Summary
यह प्रोटोकॉल कम खुराक डेक्समेडेटोमिडीन के संयोजन में कम खुराक आइसोफलुरेन का उपयोग करके चूहे से स्थिर आराम-राज्य कार्यात्मक चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (आरएस-एफएमआरआई) डेटा प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है।
Abstract
आराम-राज्य कार्यात्मक चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (rs-fMRI) एक आराम, गैर कार्य राज्य में मस्तिष्क समारोह का अध्ययन करने के लिए एक तेजी से लोकप्रिय तरीका बन गया है । यह प्रोटोकॉल रुपये-एफएमआरआई डेटा प्राप्त करने के लिए एक प्रीक्लिनिकल सर्वाइवल विधि का वर्णन करता है। α2 एड्रेनेर्जिक रिसेप्टर एगोनिस्ट डेक्समेडेटोमिडीन के निरंतर अर्क के साथ कम खुराक आइसोफ्लारेन का संयोजन मस्तिष्क नेटवर्क फ़ंक्शन को संरक्षित करते हुए स्थिर, उच्च गुणवत्ता वाले डेटा अधिग्रहण के लिए एक मजबूत विकल्प प्रदान करता है। इसके अलावा, यह प्रक्रिया चूहे में सहज श्वास और लगभग सामान्य शरीर विज्ञान के लिए अनुमति देती है। अतिरिक्त इमेजिंग दृश्यों को इस विधि का उपयोग करके 5 घंटे तक की संवेदनाहारी स्थिरता के साथ प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल बनाने वाले आराम-राज्य अधिग्रहण के साथ जोड़ा जा सकता है। यह प्रोटोकॉल उपकरणों के सेटअप, संज्ञाहरण के चार अलग-अलग चरणों के दौरान चूहे शरीर विज्ञान की निगरानी, आराम-राज्य स्कैन का अधिग्रहण, डेटा की गुणवत्ता मूल्यांकन, जानवर की वसूली, और प्रसंस्करण के बाद डेटा विश्लेषण की संक्षिप्त चर्चा का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न प्रकार के प्रीक्लिनिकल कृंतक मॉडलों में किया जा सकता है ताकि शेष पर होने वाले मस्तिष्क नेटवर्क परिवर्तनों को प्रकट करने में मदद मिल सके।
Introduction
रेस्टिंग-स्टेट फंक्शनल मैग्नेटिक रेओपनेंस इमेजिंग (आरएस-एफएमआरआई) रक्त-ऑक्सीजन स्तर पर निर्भर (बोल्ड) संकेत का एक उपाय है जब मस्तिष्क आराम पर होता है और किसी विशेष कार्य में नहीं लगा होता है। इन संकेतों का उपयोग तंत्रिका नेटवर्क के भीतर कार्यात्मक कनेक्टिविटी निर्धारित करने के लिए मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच सहसंबंधों को मापने के लिए किया जा सकता है। आरएस-एफएमआरआई का उपयोग नैदानिक अध्ययनों में व्यापक रूप से किया जाता है क्योंकि इसकी गैर-इनवेसिवनेस और रोगियों की आवश्यकता के प्रयास की कम मात्रा (कार्य-आधारित एफएमआरआई की तुलना में) यह विविध रोगी आबादी के लिए इष्टतम बना रही है1.
तकनीकी प्रगति ने रोग राज्यों में अंतर्निहित तंत्र को उजागर करने के लिए कृंतक मॉडल में उपयोग के लिए आरएस-एफएमआरआई को अनुकूलित करने की अनुमति दी है (समीक्षा के लिए संदर्भ2 देखें)। रोग या नॉकआउट मॉडल सहित प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल, मनुष्यों में लागू नहीं होने वाले प्रयोगात्मक जोड़तोड़ की एक विस्तृत श्रृंखला की अनुमति देते हैं, और अध्ययन2प्रयोगों को और बढ़ाने के लिए पोस्टमार्टम नमूनों का उपयोग भी कर सकते हैं। फिर भी, गति को सीमित करने और तनाव को कम करने दोनों में कठिनाई के कारण, कृंतक में एमआरआई अधिग्रहण पारंपरिक रूप से संज्ञाहरण के तहत किया जाता है। एनेस्थेटिक एजेंट, उनके फार्माकोकाइनेटिक्स, फार्माकोडायनामिक्स और आणविक लक्ष्यों के आधार पर, मस्तिष्क रक्त प्रवाह, मस्तिष्क चयापचय को प्रभावित करते हैं, और संभावित रूप से न्यूरोवैस्कुलर कपलिंग रास्तों को प्रभावित करते हैं।
एनेस्थेटिक प्रोटोकॉल विकसित करने के कई प्रयास हुए हैं जो न्यूरोवैस्कुलर कपलिंग और मस्तिष्क नेटवर्क कार्यको संरक्षितकरते हैं 3,4,5,6,7,8. हमने पहले एक संवेदनाहारी शासन की सूचना दी थी जिसने α2 एड्रेनेर्जिक रिसेप्टर एगोनिस्ट डेक्समेडेटोमिडीन9की कम खुराक के साथ आइसोफ्लोरेन की कम खुराक लागू की थी। संज्ञाहरण की इस विधि के तहत चूहों ने स्थापित प्रक्षेपण मार्गों (वेंट्रोलेट्रल और वेंट्रोमेडियल थैलेसीमिक न्यूक्लियी, प्राथमिक और माध्यमिक सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स) के अनुरूप क्षेत्रों में मूंछ उत्तेजना के लिए मजबूत साहसिक प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया; डिफ़ॉल्ट मोड नेटवर्क10, 11और लार नेटवर्क12 सहित बड़े पैमाने पर आराम-राज्य मस्तिष्क नेटवर्क का भी लगातार पता लगाया गया है। इसके अलावा, यह संवेदनाहारी प्रोटोकॉल एक ही जानवर पर बार-बार इमेजिंग की अनुमति देता है, जो रोग प्रगति और प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के प्रभाव की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है।
