Summary
Este protocolo descreve um método para obter dados de ressonância magnética funcional de estado de repouso estável (rs-fMRI) de um rato usando isoflurane de baixa dose em combinação com dexmedetomidina de baixa dose.
Abstract
A ressonância magnética funcional de estado de repouso (rs-fMRI) tornou-se um método cada vez mais popular para estudar a função cerebral em um estado de repouso, sem tarefa. Este protocolo descreve um método de sobrevivência pré-clínico para a obtenção de dados rs-fMRI. A combinação de isoflurano de baixa dose com infusão contínua do α2 agonizantes agonistas receptores adrenérgicos proporcionam uma opção robusta para aquisição de dados estáveis e de alta qualidade, preservando a função da rede cerebral. Além disso, este procedimento permite a respiração espontânea e fisiologia quase normal no rato. Sequências adicionais de imagem podem ser combinadas com a aquisição de estado de repouso criando protocolos experimentais com estabilidade anestésica de até 5 h usando este método. Este protocolo descreve a instalação de equipamentos, o monitoramento da fisiologia de ratos durante quatro fases distintas da anestesia, aquisição de escaneamentos de estado de repouso, avaliação da qualidade dos dados, recuperação do animal e uma breve discussão sobre análise de dados pós-processamento. Este protocolo pode ser usado em uma grande variedade de modelos de roedores pré-clínicos para ajudar a revelar as mudanças resultantes da rede cerebral que ocorrem em repouso.
Introduction
A ressonância magnética funcional de estado de repouso (rs-fMRI) é uma medida do sinal dependente do nível de oxigênio do sangue (BOLD) quando o cérebro está em repouso e não está envolvido em nenhuma tarefa particular. Esses sinais podem ser usados para medir correlações entre regiões cerebrais para determinar a conectividade funcional dentro de redes neurais. rs-fMRI é amplamente utilizado em estudos clínicos devido à sua não invasiva e à baixa quantidade de esforço necessário aos pacientes (em comparação com a ressonância magnética baseada em tarefas) tornando-o ótimo para diversas populações de pacientes1.
Os avanços tecnológicos permitiram que o RS-FMRI fosse adaptado para uso em modelos de roedores para descobrir mecanismos subjacentes aos estados da doença (ver referência2 para revisão). Modelos de animais pré-clínicos, incluindo modelos de doenças ou nocautes, permitem uma ampla gama de manipulações experimentais não aplicáveis em humanos, e estudos também podem fazer uso de amostras post-mortem para melhorar ainda mais os experimentos2. No entanto, devido à dificuldade em limitar o movimento e mitigar o estresse, a aquisição de RM em roedores é tradicionalmente realizada sob anestesia. Agentes anestésicos, dependendo de sua farmacocinética, farmacodinâmica e alvos moleculares, influenciam o fluxo sanguíneo cerebral, o metabolismo cerebral e potencialmente afetam caminhos de acoplamento neurovascular.
Houve inúmeros esforços para desenvolver protocolos anestésicos que preservam o acoplamento neurovascular e a função da rede cerebral3,4,5,6,7,8. Relatamos anteriormente um regime anestésico que aplicava uma dose baixa de isoflurano, juntamente com uma dose baixa do α2 receptor adrenérgico agonista dexmedetomidina9. Os ratos sob este método de anestesia apresentaram respostas ousadas robustas à estimulação de whisker em regiões consistentes com vias de projeção estabelecidas (núcleos talâmicos ventrolateral e ventromedial, córtex somatossensorial primário e secundário); Redes cerebrais de estado de repouso em larga escala, incluindo a rede de modo padrão10,11 e a rede de saliência12 também foram detectadas consistentemente. Além disso, este protocolo anestésico permite imagens repetidas no mesmo animal, o que é importante para monitorar a progressão da doença e o efeito de manipulações experimentais longitudinalmente.
No presente estudo, detalhamos os procedimentos experimentais de configuração, preparação animal e monitoramento fisiológico envolvidos. Em particular, descrevemos as fases anestésicas específicas e a aquisição de exames durante cada fase. A qualidade dos dados é avaliada após cada varredura de estado de repouso. Um breve resumo da análise pós-digitalização também está incluído na discussão. Laboratórios interessados em descobrir o potencial de uso de rs-fMRI em ratos acharão este protocolo útil.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados em um scanner de ressonância magnética 9.4 T, e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Dartmouth College. Foi obtida aprovação adicional para registrar e mostrar os animais utilizados no vídeo e figuras abaixo.
