Summary
Ce protocole décrit une méthode permettant d’obtenir des données d’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf- rs) stables à l’état de repos d’un rat en utilisant de l’isoflurane à faible dose en association avec de la dexmèdetomidine à faible dose.
Abstract
L’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle à l’état de repos (IRMf-rs) est devenue une méthode de plus en plus populaire pour étudier le fonctionnement du cerveau dans un état de repos et de non-tâche. Ce protocole décrit une méthode de survie préclinique pour obtenir des données rs-IRMf. La combinaison d’isoflurane à faible dose avec une perfusion continue de la dexmététomidine, agoniste des récepteurs adrénergiques α2, offre une option robuste pour une acquisition de données stable et de haute qualité tout en préservant la fonction du réseau cérébral. De plus, cette procédure permet une respiration spontanée et une physiologie presque normale chez le rat. Des séquences d’imagerie supplémentaires peuvent être combinées avec l’acquisition à l’état de repos, créant des protocoles expérimentaux avec une stabilité anesthésique allant jusqu’à 5 h en utilisant cette méthode. Ce protocole décrit la configuration de l’équipement, la surveillance de la physiologie du rat pendant quatre phases distinctes de l’anesthésie, l’acquisition de scans à l’état de repos, l’évaluation de la qualité des données, la récupération de l’animal et une brève discussion sur l’analyse des données post-traitement. Ce protocole peut être utilisé dans une grande variété de modèles précliniques de rongeurs pour aider à révéler les changements du réseau cérébral qui en résultent et qui se produisent au repos.
Introduction
L’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle à l’état de repos (IRMf rs) est une mesure du signal BOLD (blood-oxygen-level-dependent) lorsque le cerveau est au repos et n’est engagé dans aucune tâche particulière. Ces signaux peuvent être utilisés pour mesurer les corrélations entre les régions du cerveau afin de déterminer la connectivité fonctionnelle au sein des réseaux neuronaux. L’IRMf rs est largement utilisée dans les études cliniques en raison de son caractère non invasif et du faible effort requis des patients (par rapport à l’IRMf basée sur les tâches), ce qui la rend optimale pour diverses populations de patients1.
Les progrès technologiques ont permis d’adapter l’IRMf-rs pour une utilisation dans des modèles de rongeurs afin de découvrir les mécanismes sous-jacents aux états pathologiques (voir la référence2 pour la revue). Les modèles animaux précliniques, y compris les modèles de maladie ou de knockout, permettent un large éventail de manipulations expérimentales non applicables chez l’homme, et les études peuvent également utiliser des échantillons post-mortem pour améliorer davantage les expériences2. Néanmoins, en raison de la difficulté à limiter le mouvement et à atténuer le stress, l’acquisition d’IRM chez les rongeurs est traditionnellement réalisée sous anesthésie. Les agents anesthésiques, en fonction de leur pharmacocinétique, de leur pharmacodynamique et de leurs cibles moléculaires, influencent le flux sanguin cérébral, le métabolisme cérébral et affectent potentiellement les voies de couplage neurovasculaire.
Il y a eu de nombreux efforts pour développer des protocoles anesthésiques qui préservent le couplage neurovasculaire et la fonction du réseau cérébral3,4,5,6,7,8. Nous avons précédemment rapporté un régime anesthésique qui appliquait une faible dose d’isoflurane ainsi qu’une faible dose de l’agoniste des récepteurs adrénergiques α2 dexmèdetomidine9. Les rats sous cette méthode d’anesthésie ont présenté des réponses BOLD robustes à la stimulation des moustaches dans des régions compatibles avec les voies de projection établies (noyaux thalamiques ventrolatéral et ventromédian, cortex somatosensoriel primaire et secondaire); les réseaux cérébraux à l’état de repos à grande échelle, y compris le réseau de mode par défaut10,11 et le réseau de saillance12 ont également été systématiquement détectés. De plus, ce protocole anesthésique permet une imagerie répétée sur le même animal, ce qui est important pour surveiller longitudinalement la progression de la maladie et l’effet des manipulations expérimentales.
