при 30 °C в течение ~7-8 ч с встряхиванием при 200 об/мин.
    2. Инокулируют 40 мл среды YPD предварительной культурой 10 мл и инкубируют клетки при 30 °C o/n (~16 ч) с встряхиванием при 200 об/мин до тех пор, пока плотность клеток не достигнет OD600 1-3.
  2. Сбор дрожжевых клеток
    1. Соберите 40 единиц OD (ODU; например, 1 мл при OD600 1 = 1 ODU) логарифмических фазовых ячеек при 4 200 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    2. Повторно суспендировать и промыть клетки дважды ледяным холодным стерильным ddH2O (т.е. 40 мл, а затем 1 мл; собирать клетки между этапами центрифугированием при 4,200 х г в течение 5 мин при 4 °C).
    3. Повторно суспендируют гранулу в 1 мл ледяного холодного стерильного ddH2O и переложат клеточную суспензию в предварительно охлажденный (на льду) 1,5 мл микроцентрифужную трубку.
    4. Собирайте ячейки при 3 300 х г в течение 3 мин при 4 °C.
    5. Аспирировать супернатанта.
    6. Повторно суспендируют клеточную гранулу в гомогенизирующий буфер 0,5 мл [HB; 50 мМ Tris, 0,5 мМ ЭДТА, 20% (v/v) глицерин; pH 7,5], только что дополненный 1 мМ фенилметилсульфонилфторидом (PMSF).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда добавляйте PMSF свежим, потому что PMSF быстро инактивируется при воздействии воды.
      ВНИМАНИЕ: PMSF является ингибитором серинпротеазы, который чрезвычайно коррозионный и разрушительный для тканей. Это может привести к необратимому повреждению глаз.
    7. Храните клеточную суспензию при -80 °C или используйте немедленно.
  3. Изоляция плазматических мембран
    1. Если заморожены, разморозить клетки на льду в течение ~1 ч.
    2. Добавьте ледяные шарики кремнезема диаметром 0,5 мм к суспензии ячейки 0,5 мл, чтобы достичь общего объема 1 мл.
    3. Разбейте клетки с 6 циклами вихря при максимальной интенсивности встряхивания в течение 1 мин, перемежаясь с 3 мин периодами охлаждения на льду.
    4. Сделайте тонкое отверстие на дне трубки с помощью нагретого лезвия скальпеля.
    5. Соберите гомогенат сломанной ячейки через дно трубки, установленной в другой ледяной микроцентрифужной трубке 1,5 мл с низкоскоростным (~ 200 об/мин) вращением 10 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это гарантирует, что шарики кремнезема останутся в исходной трубке.
    6. Центрифугируют гомогенат клеток при 5,156 х г в течение 5 мин при 4 °C для удаления клеточного мусора, неразрывных клеток и ядер.
    7. Переложите 450 мкл супернатанта в ледяную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и добавьте еще 1 мл ледяного HB, дополненного свежим PMSF (1 мМ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап разведения имеет решающее значение для восстановления высококачественного белка плазматической мембраны.
    8. Собирают плазматические мембраны при 17,968 х г в течение 1 ч при 4 °C и повторно суспендируют гранулу плазматической мембраны путем повторного пипетирования в 100 мкл HB, только что дополненного 1 мМ PMSF. Ослабьте гранулу клетки для правильной гомогенизации плазматической мембраны, перемешав гранулу клетки наконечником пипетки 100 мкл перед высвобождением 100 мкл HB и пипеткой вверх и вниз.
    9. Измерьте концентрацию белка препарата плазматической мембраны с помощью набора для анализа белка, совместимого с буферами, содержащими восстановительный агент и моющее средство.
    10. Храните плазматические мембраны при -80 °C или храните на льду для немедленного использования.

4. Электрофорез полиакриламидного геля додецилсульфата натрия (SDS-PAGE)

  1. Соберите аппарат для приготовления полиакриламидных гелей.
  2. Для двух разделяющих гелей (7% полиакриламида) смешайте 2,1 мл 40% акриламида/бис-акриламида, 3 мл 4-кратного разделительного буфера (1,5 М Трис, 0,4% додецилсульфата натрия [SDS] (мас./об);рН 8,8) и 6,9 мл ddH2O. Добавьте 8 мкл тетраметилэтилендиамина (TEMED) и 60 мкл 10% персульфата аммония (APS), чтобы инициировать полимеризацию акриламида.
    ВНИМАНИЕ: Акриламид/бис-акриламид очень токсичен. Он вызывает раздражение кожи, периферическую невропатию и является канцерогеном. TEMED вреден при проглатывании или вдыхании. АФС вреден при проглатывании. Вызывает серьезные раздражения глаз и кожи.
  3. Налейте ~4-5 мл этой смеси в собранный гель-аппарат, до ~2 см сверху.
  4. Осторожно наложите ~ 1-2 мл 0,1% SDS сверху, чтобы создать планарный мениск.
  5. Дайте полиакриламиду заготовиться в течение ~60 мин при RT.
  6. Приготовьте смесь гелевого укладки для двух гелей, смешивая 0,5 мл 40% акриламида/бис-акриламида, 1 мл 4-кратного буфера укладки (0,5 М Трис, 0,4% SDS (мас./об.); рН 6,8) и 6,9 мл ddH2O. Добавьте 2 мкл TEMED и 30 мкл 10% APS, чтобы начать полимеризацию акриламида.
  7. Удалите слой SDS 0,1% из полимеризованного разделительного геля и промойте ddH2O, чтобы удалить следы SDS.
  8. Налейте смесь геля для укладки на разделительные гели.
  9. Поместите расческу в гель для укладки и удалите пузырьки воздуха вокруг гребня.
  10. Дайте укладывать гель в течение ~60 мин при RT.
  11. Снимите расческу и промойте гелевые прорези водой. Поместите гель в гелевой резервуар и заполните гель-резервуар сверху 1x бегущим буфером (24,8 мМ Tris, 190 мМ глицина, 0,1% SDS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте 1-кратный работающий буфер из 10-кратного буферного запаса (248 мМ Tris, 1,9 М глицина, 1% SDS (с/в) в ddH2O), хранящегося в RT.
  12. Смешайте образцы плазматической мембраны 5-10 мкл (т.е. 10-20 мкг белка) с равными объемами 2-кратного красителя для загрузки белка [120 мМ Tris-HCl (рН 6,8), 20% глицерина, 0,02% бромфенола синего, 4% SDS, 200 мМ дитиотрейтола (DTT)] и немедленно загрузите в отдельные гелевые щели, погруженные в работающий буфер.
    ВНИМАНИЕ: DTT вреден при проглатывании. Вызывает серьезные раздражения глаз и кожи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте 10 мл запаса 2x белкового красителя, аликвоты и храните при -20 °C. Не нагревайте смешанные образцы, а немедленно загружайте их в отдельные гелевые пазы, чтобы метка GFP не денатурировалась, и можно было обнаружить сигналы флуоресценции в геле.
  13. Загрузите маркеры молекулярной массы белка (диапазон 10-245 кДа) в отдельный слот, чтобы можно было оценить размер отдельных фрагментов белка.
  14. Выполняют гель-электрофорез при 200 В до тех пор, пока синий нагрузочный краситель не достигнет дна геля (обычно 45-55 мин).
  15. Исследуйте гель на наличие геля на GFP-флуоресценцию с помощью гелевой системы визуализации (длины волн возбуждения и излучения составляют 475-485 нм и 520 нм соответственно).
  16. После визуализации флуоресценции в геле фиксируют белки путем мягкого перемешивания геля в ~10-20 мл раствора для фиксации белкового геля (40% этанола, 10% уксусной кислоты) в течение 15 мин при RT.
  17. Промыть гель дважды в течение 10 мин 10 мл ddH2O и визуализировать белковые полосы, поместив гель в 10 мл коллоидного раствора для окрашивания Coomassie с мягким встряхиванием в течение ~ 1 ч при RT.
  18. Для улучшения визуализации белковых полос обезкрасить гель один или два раза в ~20 мл ddH2O в течение ~1 ч перед записью изображений с помощью гелевой системы визуализации.

