Summary
Este protocolo describe un método para obtener datos estables de resonancia magnética funcional en estado de reposo (rs-fMRI) de una rata que utiliza dosis bajas de isoflurano en combinación con dosis bajas de dexmedetomidina.
Abstract
La resonancia magnética funcional en estado de reposo (rs-fMRI) se ha convertido en un método cada vez más popular para estudiar la función cerebral en un estado de reposo, sin tareas. Este protocolo describe un método de supervivencia preclínica para obtener datos de rs-fMRI. La combinación de dosis bajas de isoflurano con la infusión continua del agonista del receptor adrenérgico α2 dexmedetomidina proporciona una opción sólida para la adquisición de datos estable y de alta calidad, al tiempo que preserva la función de la red cerebral. Además, este procedimiento permite la respiración espontánea y una fisiología casi normal en la rata. Se pueden combinar secuencias de imágenes adicionales con la adquisición de estado de reposo creando protocolos experimentales con estabilidad anestésica de hasta 5 h utilizando este método. Este protocolo describe la configuración del equipo, el monitoreo de la fisiología de la rata durante cuatro fases distintas de la anestesia, la adquisición de escaneos en estado de reposo, la evaluación de la calidad de los datos, la recuperación del animal y una breve discusión del análisis de datos posterior al procesamiento. Este protocolo se puede utilizar en una amplia variedad de modelos preclínicos de roedores para ayudar a revelar los cambios resultantes en la red cerebral que ocurren en reposo.
Introduction
La resonancia magnética funcional en estado de reposo (rs-fMRI) es una medida de la señal dependiente del nivel de oxígeno en la sangre (BOLD) cuando el cerebro está en reposo y no participa en ninguna tarea en particular. Estas señales se pueden utilizar para medir las correlaciones entre las regiones del cerebro para determinar la conectividad funcional dentro de las redes neuronales. rs-fMRI es ampliamente utilizado en estudios clínicos debido a su no invasividad y la baja cantidad de esfuerzo requerido de los pacientes (en comparación con la fMRI basada en tareas) por lo que es óptimo para diversas poblaciones de pacientes1.
Los avances tecnológicos han permitido adaptar la rs-fMRI para su uso en modelos de roedores para descubrir los mecanismos subyacentes a los estados de enfermedad (ver referencia2 para su revisión). Los modelos animales preclínicos, incluidos los modelos de enfermedad o knockout, permiten una amplia gama de manipulaciones experimentales no aplicables en humanos, y los estudios también pueden hacer uso de muestras post mortem para mejorar aún más los experimentos2. Sin embargo, debido a la dificultad tanto para limitar el movimiento como para mitigar el estrés, la adquisición de resonancia magnética en roedores se realiza tradicionalmente bajo anestesia. Los agentes anestésicos, dependiendo de su farmacocinética, farmacodinámica y objetivos moleculares, influyen en el flujo sanguíneo cerebral, el metabolismo cerebral y potencialmente afectan las vías de acoplamiento neurovascular.
Ha habido numerosos esfuerzos para desarrollar protocolos anestésicos que preserven el acoplamiento neurovascular y la función de la red cerebral3,4,5,6,7,8. Anteriormente informamos de un régimen anestésico que aplicaba una dosis baja de isoflurano junto con una dosis baja del agonista del receptor adrenérgico α2 dexmedetomidina9. Las ratas bajo este método de anestesia exhibieron respuestas BOLD robustas a la estimulación del bigote en regiones consistentes con las vías de proyección establecidas (núcleos talámicos ventrolaterales y ventromediales, corteza somatosensorial primaria y secundaria); Las redes cerebrales de estado de reposo a gran escala, incluida la red de modo predeterminado10,11 y la red de prominencia12 también se han detectado constantemente. Además, este protocolo anestésico permite repetir las imágenes en el mismo animal, lo que es importante para controlar la progresión de la enfermedad y el efecto de las manipulaciones experimentales longitudinalmente.