Dans la présente étude, nous détaillons la configuration expérimentale, la préparation des animaux et les procédures de surveillance physiologique impliquées. En particulier, nous décrivons les phases anesthésiques spécifiques et l’acquisition de scans au cours de chaque phase. La qualité des données est évaluée après chaque analyse de l’état de repos. Un bref résumé de l’analyse post-balayage est également inclus dans la discussion. Les laboratoires intéressés à découvrir le potentiel de l’utilisation de l’IRMf chez le rat trouveront ce protocole utile.
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Protocol
Toutes les expériences ont été réalisées sur un scanner IRM de 9,4 T et ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Dartmouth College. Une approbation supplémentaire a été obtenue pour enregistrer et montrer les animaux utilisés dans la vidéo et les figures ci-dessous.
1. Préparations avant la numérisation
- Ligne de perfusion sous-cutanée
- Retirez partiellement une aiguille de 23 G de son emballage afin que le point de l’aiguille reste stérile.
- Tenez solidement le moyeu de l’aiguille et utilisez une lame de rasoir pour marquer l’arbre de l’aiguille à l’endroit où il rencontre le moyeu.
- Serrez un porte-aiguille autour de l’arbre directement sous le scoring et cassez doucement l’arbre du moyeu.
- Insérez 1/3 de l’arbre de l’aiguille (extrémité émoussée) dans une ligne PE50 préalablement stérilisée avec une longueur de ligne suffisante pour s’étendre de la pompe à médicament à l’animal à l’intérieur de l’alésage de l’aimant.
- Dilution de la dexmététomidine et de l’atipamezole
- Préparer une solution de chlorhydrate de dexmédétomidine dilué en utilisant 0,5 mL de 0,5 mg/mL de bouillon mélangé à 9,5 mL de solution saline stérile dans un flacon en verre clair et stérile (concentration diluée = 0,025 mg/mL).
- Préparer une solution d’atipamézole dilué en utilisant 0,1 mL de bouillon de 5 mg/mL mélangé à 9,9 mL de solution saline stérile dans un flacon en verre clair et stérile (concentration diluée = 0,05 mg/mL).
- Paramètres d’analyse
- Utilisez les paramètres présentés dans le tableau 1 pour préparer les séquences de numérisation.
2. Anesthésie de phase 1 : Induction et préparation des animaux
- Coup monté
- Assurez-vous que tout l’équipement est allumé et fonctionne correctement, y compris le mélangeur d’oxygène et d’air, le coussin chauffant et le système de récupération actif (voir la figure 1).
- Réglez le point de consigne de température du système de chauffage à 37,5 °C.
- Induction animale
- Placer l’animal (rat Sprague Dawley mâle de 90 jours) dans la chambre d’induction et induire une anesthésie avec 2,5% d’isoflurane dans un air enrichi en oxygène à 30%.
REMARQUE: Un large éventail d’âges d’animaux et les deux sexes peuvent être utilisés. - Une fois l’animal anesthésié, retirez-le de la chambre, pesez-le et placez-le dans le cône du nez (à 2,5% d’isoflurane) sur le coussin chauffant dans l’espace de préparation.
- Placer l’animal (rat Sprague Dawley mâle de 90 jours) dans la chambre d’induction et induire une anesthésie avec 2,5% d’isoflurane dans un air enrichi en oxygène à 30%.
- Préparation des animaux
- Appliquez une pommade lubrifiante ophtalmique sur chaque œil pour éviter le dessèchement.
- Confirmez la profondeur de l’anesthésie par un manque de réponse au pincement des orteils.
- Utilisez des tondeuses pour raser une zone carrée de 2 po sur 2 po sur la région lombaire inférieure du dos de l’animal (c.-à-d. directement au-dessus de la queue).
- Administrer 0,015 mg/kg de la solution de dexmédétomidine avec une injection intrapéritonéale (p.i.) (p.ex., un rat de 300 g recevrait 0,18 mL) dans le quadrant inférieur droit de l’abdomen à l’aide d’une aiguille de 25 G.