वर्तमान अध्ययन में, हम इसमें शामिल प्रायोगिक सेटअप, पशु तैयारी और शारीरिक निगरानी प्रक्रियाओं का विस्तार करते हैं। विशेष रूप से, हम प्रत्येक चरण के दौरान विशिष्ट संवेदनाहारी चरणों और स्कैन के अधिग्रहण का वर्णन करते हैं। प्रत्येक आराम-राज्य स्कैन के बाद डेटा की गुणवत्ता का आकलन किया जाता है। पोस्ट-स्कैन विश्लेषण का एक संक्षिप्त सारांश भी चर्चा में शामिल है। चूहों में आरएस-एफएमआरआई का उपयोग करने की क्षमता को उजागर करने में रुचि रखने वाली प्रयोगशालाओं को यह प्रोटोकॉल उपयोगी लगेगा।
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Protocol
सभी प्रयोगों को ९.४ टी एमआरआई स्कैनर पर किया गया था, और डार्टमाउथ कॉलेज में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था । नीचे दिए गए वीडियो और आंकड़ों में इस्तेमाल किए गए जानवरों को रिकॉर्ड करने और दिखाने के लिए अतिरिक्त अनुमोदन प्राप्त किया गया था ।
1. स्कैनिंग से पहले तैयारी
- चमड़े के नीचे जलसेक रेखा
- आंशिक रूप से अपने पैकेज से एक 23 जी सुई निकालें ताकि सुई बिंदु बाँझ रहता है।
- सुरक्षित रूप से सुई के हब पकड़ और सुई शाफ्ट स्कोर करने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें, जहां यह हब मिलता है ।
- स्कोरिंग के नीचे सीधे शाफ्ट के चारों ओर एक सुई धारक क्लैंप और धीरे हब से शाफ्ट तोड़ ।
- सुई शाफ्ट के 1/3 डालें (कुंद अंत) पर्याप्त लाइन लंबाई के साथ पहले निष्फल PE50 लाइन में चुंबक बोर के अंदर जानवर के लिए दवा पंप से विस्तार करने के लिए ।
- डेक्समेडेटोमिडीन और अतिपैमेजोल का कमजोर पड़ना
- पतला डेक्समेडेटिमोडीन हाइड्रोक्लोराइड का एक समाधान तैयार करें जिसमें 0.5 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक के 0.5 एमएल का उपयोग करके एक स्पष्ट, बाँझ कांच की बोतल (पतला एकाग्रता = 0.025 मिलीग्राम/एमएलएम) में बाँझ नमकीन के 9.5 एमएल के साथ मिलाया जाता है।
- एक स्पष्ट, बाँझ कांच की बोतल (पतला एकाग्रता = 0.05 मिलीग्राम/एमएल) में बाँझ नमकीन के 9.9 एमएल के साथ मिश्रित 5 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक के 0.1 एमएल का उपयोग करके पतला अतिपैमेजोल का समाधान तैयार करें।
- स्कैनिंग पैरामीटर
- स्कैनिंग दृश्यों को तैयार करने के लिए तालिका 1 में प्रस्तुत मापदंडों का उपयोग करें।
2. चरण 1 संज्ञाहरण: पशु प्रेरण और तैयारी
- सेटअप
- सुनिश्चित करें कि सभी उपकरण चालू हैं और ऑक्सीजन और एयर मिक्सर, हीटिंग पैड और सक्रिय मैला ढोने की प्रणाली (चित्रा 1देखें) सहित ठीक से काम कर रहे हैं।
- हीटिंग सिस्टम का तापमान सेट पॉइंट को 37.5 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
- पशु प्रेरण
- जानवर (90 दिन पुराने, पुरुष स्प्राग डावले चूहा) को इंडक्शन कक्ष में रखें और 30% ऑक्सीजन-समृद्ध हवा में 2.5% आइसोफ्लुन के साथ संज्ञाहरण को प्रेरित करें।
नोट: पशु उम्र और दोनों लिंगों की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग किया जा सकता है। - एक बार जब जानवर एनेस्थेटाइज्ड हो जाता है, तो इसे कक्ष से हटा दें, जानवर का वजन करें, और इसे तैयारी की जगह में हीटिंग पैड पर नाक शंकु (2.5% आइसोफ्लुना) में रखें।
- जानवर (90 दिन पुराने, पुरुष स्प्राग डावले चूहा) को इंडक्शन कक्ष में रखें और 30% ऑक्सीजन-समृद्ध हवा में 2.5% आइसोफ्लुन के साथ संज्ञाहरण को प्रेरित करें।
- पशु तैयारी
- सुखाने को रोकने के लिए प्रत्येक आंख में नेत्र स्नेहक मरहम लगाएं।
- अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया की कमी से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें।
- जानवर की पीठ के निचले काठ क्षेत्र (यानी, सीधे पूंछ के ऊपर) पर 2 "बाय 2" वर्ग क्षेत्र को दाढ़ी बनाने के लिए कतरनी का उपयोग करें।