En el presente estudio, detallamos la configuración experimental, la preparación animal y los procedimientos de monitoreo fisiológico involucrados. En particular, describimos las fases anestésicas específicas y la adquisición de exploraciones durante cada fase. La calidad de los datos se evalúa después de cada exploración en estado de reposo. También se incluye en la discusión un breve resumen del análisis posterior a la exploración. Los laboratorios interesados en descubrir el potencial del uso de rs-fMRI en ratas encontrarán útil este protocolo.
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Protocol
Todos los experimentos se realizaron en un escáner de resonancia magnética de 9.4 T y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en Dartmouth College. Se obtuvo una aprobación adicional para grabar y mostrar los animales utilizados en el video y las figuras a continuación.
1. Preparativos antes del escaneo
- Línea de infusión subcutánea
- Retire parcialmente una aguja de 23 G de su paquete para que el punto de la aguja permanezca estéril.
- Sostenga de forma segura el cubo de la aguja y use una cuchilla de afeitar para marcar el eje de la aguja donde se encuentra con el cubo.
- Sujete un soporte de aguja alrededor del eje directamente debajo de la puntuación y rompa suavemente el eje del cubo.
- Inserte 1/3 del eje de la aguja (extremo romo) en la línea PE50 previamente esterilizada con suficiente longitud de línea para extenderse desde la bomba de medicamento hasta el animal dentro del orificio del imán.
- Dilución de dexmedetomidina y atipamezol
- Preparar una solución de clorhidrato de dexmedetomidina diluido utilizando 0,5 ml de caldo de 0,5 mg/ml mezclado con 9,5 ml de solución salina estéril en un frasco de vidrio transparente y estéril (concentración diluida = 0,025 mg/ml).
- Preparar una solución de atipmezol diluido utilizando 0,1 ml de caldo de 5 mg/ml mezclado con 9,9 ml de solución salina estéril en un frasco de vidrio transparente y estéril (concentración diluida = 0,05 mg/ml).
- Parámetros de escaneo
- Utilice los parámetros presentados en la Tabla 1 para preparar secuencias de escaneo.
2. Anestesia de fase 1: inducción y preparación animal
- Arreglo
- Asegúrese de que todo el equipo esté encendido y funcione correctamente, incluido el mezclador de oxígeno y aire, la almohadilla térmica y el sistema de eliminación activa (consulte la Figura 1).
- Ajuste el punto de ajuste de temperatura del sistema de calefacción a 37,5 °C.
- Inducción animal
- Coloque al animal (rata macho Sprague Dawley de 90 días de edad) en la cámara de inducción e induzca anestesia con isoflurano al 2,5% en aire enriquecido con oxígeno al 30%.
NOTA: Se puede utilizar una amplia gama de edades de animales y ambos sexos. - Una vez que el animal esté anestesiado, retírelo de la cámara, pese al animal y colóquelo en el cono de la nariz (al 2,5% de isoflurano) en la almohadilla térmica en el espacio de preparación.
- Coloque al animal (rata macho Sprague Dawley de 90 días de edad) en la cámara de inducción e induzca anestesia con isoflurano al 2,5% en aire enriquecido con oxígeno al 30%.
- Preparación animal
- Aplique ungüento lubricante oftálmico en cada ojo para evitar el secado.
- Confirme la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta de pellizco del dedo del dedo del dedo del día.
- Use clippers para afeitar un área cuadrada de 2 "por 2" en la región lumbar inferior de la espalda del animal (es decir, directamente sobre la cola).
- Administrar 0,015 mg/kg de la solución de dexmedetomidina con una inyección intraperitoneal (p.p.) (por ejemplo, una rata de 300 g recibiría 0,18 ml) en el cuadrante inferior derecho del abdomen utilizando una aguja de 25 G.
- Cambie el flujo de isoflurano desde el espacio de preparación a la cuna del animal.