1. Preparações antes da digitalização
- Linha de infusão subcutânea
- Remova parcialmente uma agulha de 23 G de seu pacote para que o ponto da agulha permaneça estéril.
- Segure firmemente o cubo da agulha e use uma lâmina de barbear para marcar o eixo da agulha onde ele encontra o cubo.
- Aperte um suporte de agulha ao redor do eixo diretamente abaixo da pontuação e quebre suavemente o eixo do cubo.
- Insira 1/3 do eixo da agulha (extremidade cega) na linha PE50 previamente esterilizada com comprimento de linha suficiente para estender da bomba de drogas até o animal dentro do furo do ímã.
- Diluição de dexmedetomidina e atipamezole
- Prepare uma solução de cloridrato de dexmedetomidina diluído utilizando 0,5 mL de caldo de 0,5 mg/mL misturado com 9,5 mL de soro fisiológico estéril em uma garrafa de vidro clara e estéril (concentração diluída = 0,025 mg/mL).
- Prepare uma solução de atipamezole diluído utilizando 0,1 mL de estoque de 5 mg/mL misturado com 9,9 mL de soro fisiológico estéril em uma garrafa de vidro clara e estéril (concentração diluída = 0,05 mg/mL).
- Parâmetros de digitalização
- Use os parâmetros apresentados na Tabela 1 para preparar sequências de varredura.
2. Anestesia da Fase 1: Indução e preparação animal
- Configuração
- Certifique-se de que todos os equipamentos estão ligados e funcionando corretamente, incluindo a batedeira de oxigênio e ar, almofada de aquecimento e sistema de limpeza ativo (ver Figura 1).
- Defina o ponto de temperatura do sistema de aquecimento para 37,5 °C.
- Indução animal
- Coloque o animal (rato Sprague Dawley, de 90 dias de idade) na câmara de indução e induza a anestesia com 2,5% de isoflurane em ar enriquecido com oxigênio.
NOTA: Uma ampla gama de idades dos animais e ambos os sexos podem ser usados. - Uma vez que o animal é anestesiado, remova-o da câmara, pese o animal e coloque-o no cone do nariz (a 2,5% isoflurane) na almofada de aquecimento no espaço de preparação.
- Coloque o animal (rato Sprague Dawley, de 90 dias de idade) na câmara de indução e induza a anestesia com 2,5% de isoflurane em ar enriquecido com oxigênio.
- Preparação animal
- Aplique pomada lubrificante oftálmica em cada olho para evitar a secagem.
- Confirme a profundidade da anestesia por falta de resposta ao dedo do dedo do dedo.
- Use cortadores para raspar uma área quadrada de 2" por 2" na região lombar inferior das costas do animal (ou seja, diretamente acima da cauda).
- Administre 0,015 mg/kg da solução dexmedetomidina com uma injeção intraperitoneal (i.p.) (por exemplo, um rato de 300 g receberia 0,18 mL) no quadrante inferior direito do abdômen usando uma agulha de 25 G.
- Troque o fluxo isoflurane do espaço de preparação para o berço animal.
- Mova o animal para o berço animal. Coloque os dentes da frente do rato firmemente sobre e dentro da barra de mordida. Empurre o cone do nariz sobre o nariz para garantir um ajuste apertado.
NOTA: Se o cone do nariz não cobrir a mandíbula inferior, use um filme de parafina para segurar suavemente a mandíbula fechada enquanto também sela ao redor do cone do nariz. - Posicione a almofada de respiração sob o abdômen do rato abaixo da caixa torácica e reforme-a até que a forma de onda de respiração mostre um cocho profundo centrado em cada respiração (veja a forma de onda de respiração na Figura 2).
- Monitore a respiração do animal usando o software de monitoramento da fisiologia. Mova-se para a próxima fase da anestesia quando a respiração for inferior a 40 respirações/min (bpm; aproximadamente 5 min após a injeção de dexmedetomidina).
3. Anestesia da Fase 2: Configuração animal
- Insira barras de ouvido no canal auditivo para estabilizar a cabeça do rato no berço animal. Uma vez posicionado, puxe para a frente na barra de mordida e confirme que a cabeça não se move. Reajustar o cone do nariz e o filme de parafina conforme necessário (ver Figura 3a).
- Insira a sonda de temperatura em uma tampa de sonda pré-lubrificada e descartável. Insira suavemente a sonda de temperatura aproximadamente 1/2" no reto e grave-a na base da cauda com fita médica.
- Coloque o clipe do oxímetro de pulso sobre a área metatarsal do pé traseiro, garantindo que a fonte de luz esteja na parte inferior do pé (palma).
NOTA: A rotação do clipe pode afetar o sinal; assim, criar um suporte para manter a pata e o clipe ereto levará a uma maior estabilidade. Observe também que até que o rato esteja em temperatura normal do corpo, a saturação de oxigênio pode ser baixa (<95%). - Use o peso do rato para calcular a taxa de infusão para ejetar 0,015 mg/kg/h de dexmedetomidina (um rato de 300 g recebe 0,18 mL/h).
- Defina a bomba de droga para ejetar a taxa de infusão calculada.
- Encha uma seringa de 3 mL com a solução de dexmedetomidina estéril diluída e insira a ponta da agulha na extremidade aberta da linha de infusão esterilizada (estendendo-se da bomba de drogas até o berço animal com a agulha subcutânea previamente anexada). Encha a linha e proteja a seringa no porta-ar seringa da bomba de drogas.
- Mova o bloco de empurrador para a frente até tocar o êmbolo, e a droga é expelida na agulha, garantindo que a linha de infusão esteja completamente preenchida.
- Usando uma limpeza de álcool, limpe a área raspada para remover qualquer cabelo perdido.
- Aperte a pele aproximadamente duas larguras de dedos acima da base da cauda. Insira 1/3 da agulha da linha de infusão na pele de tenda.
- Segure a agulha na pele com um pedaço de fita médica de 3". Coloque um segundo pedaço de fita médica larga sobre o primeiro, através do rato, e anexado a ambos os lados do berço animal (ver Figura 4).
NOTA: É extremamente importante que a agulha ferromagnética esteja bem presa para evitar o movimento durante a varredura. - Comece a infusão de dexmedetomidina subcutânea.
- Coloque um pedaço de gaze na ponte do nariz do rato para criar uma superfície nivelada para a bobina. Use fita de papel, que não interfere com o sinal de ressonância magnética, para fixar a bobina na cabeça do rato, centralizando-a sobre o cérebro (ver Figura 3b,c).
- Fixar todas as linhas e cabos dentro do berço animal com fita de laboratório e verificar se todos os sinais de fisiologia estão estáveis (ver Figura 2).
- Coloque toalhas de papel sobre o animal, prendendo-as ao berço animal com fita de laboratório. Se usar um sistema de aquecimento de ar, enrole uma folha de plástico em torno de todo o berço para conter o ar quente.
- Mova o animal para dentro do furo e sintonize o ímã.
4. Fase 3 anestesia: Aquisição de varredura anatômica
- Reduza o isoflurane para 1,5%, resultando em um aumento constante da respiração para aproximadamente 45-50 bpm. Permaneça neste nível durante a duração da varredura anatômica.
- Use a varredura do localizador FLASH para garantir que o cérebro esteja alinhado com o isocentro do ímã(Figura 5a). Reposicione o animal e repita se necessário.
- Execute a varredura de localizador RARE de maior resolução e use esta saída de varredura para alinhar 15 fatias sagiais centradas em todo o cérebro (da esquerda para a direita, Figura 5b).
- Usando a fatia sagital média, alinhe a fatia axial central à descussação da comissure anterior, que aparece como uma mancha escura(Figura 5c). Observe o deslocamento da fatia para usar mais tarde nas varreduras de estado de repouso.
- Adquira 23 fatias usando os protocolos axiais FLASH e RARE para auxiliar no registro em um espaço comum durante a análise pós-digitalização.
- Shim por todo o cérebro usando a sequência press.
5. Fase 4: Aquisição de varredura de estado de repouso
- Após a conclusão dos exames anatômicos, reduza o isoflurane para 0,5% a 0,75%, ajustando-se para que a respiração do animal seja de 60-65 respirações por minuto. Permaneça neste nível por pelo menos 10 minutos antes de iniciar a varredura de estado de repouso para garantir a estabilidade.
- Quando a fisiologia é estável (a faixa de respiração é de 60-75 bpm sem ofegante ou irregularidades, a temperatura corporal do núcleo é de 37,5 ± 1,0 °C, e a saturação de oxigênio é de 95% ou mais), adquira uma varredura EPI de 15 fatias usando a mesma fatia compensada da série axial anatômica.
- Após cada varredura de estado de repouso ser concluída, verifique a qualidade usando uma análise de componentes independente (ICA) para decompor os dados em componentes espaciais e temporais.
- Obtenha pelo menos três exames de estado de repouso de alta qualidade.
6. Recuperação pós-digitalização
- Quando a varredura estiver completa, aumente o isoflurane para 2% e pare a infusão dexmedetomidina subcutânea.
- Remova o berço animal do ímã, desembrulhe o animal e remova as barras de ouvido, a sonda de temperatura, o clipe do oxímetro de pulso e a agulha dexmedetomidina.
- Injete 0,015 mg/kg da solução de atipamezole diluída no músculo da perna traseira do rato usando uma seringa de 1 mL com uma agulha de 25 G (ou seja, um rato de 300 g receberia 0,09 mL).
- Coloque o rato de volta na gaiola em cima de uma almofada de aquecimento e monitore até que o animal esteja ambulatorial.
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Representative Results
Após cada varredura de estado de repouso, a estabilidade é avaliada por meio de uma análise de componentes independente (ICA; script de exemplo incluído em Arquivos Suplementares). A Figura 6 mostra exemplos de saídas de componentes de escaneamentos de estado de repouso. A Figura 6a mostra um componente de sinal de uma varredura com alta estabilidade. Note que espacialmente, o componente tem alta regionalidade. Dentro do curso de tempo abaixo do componente espacial, o sinal é estável e não previsível, indicativo da verdadeira atividade cerebral. O espectro de energia na parte inferior mostra frequências predominantemente baixas. A Figura 6b mostra um componente da mesma varredura da Figura 6a que representa o ruído. Observe a não regionalidade no componente espacial, curso de tempo de alta frequência e pico de alta frequência no espectro de energia. Finalmente, a Figura 6c mostra um componente de uma varredura com anestesia instável. O curso de tempo é variável e irregular. Quando isso ocorre, são necessárias melhorias no protocolo anestésico, comumente para a vedação do cone do nariz e a limpeza de gases residuais.
Figura 1: Espaço de preparação e berço animal de ressonância magnética. a) Espaço de preparação. O vácuo retira gases residuais tanto da câmara de indução quanto do cone do nariz no berço animal. A almofada de aquecimento ajuda a manter a temperatura animal durante a Fase 1 e a recuperação. b) Berço animal de ressonância magnética. A parte superior indica componentes da configuração animal na Fase 2. A parte inferior mostra um rato totalmente configurado e pronto para a varredura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Saída de varredura fisiológica. Saturação de oxigênio (PulseOx, 96%), frequência cardíaca (325 BPM [batidas por minuto]), taxa de respiração (61 respirações/min) e temperatura corporal do núcleo (T1, 37,5 °C) são constantemente monitoradas durante toda a sessão de varredura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cone de nariz e colocação da bobina. (a) Vista de perto do cone do nariz selado ao redor do nariz do animal e mandíbula inferior. bVisão aérea do alinhamento da bobina superficial ao cérebro. (c) Visão lateral do alinhamento da bobina com o ponto médio do olho do animal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Linha de infusão dexmedetomidina subcutânea e colocação da agulha. (a) Inserção da agulha na região lombar inferior das costas do animal. (b) Fita que prende a agulha na pele do animal. cFita no berço animal para evitar o movimento da agulha ferromagnética. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Alinhamento anatômico da varredura. (a) Escaneamento localizador para alinhar o cérebro do animal ao isocentro do ímã, notado com mira. (b) Fatias sagidas alinhadas através do cérebro da esquerda para a direita. (c) Alinhamento à descussação da comissura anterior, indicada pela seta branca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Avaliação de qualidade utilizando análise de componentes independentes. (a) Componente de sinal durante anestesia constante. (b) Componente de ruído durante a anestesia constante. (c) Anestesia instável. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Varredura | Seqüenciar | Orientação | FOV (mm x mm) | Matriz | Fatias | Espessura da fatia (mm) | TE (ms) | TR (ms) | Médias | Espaçamento de Eco (ms) | Fator Raro | Repetições | Tempo de varredura |
| Localizer | LAMPEJO | Todos os aviões | 50 | 256 | 1/dir | 1 | 2.5 | 100 | 1 | 1 | 12,8 s | ||
| Localizer | RARO | Todos os aviões | 35 | 192 | 1/dir | 0.75 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 min |
| Anat | RARO | Sagital | 35 | 192 | 15 | 1 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 min |
| Anat | LAMPEJO | Axial | 35 | 192 | 23 | 1 | 5 | 250 | 2 | 1 | 1 min 36 s | ||
| Anat | RARO | Axial | 35 | 192 | 23 | 1 | 28 | 2500 | 4 | 7 | 8 | 1 | 4 min. |
| Shim | IMPRENSA | Todos os aviões | 16.223 | 2500 | 1 | 1 | 2,5 s | ||||||
| Estado de Repouso | EPI | Axial | 35 | 64 | 15 | 1 | 15 | 1200 | 1 | 300 | 6 min cada |
Tabela 1: Tabela de referência dos parâmetros de varredura. Parâmetros para as sequências descritas no protocolo. FLASH = Tiro de ângulo baixo rápido, RARE = Aquisição rápida com Aprimoramento de Relaxamento, PRESS = Ponto RESolved Spectroscopy, EPI = Echo Planar Imaging.
Arquivos suplementares: Exemplo de script para avaliação de qualidade ica. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
A estabilidade do animal, tanto física quanto fisiologicamente, é fundamental para obter dados de estado de repouso de alta qualidade. Este protocolo alcança estabilidade movendo-se através de quatro fases distintas da anestesia. É imperativo que o animal tenha cumprido os limites fisiológicos definidos antes de passar para a próxima fase da anestesia; uma vez que este método se baseia em mecanismos autoregulatórios fisiológicos, animais individuais podem exigir quantidades ligeiramente diferentes de tempo em cada fase da anestesia. É nossa experiência que tomar mais tempo em cada fase é mais eficiente do que correr através de estágios anteriores sem dar à fisiologia do rato tempo suficiente para resolver. Os componentes-chave que permitem estabilidade são o ajuste do cone do nariz e a limpeza adequada do gás residuado.
Um cone de nariz devidamente selado e uma limpeza permitem que o animal permaneça estável com respiração regularmente espaçada e níveis constantes de saturação de oxigênio. Se ocorrerem suspiros, espaçamento irregular, tenção da respiração ou diminuição dos níveis de saturação de oxigênio, deve-se trabalhar para melhorar a vedação e a limpeza do cone do nariz. O cone do nariz deve caber de perto, mas não deve empurrar para a ponte do nariz. Um cone de nariz personalizado pode precisar ser fabricado. O cone original do nariz do nosso fabricante tinha uma válvula de tomada de ar que era muito pequena, então um tubo falcão foi equipado com uma linha de vácuo selada maior mais perto do animal. Isso resultou em melhor liberação de CO2 expirado e saturação constante de oxigênio. Como mencionado no protocolo, o filme de parafina pode ser enrolado em torno da mandíbula inferior e borda do cone do nariz, mas se embrulhado muito fortemente, pode restringir a respiração e levar à instabilidade. Além disso, a colocação inadequada de barras de ouvido e barra de mordida não só afetam a estabilidade necessária da cabeça para a imagem, mas também podem afetar a respiração; ruído contínuo piscando ou audível do animal é uma provável indicação de colocação inadequada da barra de ouvido. Os dentes da frente devem sentar-se firmemente na barra de mordida e ser puxados para a frente após a colocação da barra de ouvido para garantir um ajuste apertado. A língua do rato pode precisar ser puxada para a frente se ele se sentar muito para trás na boca e restringir a respiração adequada.
Como cada sistema é único, a sintonia fina do nível de vácuo é necessária para alcançar a limpeza ideal. Como guia prático, deve ser possível sentir uma pequena quantidade de sucção, seja colocando um dedo sobre a linha de vácuo abrindo dentro do cone do nariz, ou selando todo o cone do nariz abrindo com a palma. A taxa de fluxo correspondente para entrada de anestesia (0,8 L/min foi usada aqui) é um bom ponto de partida. A saturação de oxigênio no animal deve permanecer acima de 95% durante todo o exame. Se a saturação de oxigênio mostra uma tendência decrescente, isso pode ser uma indicação de que o CO2 está se acumulando no cone do nariz e a limpeza precisa ser aumentada. Outra possibilidade é que a pressão do grampo do oxímetro de pulso no pé precisa ser ajustada, solta para melhorar o fluxo sanguíneo ou apertada para garantir um sinal forte e estável. Se a respiração do animal for maior do que os limiares descritos, isso pode indicar que a limpeza é muito alta e está removendo muito isoflurane. Em raras circunstâncias, pode ser necessário aumentar a dose de dexmedetomidina subcutânea para 0,02 mg/kg/h, mas descobrimos que 0,015 mg/kg funcionou bem em uma ampla gama de idades de ratos e ambos os sexos, e é apoiado em estudos farmacológicos4.
A duração da varredura necessária para a ativação da ressonância magnética é uma função do tamanho do efeito, da relação sinal-ruído espacial (SNR) e do SNR temporal, como mostrado anteriormente por Murphy et al.13. O uso de uma pequena bobina de superfície (2 cm) e de campo magnético alto (9,4 T) aumenta substancialmente a sensibilidade SNR e BOLD. Com nossa configuração de imagem, descobrimos que uma única varredura de 6 minutos é suficiente para detectar uma robusta rede de conectividade funcional de estado de repouso, consistente com nosso relatório anterior10. No entanto, normalmente repetimos o exame de 3 a 4 vezes, e mediamos os resultados para derivar redes cerebrais funcionais para animais individuais. Alternativamente, pode-se digitalizar uma única vez com uma duração maior (10 min ou mais) para derivar redes de conectividade funcional14.
Depois de coletar rs-fMRI de alta qualidade usando este protocolo, pré-processo os dados como foi publicado anteriormente15,16. Com o uso de barras de ouvido e uma barra de mordida, artefatos de movimento no curso de tempo fMRI são mínimos, e o uso da correção de movimento não teve um efeito perceptível em nossos dados. Os epis individuais de estado de repouso precisam ser despojados e registrados em um espaço comum (usamos um único cérebro de rato representativo)16,17. Remova os volumes inacorredores de cada EPI para que todos os incluídos sejam adquiridos quando o ímã estiver em estado estável (removemos 5 pontos de tempo). Denoizar varreduras individuais (ver Resultados Representativos para exemplos de componentes de sinal e ruído). Aplique correção de tempo de fatia, bem como remoção de tendência linear e quadrática, filtragem de passe de banda (0,005-0,1 Hz) e suavização espacial (0,6 mm FWHM [largura total à metade do máximo]). Além disso, remova o curso médio de tempo de sinal da matéria branca e ventrículos através da regressão linear. Após essas etapas padrão de pré-processamento, mais análises de nível de grupo podem ser realizadas, incluindo conectividade funcional baseada em sementes11,15,18,19,20,21,22, análises de componentes independentes10,20,22e análises de modularidade12,19.
Existem duas principais vantagens do protocolo atual: 1) permite a atividade cerebral espontânea; e 2) mantém o animal em fisiologia quase normal. Métodos anestésicos alternativos (como propofol21, α-clorona15e brometo de pancurônio em combinação com outro anestésico21,23) também têm sido usados para adquirir dados de estado de repouso. No entanto, o uso de uma combinação de isoflurano de baixa dose com dexmedetomidina de baixa dose, como descrito neste protocolo, tem sido mostrado apenas para interromper minimamente as funções da rede cerebral, ao mesmo tempo em que fornece a estabilidade fisiológica necessária para obter dados de conectividade funcional de estado de repouso de qualidade9,10,18,24. Além disso, respostas BOLD da estimulação somatosensorial9 e deflexão mecânica do bigode11 podem ser vistas em ou após um período de 90 minutos ao usar este protocolo, sugerindo um nível de excitação consistente. Curiosamente, o uso de dexmedetomidina isoladamente pode provocar atividade epiléptica; no entanto, essa atividade foi abolida com isoflurane suplementado8. Outra vantagem do protocolo atual é que elimina a necessidade de ventilação artificial. Embora a ventilação mecânica possa levar a uma faixa mais estreita de dióxido de carbono parcial e saturação de oxigênio entre os animais, em estudos longitudinais, manter parâmetros fisiológicos sem a necessidade de intubação pode resultar em menos complicações e efeitos colaterais indesejados.
O interesse em repouso-estado fMRI cresceu consideravelmente nos últimos 10 anos, e com ele a necessidade de adquirir escaneamentos de estado de repouso pré-clínicos de alta qualidade de roedores. Este protocolo de sobrevivência alcança anestesia estável por até 5h com fisiologia quase normal durante a aquisição do estado de repouso. Como o protocolo é altamente estável, sequências adicionais (estrutural, estimulação, ressonância magnética farmacológica, etc.) podem ser facilmente adicionadas para alcançar o design experimental desejado. A combinação de isoflurane de baixa dose com dexmedetomidina utilizada neste protocolo permite uma grande variedade de estudos pré-clínicos para pesquisadores interessados em estudar o cérebro de roedores em seu estado de repouso.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por financiamento do Instituto Nacional de Saúde (NIH) do Instituto Nacional de Drogas (NIDA) [DJW, EDKS, e EMB foram apoiados por Grant R21DA044501 concedido a Alan I. Green e DJW foi apoiado por Grant T32DA037202 para Alan J. Budney] e o National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIAAA) [Grant F31AA028413 para Emily D. K. Sullivan]. Apoio adicional foi dado através do fundo dotado de Alan I. Green como o Raymond Sobel Professor de Psiquiatria em Dartmouth.
Hanbing Lu é apoiado pelo National Institute on Drug Abuse Intramural Research Program, NIH.
Os autores desejam reconhecer e agradecer ao falecido Alan I. Green. Sua dedicação inabalável ao campo dos distúrbios que ocorrem co-ocorreu ajudou a estabelecer a colaboração entre os autores. Agradecemos a ele por sua orientação e orientação, que fará muita falta.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9.4T MRI | Varian/Bruker | Varian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software | |
| Air-Oxygen Mixer | Sechrist | Model 3500CP-G | |
| Analysis of Functional NeuroImages (AFNI) | NIMH/NIH | Version AFNI_18.3.03 | Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/ |
| Animal Cradle | RAPID Biomedical | LHRXGS-00563 | rat holder with bite bar, nose cone and ear bars |
| Animal Physiology Monitoring & Gating System | SAII | Model 1025 | MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on |
| Antisedan (atipamezole hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-867-7097 | Zoetis, Manufacturer Item #10000449 |
| Ceramic MRI-Safe Scissors | MRIequip.com | MT-6003 | |
| Clippers | Patterson Veterinary | 07-882-1032 | Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201 |
| Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-893-1801 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10 |
| Digital Rectal Thermometer Covers | Medline | MDS9608 | |
| FMRIB Software Library | FMRIB | MELODIC Version 3.15 | Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki |
| Heating Pad | Cara Inc. | Model 50 | |
| Hemostat forceps, straight | Kent Scientific | INS750451-2 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06 |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip Inc. | 911103 | |
| Lab Tape, 3/4" | VWR International | 89097-990 | |
| Needles, 23 gauge | BD | 305145 | plastic hub removed |
| Parafilm Laboratory Film | Patterson Veterinary | 07-893-0260 | Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A |
| Planar Surface Coil | Bruker | T12609 | 2cm |
| Polyethylene Tubing | Braintree Scientific | PE50 50FT | 0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter) |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38 |
| Sprague Dawley Rats | Charles River | 400 SAS SD | |
| Sterile 0.9% Saline Solution | Patterson Veterinary | 07-892-4348 | Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186 |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Medline | MDS090735 | |
| Surgical Tape, 1" (3M Durapore) | Medline | MMM15381Z | 3M Healthcare, "wide medical tape" |
| Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore) | Medline | MMM15300 | 3M Healthcare |
| Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needle | BD | 309626 | |
| Syringes, 3 mL | BD | 309657 | |
| Vented induction and scavenging system | VetEquip Inc. | 942102 | 2 liter induction chamber with active scavenging |
| 411724 | omega flowmeter | ||
| 931600 | scavenging cube, "vacuum" | ||
| 921616 | nose cone, non-rebreathing |
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