5. Определение деятельности Cdr1 ATPase 57

  1. Разбавляем образцы плазматической мембраны >2,2 мг/мл до 1-2 мг/мл в ГВ.
  2. Уравновешивайте коктейль для анализа АТФазы (75 мМ MES-Tris, 75 мМ нитрата калия, 0,3 мМ молибдата аммония, 7,5 мМ азида натрия; рН 7,5) и Mg-АТФ (28,8 мМ АТФ динатриевой соли, 28,8 мМ MgCl2;рН 7,0) до 30 °C в инкубаторе с 30 °C.
    ВНИМАНИЕ: Азид натрия очень токсичен.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все буферные запасы и бутылки не содержит фосфатов; т.е. промыть стеклянную посуду с 1% (об/об) HCl и промыть ее несколько раз ddH2O. Кроме того, держите его отдельно от другой стеклянной посуды, которая, вероятно, содержит следы фосфата, обычно присутствующего в моющих средствах, используемых для мытья стеклянной посуды.
  3. Добавьте 90 мкл пробирного коктейля с ингибитором Cdr1-АТФазы или без него (20 мкМ олигомицина) в отдельные колодцы 96-скважинной микротитровой пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ выполняется в трех разах.
  4. Добавьте 5 мкл изолированных плазматических мембран (~5-10 мкг белка) или фосфатных стандартов (0-100 нмоль Pi) в соответствующие колодцы микротитрой пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните первую и последнюю колонки для двух отдельных наборов стандартов на фосфаты.
  5. Начинают анализ с добавления 25 мкл предварительно высужденного 28,8 мМ Mg-АТФ (конечная концентрация 6 мМ) с многоканальной пипеткой в отдельные скважины и инкубируют при 30 °C в течение 30 мин.
  6. Остановить реакцию можно добавлением 130 мкл реагента развития (1,6% L-аскорбата натрия, 1% SDS, 12% молибдата аммония в 6 М серной кислоты).
    ВНИМАНИЕ: Концентрированная серная кислота бурно реагирует с водой. Он коррозионный и может вызвать повреждение кожи и легких.
  7. Инкубировать в RT в течение 10 мин.
  8. Считывание поглощения микротитрных пластинчатых колодцев при 750 нм с помощью считывателя микротитерных пластин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдение 10-минутного времени инкубации для развития синего красителя (т.е. восстановленного фосфорно-молибденового комплекса) имеет решающее значение для точности анализа, поскольку развитие синего красителя продолжается со временем.
  9. Получение Cdr1-специфической активности АТФазы (т.е. активности Олигомицин-чувствительной АТФазы) путем вычитания активности АТФазы в присутствии олигомицина из общей активности АТФазы в отсутствие олигомицина.