- एक इंट्रापेरिटोनियल (यानी, एक 300 ग्राम चूहा 0.18 मिलीएल) पेट के निचले सही चतुर्भुज में 25 जी सुई का उपयोग कर के साथ डेक्समेडेटोमिडीन समाधान के 0.015 मिलीग्राम/किलो का प्रशासन करें।
- तैयारी की जगह से पशु पालने के लिए स्विच आइसोफ्लुन प्रवाह।
- जानवर को जानवर पालने में ले जाएं। चूहे के सामने के दांतों को सुरक्षित रूप से और काटने के बार में रखें। नाक के ऊपर नाक शंकु पुश करने के लिए एक तंग फिट सुनिश्चित करने के लिए।
नोट: यदि नाक शंकु निचले जबड़े को कवर नहीं करता है, तो नाक शंकु के चारों ओर सील करते हुए जबड़े को धीरे से बंद करने के लिए पैराफिन फिल्म का उपयोग करें। - रिब पिंजरे के नीचे चूहे के पेट के नीचे श्वसन पैड की स्थिति और फिर से स्थिति यह जब तक श्वसन तरंग प्रत्येक सांस पर केंद्रित एक गहरी गर्त से पता चलता है (चित्रा 2में श्वसन तरंग देखें) ।
- फिजियोलॉजी मॉनिटरिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके जानवर की श्वास की निगरानी करें। संज्ञाहरण के अगले चरण में ले जाएं जब श्वसन ४० साँस/मिनट (बीपीएम; डेक्समेडेटिमेडिडीन इंजेक्शन के बाद लगभग 5 मिनट) से कम हो ।
3. चरण 2 संज्ञाहरण: पशु सेटअप
- जानवर पालने में चूहे के सिर को स्थिर करने के लिए कान नहर में कान की सलाखों डालें। एक बार तैनात होने के बाद, काटने के बार पर आगे खींचें और पुष्टि करें कि सिर आगे नहीं बढ़ता है। जरूरत के अनुसार नाक शंकु और पैराफिन फिल्म को फिर से समायोजित करें (चित्रा 3aदेखें)।
- तापमान जांच को पूर्व-चिकनाई, डिस्पोजेबल जांच कवर में डालें। धीरे-धीरे तापमान जांच लगभग 1/2 "मलाशय में डालें, और इसे चिकित्सा टेप के साथ पूंछ के आधार पर टेप करें।
- पल्स ऑक्सीमीटर क्लिप को हिंद फुट के मेटाटारसल क्षेत्र पर रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि प्रकाश स्रोत पैर (हथेली) के नीचे है।
नोट: क्लिप का रोटेशन संकेत को प्रभावित कर सकता है; इस प्रकार, पंजा और क्लिप को सीधा रखने के लिए धारक बनाना अधिक स्थिरता का कारण बनेगा। यह भी ध्यान दें कि जब तक चूहा सामान्य शरीर के तापमान पर नहीं होता है, तब तक ऑक्सीजन संतृप्ति कम (<95%) हो सकती है। - 0.015 मिलीग्राम/किलो/एच डेक्समेडेटोमिडीन (एक 300 ग्राम चूहा 0.18 mL/h प्राप्त करता है) को बाहर निकालने के लिए जलसेक दर की गणना करने के लिए चूहे के वजन का उपयोग करें।
- गणना जलसेक दर को बाहर निकालने के लिए दवा पंप सेट करें।
- बाँझ, पतला डेक्समेडेटोमिडीन समाधान के साथ एक 3 मिलीएल सिरिंज भरें और निष्फल जलसेक रेखा के खुले अंत में सुई की नोक डालें (दवा पंप से चमड़े के नीचे सुई के साथ पशु पालने तक विस्तारित पहले से संलग्न)। लाइन भरें और दवा पंप के सिरिंज धारक में सिरिंज सुरक्षित करें।
- पुशर ब्लॉक को तब तक आगे बढ़ाएं जब तक कि यह प्लंजर को छू न जाए, और दवा को सुई पर निष्कासित कर दिया जाता है, यह सुनिश्चित करते हुए कि जलसेक रेखा पूरी तरह से भर जाए।
- अल्कोहल पोंछे का उपयोग करके, किसी भी आवारा बालों को हटाने के लिए मुंडा क्षेत्र को साफ करें।
- त्वचा को पूंछ के आधार से लगभग दो उंगली की चौड़ाई चुटकी लें। तांखी त्वचा में जलसेक रेखा सुई के 1/3 डालें।
- व्यापक चिकित्सा टेप के एक 3 "टुकड़ा के साथ त्वचा के लिए सुई सुरक्षित। चूहे के पार, पहले पर व्यापक चिकित्सा टेप का एक दूसरा टुकड़ा रखें, और पशु पालने के दोनों पक्षों से जुड़े (चित्रा 4देखें)।
नोट: यह गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है कि फेरोमैग्नेटिक सुई स्कैन के दौरान आंदोलन को रोकने के लिए अच्छी तरह से सुरक्षित है। - चमड़े के नीचे डेक्समेडेटोमिडीन का अर्क शुरू करें।
- कुंडली के लिए एक स्तर की सतह बनाने के लिए चूहे की नाक के पुल पर धुंध का एक टुकड़ा रखें। कागज टेप का उपयोग करें, जो एमआरआई सिग्नल के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है, चूहे के सिर पर कुंडली सुरक्षित करने के लिए, यह मस्तिष्क पर केंद्रित (चित्रा 3b,सीदेखें) ।
- प्रयोगशाला टेप के साथ पशु पालने के भीतर सभी लाइनों और केबल को सुरक्षित करें और जांचें कि क्या सभी शरीर विज्ञान संकेत स्थिर हैं (चित्रा 2देखें)।
- जानवर के ऊपर कागज तौलिए रखें, उन्हें प्रयोगशाला टेप के साथ पशु पालने के लिए सुरक्षित करें। यदि एक एयर हीटिंग सिस्टम का उपयोग कर रहे हैं, तो गर्म हवा को नियंत्रित करने के लिए पूरे पालने के चारों ओर एक प्लास्टिक शीट लपेटें।