- Basculez le flux d’isoflurane de l’espace de préparation vers le berceau de l’animal.
- Déplacez l’animal dans le berceau de l’animal. Placez les dents de devant du rat en toute sécurité sur et dans la barre de morsure. Poussez le cône de nez sur le nez pour assurer un ajustement serré.
REMARQUE: Si le cône de nez ne recouvre pas la mâchoire inférieure, utilisez un film de paraffine pour maintenir doucement la mâchoire fermée tout en scellant autour du cône de nez. - Placez le coussinet respiratoire sous l’abdomen du rat sous la cage thoracique et re positionnez-le jusqu’à ce que la forme d’onde respiratoire montre un creux profond centré sur chaque respiration (voir la forme d’onde respiratoire à la figure 2).
- Surveillez la respiration de l’animal à l’aide du logiciel de surveillance physiologique. Passer à la phase suivante de l’anesthésie lorsque la respiration est inférieure à 40 respirations / min (bpm; environ 5 min après l’injection de dexmététomidine).
3. Anesthésie de phase 2 : Configuration animale
- Insérez des barres auriculaires dans le conduit auditif pour stabiliser la tête du rat dans le berceau de l’animal. Une fois positionné, tirez vers l’avant sur la barre de morsure et confirmez que la tête ne bouge pas. Réajustez le cône de nez et le film de paraffine au besoin (voir La figure 3a).
- Insérez la sonde de température dans un couvercle de sonde jetable prélubrifié. Insérez doucement la sonde de température d’environ 1/2 » dans le rectum et collez-la à la base de la queue avec du ruban adhésif médical.
- Placez le clip de l’oxymètre de pouls sur la zone métatarsienne du pied postérieur, en vous assurant que la source de lumière se trouve au bas du pied (paume).
REMARQUE: La rotation du clip peut affecter le signal; ainsi, la création d’un support pour garder la patte et le clip droits conduira à une plus grande stabilité. Notez également que jusqu’à ce que le rat soit à la température corporelle normale, la saturation en oxygène peut être faible (<95%). - Utilisez le poids du rat pour calculer le débit de perfusion afin d’éjecter 0,015 mg/kg/h de dexmététomidine (un rat de 300 g reçoit 0,18 mL/h).
- Réglez la pompe à médicament pour éjecter le débit de perfusion calculé.
- Remplissez une seringue de 3 mL avec la solution stérile et diluée de dexmététomidine et insérez l’extrémité de l’aiguille dans l’extrémité ouverte de la ligne de perfusion stérilisée (s’étendant de la pompe à médicament au berceau de l’animal avec l’aiguille sous-cutanée préalablement attachée). Remplissez la ligne et fixez la seringue dans le porte-seringue de la pompe à médicaments.
- Déplacez le bloc poussoir vers l’avant jusqu’à ce qu’il touche le piston et que le médicament soit expulsé à l’aiguille, en veillant à ce que la ligne de perfusion soit complètement remplie.
- À l’aide d’une lingette alcoolisée, nettoyez la zone rasée pour éliminer les poils errants.
- Pincez la peau à environ deux largeurs de doigts au-dessus de la base de la queue. Insérez 1/3 de l’aiguille de la ligne de perfusion dans la peau de la tente.
- Fixez l’aiguille à la peau avec un morceau de ruban médical large de 3 pouces. Placez un deuxième morceau de ruban adhésif médical large sur le premier, à travers le rat, et attaché aux deux côtés du berceau de l’animal (voir la figure 4).
REMARQUE: Il est extrêmement important que l’aiguille ferromagnétique soit bien fixée pour empêcher tout mouvement pendant l’analyse. - Commencer la perfusion de dexmététomidine sous-cutanée.
- Placez un morceau de gaze sur l’arête du nez du rat pour créer une surface plane pour la bobine. Utilisez du ruban adhésif en papier, qui n’interfère pas avec le signal IRM, pour fixer la bobine à la tête du rat, en la centrant sur le cerveau (voir Figure 3b,c).