6. Мелкомасштабный моющий экран

  1. Комбинируйте препараты плазматической мембраны (т.е. 2,5 мг белка плазматической мембраны) клеток, чрезмерно экспрессирующих Cdr1-mGFPHis, с буфером GTED-20 [10 мМ Tris, 0,5 мМ ЭДТА, 20 % (мас./об.) глицерина; рН 7,5; только что дополненным 1 мМ PMSF], содержащим 5 мг испытуемого моющего средства, чтобы достичь общего объема 0,5 мл, дополненного 1% (мас./об.) моющим средством.
  2. Вращайте смесь при 4-8 °C в течение 2 ч, с помощью устройства вращения.
  3. Центрифугировать смесь при 141 000 х г при 4 °C в течение 1 ч.
  4. Перенесите супернатант, содержащий солюбилизированный материал, в свежую микроцентрифужную трубку.
  5. Добавьте 0,5 мл буфера GTED-20, дополненного 2% (мас./об.) SDS к нерастворимой фракции гранул, и инкубируйте при 30 °C o/n в встряхивающем инкубаторе для извлечения всего нерастворимого в моющем средстве мембранного белка.
  6. Анализ и сравнение фракций супернатантов и солюбилизированных гранул с помощью SDS-PAGE.
  7. Сфотографируйте гели, содержащие белки с GFP-метками, для флуоресценции GFP в геоле перед окрашиванием Coomassie и количественно оцените уровни экспрессии с помощью системы визуализации.
  8. Используйте фракцию растворимого мембранного белка для последующих применений, таких как флуоресцентная хроматография (FSEC)58 для определения подходящего моющего средства.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Высокая частота превращения S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 трансформантов/мкг) была достигнута с помощью pYES2(рисунок 2B). Как и ожидалось, управление без ДНК (т.е.толькоddH 2 O) не давало трансформаторов, а 1 мкг линейной кассеты преобразования CDR1-mGFPHis (рисунок 1A)давал ~50 трансформаторов(рисунок 2C)с оптимизированным протоколом преобразования ADΔΔ. Трансфоранты CDR1-mGFPHis также были протестированы на их способность расти на неферментируемом источнике углерода для устранения любых возможных миниатюрных мутантов с дефектными митохондриями. Три (желтые круги; Рисунок 2D) из 25 испытанные урацил-прототрофные трансформаторы не могли расти на агаровых пластинах YPG и были выброшены из дальнейших исследований. Cdr1-mGFPHis, экспрессируемый вновь созданным штаммом ADΔΔ-CDR1-mGFPHis, правильно локализован в плазматической мембране(Фиг.1А)и был выражен на достаточных уровнях для структурно-функциональной характеристики Cdr1(Фиг.3). Конструкция оптимизированного двойного тега(рисунок 1B)также позволяет удалить двойную метку mGFPHis после никель-аффинной очистки Cdr1-mGFPHis для предотвращения возможных помех от метки в последующих приложениях. Предварительные результаты, однако, показали, что 3 аминокислотный линкер между Cdr1 и участком расщепления протеазы HRV-3C, возможно, придется расширить для достижения более быстрого и эффективного расщепления. Аналогичные наблюдения были недавно зарегистрированы для N-терминально помеченного нуклеозидного транспортера Escherichia coli NupC, который требовал 15, а не первоначально разработанного 3 аминокислотного линкера для эффективного расщепления моющего средства (DDM) солюбилизированного NupC, связанного с никель-аффинной смолой59. 5 аминокислотный линкер C-терминала участка расщепления HRV-3C предотвращает стерическую интерференцию двойной метки mGFPHis с присоединенным интересующим белком, что мы ранее наблюдали для C. используйте ABC-транспортер Cdr139. Мутация yEGFP3-A206K была создана для предотвращения искусственной GFP-димеризации при высоких концентрациях белка28,а дополнительный 3 аминокислотный линкер между mGFP и меткой His Nickel-affinity обеспечивает надлежащее поверхностное воздействие метки His для максимизации эффективности связывания помеченного белка с никелевой аффинной смолой (данные не показаны).

Figure 1
Рисунок 1:Платформа экспрессии белка дрожжевой мембраны для эффективного клонирования и экспрессии транспортеров грибковой плазматической мембраны. (A)Для преобразования экспрессии хозяина S.cer используется платформа экспрессии 1 для экспрессии PDR5 (синий), CDR1 (красный) C-терминально помеченный XLmGFPHis (зеленый), терминатор PGK1 (оранжевый), маркер выбора URA3 (светло-синий) и часть нисходящей области PDR5 (синий) evisiae ADΔΔ путем интеграции в геномном локусе PDR5. Мутантный фактор транскрипции Pdr1-3 вызывает конститутивную сверхэкспрессию Cdr1 (красные восьмиугольники) в плазматической мембране (см. изображение конфокальной микроскопии ниже). (B)Плазмида pABC3-XLmGFPHis, которая может быть использована в традиционной стратегии клонирования или в качестве шаблона ПЦР для создания кассеты преобразования. Улучшения плазмиды pABC3-XLmGFPHis по сравнению с pABC3-GFP14 перечислены под плазмидной картой. (C)Альтернативная более эффективная стратегия одноэтапного клонирования для интеграции кассеты преобразования в геномный локус PDR5 ADΔΔ. ORF (красный) может быть усилен ПЦР с помощью праймеров (стрелок), которые создают перекрытия с левой рукой (синий; PDR5 промоутер) и правая рука (зеленая; XLmGFPHis-PGK1-URA3-PDR5 нисходящий поток) фрагменты. Мутации (черные линии) могут быть введены в ORF с помощью праймера, если это необходимо. Гомологичные события рекомбинации, которые направляют правильную интеграцию в локус PDR5, обозначаются пересекаемыми пунктирными линиями. (D) Анализы цельноклеточных клеток, которые могут быть использованы для функциональной характеристики грибковых мультилекарственных эфлюксных насосов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Преобразование ADΔΔ с кассетой преобразования CDR1-mGFPHis и устранение миниатюрных трансформантов ADΔΔ-CDR1-mGFPHis. Прототрофные трансформанты урацила были выбраны путем инкубации преобразованных ADΔΔ клеток на пластинах CSM-URA при 30 °C в течение 3 дней. (A) Отрицательный контроль (без ДНК). (B)Положительный контроль (10 нг pYES2). (C) CDR1-mGFPHis трансформанты (1 мкг ДНК). (D) Тестирование трансформантов ADΔΔ-CDR1-mGFPHis для миниатюрного фенотипа на агаровых пластинах YPG. Миниатюрные трансформанты, которые не могли расти на агаровых пластинах YPG из-за дефектных митохондрий, окружены желтым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Флуоресценция GFP является надежным измерительом уровней экспрессии Cdr1, поскольку существует линейная зависимость между количеством Cdr1-mGFPHis (шаг 3.3.9) и сигналами флуоресценции в гегле(рисунок 3A). В этом проекте был разработан воспроизводимый оптимизированный рабочий процесс для быстрого производства высококачественных мелкомасштабных плазматических мембранных препаратов для биохимической характеристики белков плазматической мембраны. Удалось сгенерировать почти 0,5 мг белка плазматической мембраны(рисунок 3C;левый график), показывающий самую высокую активность Cdr1 АТФазы (̃400 нмоль/мин/мг; Рисунок 3C; правый график) при разрушении 40 ODU логарифмических фаз (OD600 нм 1-3) клеток (повторно суспендированных в 0,5 мл HB) с тем же объемом (т.е. 0,5 мл) кварцевых шариков и 6 циклами вихря в течение 1 мин при максимальной интенсивности встряхивания с последующими 3-минутными периодами охлаждения на льду. Дальнейшее увеличение числа циклов разрыва (этап 3.3.3) снижало качество препарата изолированной плазматической мембраны (активность Cdr1 АТФазы снизилась со 170 нмоль/мин/мг до ~60 нмоль/мин/мг; данные не показаны). Хотя были лишь незначительные различия в белковых паттернах SDS-PAGE образцов плазматической мембраны, выделенных из клеток, нарушенных с более высоким числом циклов разрыва (данные не показаны), вполне вероятно, что почти 3-кратное снижение активности Cdr1 ATPase после 10 или более циклов разрыва было вызвано либо: i) частичной денатурацией Cdr1 из-за воздействия повышенной температуры; ii) постперекродные модификации, такие как фосфорилирование или дефосфорилирование; или iii) повышенное перекрестное загрязнение изолированных везикул плазматической мембраны мембранными фракциями других органелл. Разрушение 40 ODU клеток в 0,5 мл HB дало самое высокое качество плазматических мембран (т.е. наибольшее количество Cdr1 на 10 мкг белка плазматической мембраны; Рисунок 3B) с наибольшей активностью Cdr1 ATPase(рисунок 3C;правый график). Более высокая (> 40 ODU/0,5 мл HB) или более низкая (20 ODU/0,5 мл HB) плотности клеток снижала активность АТФазы изолированных плазматических мембран(рисунок 3C;правый график), хотя их выход увеличивался пропорционально увеличению плотности клеток(рисунок 3C;левый график). Таким образом, 40 ODU/0,5 мл HB были оптимальной плотностью клеток для выделения плазматических мембран самого высокого качества. Так, использование оптимизированного протокола для мелкомасштабной изоляции препаратов плазматической мембраны привело к повышению в 2-3 раза удельной активности Cdr1 АТФазы (~300 нмоль/мин/мг; Рисунок 3C; правый график) по сравнению с cdr1-специфической атфазной активностью, которая была первоначально получена (~100 нмоль/мин/мг; данные не показаны). Эти активности АТФазы также были значительно выше35, чем любая ранее зарегистрированная активность Cdr1 АТФазы (100-200 нмоль/мин/мг), которая была получена с помощью более трудоемкого и трудоемкого крупномасштабного протокола подготовки плазматической мембраны14,41,60.