- जानवर को बोर में ले जाएं और चुंबक को ट्यून करें।
4. चरण 3 संज्ञाहरण: शारीरिक स्कैन अधिग्रहण
- आइसोफ्लुन को घटाकर 1.5% कर दिया गया है, जिसके परिणामस्वरूप श्वसन में लगभग 45-50 बीपीएम की लगातार वृद्धि हुई है। शारीरिक स्कैनिंग की अवधि के लिए इस स्तर पर रहते हैं।
- यह सुनिश्चित करने के लिए फ्लैश लोकलाइजर स्कैन का उपयोग करें कि मस्तिष्क चुंबक आइसोकसेंटर(चित्रा 5a)के साथ गठबंधन किया गया है। जानवर को फिर से स्थान ें और यदि आवश्यक हो तो दोहराएं।
- उच्च रिज़ॉल्यूशन RARE लोकलाइजर स्कैन चलाएं और मस्तिष्क में केंद्रित 15 सैगिटल स्लाइस (बाएं से दाएं, चित्रा 5b)को संरेखित करने के लिए इस स्कैन आउटपुट का उपयोग करें।
- मध्य sagittal टुकड़ा का उपयोग करना, पूर्वकाल आयोग है, जो एक अंधेरे स्थान(चित्रा 5c)के रूप में प्रकट होता है की विक्रय के लिए केंद्र अक्षीय टुकड़ा संरेखित करें । आराम-राज्य स्कैन में बाद में उपयोग करने के लिए स्लाइस ऑफसेट नोट करें।
- पोस्ट-स्कैन विश्लेषण के दौरान एक आम स्थान पर पंजीकरण में सहायता करने के लिए फ्लैश और दुर्लभ अक्षीय प्रोटोकॉल दोनों का उपयोग करके 23 स्लाइस प्राप्त करें।
- प्रेस अनुक्रम का उपयोग कर पूरे मस्तिष्क भर में शिम ।
5. चरण 4: आराम-राज्य स्कैन अधिग्रहण
- शारीरिक स्कैन पूरा करने के बाद, आइसोफ्लुन को 0.5% से 0.75% तक कम करें, समायोजित करें ताकि जानवर का श्वसन प्रति मिनट 60-65 साँस हो। स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए आराम-राज्य स्कैनिंग शुरू करने से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए इस स्तर पर बने रहें।
- जब शरीर विज्ञान स्थिर होता है (श्वसन सीमा 60-75 बीपीएम होती है जिसमें कोई हांफते या अनियमितता नहीं होती है, तो कोर बॉडी का तापमान 37.5 ± 1.0 डिग्री सेल्सियस होता है, और ऑक्सीजन संतृप्ति 95% या उससे अधिक है), एनाटॉमिकल अक्षीय श्रृंखला के रूप में एक ही स्लाइस ऑफसेट का उपयोग करके 15 स्लाइस ईपीआई स्कैन प्राप्त करें।
- प्रत्येक आराम-राज्य स्कैन पूरा होने के बाद, स्थानिक और लौकिक घटकों में डेटा को विघटित करने के लिए एक स्वतंत्र घटक विश्लेषण (आईसीए) का उपयोग करके गुणवत्ता की जांच करें।
- कम से कम तीन उच्च गुणवत्ता वाले आराम-राज्य स्कैन प्राप्त करें।
6. पोस्ट-स्कैन रिकवरी
- स्कैनिंग पूरी होने पर, आइसोफ्लुन को 2% तक बढ़ाएं और चमड़े के नीचे डेक्समेडेटिमिनेज़ इन्फ्यूजन को रोकें।
- चुंबक बोर से पशु पालना निकालें, जानवर को खोलें, और कान की सलाखों, तापमान जांच, पल्स ऑक्सीमीटर क्लिप, और डेक्समेडेटोमिडीन सुई को हटा दें।
- 25 जी सुई के साथ 1 मिलीएल सिरिंज का उपयोग करके चूहे के पिछले पैर की मांसपेशियों में पतला अतिपैमजोल समाधान के 0.015 मिलीग्राम/किलो इंजेक्ट करें (यानी, 300 ग्राम चूहा 0.09 मिलीएल प्राप्त करेगा)।
- चूहे को एक हीटिंग पैड के शीर्ष पर घर के पिंजरे में वापस रखें और तब तक निगरानी करें जब तक कि जानवर आंचल न हो जाए।
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Representative Results
प्रत्येक आराम-राज्य स्कैन के बाद, एक स्वतंत्र घटक विश्लेषण (आईसीए; पूरक फ़ाइलों में शामिल उदाहरण स्क्रिप्ट) का उपयोग करके स्थिरता का आकलन किया जाता है। चित्रा 6 आराम-राज्य स्कैन से घटक आउटपुट के उदाहरण दिखाता है। चित्रा 6a उच्च स्थिरता के साथ एक स्कैन से एक संकेत घटक दिखाता है। ध्यान दें कि स्थानिक रूप से, घटक में उच्च क्षेत्रीयता है। स्थानिक घटक के नीचे समय पाठ्यक्रम के भीतर, संकेत स्थिर है और उम्मीद के मुताबिक नहीं है, सच मस्तिष्क गतिविधि का संकेत है । नीचे की ओर पावर स्पेक्ट्रम मुख्य रूप से कम आवृत्तियों को दर्शाता है। चित्रा 6b चित्रा 6a के रूप में एक ही स्कैन से एक घटक से पता चलता है कि शोर का प्रतिनिधित्व करता है । स्थानिक घटक, उच्च आवृत्ति समय पाठ्यक्रम, और बिजली स्पेक्ट्रम में उच्च आवृत्ति चोटी में गैर क्षेत्रीयता पर ध्यान दें । अंत में, चित्रा 6c अस्थिर संज्ञाहरण के साथ एक स्कैन से एक घटक दिखाता है। समय पाठ्यक्रम चर और अनियमित है। जब ऐसा होता है, तो एनेस्थेटिक प्रोटोकॉल में सुधार की आवश्यकता होती है, आमतौर पर नाक शंकु की सीलिंग और अपशिष्ट गैसों की सफाई के लिए।
चित्रा 1:तैयारी अंतरिक्ष और एमआरआई पशु पालना। वैक्यूम दोनों इंडक्शन चैंबर और पशु पालने पर नाक शंकु से गैसों को बर्बाद करते हैं। हीटिंग पैड चरण 1 और वसूली दोनों के दौरान जानवरों के तापमान को बनाए रखने में मदद करता है। ख) एमआरआई पशु पालना। शीर्ष चरण 2 में पशु सेटअप के घटकों को इंगित करता है। नीचे एक चूहा पूरी तरह से सेट-अप और स्कैनिंग के लिए तैयार दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2:फिजियोलॉजिक स्कैन आउटपुट। ऑक्सीजन संतृप्ति (पल्सऑक्स, 96%), हृदय गति (325 बीपीएम [बीट्स प्रति मिनट]), श्वसन दर (61 सांस/न्यूनतम), और कोर बॉडी तापमान (टी 1, 37.5 डिग्री सेल्सियस) स्कैनिंग सत्र में लगातार निगरानी की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3:नाक शंकु और कुंडली प्लेसमेंट। (क)जानवर की नाक और निचले जबड़े के चारों ओर सील किए गए नाक शंकु को बंद करें। (ख)मस्तिष्क को सतह कुंडली के संरेखण का ओवरहेड दृश्य। (ग)जानवर की आंख के मध्य बिंदु के साथ कुंडली संरेखण का साइड व्यू। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4:चमड़े के नीचे डेक्समेडेटिमिडीन जलसेक रेखा और सुई प्लेसमेंट। (एक) जानवर की पीठ के निचले काठ क्षेत्र में सुई प्रविष्टि। (ख)जानवर की त्वचा के लिए सुई सुरक्षित टेप । (ग)फेरोमैग्नेटिक सुई की आवाजाही को रोकने के लिए पशु पालने में टेप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5:शारीरिक स्कैन संरेखण। (एक)स्थानीयताकार चुंबक आइसोकसेंटर के लिए जानवर के मस्तिष्क को संरेखित करने के लिए स्कैन, क्रॉसहेयर के साथ उल्लेख किया । (ख)धनु स्लाइस बाएं से दाएं मस्तिष्क में गठबंधन किया । (ग)सफेद तीर द्वारा इंगित पूर्वकाल संयोजिका के विखंडन के लिए संरेखण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 6-स्वतंत्र घटक विश्लेषण का उपयोग करके गुणवत्ता मूल्यांकन। (ए)स्थिर संज्ञाहरण के दौरान सिग्नल घटक। (ख)स्थिर संज्ञाहरण के दौरान शोर घटक। (ग)अस्थिर संज्ञाहरण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
स्कैन | अनुक्रम | उन्मुखीकरण | एफओवी (मिमी एक्स मिमी) | मैट्रिक्स | स्लाइस | स्लाइस मोटाई (मिमी) | ते (एमएस) | टीआर (एमएस) | औसत | इको स्पेसिंग (एमएस) | दुर्लभ कारक | दोहराव | स्कैन समय |
स्थानीयता | चमक | सभी विमान | 50 | 256 | 1/डीआईआर | 1 | 2.5 | 100 | 1 | 1 | 12.8 एस | ||
स्थानीयता | दुर्लभ | सभी विमान | 35 | 192 | 1/डीआईआर | 0.75 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 मिनट |
अनत | दुर्लभ | धनुताल | 35 | 192 | 15 | 1 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 मिनट |
अनत | चमक | अक्षीय | 35 | 192 | 23 | 1 | 5 | 250 | 2 | 1 | 1 मिनट 36 एस | ||
अनत | दुर्लभ | अक्षीय | 35 | 192 | 23 | 1 | 28 | 2500 | 4 | 7 | 8 | 1 | 4 मिनट |
फन्नी | दबाना | सभी विमान | 16.223 | 2500 | 1 | 1 | 2.5 एस | ||||||
रेस्टिंग-स्टेट | महामारी | अक्षीय | 35 | 64 | 15 | 1 | 15 | 1200 | 1 | 300 | 6 मिनट प्रत्येक |
तालिका 1: स्कैन मापदंडों की संदर्भ तालिका। प्रोटोकॉल में उल्लिखित दृश्यों के लिए पैरामीटर। फ्लैश = फास्ट लो एंगल शॉट, दुर्लभ = विश्राम वृद्धि के साथ तेजी से अधिग्रहण, प्रेस = प्वाइंट रिपेक्ट स्पेक्ट्रोस्कोपी, ईपीआई = इको प्लानर इमेजिंग।
अनुपूरक फाइलें: आईसीए गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए उदाहरण स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
पशु की स्थिरता, दोनों शारीरिक और शारीरिक रूप से, उच्च गुणवत्ता वाले आराम राज्य डेटा प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह प्रोटोकॉल संज्ञाहरण के चार अलग-अलग चरणों से गुजरकर स्थिरता प्राप्त करता है। यह जरूरी है कि जानवर संज्ञाहरण के अगले चरण में जाने से पहले सेट शारीरिक थ्रेसहोल्ड को पूरा कर चुका है; चूंकि यह विधि शारीरिक ऑटोरेगुलेटरी तंत्र पर निर्भर करती है, इसलिए प्रत्येक संज्ञाहरण चरण में व्यक्तिगत जानवरों को थोड़ा अलग मात्रा में समय की आवश्यकता हो सकती है। यह हमारा अनुभव है कि प्रत्येक चरण में अधिक समय लेना चूहे के शरीर विज्ञान को व्यवस्थित करने के लिए पर्याप्त समय दिए बिना पहले के चरणों के माध्यम से जल्दी करने से अधिक कुशल है। प्रमुख घटक है कि स्थिरता के लिए अनुमति नाक शंकु और उचित अपशिष्ट गैस मैला ढोने के फिट हैं ।
एक ठीक से सील नाक शंकु और सफाई जानवर नियमित रूप से दूरी सांस लेने और स्थिर ऑक्सीजन संतृप्ति के स्तर के साथ स्थिर रहने के लिए अनुमति देते हैं । यदि हांफते हुए, अनियमित अंतर, सांस ों को पकड़ना, या ऑक्सीजन संतृप्ति का स्तर कम होना, तो नाक शंकु सीलिंग और सफाई में सुधार करने के लिए काम करना चाहिए। नाक शंकु को बारीकी से फिट होना चाहिए लेकिन नाक के पुल में धक्का नहीं देना चाहिए। एक कस्टम नाक शंकु को गढ़े जाने की आवश्यकता हो सकती है। हमारे निर्माता से मूल नाक शंकु एक हवा से बाहर निकलना वाल्व है कि बहुत छोटा था, तो एक बाज़ ट्यूब एक बड़ा सील वैक्यूम लाइन जानवर के करीब के साथ फिट किया गया था । इसके परिणामस्वरूप समाप्त हो चुके सीओ2 और स्थिर ऑक्सीजन संतृप्ति की बेहतर निकासी हुई । जैसा कि प्रोटोकॉल में उल्लेख किया गया है, पैराफिन फिल्म को निचले जबड़े और नाक शंकु के किनारे के चारों ओर लपेटा जा सकता है, लेकिन अगर बहुत कसकर लपेटा जाता है, तो यह सांस लेने को प्रतिबंधित कर सकता है और अस्थिरता का कारण बन सकता है। इसके अतिरिक्त, कान की सलाखों और काटने के बार की अनुचित नियुक्ति न केवल इमेजिंग के लिए सिर की आवश्यक स्थिरता को प्रभावित करते हैं बल्कि सांस लेने को भी प्रभावित कर सकते हैं; जानवर से निरंतर निमिष या श्रव्य शोर अनुचित कान बार प्लेसमेंट का एक संभावित संकेत है। सामने के दांत काटने बार पर सुरक्षित रूप से बैठते हैं और एक तंग फिट सुनिश्चित करने के लिए कान बार प्लेसमेंट के बाद आगे खींच लिया जाना चाहिए। चूहे की जीभ को आगे खींचने की आवश्यकता हो सकती है यदि यह मुंह में बहुत दूर तक बैठता है और उचित श्वास को प्रतिबंधित करता है।
चूंकि प्रत्येक प्रणाली अद्वितीय है, इसलिए इष्टतम मैला ढोने को प्राप्त करने के लिए वैक्यूम स्तर को ठीक ट्यूनिंग की आवश्यकता होती है। एक व्यावहारिक गाइड के रूप में, नाक शंकु के अंदर खोलने वाली वैक्यूम लाइन पर उंगली रखकर या हथेली के साथ पूरी नाक शंकु खोलने को सील करके, या तो सक्शन की एक छोटी राशि महसूस करना संभव होना चाहिए। संज्ञाहरण इनपुट के लिए प्रवाह दर मिलान (०.८ L/min यहां इस्तेमाल किया गया था) एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है । जानवर में ऑक्सीजन संतृप्ति स्कैन भर में 95% से ऊपर रहना चाहिए। यदि ऑक्सीजन संतृप्ति एक कम प्रवृत्ति से पता चलता है, यह एक संकेत है कि सीओ2 नाक शंकु में निर्माण कर रहा है और सफाई को बढ़ाने की जरूरत हो सकती है । एक और संभावना यह है कि पैर पर पल्स ऑक्सीमीटर क्लिप के दबाव को समायोजित करने की जरूरत है, या तो रक्त प्रवाह में सुधार करने के लिए ढीला या एक मजबूत, स्थिर संकेत सुनिश्चित करने के लिए कड़ा । यदि जानवर का श्वसन उल्लिखित थ्रेसहोल्ड से अधिक है, तो इससे यह संकेत मिल सकता है कि मैला ढोना बहुत अधिक सेट है और बहुत अधिक आइसोफ्लाणे को हटा रहा है। दुर्लभ परिस्थितियों में, चमड़े के नीचे डेक्समेडेटोमिडीन की खुराक को 0.02 मिलीग्राम/किलो/घंटा तक बढ़ाना आवश्यक हो सकता है, लेकिन हमने पाया है कि 0.015 मिलीग्राम/किलोग्राम चूहे की उम्र और दोनों लिंगों की एक विस्तृत श्रृंखला में अच्छी तरह से काम किया है, और औषधीय अध्ययन4में समर्थित है।
एफएमआरआई सक्रियण के लिए आवश्यक स्कैन अवधि प्रभाव आकार, स्थानिक सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) और अस्थायी एसएनआर का एक कार्य है, जैसा कि मर्फी एट अल13द्वारा पहले दिखाया गया था। एक छोटे सतह कुंडली (2 सेमी) और उच्च चुंबकीय क्षेत्र (9.4 टी) का उपयोग एसएनआर और बोल्ड संवेदनशीलता को काफी हद तक बढ़ाता है। हमारे इमेजिंग सेटअप के साथ, हमने पाया है कि एक एकल 6 मिनट स्कैन एक मजबूत आराम-राज्य कार्यात्मक कनेक्टिविटी नेटवर्क का पता लगाने के लिए पर्याप्त है, जो हमारी पिछली रिपोर्ट10के अनुरूप है। फिर भी, हम आम तौर पर स्कैन को 3 से 4 बार दोहराते हैं, और व्यक्तिगत जानवरों के लिए कार्यात्मक मस्तिष्क नेटवर्क प्राप्त करने के लिए औसत परिणाम देते हैं। वैकल्पिक रूप से, कोई भी कार्यात्मक कनेक्टिविटी नेटवर्क14प्राप्त करने के लिए लंबी अवधि (10 मिनट या उससे अधिक) के साथ एक ही बार स्कैन कर सकता है।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके उच्च गुणवत्ता वाले रुपये-एफएमआरआई एकत्र करने के बाद, डेटा को पहले से प्रकाशित किया गया है15,16। दोनों कान सलाखों और एक काटने बार के उपयोग के साथ, एफएमआरआई समय पाठ्यक्रम में गति कलाकृतियों कम से कम कर रहे हैं, और गति सुधार के उपयोग हमारे डेटा पर एक ध्यान देने योग्य प्रभाव नहीं पड़ा है। व्यक्तिगत विश्राम-राज्य ईपीआई स्कैन को खोपड़ी से छीन लिया जाना चाहिए और एक सामान्य स्थान पर पंजीकृत होना चाहिए (हम एक प्रतिनिधि चूहा मस्तिष्क का उपयोग करते हैं)16,17। प्रत्येक ईपीआई से शुरुआत की मात्रा निकालें ताकि शामिल लोग सभी प्राप्त हो जाएं जब चुंबक स्थिर-राज्य में हो (हम 5 समय अंक निकालते हैं)। व्यक्तिगत स्कैन का मूल्यकृत करें (सिग्नल और शोर घटकों के उदाहरणों के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें)। स्लाइस टाइमिंग करेक्शन, साथ ही रैखिक और क्वाड्रेटिक ट्रेंड रिमूवल, बैंड पास फिल्टरिंग (0.005-0.1 हर्ट्ज) और स्थानिक चौरसाई (0.6 मिमी एफडब्ल्यूएचएम [आधी अधिकतम पर पूर्ण चौड़ाई]) लागू करें। इसके अतिरिक्त, रैखिक प्रतिगमन के माध्यम से सफेद पदार्थ और वेंट्रिकल से औसत सिग्नल समय पाठ्यक्रम को हटा दें। इन मानक पूर्वप्रसंस्करण चरणों के बाद, बीज आधारित कार्यात्मक कनेक्टिविटी11, 15, 18,19,20,22,स्वतंत्र घटकों का विश्लेषण10, 20,22,और मॉड्यूलरता विश्लेषण12,19सहित आगे समूह स्तर का विश्लेषण किया जा सकता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल के दो मुख्य फायदे हैं: 1) यह सहज मस्तिष्क गतिविधि के लिए अनुमति देता है; और 2) यह जानवर को लगभग सामान्य शरीर विज्ञान पर रखता है। वैकल्पिक एनेस्थेटिक विधियों (जैसे प्रोपोफोल21,α-क्लोरलोज15,और एक अन्य एनेस्थेटिक21, 23के संयोजन में पैनक्यूरोनियम ब्रोमाइड का भी उपयोग आराम-राज्य डेटा प्राप्त करने के लिए किया गया है। हालांकि, कम खुराक डेक्समेडेटोमिडीन के साथ कम खुराक आइसोफ्लुन के संयोजन का उपयोग करना, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, केवल मस्तिष्क नेटवर्क कार्यों को न्यूनतम रूप से बाधित करने के लिए दिखाया गया है, जबकि गुणवत्ता आराम-राज्यकार्यात्मक कनेक्टिविटी डेटा9, 10,18,24प्राप्त करने के लिए आवश्यक फिजियोलॉजिकलस्थिरताभी प्रदान करता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करतेसमय 90 मिनट की अवधि में या उसके बाद सोमाटोसेंसरी उत्तेजना9 और यांत्रिक मूंछ विक्षेप से बोल्ड प्रतिक्रियाएं देखी जा सकती हैं, जो लगातार उत्तेजना स्तर का सुझाव देती हैं। दिलचस्प बात यह है कि अलगाव में डेक्समेडेटोमिडीन का उपयोग करने से मिर्गी की गतिविधि प्राप्त हो सकती है; हालांकि, इस गतिविधि पूरक आइसोफलुनान8साथ समाप्त हो गया था . वर्तमान प्रोटोकॉल का एक और लाभ यह है कि यह कृत्रिम वेंटिलेशन की आवश्यकता को समाप्त करता है। यद्यपि यांत्रिक वेंटिलेशन से जानवरों में आंशिक कार्बन डाइऑक्साइड और ऑक्सीजन संतृप्ति की एक संकरा रेंज हो सकती है, देशांतर अध्ययनों में, इंडिबेशन की आवश्यकता के बिना शारीरिक मापदंडों को बनाए रखने से कम जटिलताएं और अवांछित दुष्प्रभाव हो सकते हैं।
आराम में रुचि-राज्य fMRI पिछले 10 वर्षों में काफी वृद्धि हुई है, और इसके साथ कृंतक से उच्च गुणवत्ता, पूर्व नैदानिक आराम-राज्य स्कैन प्राप्त करने की जरूरत है । यह अस्तित्व प्रोटोकॉल आराम-राज्य अधिग्रहण के दौरान लगभग सामान्य शरीर विज्ञान के साथ 5 घंटे तक के लिए स्थिर संज्ञाहरण प्राप्त करता है। चूंकि प्रोटोकॉल अत्यधिक स्थिर है, इसलिए वांछित प्रयोगात्मक डिजाइन प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त दृश्यों (संरचनात्मक, उत्तेजना, औषधीय एमआरआई, आदि) को आसानी से जोड़ा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए डेक्समेडेटामिडीन के साथ कम खुराक आइसोफलुरेन का संयोजन अपने आराम राज्य में कृंतक मस्तिष्क का अध्ययन करने में रुचि रखने वाले जांचकर्ताओं के लिए विभिन्न प्रकार के प्रीक्लिनिकल अध्ययनों की अनुमति देता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (NIH) के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन ड्रग एब्यूज (निदा) [डीजेडब्ल्यू) से फंडिंग से सपोर्ट मिला । EDKS, और EMB अनुदान R21DA044501 द्वारा समर्थित थे एलन I. ग्रीन और DJW को ग्रांट T32DA037202 द्वारा एलन जे Budney को समर्थन दिया गया था] और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन अल्कोहल एब्यूज एंड अल्कोहलिज्म (एनआईएएए) [एमिली डी सुलिवान को ग्रांट F31AA028413] । डार्टमाउथ में मनोरोग के रेमंड सोबेल प्रोफेसर के रूप में एलन आई ग्रीन के संपन्न फंड के माध्यम से अतिरिक्त सहायता प्रदान की गई थी ।
हंबिंग लू को राष्ट्रीय नशीली दवाओं के दुरुपयोग इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम, एनआईएच पर संस्थान द्वारा समर्थित किया जाता है।
लेखकों को स्वीकार करते है और स्वर्गीय एलन मैं ग्रीन शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । सह-होने वाले विकारों के क्षेत्र में उनके अटूट समर्पण ने लेखकों के बीच सहयोग स्थापित करने में मदद की । हम उनकी मेंबरशिप और गाइडेंस के लिए उन्हें शुक्रिया अदा करते हैं, जो काफी मिस हो जाएगा ।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
9.4T MRI | Varian/Bruker | Varian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software | |
Air-Oxygen Mixer | Sechrist | Model 3500CP-G | |
Analysis of Functional NeuroImages (AFNI) | NIMH/NIH | Version AFNI_18.3.03 | Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/ |
Animal Cradle | RAPID Biomedical | LHRXGS-00563 | rat holder with bite bar, nose cone and ear bars |
Animal Physiology Monitoring & Gating System | SAII | Model 1025 | MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on |
Antisedan (atipamezole hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-867-7097 | Zoetis, Manufacturer Item #10000449 |
Ceramic MRI-Safe Scissors | MRIequip.com | MT-6003 | |
Clippers | Patterson Veterinary | 07-882-1032 | Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201 |
Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-893-1801 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10 |
Digital Rectal Thermometer Covers | Medline | MDS9608 | |
FMRIB Software Library | FMRIB | MELODIC Version 3.15 | Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki |
Heating Pad | Cara Inc. | Model 50 | |
Hemostat forceps, straight | Kent Scientific | INS750451-2 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06 |
Isoflurane Vaporizer | VetEquip Inc. | 911103 | |
Lab Tape, 3/4" | VWR International | 89097-990 | |
Needles, 23 gauge | BD | 305145 | plastic hub removed |
Parafilm Laboratory Film | Patterson Veterinary | 07-893-0260 | Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A |
Planar Surface Coil | Bruker | T12609 | 2cm |
Polyethylene Tubing | Braintree Scientific | PE50 50FT | 0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter) |
Puralube Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38 |
Sprague Dawley Rats | Charles River | 400 SAS SD | |
Sterile 0.9% Saline Solution | Patterson Veterinary | 07-892-4348 | Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186 |
Sterile Alcohol Prep Pads | Medline | MDS090735 | |
Surgical Tape, 1" (3M Durapore) | Medline | MMM15381Z | 3M Healthcare, "wide medical tape" |
Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore) | Medline | MMM15300 | 3M Healthcare |
Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needle | BD | 309626 | |
Syringes, 3 mL | BD | 309657 | |
Vented induction and scavenging system | VetEquip Inc. | 942102 | 2 liter induction chamber with active scavenging |
411724 | omega flowmeter | ||
931600 | scavenging cube, "vacuum" | ||
921616 | nose cone, non-rebreathing |
References
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