- Mueva al animal a la cuna del animal. Coloque los dientes frontales de la rata de forma segura sobre y de la barra de mordida. Empuje el cono de la nariz sobre la nariz para asegurar un ajuste apretado.
NOTA: Si el cono de la nariz no cubre la mandíbula inferior, use una película de parafina para mantener suavemente la mandíbula cerrada mientras se sella alrededor del cono de la nariz. - Coloque la almohadilla respiratoria debajo del abdomen de la rata debajo de la caja torácica y vuelva a colocarla hasta que la forma de onda de la respiración muestre un canal profundo centrado en cada respiración (consulte la forma de onda de la respiración en la Figura 2).
- Monitoree la respiración del animal utilizando el software de monitoreo de fisiología. Pase a la siguiente fase de la anestesia cuando la respiración sea inferior a 40 respiraciones/min (lpm; aproximadamente 5 min después de la inyección de dexmedetomidina).
3. Anestesia de fase 2: configuración animal
- Inserte barras para los oídos en el canal auditivo para estabilizar la cabeza de la rata en la cuna del animal. Una vez colocado, tire hacia adelante de la barra de mordida y confirme que la cabeza no se mueva. Reajuste el cono de la nariz y la película de parafina según sea necesario (consulte la Figura 3a).
- Inserte la sonda de temperatura en una cubierta de sonda desechable prelubricado. Inserte suavemente la sonda de temperatura aproximadamente 1/2 "en el recto y péguela con cinta adhesiva a la base de la cola con cinta médica.
- Coloque el clip del oxímetro de pulso en el área metatarsiano del pie trasero, asegurándose de que la fuente de luz esté en la parte inferior del pie (palma).
NOTA: La rotación del clip puede afectar a la señal; por lo tanto, crear un soporte para mantener la pata y el clip en posición vertical conducirá a una mayor estabilidad. También tenga en cuenta que hasta que la rata esté a temperatura corporal normal, la saturación de oxígeno puede ser baja (<95%). - Utilice el peso de la rata para calcular la velocidad de perfusión para expulsar 0,015 mg/kg/h de dexmedetomidina (una rata de 300 g recibe 0,18 ml/h).
- Configure la bomba de medicamento para expulsar la velocidad de infusión calculada.
- Llene una jeringa de 3 ml con la solución estéril de dexmedetomidina diluida e inserte la punta de la aguja en el extremo abierto de la línea de infusión esterilizada (que se extiende desde la bomba del medicamento hasta la cuna del animal con la aguja subcutánea previamente conectada). Llene la línea y asegure la jeringa en el soporte de la jeringa de la bomba de medicamentos.
- Mueva el bloque de empuje hacia adelante hasta que toque el émbolo y el medicamento se expulse a la aguja, asegurando que la línea de infusión esté completamente llena.
- Con una toallita con alcohol, limpie el área afeitada para eliminar cualquier vello perdido.
- Pellizque la piel aproximadamente dos dedos de ancho por encima de la base de la cola. Inserte 1/3 de la aguja de la línea de infusión en la piel de la tienda.
- Asegure la aguja a la piel con un trozo de cinta médica ancha de 3". Coloque un segundo trozo de cinta médica ancha sobre el primero, a través de la rata, y unido a ambos lados de la cuna del animal (ver Figura 4).
NOTA: Es de vital importancia que la aguja ferromagnética esté bien asegurada para evitar el movimiento durante la exploración. - Comience la infusión de dexmedetomidina subcutánea.
- Coloque un trozo de gasa en el puente de la nariz de la rata para crear una superficie nivelada para la bobina. Use cinta de papel, que no interfiera con la señal de resonancia magnética, para asegurar la bobina a la cabeza de la rata, centrándola sobre el cerebro (ver Figura 3b,c).
- Asegure todas las líneas y cables dentro de la cuna del animal con cinta de laboratorio y verifique si todas las señales de fisiología son estables (ver Figura 2).