Наиболее распространенным методом извлечения мембранных белков из биологических мембран является солюбилизация моющим средством. Проблема, однако, заключается в том, чтобы найти подходящее моющее средство, которое оказывает наименьшее вредное влияние на стабильность белка и / или характеристики сворачивания. Маркировка белка с помощью mGFPHis облегчает скрининг для выбора лучшего моющего средства для экстракции белка. Всего было протестировано 31 моющее средство, перечисленное в Таблице материалов,с различными свойствами на способность солюбилизировать Cdr1 из сырых плазматических мембран клеток S. cerevisiae ADΔΔ-CDR1-mGFPHis. Результаты для репрезентативного набора из 16 тестовых моющих средств (A-Q) показаны на рисунке 3D. Полосы T, P и S содержат 10 мкл аликвот общего (Т) белка плазматической мембраны сразу после моющего солюбилизации (этап 6.2) и нерастворимые гранулы моющего средства (P; солюбилизированный o/n в 0,5 мл ГТЭД-20, 2% SDS; этап 6,5) и моющее растворимое супернатант (S; шаг 6.4) фракции после разделения ультрацентрифугированием при 141 000 х г. Желаемое моющее средство должно солюбилизировать как можно больше Cdr1-mGFPHis, не изменяя его структуру и/или функцию. Сырые белки плазматической мембраны (5 мг/мл) солюбилизировали в течение 2 ч с помощью 1% (мас./об.) детергента (Т) и аликвот растворимой (S) и нерастворимой (Р) фракций анализировали с помощью SDS-PAGE(Рисунок 3D),а затем также с помощью флуоресцентно-детектируемой размерно-исключаемой хроматографии (FSEC)58 (Фиг.4). Мы определили, что для эффективной солюбилизации Cdr1 требуется минимальное соотношение моющего средства к белку 2:1 (w/w). Фактически, для определения оптимальной концентрации моющего средства (DDM), необходимой для солюбилизации Cdr1-mGFPHis, были исследованы критическая концентрация мицеллы моющего средства (x CMC) и соотношение моющего средства / мембранного белка (w / w). Большие различия в эффективности солюбилизации Cdr1-mGFPHis наблюдались при использовании фиксированных концентраций 10x или 80x CMC DDM. Эффективность солюбилизации варьировалась от 40% до 80% или 60% и 90% в зависимости от количества сырых плазматических мембран, используемых в различных экспериментах по солюбилизации. Тем не менее, выбор соотношения моющего средства к белку ≥2 (мас./мас.) дал воспроизводимо хорошие результаты, при этом >85% Cdr1-mGFPHis солюбилизируются, независимо от количества используемого белка плазматической мембраны. Таким образом, при использовании более распространенного подхода, закладывая простой выбор 1% или 2% (мас./об.) моющего средства для солюбилизации мембранных белков, таких как Cdr1-mGFPHis, важно поддерживать соотношение моющего средства к белку выше 2 (мас./мас.) [т.е. поддерживать концентрацию белка плазматической мембраны ниже 5 мг/мл при использовании 1% (т.е. 10 мг/мл) моющего средства].