- Fixez toutes les lignes et tous les câbles à l’intérieur du berceau de l’animal avec du ruban adhésif de laboratoire et vérifiez si tous les signaux physiologiques sont stables (voir la figure 2).
- Placez des serviettes en papier sur l’animal, en les fixant au berceau de l’animal avec du ruban adhésif de laboratoire. Si vous utilisez un système de chauffage de l’air, enroulez une feuille de plastique autour de tout le berceau pour contenir l’air chaud.
- Déplacez l’animal dans l’alésage et accordez l’aimant.
4. Anesthésie de phase 3 : acquisition d’un scanner anatomique
- Réduire l’isoflurane à 1,5%, ce qui entraîne une augmentation constante de la respiration à environ 45-50 bpm. Rester à ce niveau pendant toute la durée du balayage anatomique.
- Utilisez le scan du localisateur FLASH pour vous assurer que le cerveau est aligné avec l’isocentre de l’aimant (Figure 5a). Repositionnez l’animal et répétez si nécessaire.
- Exécutez l’analyse de localisation RARE à plus haute résolution et utilisez cette sortie de numérisation pour aligner 15 tranches sagnitales centrées sur le cerveau (de gauche à droite, Figure 5b).
- À l’aide de la tranche sagittale moyenne, alignez la tranche axiale centrale sur la décussation de la commissure antérieure, qui apparaît comme une tache sombre (Figure 5c). Notez le décalage de tranche à utiliser ultérieurement dans les analyses à l’état de repos.
- Acquérir 23 tranches en utilisant les protocoles axiaux FLASH et RARE pour faciliter l’enregistrement dans un espace commun lors de l’analyse post-scan.
- Parcourez tout le cerveau à l’aide de la séquence PRESS.
5. Phase 4 : Acquisition de l’analyse à l’état de repos
- Après avoir terminé les examens anatomiques, réduisez l’isoflurane à 0,5% à 0,75%, en ajustant de sorte que la respiration de l’animal soit de 60 à 65 respirations par minute. Restez à ce niveau pendant au moins 10 minutes avant de commencer l’analyse à l’état de repos pour assurer la stabilité.
- Lorsque la physiologie est stable (la plage de respiration est de 60 à 75 bpm sans halètement ni irrégularités, la température corporelle centrale est de 37,5 ± 1,0 ° C et la saturation en oxygène est de 95% ou plus), acquérir un EPI scan de 15 tranches en utilisant le même décalage de tranche que la série axiale anatomique.
- Une fois chaque analyse à l’état de repos terminée, vérifiez la qualité à l’aide d’une analyse de composants indépendante (ICA) pour décomposer les données en composants spatiaux et temporels.
- Obtenez au moins trois analyses de l’état de repos de haute qualité.
6. Récupération post-analyse
- Lorsque le balayage est terminé, augmenter l’isoflurane à 2% et arrêter la perfusion sous-cutanée de dexmététomidine.
- Retirez le berceau de l’animal de l’alésage de l’aimant, déballez l’animal et retirez les barres d’oreille, la sonde de température, le clip de l’oxymètre de pouls et l’aiguille de dexmététomidine.
- Injecter 0,015 mg/kg de la solution diluée d’atipamezole dans le muscle de la patte postérieure du rat à l’aide d’une seringue de 1 mL avec une aiguille de 25 G (c.-à-d. qu’un rat de 300 g recevrait 0,09 mL).
- Replacez le rat dans la cage de la maison sur un coussin chauffant et surveillez jusqu’à ce que l’animal soit ambulatoire.