- Coloque toallas de papel sobre el animal, asegurándolas a la cuna del animal con cinta de laboratorio. Si usa un sistema de calentamiento de aire, envuelva una lámina de plástico alrededor de toda la cuna para contener el aire caliente.
- Mueva al animal hacia el orificio y ajuste el imán.
4. Anestesia de fase 3: adquisición de exploración anatómica
- Reducir el isoflurano al 1,5%, lo que resulta en un aumento constante de la respiración a aproximadamente 45-50 lpm. Permanecer en este nivel durante la duración de la exploración anatómica.
- Utilice el escáner localizador FLASH para asegurarse de que el cerebro está alineado con el isocentro magnético(Figura 5a). Reposicione al animal y repita si es necesario.
- Ejecute el escaneo del localizador RARE de mayor resolución y use esta salida de escaneo para alinear 15 cortes sagitales centrados en todo el cerebro (de izquierda a derecha, Figura 5b).
- Usando la rebanada sagital media, alinee la rebanada axial central con la decusación de la comisura anterior, que aparece como una mancha oscura (Figura 5c). Anote el desplazamiento de división que se utilizará más adelante en los análisis de estado de reposo.
- Adquiera 23 cortes utilizando los protocolos axiales FLASH y RARE para ayudar en el registro en un espacio común durante el análisis posterior al escaneo.
- Shim a través de todo el cerebro usando la secuencia PRESS.
5. Fase 4: Adquisición de escaneo de estado en reposo
- Después de completar las exploraciones anatómicas, reduzca el isoflurano a 0.5% a 0.75%, ajustando para que la respiración del animal sea de 60-65 respiraciones por minuto. Permanezca en este nivel durante al menos 10 minutos antes de comenzar el escaneo en estado de reposo para garantizar la estabilidad.
- Cuando la fisiología es estable (el rango de respiración es de 60-75 lpm sin jadeos ni irregularidades, la temperatura corporal central es de 37.5 ± 1.0 ° C y la saturación de oxígeno es del 95% o más), adquiera una exploración EPI de 15 cortes utilizando el mismo desplazamiento de corte que la serie axial anatómica.
- Una vez completado cada análisis en estado de reposo, compruebe la calidad mediante un análisis de componentes independiente (ICA) para descomponer los datos en componentes espaciales y temporales.
- Obtenga al menos tres exploraciones de estado de reposo de alta calidad.
6. Recuperación posterior al escaneo
- Cuando se complete la exploración, aumente el isoflurano al 2% y detenga la infusión subcutánea de dexmedetomidina.
- Retire la cuna del animal del orificio del imán, desenvuelva al animal y retire las barras para los oídos, la sonda de temperatura, el clip del oxímetro de pulso y la aguja de dexmedetomidina.
- Inyecte 0,015 mg/kg de la solución diluida de atipmozol en el músculo de la pata trasera de la rata utilizando una jeringa de 1 ml con una aguja de 25 G (es decir, una rata de 300 g recibiría 0,09 ml).
- Coloque a la rata de nuevo en la jaula de la casa encima de una almohadilla térmica y monitoree hasta que el animal sea ambulatorio.
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Representative Results
Después de cada análisis de estado de reposo, la estabilidad se evalúa mediante un análisis de componentes independiente (ICA; script de ejemplo incluido en Archivos suplementarios). La figura 6 muestra ejemplos de salidas de componentes de análisis de estado de reposo. La figura 6a muestra un componente de señal de un escaneo con alta estabilidad. Tenga en cuenta que espacialmente, el componente tiene una alta regionalidad. Dentro del curso de tiempo por debajo del componente espacial, la señal es estable y no predecible, indicativa de la verdadera actividad cerebral. El espectro de potencia en la parte inferior muestra predominantemente frecuencias bajas. La Figura 6b muestra un componente del mismo escaneo que la Figura 6a que representa el ruido. Tenga en cuenta la no regionalidad en el componente espacial, el curso de tiempo de alta frecuencia y el pico de alta frecuencia en el espectro de potencia. Finalmente, la Figura 6c muestra un componente de una exploración con anestesia inestable. El curso del tiempo es variable e irregular. Cuando esto ocurre, se necesitan mejoras en el protocolo anestésico, comúnmente en el sellado del cono de la nariz y la eliminación de gases residuales.