Figure 3
Рисунок 3:Количественная оценка уровней экспрессии Cdr1-mGFP, оптимизация маломасштабного протокола изоляции плазматической мембраны и моющего экрана для Cdr1-mGFPHis. (A)Количественная оценка Cdr1-mGFPHis с помощью флуоресценции in-gel; слева показаны окрашенные Coomassie и ин-гелевые флуоресцентные изображения SDS-PAGE того же 0,7% полиакриламидного геля. Полосы с 1 по 6 были загружены 0,75, 1,5, 3, 6, 12 и 24 мкг белка плазматической мембраны ADΔΔ-CDR1-mGFPHis. Cdr1-mGFPHis обозначается красной стрелкой. M = Точность плюс белковый маркер. Интенсивность флуоресценции mGFP (показана справа) была линейной во всем ископаемом диапазоне концентраций и наблюдалась минимальная фоновая флуоресценция. (B) Влияние плотности клеток при разрыве на качество изолированных плазматических мембран. Окрашенный Coomassie полиакриламидный гель (7%) образцов белка плазматической мембраны (10 мкг) и зеленые флуоресцентные сигналы Cdr1-mGFPHis того же геля перед окрашиванием Coomassie. M = Точность плюс белковый маркер. Полосы 1, 3, 5 и 7 представляют собой белки плазматической мембраны ADΔΔ, а полосы 2, 4, 6 и 8 представляют собой белки плазматической мембраны ADΔΔ-CDR1-mGFPHis, выделенные из 20, 40, 60 и 80 ODU клеток соответственно. Cdr1-mGFPHis обозначается красной стрелкой. Относительные проценты зеленых флуоресцентных сигналов перечислены ниже. (C)Влияние плотности клеток при разрыве на выход изолированных плазматических мембран и активность АТФазы Cdr1-mGFPHis. Слева - влияние плотности клеток (ODU/0,5 мл HB) на количество белка плазматической мембраны, выделенного из КЛЕТОК ADΔΔ и ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (Cdr1). Справа - влияние плотности клеток на активность Cdr1 АТФазы плазматических мембран, выделенных из КЛЕТОК ADΔΔ-CDR1-mGFPHis. (D)Примерный SDS-PAGE из 10 мкл аликвот солюбилизационной смеси (T; 0,5 мл), гранул после солюбилизации (P; 0,5 мл) и солюбилизированных (надводящих) фракций (S; 0,5 мл) моющего средства, солюбилизированных сырых белков плазмы плазмы ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (вверху) и гелевой флуоресценции Cdr1-mGFPHis перед окрашиванием Кумасси того же геля (снизу). M = широкая mw предварительно окрашенная белковая лестница (полосы 245, 180, 135, 100, 75, 63 и 48 кДа; полосы 180 кДа и 75 кДа обозначены красными и зелеными стрелками соответственно). Полосами от A до L и от N до Q являются фракции T, S и P для DM (A), β-DDM (B), α-DDM (C), TDM (D), LMNG (E), OGNG (F), OG (G), LDAO (H), Hega (I), Mega (J), Triton-X100 (K), CHAPS (L), NM (N), Tween80 (O), Fos-холин-13 (P) и SDS (Q), соответственно. Аббревиатуры определены в Таблице материалов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Основываясь на результатах скрининга моющих средств(рисунок 3D),DDM (B и C) и Fos-холин-13 (P) оказались лучшими моющими средствами для солюбилизации Cdr1-mGFPHis. Однако использование Fos-холина-13, по-видимому, вызывало частичный протеолиз Cdr1-mGFPHis (P на рисунке 3D). LMNG (E), PCC-α-M (не показаны) и, возможно, также DM (A) были следующими лучшими моющими средствами. Экран моющего средства также показал, что глюкозиды OGNG (F) и OG (G), CHAPS (L), NM (N) и Анзергенты (не показаны) были плохим выбором для солюбилизации Cdr1-mGFPHis, поскольку значительные количества белка были обнаружены в нерастворимых фракциях гранул(рисунок 3D). SDS денатурирует Cdr1-XLmGFPHis, поэтому в полосах Q не видны зеленые флуоресцентные сигналы(рисунок 3D).

Пригодность моющего средства для солюбилизации правильно сложенных нативных частиц Cdr1-mGFPHis также оценивалась FSEC моющего солюбилизированного белка плазматической мембраны (этап 6.4 супернатанта). Примеры хроматограмм, полученных для 100 мкл сырого белка плазматической мембраны из ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (2 мг/мл), солюбилизированного 1% моющим средством, показаны на фиг.4. Пик при объеме элюирования 9 мл представляет собой в основном агрегированные Cdr1-mGFPHis, которые элюируются в объеме пустоты, тогда как правильно солюбилизированные и правильно сложенные частицы Cdr1-mGFPHis представлены пиком гаусса при объеме элюирования 15,5 мл. Широкое плечо между 12 и 14 мл элюирования, возможно, содержит менее четко определенные частицы мицелл Cdr1-mGFPHis и/или указывает на частичное неправильное сворачивание или белковые агрегаты. Хроматограммы мальтозидов и LMNG-экстрагированных белков показали, что большая часть Cdr1-mGFPHis элюируется как красиво сформированный гауссов пик при 15,5 мл с небольшим плечом, элюируемым немного раньше при 14 мл(рисунок 4A). Эти образцы не имели cdr1-mGFPHis, элюирования в объеме пустоты. Пустой образец представляет буфер плюс элемент управления DDM, который не давал сигнала mGFP. Хроматограммы на рисунке 4B подчеркивают важность типа головной группы сахара для качества моющих солюбилизированных частиц Cdr1-mGFPHis. Глюкозосодержащие моющие средства (OG, NG, OGNG) показали худшие результаты, чем сахарозодержащие моющие средства (DDS), которые, в свою очередь, работали хуже, чем мальтозосодержащие моющие средства (NM, DMNG, DDM). Cdr1-mGFPHis солюбилизирован глюкозосодержащими моющими средствами, элюированными в виде агрегированного (OG) или широкого агрегированного пика (NG, OGNG), который следовало ожидать от большой доли осадка Cdr1-mGFPHis в фракциях гранул для OGNG (F) и OG (G), наблюдаемой на рисунке 3D. Хотя хроматограмма ДМНГ (зеленая; Рисунок 4B) был качественно похож на Хроматограмму DDM (синий; Рисунок 4B),более высокие пики для DDM указывают на то, что большая часть солюбилизированных DMNG Cdr1-mGFPHis может фактически денатурирована. На рисунке 4C показаны хроматограммы FSEC для цвиттерионических Fos-холинов (Fos-choline-8, Fos-choline-10, Fos-choline-13) и двух неионных детергентов (digitonin, Triton-X100), а на рисунке 4D показано, как нагрузка в два раза больше (200 мкл) моющего солюбилизированного белка не оказала заметного влияния на качество хроматограммы для Fos-choline-8, -10 и -13 и DDM. Только дигитонин (оранжевый; Рисунок 4C) дал аналогичную Хроматограмму ДДМ (синий; Рисунок 4C) и, хотя Фос-холин-13 дал симметричный пик резкой формы, он снова элюировался со значительно меньшим объемом элюдения (14 мл), чем у ДДМ (15,5 мл). В целом наблюдлась четкая тенденция к лучшему солюбилизации моющими средствами с более длинными алифатическими боковыми цепями из 12 или 13 углеродных остатков; Например, DDM > DM > NM (12, 10 или 9 атомов углерода), Fos-холин-13 > 10 > 8 (13, 10 или 8 атомов углерода) и LMNG > DMNG > OGNG (12, 10 или 8 атомов углерода) соответственно. Таким образом, моющие средства с гидрофобными хвостами менее 12 атомов углерода были гораздо менее подходящими моющими средствами для солюбилизации Cdr1-mGFPHis, чем моющие средства с более длинными гидрофобными хвостами 12 или 13 атомов углерода, а неионные моющие средства (DDM, LMNG) казались в целом более подходящими для солюбилизации Cdr1-mGFPHis, чем цвиттерионные моющие средства(рисунок 3D, рисунок 4).