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Representative Results
Après chaque analyse à l’état de repos, la stabilité est évaluée à l’aide d’une analyse de composants indépendante (ICA; exemple de script inclus dans les fichiers supplémentaires). La figure 6 montre des exemples de sorties de composants provenant d’analyses à l’état de repos. La figure 6a montre un composant de signal provenant d’un balayage avec une grande stabilité. Notez que spatialement, la composante a une grande régionalité. Dans le cours du temps sous la composante spatiale, le signal est stable et non prévisible, ce qui indique une véritable activité cérébrale. Le spectre de puissance en bas montre principalement des basses fréquences. La figure 6b montre un composant du même balayage que la figure 6a qui représente le bruit. Notez la non-régionalité dans la composante spatiale, le parcours temporel à haute fréquence et le pic de haute fréquence dans le spectre de puissance. Enfin, la figure 6c montre un composant d’un scan avec anesthésie instable. Le cours du temps est variable et irrégulier. Lorsque cela se produit, des améliorations sont nécessaires au protocole anesthésique, généralement à l’étanchéité du cône de nez et à l’élimination des gaz résiduaires.
Figure 1: Espace de préparation et berceau d’IRM pour animaux. a) Espace de préparation. Le vide récupère les gaz résiduaires de la chambre d’induction et du cône de nez au niveau du berceau de l’animal. Le coussin chauffant aide à maintenir la température de l’animal pendant la phase 1 et la récupération. b) IRM berceau animal. Le haut indique les composants de la configuration animale dans la phase 2. Le bas montre un rat entièrement configuré et prêt à être scanné. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Sortie de l’analyse physiologique. La saturation en oxygène (PulseOx, 96 %), la fréquence cardiaque (325 BPM [battements par minute]), la fréquence respiratoire (61 respirations/min) et la température corporelle centrale (T1, 37,5 °C) sont constamment surveillées tout au long de la séance de balayage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Placement du cône de nez et de la bobine. (a) Vue rapprochée du cône de nez scellé autour du nez et de la mâchoire inférieure de l’animal. b)Vue aérienne de l’alignement de la bobine de surface sur le cerveau. c) Vue latérale de l’alignement de la bobine avec le point médian de l’œil de l’animal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Ligne de perfusion sous-cutanée de dexmététomidine et placement de l’aiguille. ( a ) Insertiondel’aiguille dans la région lombaire inférieure du dos de l’animal. b)Ruban adhésif fixant l’aiguille à la peau de l’animal. c)Ruban adhésif à travers le berceau de l’animal pour empêcher le mouvement de l’aiguille ferromagnétique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Alignement du balayage anatomique. (a) Balayage localisateur pour aligner le cerveau de l’animal sur l’isocentre de l’aimant, noté avec un réticule. (b) Tranches sagnitales alignées à travers le cerveau de gauche à droite. c)Alignement sur la décussation de la commissure antérieure, indiquée par la flèche blanche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6: Évaluation de la qualité à l’aide d’une analyse indépendante des composants. (a) Composante du signal pendant l’anesthésie régulière. b)Composante de bruit pendant l’anesthésie régulière. c)Anesthésie instable. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Numériser | Séquence | Orientation | Champ de vision (mm x mm) | Matrice | Tranches | Épaisseur de la tranche (mm) | TE (ms) | TR (ms) | Moyennes | Espacement des échos (ms) | Facteur rare | Répétitions | Temps d’analyse |
| Localizer | FLASH | Tous les avions | 50 | 256 | 1/dir | 1 | 2.5 | 100 | 1 | 1 | 12,8 s | ||
| Localizer | RARE | Tous les avions | 35 | 192 | 1/dir | 0.75 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 min |
| Anat | RARE | Sagittale | 35 | 192 | 15 | 1 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 min |
| Anat | FLASH | Axial | 35 | 192 | 23 | 1 | 5 | 250 | 2 | 1 | 1 min 36 s | ||
| Anat | RARE | Axial | 35 | 192 | 23 | 1 | 28 | 2500 | 4 | 7 | 8 | 1 | 4 min |
| Shim | PRESSER | Tous les avions | 16.223 | 2500 | 1 | 1 | 2,5 s | ||||||
| État de repos | PEV | Axial | 35 | 64 | 15 | 1 | 15 | 1200 | 1 | 300 | 6 min chacun |
Tableau 1 : Tableau de référence des paramètres d’analyse. Paramètres des séquences décrites dans le protocole. FLASH = Prise de vue rapide à faible angle, RARE = Acquisition rapide avec amélioration de la relaxation, PRESS = Spectroscopie resolvée ponctuelle, EPI = Imagerie planaire d’écho.