Figura 1: Espacio de preparación y cuna de animales de resonancia magnética. a) Espacio de preparación. El vacío elimina los gases residuales tanto de la cámara de inducción como del cono de la nariz en la cuna del animal. La almohadilla térmica ayuda a mantener la temperatura del animal tanto durante la Fase 1 como durante la recuperación. b) Resonancia magnética de cuna animal. La parte superior indica los componentes de la configuración animal en la Fase 2. La parte inferior muestra una rata completamente configurada y lista para escanear. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Salida de escaneo fisiológico. La saturación de oxígeno (PulseOx, 96%), la frecuencia cardíaca (325 BPM [latidos por minuto]), la frecuencia respiratoria (61 respiraciones / min) y la temperatura corporal central (T1, 37.5 ° C) se monitorean constantemente durante toda la sesión de escaneo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Colocación del cono de la nariz y la bobina. (a ) Vista de cerca del cono de la nariz sellado alrededor de la nariz y la mandíbula inferior del animal. (b)Vista aérea de la alineación de la bobina de la superficie con el cerebro. c)Vista lateral de la alineación de la bobina con el punto medio del ojo del animal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Línea de infusión de dexmedetomidina subcutánea y colocación de la aguja. (a) Inserción de la aguja en la región lumbar inferior de la espalda del animal. b)Cinta adhesiva que sujeta la aguja a la piel del animal. c)Cinta adhesiva a través de la cuna del animal para evitar el movimiento de la aguja ferromagnética. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Alineación de escaneo anatómico. (a ) Escaneo localizador para alinear el cerebro del animal con el isocentro magnético, observado con puntos de mira. (b)Cortes sagitales alineados a través del cerebro de izquierda a derecha. c)Alineación a la decusación de la comisura anterior, indicada por la flecha blanca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Evaluación de la calidad mediante análisis de componentes independientes. (a ) Componente de señal durante la anestesia constante. b)Componente de ruido durante la anestesia constante. c)Anestesia inestable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Escanear | Secuencia | Orientación | FOV (mm x mm) | Matriz | Rebanadas | Grosor de la rebanada (mm) | TE (ms) | TR (ms) | Promedios | Espaciado de eco (ms) | Factor raro | Repeticiones | Tiempo de escaneo |
| Localizador | FLASH | Todos los aviones | 50 | 256 | 1/dir | 1 | 2.5 | 100 | 1 | 1 | 12,8 s | ||
| Localizador | RARO | Todos los aviones | 35 | 192 | 1/dir | 0.75 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 min |
| Anat | RARO | Sagital | 35 | 192 | 15 | 1 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 min |
| Anat | FLASH | Axial | 35 | 192 | 23 | 1 | 5 | 250 | 2 | 1 | 1 min 36 s | ||
| Anat | RARO | Axial | 35 | 192 | 23 | 1 | 28 | 2500 | 4 | 7 | 8 | 1 | 4 minutos |
| Calza | PRENSA | Todos los aviones | 16.223 | 2500 | 1 | 1 | 2,5 s | ||||||
| Estado de reposo | EPI | Axial | 35 | 64 | 15 | 1 | 15 | 1200 | 1 | 300 | 6 min cada uno |
Tabla 1: Tabla de referencia de parámetros de escaneo. Parámetros para las secuencias descritas en el protocolo. FLASH = Disparo rápido de ángulo bajo, RARE = Adquisición rápida con mejora de relajación, PRESS = Espectroscopia reresuelta de punto, EPI = Imagen plana de eco.
Expedientes complementarios: Script de ejemplo para la evaluación de la calidad de ICA. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
La estabilidad del animal, tanto física como fisiológicamente, es clave para obtener datos de estado de reposo de alta calidad. Este protocolo logra la estabilidad al pasar por cuatro fases distintas de la anestesia. Es imperativo que el animal haya alcanzado los umbrales fisiológicos establecidos antes de pasar a la siguiente fase de la anestesia; dado que este método se basa en mecanismos fisiológicos de autorregulación, los animales individuales pueden requerir cantidades de tiempo ligeramente diferentes en cada fase de la anestesia. Es nuestra experiencia que tomar más tiempo en cada fase es más eficiente que apresurarse a través de etapas anteriores sin dar a la fisiología de la rata el tiempo suficiente para asentarse. Los componentes clave que permiten la estabilidad son el ajuste del cono de la nariz y la eliminación adecuada de gases residuales.
Un cono nasal debidamente sellado y la recolección permiten que el animal permanezca estable con respiración regularmente espaciada y niveles constantes de saturación de oxígeno. Si se produce jadeo, espaciamiento irregular, contención de la respiración o disminución de los niveles de saturación de oxígeno, se debe trabajar para mejorar el sellado y la eliminación del cono de la nariz. El cono de la nariz debe ajustarse bien, pero no debe empujar hacia el puente de la nariz. Es posible que sea necesario fabricar un cono nasal personalizado. El cono nasal original de nuestro fabricante tenía una válvula de salida de aire que era demasiado pequeña, por lo que se equipó un tubo de halcón con una línea de vacío sellada más grande más cerca del animal. Esto resultó en un mejor aclaramiento del CO2 expirado y una saturación constante de oxígeno. Como se mencionó en el protocolo, la película de parafina puede envolverse alrededor de la mandíbula inferior y el borde del cono de la nariz, pero si se envuelve demasiado, puede restringir la respiración y provocar inestabilidad. Además, la colocación inadecuada de las barras para los oídos y la barra de mordida no solo afecta la estabilidad necesaria de la cabeza para la obtención de imágenes, sino que también puede afectar la respiración; El parpadeo continuo o el ruido audible del animal es una indicación probable de la colocación inadecuada de la barra del oído. Los dientes frontales deben sentarse de forma segura en la barra de mordida y tirar hacia adelante después de la colocación de la barra de la oreja para garantizar un ajuste ajustado. La lengua de la rata puede necesitar ser tirada hacia adelante si se sienta demasiado atrás en la boca y restringe la respiración adecuada.
Como cada sistema es único, se requiere ajustar el nivel de vacío para lograr una eliminación óptima. Como guía práctica, debe ser posible sentir una pequeña cantidad de succión, ya sea colocando un dedo sobre la abertura de la línea de vacío dentro del cono de la nariz o sellando toda la abertura del cono de la nariz con la palma de la mano. Igualar el caudal para la entrada de anestesia (aquí se utilizó 0,8 L/min) es un buen punto de partida. La saturación de oxígeno en el animal debe permanecer por encima del 95% durante toda la exploración. Si la saturación de oxígeno muestra una tendencia decreciente, esto puede ser una indicación de que el CO2 se está acumulando en el cono de la nariz y es necesario aumentar la eliminación. Otra posibilidad es que la presión del clip del oxímetro de pulso en el pie deba ajustarse, ya sea aflojada para mejorar el flujo sanguíneo o apretada para garantizar una señal fuerte y estable. Si la respiración del animal es más alta que los umbrales descritos, esto puede indicar que la recolección de basura se establece demasiado alta y está eliminando demasiado isoflurano. En raras circunstancias, puede ser necesario aumentar la dosis de dexmedetomidina subcutánea a 0,02 mg/kg/h, pero hemos encontrado que 0,015 mg/kg ha funcionado bien en una amplia gama de edades de ratas y ambos sexos, y está respaldado en estudios farmacológicos4.