Figure 4
Рисунок 4:Скрининг моющих средств для солюбилизации Cdr1-mGFPHis с использованием FSEC. Хроматограммы 100 мкл солюбилизированной ADΔΔ-CDR1-mGFPHis сырой плазматической мембраны (2 мг/мл) с 1% указанных моющих средств и разделенных с использованием колонки исключения размера Superose 6-увеличение 10/300 GL. Хроматограммы изображают относительные единицы флуоресценции mGFP (FU) одного колонного объема (CV; 25 мл) собранного буфера элюирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Несмотря на недавний прогресс в структурном анализе мембранных белков, в настоящее время нет 3D-структуры для Cdr1 или любого другого транспортера PDR. Таким образом, получение знаний о структуре Cdr1 и ее биохимических особенностях важно, поскольку это не только даст представление о рациональном проектировании новых лекарств для преодоления опосредованной из потоком лекарственной устойчивости, но и о механизме функционирования важного подсемейства белков ABC.

Одним из основных требований к структурной характеристике мембранных белков является экспрессия правильно свернутого и интактного мембранного белка в количествах, необходимых для рентгеновской кристаллографии или крио-ЭМ. Важными критериями при выборе системы экспрессии являются простота использования, темпы роста и затраты, а также способность экспрессировать белки с постпереводными модификациями, которые могут иметь решающее значение для функции и/или стабильности белка61,62.

За последние два десятилетия технология экспрессии мембранных белков S. cerevisiae 60 была оптимизирована14 для облегчения одноэтапного клонирования интересующих мембранных белков24, помеченных либо на их N-, либо на C-конце с различными сродством, эпитопными или репортерными метками, и, при желании, их уровни экспрессии предсказуемо подавляются до где-то от 50% до 0,1% от максимального уровня экспрессии25. Эта универсальная платформа экспрессии белка плазматической мембраны позволяет исследователям очень подробно охарактеризовать насосы грибкового эфлюкса. Разработка и оптимизация анализов функции насоса в целых клетках позволила успешно охарактеризовать специфичность субстрата24 и чувствительность к ингибиторам ряда основных грибковых мультилекарственных эфлюксных насосов, и они были использованы в высокопроизводительных скринингах лекарств для идентификации новых 42, 43, 44 или подтверждения существующих 14,33, 36ингибиторов эфлюксного насоса широкого спектра действия или для разработки новых42,43,44или для подтверждения существующих14, 33,36ингибиторов эфлюксного насоса широкого спектра действия или для разработки новые ингибиторы эфлюксного насоса, специфичные для Cdr141.

Хотя существующая платформа экспрессии была успешно использована для экспрессии грибковых транспортеров ABC из множества грибов, включая Basidomycota(C. neoformans Mdr1),14 нитевидных грибов, таких как P. marneffei (Abc1)37 и многие виды Saccharomycotina (например, S. cerevisiae Pdr5, C. glabrata Cdr1 и Cdr2, C. utilis Cdr1, C. krusei Abc1, Abc11 и Abc12 и C. albicans Cdr1 и Cdr2), 14,24,32,36,39,60,63 было меньшеуспеха,выражая высокие уровни правильно сложенных человеческих транспортеров ABC64. Предварительные результаты показывают, что это связано со специфической липидной средой, которая требуется этим транспортерам для правильной экспрессии и функционирования в дрожжах. Есть признаки того, что это также может быть верно для переносчиков ABC растений, хотя это еще не подтверждено экспериментально.

Основные причины значительно более высокой специфической активности Cdr1 АТФазы (т.е. препаратов с меньшим количеством загрязняющих мембран), полученных с помощью оптимизированного протокола изоляции маломасштабной плазматической мембраны, двояки: i) более мягкий ручной разрыв клеток по сравнению с использованием бисерного битеровика для препаратов плазматической мембраны более крупного масштаба; и ii) сбор клеток в середине бревенчатой фазы, что уменьшает возможное митохондриальное загрязнение из-за подавления глюкозы митохондриальными ферментами. 3-минутные периоды охлаждения между каждым из шести циклов поломки могут быть продлены без какого-либо заметного влияния на качество плазматических мембран. Однако следует избегать повторных циклов замораживания-оттаивания, поскольку активность Cdr1 АТФазы изолированных плазматических мембран снижается на ~ 10% с каждым дополнительным циклом замораживания-оттаивания. Вот почему рекомендуется разделить образцы плазматической мембраны на более мелкие аликвоты, чтобы уменьшить необходимость в множественных циклах замораживания-оттаивания. Двойная метка mGFPHis повышает производительность очистки и позволяет эффективно проводить одноступенчатую просеивание моющих средств. Используя эту конструкцию, можно легко обнаружить правильную локализацию, правильное складывание/провоз и термостабильность; и двойная метка может быть удалена, при необходимости, путем расщепления с коммерчески доступной протеазой, хотя 3 аминокислоты-линкер между интересующим белком и меткой, возможно, придется расширить для эффективного удаления метки.