Dossiers supplémentaires : Exemple de script pour l’évaluation de la qualité ICA. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La stabilité de l’animal, à la fois physiquement et physiologiquement, est essentielle pour obtenir des données de haute qualité sur l’état de repos. Ce protocole atteint la stabilité en passant par quatre phases distinctes de l’anesthésie. Il est impératif que l’animal ait atteint les seuils physiologiques fixés avant de passer à la phase suivante de l’anesthésie; étant donné que cette méthode repose sur des mécanismes physiologiques d’autorégulation, les animaux individuels peuvent nécessiter des quantités de temps légèrement différentes à chaque phase d’anesthésie. D’après notre expérience, prendre plus de temps à chaque phase est plus efficace que de se dépêcher de passer par les stades plus précoces sans donner à la physiologie du rat suffisamment de temps pour s’installer. Les composants clés qui permettent la stabilité sont l’ajustement du cône de nez et l’élimination appropriée des gaz résiduaires.
Un cône de nez correctement scellé et un piégeage permettent à l’animal de rester stable avec une respiration régulièrement espacée et des niveaux de saturation en oxygène constants. Si des halètements, un espacement irrégulier, une retenue de la respiration ou une diminution des niveaux de saturation en oxygène se produisent, il faut travailler à améliorer l’étanchéité et le nettoyage du cône de nez. Le cône de nez doit s’ajuster étroitement mais ne doit pas pousser dans l’arête du nez. Un cône de nez personnalisé peut avoir besoin d’être fabriqué. Le cône de nez d’origine de notre fabricant avait une soupape de sortie d’air trop petite, de sorte qu’un tube de faucon était équipé d’une plus grande ligne de vide scellée plus proche de l’animal. Il en a résulté une meilleure élimination du CO2 expiré et une saturation constante en oxygène. Comme mentionné dans le protocole, le film de paraffine peut être enroulé autour de la mâchoire inférieure et du bord du cône du nez, mais s’il est enveloppé trop étroitement, il peut restreindre la respiration et entraîner une instabilité. De plus, un mauvais placement des barres auriculaires et de la barre de morsure affecte non seulement la stabilité nécessaire de la tête pour l’imagerie, mais peut également affecter la respiration; le clignotement continu ou le bruit audible de l’animal est une indication probable d’un mauvais placement de la barre auriculaire. Les dents de devant doivent s’asseoir solidement sur la barre de morsure et être tirées vers l’avant après le placement de la barre auriculaire pour assurer un ajustement serré. La langue du rat peut avoir besoin d’être tirée vers l’avant si elle se trouve trop loin en arrière dans la bouche et restreint la bonne respiration.
Comme chaque système est unique, un réglage fin du niveau de vide est nécessaire pour obtenir un nettoyage optimal. À titre de guide pratique, il devrait être possible de sentir une petite quantité d’aspiration soit en plaçant un doigt sur la ligne de vide s’ouvrant à l’intérieur du cône de nez, soit en scellant toute l’ouverture du cône de nez avec la paume. L’appariement du débit pour l’entrée d’anesthésie (0,8 L / min a été utilisé ici) est un bon point de départ. La saturation en oxygène chez l’animal doit rester supérieure à 95% tout au long de l’analyse. Si la saturation en oxygène montre une tendance à la baisse, cela peut indiquer que le CO2 s’accumule dans le cône du nez et que le nettoyage doit être augmenté. Une autre possibilité est que la pression du clip de l’oxymètre de pouls sur le pied doit être ajustée, soit relâchée pour améliorer la circulation sanguine, soit resserrée pour assurer un signal fort et stable. Si la respiration de l’animal est supérieure aux seuils indiqués, cela peut indiquer que le piégeage est trop élevé et élimine trop d’isoflurane. Dans de rares circonstances, il peut être nécessaire d’augmenter la dose de dexmététomidine sous-cutanée à 0,02 mg / kg / h, mais nous avons constaté que 0,015 mg / kg a bien fonctionné dans un large éventail d’âges de rats et des deux sexes, et est soutenu dans des étudespharmacologiques 4.
La durée de balayage nécessaire à l’activation de l’IRMf est fonction de la taille de l’effet, du rapport signal/bruit spatial (SNR) et du SNR temporel, comme l’ont montré précédemment Murphy et al.13. L’utilisation d’une petite bobine de surface (2 cm) et d’un champ magnétique élevé (9,4 T) améliore considérablement la sensibilité SNR et BOLD. Avec notre configuration d’imagerie, nous avons constaté qu’une seule analyse de 6 minutes est suffisante pour détecter un réseau de connectivité fonctionnelle robuste à l’état de repos, conformément à notre rapport précédent10. Néanmoins, nous répétons généralement l’analyse 3 à 4 fois et faisons la moyenne des résultats pour dériver des réseaux cérébraux fonctionnels pour des animaux individuels. Alternativement, on peut scanner une seule fois avec une durée plus longue (10 min ou plus) pour dériver des réseaux de connectivitéfonctionnels 14.
Après avoir collecté des rs-IRMf de haute qualité à l’aide de ce protocole, prétraitez les données comme cela a été précédemment publié15,16. Avec l’utilisation des deux barres auriculaires et d’une barre de morsure, les artefacts de mouvement dans le cours du temps IRMf sont minimes, et l’utilisation de la correction de mouvement n’a pas eu d’effet notable sur nos données. Les PEV individuels à l’état de repos doivent être dépouillés du crâne et enregistrés dans un espace commun (nous utilisons un seul cerveau de rat représentatif)16,17. Retirez les volumes de début de chaque EPI afin que ceux inclus soient tous acquis lorsque l’aimant est à l’état d’équilibre (nous supprimons 5 points de temps). Débruiter les scans individuels (voir Résultats représentatifs pour des exemples de composants de signal et de bruit). Appliquez la correction de la synchronisation des tranches, ainsi que la suppression des tendances linéaires et quadratiques, le filtrage passe-bande (0,005-0,1 Hz) et le lissage spatial (0,6 mm FWHM [pleine largeur à la moitié maximale]). De plus, supprimez le temps moyen du signal de la substance blanche et des ventricules par régression linéaire. Après ces étapes de prétraitement standard, d’autres analyses au niveau du groupe peuvent être effectuées, y compris la connectivité fonctionnelle basée sur les semences11,15,18,19,20 , 21,22, des analyses de composants indépendants10,20,22et des analyses de modularité12,19.
Le protocole actuel présente deux avantages principaux : 1) il permet une activité cérébrale spontanée ; et 2) il maintient l’animal à une physiologie presque normale. Des méthodes anesthésiques alternatives (telles que le propofol21,le α-chloralose15et le bromure de pancuronium en combinaison avec un autre anesthésique21,23)ont également été utilisées pour acquérir des données sur l’état de repos. Cependant, il a été démontré que l’utilisation d’une combinaison d’isoflurane à faible dose et de dexmététomidine à faible dose, telle que décrite dans ce protocole, ne perturbe que de manière minimale les fonctions du réseau cérébral tout en fournissant la stabilité physiologique nécessaire pour obtenir des données de connectivité fonctionnelle de qualité à l’état de repos9,10,18,24. De plus, les réponses BOLD de la stimulation somatosensorielle9 et de la déviation mécanique de la moustache11 peuvent être observées à une période de 90 minutes ou après lors de l’utilisation de ce protocole, suggérant un niveau d’excitation constant. Fait intéressant, l’utilisation isolée de la dexmététomidine peut provoquer une activité épileptique; cependant, cette activité a été abolie avec de l’isofluranesupplémenté 8. Un autre avantage du protocole actuel est qu’il élimine le besoin de ventilation artificielle. Bien que la ventilation mécanique puisse conduire à une gamme plus étroite de dioxyde de carbone partiel et de saturation en oxygène chez les animaux, dans les études longitudinales, le maintien des paramètres physiologiques sans avoir besoin d’intubation peut entraîner moins de complications et d’effets secondaires indésirables.
L’intérêt pour l’IRMf à l’état de repos a considérablement augmenté au cours des 10 dernières années, et avec lui la nécessité d’acquérir des scans précliniques de haute qualité à l’état de repos de rongeurs. Ce protocole de survie permet d’obtenir une anesthésie stable jusqu’à 5 h avec une physiologie presque normale lors de l’acquisition à l’état de repos. Comme le protocole est très stable, des séquences supplémentaires (structurale, stimulation, IRM pharmacologique, etc.) peuvent facilement être ajoutées pour obtenir la conception expérimentale souhaitée. La combinaison d’isoflurane à faible dose avec la dexmététomidine utilisée dans ce protocole permet une grande variété d’études précliniques pour les chercheurs intéressés à étudier le cerveau du rongeur à son état de repos.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par un financement de l’Institut national de la santé (NIH) de l’Institut national sur l’abus des drogues (NIDA) [DJW, EDKS et EMB ont été soutenus par la subvention R21DA044501 accordée à Alan I. Green et DJW a été soutenu par la subvention T32DA037202 à Alan J. Budney] et le National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIAAA) [Subvention F31AA028413 à Emily D. K. Sullivan]. Un soutien supplémentaire a été fourni par le fonds doté d’Alan I. Green en tant que professeur de psychiatrie Raymond Sobel à Dartmouth.
Hanbing Lu est soutenu par le National Institute on Drug Abuse Intramural Research Program, NIH.
Les auteurs tiennent à remercier et à remercier le regretté Alan I. Green. Son dévouement inébranlable dans le domaine des troubles concomitants a contribué à établir une collaboration entre les auteurs. Nous le remercions pour son mentorat et ses conseils, qui nous manqueront beaucoup.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9.4T MRI | Varian/Bruker | Varian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software | |
| Air-Oxygen Mixer | Sechrist | Model 3500CP-G | |
| Analysis of Functional NeuroImages (AFNI) | NIMH/NIH | Version AFNI_18.3.03 | Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/ |
| Animal Cradle | RAPID Biomedical | LHRXGS-00563 | rat holder with bite bar, nose cone and ear bars |
| Animal Physiology Monitoring & Gating System | SAII | Model 1025 | MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on |
| Antisedan (atipamezole hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-867-7097 | Zoetis, Manufacturer Item #10000449 |
| Ceramic MRI-Safe Scissors | MRIequip.com | MT-6003 | |
| Clippers | Patterson Veterinary | 07-882-1032 | Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201 |
| Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-893-1801 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10 |
| Digital Rectal Thermometer Covers | Medline | MDS9608 | |
| FMRIB Software Library | FMRIB | MELODIC Version 3.15 | Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki |
| Heating Pad | Cara Inc. | Model 50 | |
| Hemostat forceps, straight | Kent Scientific | INS750451-2 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06 |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip Inc. | 911103 | |
| Lab Tape, 3/4" | VWR International | 89097-990 | |
| Needles, 23 gauge | BD | 305145 | plastic hub removed |
| Parafilm Laboratory Film | Patterson Veterinary | 07-893-0260 | Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A |
| Planar Surface Coil | Bruker | T12609 | 2cm |
| Polyethylene Tubing | Braintree Scientific | PE50 50FT | 0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter) |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38 |
| Sprague Dawley Rats | Charles River | 400 SAS SD | |
| Sterile 0.9% Saline Solution | Patterson Veterinary | 07-892-4348 | Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186 |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Medline | MDS090735 | |
| Surgical Tape, 1" (3M Durapore) | Medline | MMM15381Z | 3M Healthcare, "wide medical tape" |
| Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore) | Medline | MMM15300 | 3M Healthcare |
| Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needle | BD | 309626 | |
| Syringes, 3 mL | BD | 309657 | |
| Vented induction and scavenging system | VetEquip Inc. | 942102 | 2 liter induction chamber with active scavenging |
| 411724 | omega flowmeter | ||
| 931600 | scavenging cube, "vacuum" | ||
| 921616 | nose cone, non-rebreathing |
References
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