La duración del escaneo necesaria para la activación de fMRI es una función del tamaño del efecto, la relación señal espacial-ruido (SNR) y el SNR temporal, como se mostró anteriormente por Murphy et al.13. El uso de una bobina de superficie pequeña (2 cm) y un alto campo magnético (9,4 T) mejora sustancialmente la sensibilidad SNR y BOLD. Con nuestra configuración de imágenes, hemos encontrado que un solo escaneo de 6 minutos es suficiente para detectar una red de conectividad funcional robusta en estado de reposo, de acuerdo con nuestro informe anterior10. Sin embargo, normalmente repetimos la exploración de 3 a 4 veces, y promediamos los resultados para derivar redes cerebrales funcionales para animales individuales. Alternativamente, se puede escanear una sola vez con una duración más larga (10 minutos o más) para derivar redes de conectividad funcional14.
Después de recopilar rs-fMRI de alta calidad utilizando este protocolo, preprocesar los datos como se ha publicado anteriormente15,16. Con el uso de barras para los oídos y una barra de mordida, los artefactos de movimiento en el curso de tiempo de fMRI son mínimos, y el uso de la corrección de movimiento no ha tenido un efecto notable en nuestros datos. Las exploraciones EPI individuales en estado de reposo deben ser despojadas del cráneo y registradas en un espacio común (usamos un solo cerebro de rata representativo)16,17. Elimine los volúmenes iniciales de cada EPI para que todos los incluidos se adquieran cuando el imán esté en estado estacionario (eliminamos 5 puntos de tiempo). Elimina el ruido de los escaneos individuales (consulte Resultados representativos para ver ejemplos de componentes de señal y ruido). Aplique corrección de tiempo de corte, así como eliminación de tendencia lineal y cuadrática, filtrado de paso de banda (0.005-0.1 Hz) y suavizado espacial (0.6 mm FWHM [ancho completo a la mitad máximo]). Además, elimine el curso promedio del tiempo de señal de la materia blanca y los ventrículos a través de la regresión lineal. Después de estos pasos de preprocesamiento estándar, se pueden realizar análisis adicionales a nivel degrupo,incluida la conectividad funcional basadaen semillas11,15,18, 19,20, 21,22,análisis de componentes independientes10,20, 22y análisis de modularidad12,19.
Hay dos ventajas principales del protocolo actual: 1) permite la actividad cerebral espontánea; y 2) mantiene al animal en una fisiología casi normal. También se han utilizado métodos anestésicos alternativos (como propofol21, α-cloralosa15y bromuro de pancuronio en combinación con otro anestésico21,23) para adquirir datos en estado de reposo. Sin embargo, se ha demostrado que el uso de una combinación de dosis bajas de isoflurano con dosis bajas de dexmedetomidina, como se describe en este protocolo, solo interrumpe mínimamente las funciones de la red cerebral al tiempo que proporciona la estabilidad fisiológica necesaria para obtener datos de conectividad funcional de calidad en estado de reposo9,10,18,24. Además, las respuestas BOLD de la estimulación somatosensorial9 y la desviación mecánica del bigotes11 se pueden ver en o después de un período de 90 min cuando se utiliza este protocolo, lo que sugiere un nivel de excitación consistente. Curiosamente, el uso de dexmedetomidina de forma aislada puede provocar actividad epiléptica; sin embargo, esta actividad fue abolida con isoflurano suplementado8. Otra ventaja del protocolo actual es que elimina la necesidad de ventilación artificial. Aunque la ventilación mecánica puede conducir a un rango más estrecho de saturación parcial de dióxido de carbono y oxígeno en los animales, en estudios longitudinales, mantener los parámetros fisiológicos sin necesidad de intubación puede resultar en menos complicaciones y efectos secundarios no deseados.
El interés en la resonancia magnética funcional en estado de reposo ha crecido considerablemente en los últimos 10 años, y con ello la necesidad de adquirir exploraciones preclínicas de alta calidad en estado de reposo de roedores. Este protocolo de supervivencia logra una anestesia estable hasta 5 h con una fisiología casi normal durante la adquisición del estado de reposo. Como el protocolo es altamente estable, se pueden agregar fácilmente secuencias adicionales (estructurales, de estimulación, resonancia magnética farmacológica, etc.) para lograr el diseño experimental deseado. La combinación de dosis bajas de isoflurano con dexmedetomidina utilizada en este protocolo permite una amplia variedad de estudios preclínicos para investigadores interesados en estudiar el cerebro de roedores en su estado de reposo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos del Instituto Nacional de Salud (NIH) del Instituto Nacional de Salud (NIH) [DJW, EDKS y EMB fueron apoyados por la Subvención R21DA044501 otorgada a Alan I. Green y DJW fue apoyada por la Subvención T32DA037202 a Alan J. Budney] y el Instituto Nacional sobre el Abuso del Alcohol y el Alcoholismo (NIAAA) [Subvención F31AA028413 a Emily D. K. Sullivan]. Se proporcionó apoyo adicional a través del fondo dotado de Alan I. Green como Profesor Raymond Sobel de Psiquiatría en Dartmouth.
Hanbing Lu cuenta con el apoyo del Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas, NIH.
Los autores desean reconocer y agradecer al difunto Alan I. Green. Su dedicación inquebrantable al campo de los trastornos concurrentes ayudó a establecer la colaboración entre los autores. Le agradecemos su tutoría y orientación, que se echará mucho de menos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9.4T MRI | Varian/Bruker | Varian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software | |
| Air-Oxygen Mixer | Sechrist | Model 3500CP-G | |
| Analysis of Functional NeuroImages (AFNI) | NIMH/NIH | Version AFNI_18.3.03 | Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/ |
| Animal Cradle | RAPID Biomedical | LHRXGS-00563 | rat holder with bite bar, nose cone and ear bars |
| Animal Physiology Monitoring & Gating System | SAII | Model 1025 | MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on |
| Antisedan (atipamezole hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-867-7097 | Zoetis, Manufacturer Item #10000449 |
| Ceramic MRI-Safe Scissors | MRIequip.com | MT-6003 | |
| Clippers | Patterson Veterinary | 07-882-1032 | Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201 |
| Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-893-1801 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10 |
| Digital Rectal Thermometer Covers | Medline | MDS9608 | |
| FMRIB Software Library | FMRIB | MELODIC Version 3.15 | Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki |
| Heating Pad | Cara Inc. | Model 50 | |
| Hemostat forceps, straight | Kent Scientific | INS750451-2 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06 |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip Inc. | 911103 | |
| Lab Tape, 3/4" | VWR International | 89097-990 | |
| Needles, 23 gauge | BD | 305145 | plastic hub removed |
| Parafilm Laboratory Film | Patterson Veterinary | 07-893-0260 | Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A |
| Planar Surface Coil | Bruker | T12609 | 2cm |
| Polyethylene Tubing | Braintree Scientific | PE50 50FT | 0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter) |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38 |
| Sprague Dawley Rats | Charles River | 400 SAS SD | |
| Sterile 0.9% Saline Solution | Patterson Veterinary | 07-892-4348 | Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186 |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Medline | MDS090735 | |
| Surgical Tape, 1" (3M Durapore) | Medline | MMM15381Z | 3M Healthcare, "wide medical tape" |
| Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore) | Medline | MMM15300 | 3M Healthcare |
| Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needle | BD | 309626 | |
| Syringes, 3 mL | BD | 309657 | |
| Vented induction and scavenging system | VetEquip Inc. | 942102 | 2 liter induction chamber with active scavenging |
| 411724 | omega flowmeter | ||
| 931600 | scavenging cube, "vacuum" | ||
| 921616 | nose cone, non-rebreathing |
References
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