Сочетание нескольких признаков в этих протоколах, а именно: использование ДНК-полимеразы, специально разработанной для колонии ПЦР-амплификации 8 кб трансформационной кассеты; оптимизированный высокоэффективный метод трансформации дрожжей; возможность создания замороженных грамотных дрожжевых запасов; и оптимизированный протокол подготовки плазматической мембраны в малых масштабах демонстрирует создание оптимизированной платформы экспрессии мембранного белка, поддающейся высокопроизводительному клонированию, экспрессии и характеристике грибковых насосов ABC эффлюкса.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы с благодарностью отмечают финансирование из Новозеландского фонда Марсдена (грант UOO1305) и блочный грант от медицинского факультета Университета Чулалонгкорн, Бангкок, Таиланд (М. Ниими). Они хотели бы поблагодарить Университет Отаго за предоставление Г. Мадани стипендии PhD. Авторы также хотели бы выразить свою благодарность профессору Штефану Раунсеру и его коллегам, доктору Амиру Апельбауму и доктору Дейванаягабарати Винаягаму, за их поддержку и руководство во время 6-месячного визита Г. Мадани в Институт молекулярной физиологии Макса Планка (MPIMP), Дортмунд, Германия. Авторы также благодарят Немецкую службу академических обменов (DAAD) за предоставление Г. Мадани исследовательского гранта (57381332) для посещения MPIMP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES) Sigma-Aldrich M3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) Merck 77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG310S LMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside Anatrace NG311S OGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG322S DMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside Glycon Biochemicals GmbH D99019-C PCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) Bio-Rad 1610148
Acetic acid (glacial) Merck 64-19-7
Agar Formedium  009002-18-0
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich 13106-76-8
Ammonium persulphate (APS) Bio-Rad 1610700
ATP disodium salt sigma-Aldrich A-6419
Bromophenol blue SERVA Electrophoresis GmbH 34725-61-6
CHAPS Anatrace C316S
CHAPSO Anatrace C317S
CSM Formedium DCS0019
CSM minus uracil Formedium DCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C324S CYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C327S CYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C321S CYMAL-1
Digitonin Sigma-Aldrich 11024-24-1
Dithiothreitol (DTT) Roche Diagnostics 10197785103
DMSO Merck 67-68-5
Ethanol Merck 459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) Merck 6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent Applied Biosystems 78205 A blend of exonuclease and phosphatase
Glucose Formedium 50-99-7
Glycerol Merck 56-81-5
Glycine Merck G8898
HEPES Formedium 7365-45-9
Hydrochloric acid Merck 1003172510
KOD Fx Neo TOYOBO Co KFX-201 Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc) Sigma-Aldrich 546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydrate sigma-Aldrich M2393
MES Formedium 145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide Anatrace H110S HEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamide Anatrace M320S MEGA-10
n-Decyl-phosphocholine Anatrace F304S Fos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D322S DM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ312S Anzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide Anatrace D360S LDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranoside Anatrace D310HA α-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310S β-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Nonyl-β-D-maltopyranoside Anatrace N330S NM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ318S Anzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ308S Anzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholine Anatrace F300S Fos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranoside Anatrace O311S OG
n-Tetradecyl-phosphocholine Anatrace F312S Fos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T315S TDM
n-Tridecyl-phosphocholine Anatrace F310S Fos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T323S -
n-Undecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace U300S UM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Octylphenoxypolyethoxyethanol Sigma-Aldrich 9002-93-1 TRITON X-100
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351
Peptone Formedium 3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Diagnostics 329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase New England Biolabs M0535S High-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350) Sigma-Aldrich 25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleate Sigma-Aldrich 9005-65-6 TWEEN 80
Potassium nitrate Sigma-Aldrich P8394
Protein Assay Kit Bio-Rad 5000122 RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie Stain Bio-Rad 1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) Abcam AB116028
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sodium dodecyl sulphate Sigma-Aldrich 151-21-3 SDS
Sodium L-ascorbate BioXtra Sigma-Aldrich 11140
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350S DDS
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 339741
Yeast extract Formedium 008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804) Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra) Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6) Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator) Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager) Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection) BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch) Bio-Rad
Power supply (PowerPac) Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron) Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences GE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro) Amersham BioSciences UK Ltd

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  2. Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or complexes prepared in detergents. Crystals (Basel). 10 (2), 86 (2020).
  3. Lewinson, O., Orelle, C., Seeger, M. A. Structures of ABC transporters: handle with care. FEBS Letters. 594 (23), 3799-3814 (2020).
  4. Luckey, M. Membrane Structural Biology: With Biochemical and Biophysical Foundations. , Cambridge University Press. Ch. 4 69-105 (2014).
  5. Opekarova, M., Tanner, W. Specific lipid requirements of membrane proteins--a putative bottleneck in heterologous expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1610 (1), 11-22 (2003).
  6. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  7. Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids. Annual Review of Biochemistry. 66, 199-232 (1997).
  8. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1612 (1), 1-40 (2003).
  9. Ahn, J. H., Pan, J. G., Rhee, J. S. Homologous expression of the lipase and ABC transporter gene cluster, tliDEFA, enhances lipase secretion in Pseudomonas spp. Applied and Environmental Microbiology. 67 (12), 5506-5511 (2001).
  10. Newby, Z. E., et al. A general protocol for the crystallization of membrane proteins for X-ray structural investigation. Nature Protocols. 4 (5), 619-637 (2009).
  11. Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 61-72 (2016).
  12. Wiener, M. C. A pedestrian guide to membrane protein crystallization. Methods. 34 (3), 364-372 (2004).
  13. Grisshammer, R. Understanding recombinant expression of membrane proteins. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 337-340 (2006).
  14. Lamping, E., et al. Characterization of three classes of membrane proteins involved in fungal azole resistance by functional hyperexpression in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 6 (7), 1150-1165 (2007).
  15. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  16. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  17. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  18. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  19. Harvey, C. J. B., et al. HEx: A heterologous expression platform for the discovery of fungal natural products. Science Advances. 4 (4), (2018).
  20. Kingsman, S. M., Kingsman, A. J., Dobson, M. J., Mellor, J., Roberts, N. A. Heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 3, 377-416 (1985).
  21. Monk, B. C., et al. Yeast membrane protein expression system and its application in drug screening. US patent. , 8728797 NZ 513755, AU 2002330796, US 8728797 patent NZ 513755, AU 2002330796 (2002).
  22. Sagatova, A. A., Keniya, M. V., Wilson, R. K., Monk, B. C., Tyndall, J. D. Structural insights into binding of the antifungal drug fluconazole to Saccharomyces cerevisiae lanosterol 14alpha-demethylase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (8), 4982-4989 (2015).
  23. Decottignies, A., et al. ATPase and multidrug transport activities of the overexpressed yeast ABC protein Yor1p. The Journal of Biological Chemistry. 273 (20), 12612-12622 (1998).
  24. Lamping, E., Zhu, J. Y., Niimi, M., Cannon, R. D. Role of ectopic gene conversion in the evolution of a Candida krusei pleiotropic drug resistance transporter family. Genetics. 205 (4), 1619-1639 (2017).
  25. Lamping, E., Niimi, M., Cannon, R. D. Small, synthetic, GC-rich mRNA stem-loop modules 5' proximal to the AUG start-codon predictably tune gene expression in yeast. Microbial Cell Factories. 12, 74 (2013).
  26. James, J. E., Lamping, E., Santhanam, J., Cannon, R. D. PDR transporter ABC1 is involved in the innate azole resistance of the human fungal pathogen Fusarium keratoplasticum. Frontiers in Microbiology. , (2021).
  27. Ullah, R., et al. Activity of the human rhinovirus 3C protease studied in various buffers, additives and detergent solutions for recombinant protein production. PLoS One. 11 (4), 0153436 (2016).
  28. von Stetten, D., Noirclerc-Savoye, M., Goedhart, J., Gadella, T. W., Royant, A. Structure of a fluorescent protein from Aequorea victoria bearing the obligate-monomer mutation A206K. Acta Crystallographica Section F. Structural Biology and Crystalization Communications. 68, Pt 8 878-882 (2012).
  29. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  30. Cormack, B. P., et al. Yeast-enhanced green fluorescent protein (yEGFP): a reporter of gene expression in Candida albicans. Microbiology (Reading). 143, Pt 2 303-311 (1997).
  31. Monk, B. C., et al. Architecture of a single membrane spanning cytochrome P450 suggests constraints that orient the catalytic domain relative to a bilayer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3865-3870 (2014).
  32. Holmes, A. R., et al. ABC transporter Cdr1p contributes more than Cdr2p does to fluconazole efflux in fluconazole-resistant Candida albicans clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (11), 3851-3862 (2008).
  33. Tanabe, K., et al. FK506 resistance of Saccharomyces cerevisiae Pdr5 and Candida albicans Cdr1 involves mutations in the transmembrane domains and extracellular loops. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (1), 01146 (2019).
  34. Tanabe, K., et al. Chimeras of Candida albicans Cdr1p and Cdr2p reveal features of pleiotropic drug resistance transporter structure and function. Molecular Microbiology. 82 (2), 416-433 (2011).
  35. Madani, G., Lamping, E., Cannon, R. D. Engineering a cysteine-deficient functional Candida albicans Cdr1 molecule reveals a conserved region at the cytosolic apex of ABCG transporters important for correct folding and frafficking of Cdr1. mSphere. 6 (1), (2021).
  36. Lamping, E., et al. Abc1p is a multidrug efflux transporter that tips the balance in favor of innate azole resistance in Candida krusei. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 354-369 (2009).
  37. Panapruksachat, S., et al. Identification and functional characterization of Penicillium marneffei pleiotropic drug resistance transporters ABC1 and ABC2. Medical Mycology. 54 (5), 478-491 (2016).
  38. Wada, S., et al. Phosphorylation of Candida glabrata ATP-binding cassette transporter Cdr1p regulates drug efflux activity and ATPase stability. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 94-103 (2005).
  39. Watanasrisin, W., et al. Identification and characterization of Candida utilis multidrug efflux transporter CuCdr1p. FEMS Yeast Research. 16 (4), (2016).
  40. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  41. Niimi, K., et al. Specific interactions between the Candida albicans ABC transporter Cdr1p ectodomain and a D-octapeptide derivative inhibitor. Molecular Microbiology. 85 (4), 747-767 (2012).
  42. Holmes, A. R., et al. The monoamine oxidase A inhibitor clorgyline is a broad-spectrum inhibitor of fungal ABC and MFS transporter efflux pump activities which reverses the azole resistance of Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (3), 1508-1515 (2012).
  43. Reis de Sa, L. F., et al. Synthetic organotellurium compounds sensitize drug-resistant Candida albicans clinical isolates to fluconazole. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (1), 01231 (2017).
  44. Tanabe, K., et al. Inhibition of fungal ABC transporters by unnarmicin A and unnarmicin C, novel cyclic peptides from marine bacterium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 364 (4), 990-995 (2007).
  45. le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
  46. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  47. Pfaller, M. A. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs, and modes of transmission. Clinical Infectious Diseases. 22, Suppl 2 89-94 (1996).
  48. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clinical Microbiology Reviews. 22 (2), 291-321 (2009).
  49. Sanglard, D., et al. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (11), 2378-2386 (1995).
  50. Prasad, R., De Wergifosse, P., Goffeau, A., Balzi, E. Molecular cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple resistance to drugs and antifungals. Current Genetics. 27 (4), 320-329 (1995).
  51. Lamping, E., Madani, G., Lee, H. J., Niimi, M., Cannon, R. D. Candida albicans: Cellular and Molecular Biology. Prasad, R. , Chapter 18 379-406 (2017).
  52. Crouzet, J., Trombik, T., Fraysse, A. S., Boutry, M. Organization and function of the plant pleiotropic drug resistance ABC transporter family. FEBS Letters. 580 (4), 1123-1130 (2006).
  53. Kang, J., et al. Plant ABC Transporters. Arabidopsis Book. 9, 0153 (2011).
  54. Lamping, E., et al. Fungal PDR transporters: phylogeny, topology, motifs and function. Fungal Genetics and Biology. 47 (2), 127-142 (2010).
  55. Lamping, E., Cannon, R. D. Use of a yeast-based membrane protein expression technology to overexpress drug resistance efflux pumps. Methods in Molecular Biology. 666, 219-250 (2010).
  56. Day, M. Yeast petites and small colony variants: for everything there is a season. Advances in Applied Microbiology. 85, 1-41 (2013).
  57. Niimi, K., et al. Chemosensitization of fluconazole resistance in Saccharomyces cerevisiae and pathogenic fungi by a D-octapeptide derivative. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (4), 1256-1271 (2004).
  58. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  59. Hao, Z., et al. A novel and fast purification method for nucleoside transporters. Frontiers in Molecular Biosciences. 3, 23 (2016).
  60. Nakamura, K., et al. Functional expression of Candida albicans drug efflux pump Cdr1p in a Saccharomyces cerevisiae strain deficient in membrane transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3366-3374 (2001).
  61. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), 29191 (2011).
  62. Byrne, B. Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 32, 9-17 (2015).
  63. Holmes, A. R., et al. Heterozygosity and functional allelic variation in the Candida albicans efflux pump genes CDR1 and CDR2. Molecular Microbiology. 62 (1), 170-186 (2006).
  64. Keniya, M. V., et al. Drug resistance is conferred on the model yeast Saccharomyces cerevisiae by expression of full-length melanoma-associated human ATP-binding cassette transporter ABCB5. Molecular Pharmaceutics. 11 (10), 3452-3462 (2014).

Tags

Биология выпуск 172
Маломасштабная плазматическая мембранная подготовка для анализа <em>Candida albicans</em> Cdr1-mGFPHis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., … More

Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., Niimi, M., Mitra, A. K., Cannon, R. D. Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis. J. Vis. Exp. (172), e62592, doi:10.3791/62592 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter