Summary
تصف هذه المخطوطة الإدارة داخل الجسم البولي للبكتيريا المسالك البولية مع لوكس أوبرون للحث على عدوى المسالك البولية في الفئران والتحليل الطولي اللاحق في الجسم الحي للعبء البكتيري باستخدام التصوير الإضاءة الحيوية.
Abstract
التهابات المسالك البولية (UTI) رتبة بين العدوى البكتيرية الأكثر شيوعا في البشر ويتم علاجها بشكل روتيني مع المضادات الحيوية التجريبية. ومع ذلك ، بسبب زيادة المقاومة الميكروبية ، انخفضت فعالية المضادات الحيوية الأكثر استخداما. لإيجاد خيارات العلاج البديلة، هناك حاجة ماسة لفهم أفضل لمسببات الأمراض UTI والآليات التي تحدد قابلية التهاب المسالك البولية. من أجل التحقيق في هذا في نموذج حيواني ، لا غنى عن إجراء فحص غير جراحي قابل للاستنساخ لدراسة مسار التهاب المسالك البولية.
لسنوات، كان المعيار الذهبي لتعداد الحمل البكتيري هو تحديد وحدات تشكيل المستعمرة (CFU) لحجم عينة معينة. تتطلب هذه التقنية تجانسات الأعضاء بعد الوفاة والتخفيفات التسلسلية ، مما يحد من إخراج البيانات وقابلية الاستنساخ. كبديل، يكتسب التصوير بالإضاءة الحيوية (BLI) شعبية لتحديد الحمل البكتيري. وسم مسببات الأمراض مع لوكس operon تسمح للكشف الحساسة وتكميم بطريقة غير الغازية، وبالتالي تمكين المتابعة الطولية. وحتى الآن، لا يزال اعتماد BLI في أبحاث التهاب المسالك البولية محدودا.
تصف هذه المخطوطة التطبيق العملي ل BLI في نموذج عدوى المسالك البولية للفأرة. هنا، يتم توفير دليل خطوة بخطوة لزراعة البكتيريا، والغرس داخل الزج والتصوير. يتم فحص الارتباط في الجسم الحي مع CFU ويتم توفير إثبات المفهوم من خلال مقارنة الحمل البكتيري للحيوانات المصابة غير المعالجة مع الحيوانات المعالجة بالمضادات الحيوية. وعلاوة على ذلك، تناقش مزايا وقيود واعتبارات محددة لتنفيذ BLI في نموذج UTI في الجسم الحي. إن تنفيذ BLI في مجال أبحاث التهاب المسالك البولية سيسهل بشكل كبير البحث في مسببات الأمراض في التهاب المسالك البولية واكتشاف طرق جديدة لمنع وعلاج التهاب المسالك البولية.
Introduction
التهابات المسالك البولية (UTI) هي من بين العدوى البكتيرية الأكثر شيوعا في البشر. ما يقرب من نصف جميع النساء سوف تواجه أعراض التهاب المسالك البولية خلالحياتهم 1. يمكن أن تؤدي العدوى التي تقتصر على المثانة إلى ظهور أعراض بولية مثل زيادة وتيرة البول والإلحاح والوبيلة الدموية وسلس البول والألم. عندما تصعد العدوى إلى المسالك البولية العليا ، يصاب المرضى بالتهاب البيلونفر ، مع الضيق والحمى والقشعريرة وآلام الظهر. وعلاوة على ذلك، ما يصل إلى 20٪ من المرضى الذين يعانون من التهاب المسالك البولية يعانون من التهابات متكررة مما أدى إلى انخفاض كبير فيحساسيةالمضادات الحيوية 2،3،4. في السنوات الأخيرة ، كان هناك اهتمام متزايد في العلاجات الجديدة لعلاج والوقاية من التهاب المسالك البولية المتكرر. على الرغم من فهم أفضل للمناعة الفطرية والتكيفية للمسالك البولية السفلية وعوامل الفوعة البكتيرية اللازمة للغزو والاستعمار ، لم تترجم أي تغييرات جذرية في نظام العلاج إلى الممارسة اليومية للمسالك البولية2. من أجل دراسة مسببات الأمراض UTI وقابلية في الجسم الحي، لا غنى عن الفحص القابل للتكرار وغير الغازية.
وقد وصفت نماذج متعددة UTI الحيوانية تتراوح بين الديدان الخيطية إلى الرئيسيات، ولكن يستخدم في الغالب نموذج مورين5،6. هذا النموذج يتكون من القسطرة عبر مجرى البول من الفئران (أنثى) وغرس لاحقة من تعليق البكتيرية, الأكثر شيوعا uropathogenic إشريتشيا القولونية (UPEC), مباشرة في تجويف المثانة7. بعد التطعيم ، تم قياس الحمل البكتيري تقليديا من خلال تحديد وحدات تشكيل المستعمرة (CFU). تتطلب هذه التقنية التضحية بالحيوانات للحصول على تجانسات الأعضاء بعد الوفاة والتخفيفات التسلسلية ، مما يحد من إخراج البيانات وقابلية التكاثر. وعلاوة على ذلك، المتابعة الطولية للعبء البكتيري في الحيوانات الفردية غير ممكن باستخدام هذه التقنية.
في عام 1995،اقترح Contag وآخرون استخدام مسببات الأمراض الموسومة بالإضاءة الحيوية لرصد عمليات المرض فيالحيواناتالحية 8و9. ومنذ ذلك الحين ، تم تطبيق التصوير الإضاءة الحيوية (BLI) على العديد من نماذج العدوى مثل التهاب السحايا والتهاب الشغاف والتهاب العظم والنقي والجلد والتهابات الأنسجة الرخوة ، وما إلى ذلك10،11،12. في نموذج مورين UTI، يمكن استخدام سلالة UPEC مع لوكسoperon كاملة (luxCDABE) من لومينسنس Photorhabdus 13. يتم تحفيز رد فعل أنزيمي من قبل لوسيفيراز البكتيري الذي يعتمد على أكسدة الألدهيدات طويلة السلسلة التي تتفاعل مع انخفاض أحادي النوكليوتيد الفلافين في وجود الأكسجين ، مما ينتج عنه فلافين مؤأكسد ، وحمض دهني طويل السلسلة وخفيف12. يقوم لوكس أوبيرون بترميز لوسيفيراز والإنزيمات الأخرى المطلوبة لتركيب الركائز. لذلك، فإن جميع البكتيريا النشطة الأيضية تنبعث منها باستمرار الضوء الأخضر الأزرق (490 نانومتر) دون الحاجة إلى حقن ركيزة خارجية12. يمكن التقاط الفوتونات المنبعثة من البكتيريا الموسومة باللوكسباستخدام كاميرات جهاز حساسة للغاية وباردة مقترنة بالشحن (CCD).
استخدام البكتيريا الإنارة الحيوية في نموذج لUTI يسمح للقياس الكمي الطولي، غير الغازية من الحمل البكتيري، وحذف الحاجة إلى التضحية بالحيوانات في نقاط زمنية محددة خلال متابعة لتحديد CFU. على الرغم من مجموعة واسعة من الاحتمالات، وتراكم الأدلة على قوة هذه التقنية BLI في مجالات أخرى ومزاياها على النماذج الكلاسيكية من التهاب المسالك البولية، فإنه لم يتم تنفيذها على نطاق واسع في البحوث UTI. يقدم البروتوكول المعروض هنا دليلا تفصيليا خطوة بخطوة ويسلط الضوء على مزايا BLI لجميع أبحاث UTI المستقبلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية لمجلس الاتحاد الأوروبي ووافقت عليها لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة KU Leuven (P158/2018).
1. زراعة البكتيريا (مقتبس من7،13،14)
- اعداد
- اختر سلالة UPEC مضيئة تناسب الاحتياجات التجريبية على أفضل وجه.
ملاحظة: هنا، عزل التهاب المثانة السريرية، UTI89 (E. القولونية)،تم اختياره بسبب قدرته uropathogenic في كل من البشر والقوارض، واستخدامه المشترك في نماذج مورين UTI5،7،15. سلالة إيزوجينيك الإنارة الحيوية تحمل لوكسoperon كاملة (luxCDABE) ويشار إلى كذلك باسم UTI89-لوكس. هذا operon يحمل أيضا كبريتات الكاناميسين (كم) جينات المقاومة. لذلك، يمكن استخدام كم لتحديد المستعمرات الإنارة الحيوية13. - جعل منحنى الارتباط لCFU والكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600 نانومتر) للسلالة البكتيرية المختارة7.
- للقيام بذلك، البكتيريا الثقافة (باستخدام البروتوكول أدناه) وجعل 8 تخفيفات مختلفة في الفوسفات المالحة المخزنة مؤقتا (PBS). قياس OD في 600 نانومتر لجميع هذه التخفيفات ولوحة لهم على لوحات لوريا-بيرتاني (LB) لتحديد CFU.
- رسم قيم OD 600 نانومتر وقيم CFU لتحديد الارتباط والحصول على منحنى قياسي.
ملاحظة: بالنسبة للتجارب المستقبلية، قم بقياس OD عند 600 نانومتر واستخدم هذا المنحنى القياسي للحصول على تقدير فوري ل CFU في محلول بكتيري.
تنبيه: تعد UPEC بكتيريا مسببة للأمراض، وتضمن تجهيز الغرف بشكل صحيح واستخدام معدات الحماية الشخصية.
- اختر سلالة UPEC مضيئة تناسب الاحتياجات التجريبية على أفضل وجه.
- قبل ثلاثة أيام من التقطير
- الحصول على مستعمرات واحدة عن طريق streaking من مخزون الجلسرين من البكتيريا، وذلك باستخدام حلقة التطعيم، على لوحات LB تكملها مع 50 ميكروغرام / مل كم والثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. ختم هذه اللوحات مع فيلم البارافين لتخزين في 4 درجة مئوية تصل إلى 1 أسبوع.
- قبل يومين من التقطير
- ملء أنبوب معقم 14 مل البوليسترين جولة أسفل مع قبعات المفاجئة مزدوجة الموقف مع 5 مل من مرق LB تكملها مع 50 ميكروغرام / مل كم. اختيار مستعمرة بكتيرية واحدة مع حلقة التطعيم وإضافة هذا إلى مرق LB. دوامة لمدة 10 ق لضمان خلط السليم.
- ثقافة ثابتة مع سقف المفاجئة في موقف مفتوح في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: النمو الثابت للإشريكية القولونية يعزز التعبير عن النوع 1-بيلي، والتي تعتبر حاسمة للالتزام والغزو من الخلايا الظهارية البولية. - إعداد Erlenmeyer عقيمة أو قارورة الثقافة.
- قبل يوم واحد من غرس
- بعد الحضانة ، دوامة الأنبوب لمدة 10 ق لضمان التجانس السليم للثقافة البكتيرية. جعل ثقافة فرعية في Erlenmeyer بإضافة 25 ميكرولتر من تعليق البكتيرية إلى 25 مل من المتوسط LB الطازجة دون المضادات الحيوية.
- أغلق Erlenmeyer والثقافة بشكل ثابت عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- في يوم الزرع
- دوامة Erlenmeyer لمدة 10 ق لضمان خلط السليم.
- صب الثقافة من Erlenmeyer في أنبوب ثقافة 50 مل والطرد المركزي في 3000 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. Decant العملاقة وإعادة إنفاق بيليه البكتيرية في 10 مل من برنامج تلفزيوني معقم ودوامة مرة أخرى لمدة 10 ثانية.
- اختر التركيز التجريبي لل inoculum (CFU) واستخدم المنحنى القياسي الذي تم الحصول عليه في الخطوة 1.1.2 لتحديد OD 600 nm المقابل.
- إضافة 1 مل من الثقافة البكتيرية resuspended في 9 مل من برنامج تلفزيوني عقيمة والتحقق من OD في 600 نانومتر. ضبط مزيد من خلال إضافة إما برنامج تلفزيوني عقيم أو محلول بكتيري مركزة، حتى يتم الوصول إلى OD 600 نانومتر المطلوب7.
ملاحظة: على سبيل المثال، بالنسبة ل UTI89-lux ضبط الثقافة بإضافة برنامج تلفزيوني حتى يصل إلى 0.45 نانومتر OD 600، المقابلة إلى 2 × 107 CFU/50 ميكرولتر. للتحقق من عدد وحدات الكربون الكلورية فلورية قابلة للحياة، وجعل 10 أضعاف المخففات التسلسلية ولوحة 50 ميكرولتر من المخففات 10 أضعاف الخامس والسادس على لوحات LB في ثلاثة أضعاف للحصول على أقل من 300 مستعمرة. عد المستعمرات التي تم الحصول عليها في اليوم التالي بعد الحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية OD 600 نانومتر يعطي لحظة القراءة ولكن استخدام CFU كرقابة على الجودة.
2. تلقيح الحيوانات (مقتبس من7،16)
- إعداد الحيوانات
- اختيار سلالة الماوس المطلوب (ق) اعتمادا على سؤال البحث وتوافر خطوط خروج المغلوب، والتفاصيل التجريبية، والاختلافات في قابلية UTI5،17. ضع في اعتبارك أن القسطرة عبر مجرى البول أسهل في الفئران الإناث. لا تستخدم الحيوانات التي تقل الأسابيع عن 8 أسابيع، لأنها غير ناضجة من الناحية المناعية. هنا، تم استخدام الفئران C57Bl/6J الإناث البالغ من العمر 12 أسبوعا.
- اطلب الحيوانات مقدما ودعها تتكيف ، بشكل مثالي لمدة 7 أيام. مجموعة منزل الحيوانات في أقفاص التهوية بشكل فردي، في ظل ظروف ضوء / الظلام القياسية 12 ساعة.
- حلق منطقة البطن من الحيوانات للحد من فقدان الإشارة. لا تستخدم كريم إزالة الشعر، كما يمكن أن يحرق الجلد من الحيوانات بسرعة. كبح جماح الحيوان عن طريق عقد بإحكام scruff والأطراف الخلفية مع اليد غير المهيمنة في حين حلق مع اليد المهيمنة. بدلا من ذلك، حلق تحت التخدير isoflurane.
ملاحظة: تم حلق الحيوانات قبل يومين من التصوير ، مع الأخذ في الاعتبار أن الحيوانات سوف تجهز المنطقة الحليقة أكثر من ذلك. - توفير المياه والغذاء القياسية libitum الإعلانية طوال التجربة. ومع ذلك، حرمان الحيوانات من الماء 2 ساعة قبل غرس لتقليل حجم المثانة أثناء غرس.
- قم بتركيب طرف معقم 24 G angiocatheter على حقنة 100 ميكرولتر وملء الحقنة بالمحلول البكتيري المعد في الخطوة 1.5.3.
ملاحظة: لتحديد الإضاءة الخلفية، الحصول على صورة الأساس قبل instillation (انظر الخطوة 3 أدناه).
- غرس الحيوانات
- ضع الحيوانات في غرفة التعريفي وتخديرها باستخدام استنشاق الأيزوفلوران بالأوكسجين النقي كغاز ناقل (التعريفي بنسبة 3٪ والصيانة بنسبة 1.5٪).
- ضع حيوانا واحدا على سطح عمل في وضعية السطاخ وحافظ على تخدير isoflurane مستقر باستخدام مخروط الأنف أثناء التقطير. تطبيق مرهم العين.
- طرد البول المتبقية عن طريق تطبيق ضغط لطيف وإجراء حركات دائرية على المنطقة فوق العانة. تنظيف أسفل البطن مع 70٪ الإيثانول قبل غرس.
- تليين طرف القسطرة مع المالحة العادية. ضع السبابة من اليد غير المهيمنة على البطن ودفعها بلطف إلى الأعلى. ابدأ قسطرة مجرى البول بزاوية 90 درجة (عموديا) وبمجرد مواجهة المقاومة ، قم بإمالتها أفقيا قبل إدخالها كذلك (0.5 سم).
ملاحظة: لا تدفع القسطرة بقوة أبدا، لأن ذلك سيسبب ضررا لمجرى البول. يمكن أن تكون حركات الدوران اللطيفة مفيدة في إدخال القسطرة. من ناحية أخرى، عدم وجود مقاومة عادة ما يشير إلى الإدراج الخاطئ في المهبل. - إجراء غرس بطيء (5 ميكرولتر / ثانية) من 50 ميكرولتر من inoculum البكتيرية (2 × 107 CFU).
ملاحظة: قد يسبب ارتفاع الأحجام أو سرعة التقطير ارتجاع الكلى. أثناء ممارسة هذه التقنية، يمكن استخدام الحبر الأزرق لتقييم الجزر. - بعد التقطير، احتفظ بالحقنة والقسطرة في مكانها لبضع ثوان ثم تراجع ببطء لمنع التسرب. سجل أي مخالفات مثل كمية عالية من التسرب أو اللحم الدموي واستبعاد الحيوانات ، إذا لزم الأمر.
- ضع الحيوان في وضعية السبق في مخروط الأنف في غرفة التصوير وكرر الخطوات السابقة 2.1.1-2.1.6 لجميع الحيوانات المتبقية. استخدم قسطرة واحدة لكل مجموعة تجريبية. ضمان استمرار التخدير وتقليل الوقت بين الحيوان الأول والأخير.
- إذا لزم الأمر، إعطاء المضادات الحيوية أو الأدوية التجريبية، قبل أو بعد التصوير (الخطوة 3). على سبيل المثال، لإدارة enrofloxacin، إضافة 40 ميكرولتر من محلول enrofloxacin (100 ملغم / مل) إلى 3.96 مل من المالحة الفسيولوجية للحصول على تخفيف 1/100. حقن 100 ميكرولتر/10 غرام تحت الجلد في الساعة 9 صباحا و5 مساء لإدارة 10 ملغم/كغ من الإنروفلوكساسين مرتين يوميا لمدة 3 أيام.
3. التصوير الإضاءة الحيوية
- إعداد واختيار معلمات التصوير
- افتح برنامج الحصول على BLI (انظر جدول المواد)وانقر على التهيئة في جهاز التصوير (انظر جدول المواد)لاختبار الكاميرا ونظام تحكم المرحلة وتبريد كاميرا CCD إلى -90 درجة مئوية.
ملاحظة: أثناء هذه العملية، يتم تأمين الباب، ويمكن متابعة تقدم التهيئة على لوحة التحكم. يشير الضوء الأخضر إلى أن درجة الحرارة -90 درجة مئوية يتم الوصول إليها. سيظهر تحذير إذا تمت محاولة التصوير قبل إكمال التهيئة. - تأكد من حفظ البيانات تلقائيا: انقر على اقتناء السيارات حفظ لتحديد المجلد الصحيح.
- حدد التلألؤ والصورة . تحقق من إعدادات الإضاءة الافتراضية: تعيين فلتر الإثارة إلى كتلة ومرشح الانبعاثات لفتح.
- تعيين وقت التعرض إلى تلقائي عند التقاط الصورة الأولى، خاصة عند توقع إشارة خافتة لضمان عدد كاف من عدد الفوتونات. لقياسات في الجسم الحي وإشارات ساطعة، تعيين وقت التعرض إلى ~ 30 ق. إذا كانت الصورة مشبعة، سيظهر تحذير. إذا حدث هذا، تقليل وقت التعرض.
- حدد بينينغ المتوسطة، F / وقف 1 واختيار المجال الصحيح للعرض (FOV) (D للحيوانات 5).
- تعيين ارتفاع الموضوع إلى 1 سم عند تصوير الفئران.
- انقر على إضافة ثلاث مرات في لوحة التحكم الاستحواذ للحصول على سلسلة من ثلاث صور، كما يكرر التقنية.
- افتح برنامج الحصول على BLI (انظر جدول المواد)وانقر على التهيئة في جهاز التصوير (انظر جدول المواد)لاختبار الكاميرا ونظام تحكم المرحلة وتبريد كاميرا CCD إلى -90 درجة مئوية.
- التصوير
- ضع الفئران في غرفة التصوير في وضع السطاخ واستخدم مخروط الأنف متعدد الجوانب للحفاظ على التخدير (isoflurane 1.5٪) طوال التجربة. صورة تصل إلى 5 الفئران في وقت واحد وفصل الحيوانات باستخدام حيرة الضوء لمنع الانعكاس.
- أغلق الباب وانقر على اكتساب لبدء تسلسل التصوير.
- ملء معلومات مفصلة عن التجربة (نوع البرية والحيوانات بالضربة القاضية، والعلاجات، يوم التصوير، الخ). يتم حفظ إعدادات التصوير، مثل وقت التعرض، تلقائيا.
- إزالة الفئران من غرفة التصوير وإعادتها إلى قفصهم. تحقق من الشفاء التام بعد التخدير. في غضون دقائق ، يجب أن تكون الحيوانات مستيقظة تماما واستكشافية. لا تقدم مسكن لأن هذا قد تتداخل مع مسار UTI18.
- أعد الأقفاص إلى الرفوف التهوية حتى دورة التصوير التالية. بعد الانتهاء من التجربة، قتل الحيوانات عن طريق اختناقثاني أكسيد الكربون أو خلع عنق الرحم. القيام بذلك قبل الانتعاش من التخدير isoflurane لتقليل الضيق.
- تحليل الصور
- بدء تشغيل برنامج التصوير وتحميل الملف التجريبي من خلال النقر على تصفح.
- استخدم لوحة الأدوات لضبط مقياس لون الصورة. توحيد الجانب البصري للنتائج باستخدام نفس الإعدادات لجميع الصور، أي استخدام مقياس لوغاريتمي مع الحد الأدنى من 104 إلى حد أقصى 107 الفوتونات. لا تؤثر هذه التعديلات على البيانات الأولية ولكن على العرض التقديمي الرسومي فقط.
- استخدم أدوات عائد الاستثمار لرسم منطقة الاهتمام (ROI) على الصورة. تأكد من أن عائد الاستثمار كبير بما يكفي لتغطية المساحة الكاملة واستخدام نفس الأبعاد لجميع الصور. هنا، تم وضع عائد استثمار مربع من 3.5 سم × 4.5 سم فوق أسفل البطن.
- انقر على قياس عائد الاستثمار لتحديد شدة الضوء (العد أو إجمالي تدفق الفوتون). تصدير هذه البيانات واستخدام متوسط النسخ المتماثلة التقنية.
ملاحظة: تمثل الأعداد عدد فوتونات تم اكتشافها بواسطة الكاميرا ويجب استخدامها فقط لمراقبة جودة الصورة. للإبلاغ عن البيانات، استخدم إجمالي تدفق الفوتون. إجمالي تدفق الفوتونات هو أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية لأنه يمثل الضوء المنبعث من السطح وهو وحدة معايرة ، والتي يتم تصحيحها لوقت التعرض (في الثانية).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الجسم الحي BLI يرتبط مع CFU من inoculum في وقت غرس.
لتقييم حد الكشف عن BLI في الجسم الحي والارتباط مع CFU من inoculum ، أصيبت الفئران بتركيزات مختلفة من UTI89 -lux و PBS كتحكم سلبي. قبل التقطير، تم مسح الحيوانات غير المصابة لتحديد تلألؤ الخلفية. تم الحصول على الصور اللاحقة على الفور بعد غرس (الشكل 1A). بعد غرس UTI89-لوكس، تم اكتشاف الإضاءة الحيوية بقوة فوق 2 × 104 CFU وتم تأسيس ارتباط خطي بين CFU من الإنكولوم والإضاءة الحيوية (الشكل 1B). وعلى النقيض من ذلك، كان إجمالي تدفق الفوتون مماثلا لإشارات الخلفية للحيوانات التي غرست مع برنامج تلفزيوني وبأقل تركيز بكتيري قدره 2 × 103 CFU.
BLI كأداة للمتابعة الطولية أثناء العلاج
لتحديد ما إذا كان التأثير العلاجي للعلاج بالمضادات الحيوية المعتمدة يمكن إثباته باستخدام BLI الطولي ، أصيب 20 حيوانا بعياء 2 × 107 CFU/50 μL ، وعولجت 10 من هذه الحيوانات ب enrofloxacin 10 ملغ / كجم تحت الجلد مرتين يوميا خلال الأيام ال 3 الأولى بعد العدوى. يمكن تصور كل من التطور الطبيعي في مجموعة المكافحة المصابة ولكن غير المعالجة وتأثير العلاج بالمضادات الحيوية على الحركية العدوى في المجموعة المعالجة بالتفصيل(الشكل 2). وشوهد انخفاض فوري في الحمل البكتيري، كما يقاس بإجمالي تدفق الفوتون، بعد الجرعة الأولى من الإنروفلوكساسين. لم يكن لأي من الحيوانات المعالجة ارتفاع لاحق في الحمل البكتيري. وكان التباين بين المواضيع في مجموعة المكافحة المصابة ولكن غير المعالجة أعلى وكان الانخفاض في الحمل البكتيري أبطأ. في اليوم العاشر، عاد 8 من أصل 10 من مجموعة المراقبة إلى إشارة BLI مماثلة لخلفيتها السابقة للغرس. تم حساب الحمل البكتيري الإجمالي لكل باستخدام المنطقة تحت منحنى (AUC) من تدفق فوتون إجمالي تم تحويله. ولوحظ فرق كبير بين الحيوانات المعالجة بالحيوانات التي تعالج بالانروفلوكساسين والحيوانات غير المعالجة على مدى 10 أيام. هذه النتائج تثبت أن BLI هو أداة قوية لتقييم تأثير العلاج المحتمل على مسار المرض من التهاب المسالك البولية.
الشكل 1:في الجسم الحي BLI يرتبط مع CFU من inoculum في وقت غرس. (أ) الصور التمثيلية التي تم الحصول عليها مع في الجسم الحي BLI من الفئران المصابة بتركيزات متزايدة من inoculum (2 × 103-2 × 108 CFU) صورت مباشرة بعد غرس البكتيرية في المثانة. CFU = وحدات تشكيل المستعمرة. (ب)تحديد كمي للإضاءة الحيوية المنبعثة فوق منطقة المثانة (إجمالي تدفق فوتون) مقارنة بتركيز الإنكولوم (CFU). تم الكشف عن إشارة BLI بقوة فوق 2 × 104 CFU (p = 0.0002 مقارنة بالخلفية وp = 0.015 مقارنة بعنصر التحكم في PBS ، غير المدفوع t-test). بيرسون الارتباط ل inoculi تتراوح بين 2 × 103-2 × 108 CFU كان ص = 0.9995 (ص < 0.0001). BG = الخلفية، برنامج تلفزيوني = الفوسفات العازلة المالحة، CFU = مستعمرة تشكيل وحدات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: BLI كأداة للمتابعة الطولية أثناء العلاج. (أ)آثار فردية من تدفق الفوتون الكلي للحيوانات المصابة 2 × 107 CFU من UTI89-لوكس وعلاجها مع enrofloxacin 10 ملغ / كغ مرتين يوميا لمدة 3 أيام (الأزرق) مقابل مجموعة مراقبة غير المعالجة (أسود)، ن = 10 لكل مجموعة. BG = الخلفية. (ب)تحليل آثار الحيوانات المبينة في لوحة A، والإبلاغ عن AUC من تدفق الفوتون الكلي تحويل السجل لكل من enrofloxacin (الأزرق) ومجموعة التحكم (أسود). N = 10 لكل مجموعة، يعني ± SD، غير مدفوعة ر-اختبار p < 0.0001. AUC = المنطقة تحت المنحنى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مزايا BLI مقارنة بحسابات CFU
البيانات الطولية
ومن العيوب الرئيسية للطريقة التقليدية لحساب CFU لتحديد العبء الميكروبي شرط تجانس الأعضاء بعد الوفاة ، وتوفير نقطة بيانات مقطعية واحدة فقط لكل. وعلى العكس من ذلك، تمكن BLI من المتابعة الطولية غير الغازية للحيوانات المصابة. يمكن تصوير الحيوانات مرتين إلى ثلاث مرات في اليوم ، مما يوفر رؤية مفصلة حركية العدوى. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التدابير المتكررة لنفس الحيوان تقلل بشكل كبير من عدد الحيوانات اللازمة للتجارب التي تعمل بالطاقة الكافية. وعلاوة على ذلك، يمكن للباحثين التركيز على التباين بين الأفراد وقبل فحص أو علاج الحيوانات مع عامل جديد، فإنها يمكن أن تختار الحيوانات مع الأحمال البكتيرية محددة مسبقا باستخدام البيانات في الوقت الحقيقي. من ناحية أخرى ، فإن استخدام AUC لتجربة يسمح للباحثين بالتركيز على الحمل البكتيري الإجمالي وليس على قيمة مقطعية واحدة. لا يمكن المبالغة في تقدير القيمة المضافة للبيانات الطولية وفي الوقت الحقيقي في إعداد UTI.
تحديد انتشار العدوى
الدقة المكانية للصور التي تم الحصول عليها مع BLI كافية لتحديد المواقع الأخرى التي يتم استعمارها بواسطة مسببات الأمراض الموسومة لوكس أو FLuc -19. بالنسبة لالتهاب المسالك البولية، فإن العدوى الصاعدة إلى الكلى أو الانتشار إلى الدم هي نتائج ذات صلة عالية. في هذا الإعداد التجريبي ، لم يلاحظ أي انتشار للعدوى الناجمة عن UTI89 -لوكس وراء المسالك البولية السفلية. وكان هذا متوقعا بالنظر إلى أن هذه السلالة تسبب التهاب المثانة في الغالب.
إمكانية استنساخ البيانات ومقارنتك
إعادة إنتاج التجارب أعلى عند استخدام BLI مقارنة مع عدد CFU. كلاسيكيا، مطلي ثلاثة أضعاف من المخففات التسلسلية 10 أضعاف من التجانسات ويتم حساب فقط تلك اللوحات مع 30 إلى 300 CFU بعد ذلك لحساب العدد الإجمالي للCFU. هذه الطريقة مرهقة ، عرضة للتغير العالي ، تؤدي إلى العديد من اللوحات العقيمة ، وهي عرضة للغاية للأخطاء البشرية. وعلاوة على ذلك، لا يوجد توافق في الآراء حول كيفية الإبلاغ عن CFU، وهي، لكل غرام أنسجة المثانة، لكل المثانة، أو لكل 1 مل متجانسة. وهذا يجعل المقارنة بين نتائج المجموعات المختلفة صعبة للغاية ويمكن تحسينها باستخدام BLI وتدفق فوتون الكلي.
اعتبارات وتقييدات الطريقة
إلى جانب الاعتبارات الكلاسيكية المتعلقة ب BLI في الجسم الحي مثل امتصاص الفوتونات عن طريق الفراء أو الهيموغلوبين ، هناك بعض الاعتبارات التي يجب اتخاذها عند ربط BLI و CFU في وقت التضحية.
أولا، تواجه التناقضات بين كلا الأسلوبين في وقت التضحية20،وخاصة عندما يتم استخدام العلاجات بالمضادات الحيوية. ولذلك، فإن الارتباط بين BLI وCFU العد في وقت التضحية يمكن أن يكون دون المستوى الأمثل وليس بالضرورة ذات الصلة. بالنسبة ل BLI ، يمكن أن يكون إجمالي تدفق الفوتون أقل من المتوقع ، لأن البكتيريا التي تواجه تحديات يمكن أن تعيد توجيه عملية التمثيل الغذائي الخاصة بها نحو عمليات التعافي والإصلاح ، بدلا من الانبعاثات الخفيفة. بالإضافة إلى ذلك ، يلتقط قياس BLI لقطة للبكتيريا والتمثيل الغذائي في الوقت الحقيقي في الجسم الحي ، مما يؤدي إلى انخفاض إشارات BLI إذا كانت البكتيريا في حالة سبات أو ممدود في وقت التصوير. من ناحية أخرى ، لتحديد CFU ، تتفاعل البكتيريا التي تتحدى المخدرات بطريقة كل شيء أو لا شيء بعد إزالتها من بيئتها المعدية (أي فيلم حيوي) ومطلية. مرة واحدة مطلي على أجار، قد تكون البكتيريا التي تواجه تحديات إصابة لا رجعة فيها وغير قادر على تطوير إلى مستعمرات يمكن ملاحظتها، مما أدى إلى انخفاض عدد CFU21. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للبكتيريا التي تواجه تحديات أن تدخل في حالة قابلة للحياة ولكنها غير قابلة للطائفة (VBNC). وهي لا تزال نشطة استقلابيا وقابلة للحياة ولكنها لم تعد قابلة للطائفة على وسائل الإعلام المختبرية القياسية. البكتيريا التي تدخل الدولة VBNC أو التي يتم تنظيمها في الأغشية الحيوية يمكن الكشف عنها بسهولة مع BLI، في حين أن تعداد CFU يتطلب معالجة إضافية21،22،23. في الختام، الإضاءة الحيوية والتعيين قابلة للحياة قياس جوانب مختلفة من فسيولوجيا الخلية ولا ينبغي أن ينظر إليها على أنها المؤشر النهائي لبقاء الخلية21.
وعلاوة على ذلك، فإن تعريف الحمل البكتيري كما يقاس من قبل BLI أو CFU التهم يختلف بسبب الاختلافات في معالجة العينات. عند استخدام التهم CFU، يتم تضمين البكتيريا التي تتواجد داخل جدار المثانة فقط في المتجانسة والعد. وعلى النقيض من ذلك، يلتقط BLI أيضا الفوتونات المنبعثة من البكتيريا في البول والإحليل. في رأينا ، فإن هذا الأخير هو تمثيل أكثر صحة من الناحية الفسيولوجية لمجموع الحمل البكتيري لأنه يشمل جميع المقصورات ذات الصلة تشريحيا (المثانة والبول والإحليل).
على النقيض من التهم CFU، BLI يتطلب توليد البكتيريا الإنارة المعدلة وراثيا. اعتمادا على موقع الإدراج ، من المعقول أن إدخال لوكس أوفيرون في الجينوم يمكن أن يغير إمكانات الفوعة للسلالة البكتيرية. لذلك ، عند تطوير سلالة جديدة من الإنارة الحيوية ، يجب مقارنة ضراوتها وخصائص النمو بسلالة الوالدين10،13. ومع ذلك، فإن التقدم الأخير في تحرير الجينوم يسمح بوضع علامات فعالة وغير ندبة على جميع مسببات الأمراض البكتيرية الرئيسية، مما يحد من التأثير على الفوعة أو استجابات العلاج. وعلاوة على ذلك، الهندسة الوراثية يفتح إمكانيات نحو التعبير المشروط عن الجينات مراسل الإضاءة الحيوية، وبالتالي، في الجسم الحي قياس الخلايا الفرعية البكتيرية ذات الصلة، والتعبير الجيني، الخ24،25.
وأخيرا، قد يكون الوصول إلى جهاز التصوير المتقدم وبرامج الاستحواذ في vivo BLI عاملا مقيدا مقارنة بالمعدات الأساسية المطلوبة لتعداد CFU. ومع ذلك، يمكن للتعاون مع نواة التصوير تقليل النفقات والاستثمارات اللازمة لBLI.
اعتبارات خاصة بتنفيذ BLI في نموذج UTI في الجسم الحي
نموذج حيواني
مزايا نموذج UTI مورين هي ثلاثة أضعاف: أنه يسمح لرصد تطور المرض في المسالك البولية الثدييات, الحيوانات وصيانتها غير مكلفة نسبيا, وخطوط متحولة متاحة. من ناحية أخرى ، عادة ما ينطوي تحريض العدوى على قسطرة عبر مجرى البول وغرس جرعة عالية من البكتيريا مباشرة في تجويف المثانة ، وبالتالي تجاوز العملية الطبيعية للصعود عبر مجرى البول5.
إسكان الحيوانات
يمكن تجميع الحيوانات أثناء التجربة. لقد درسنا حدوث انتقال العدوى بين الحيوانات من نفس القفص ، من خلال إدخال الحيوانات الحارسة في أقفاص مع الحيوانات المصابة. لم يكن لدى أي من الحيوانات الحارسة حمولة بكتيرية يمكن اكتشافها ، تقاس بكل من CFU و BLI.
حجم المثانة
عند الجمع بين نموذج مورين UTI مع BLI ، يجب على الباحثين الحفاظ على الخصائص التشريحية الفريدة للمثانة في الاعتبار. المثانة هي عضو أجوف يحتوي على كمية متفاوتة من البول. خلال التهاب المسالك البولية ، يمكن أن يؤثر وجود البول الموبوء بالبكتيريا نظريا على إجمالي عدد الفوتونات اعتمادا على درجة ملء المثانة. ومع ذلك ، فإن توحيد حجم المثانة غير عملي ويمكن أن يتدخل في التصميم التجريبي. وعلاوة على ذلك، في تجربتنا، والاختلافات في حجم المثانة لا يؤدي إلى اختلافات ذات دلالة إحصائية في تدفق الفوتون الكلي.
عينة درجة الحرارة
في المختبر BLI (أو كبديل أبسط وأرخص، قياس الإضاءة الحيوية في لومينوميتر) يمكن أيضا أن تستخدم لتحديد الحمل البكتيري على المتجانسات، البول، أو تعليق البكتيرية التي تحتوي على UTI89-لوكس. ومع ذلك ، فإن درجة حرارة العينة مهمة لأن انبعاث الفوتونات ينتج عن تفاعل أنزيمي وبالتالي يتطلب نشاطا أيضيا ووجود الأكسجين. وينبغي تجنب التغيرات الجذرية في درجة الحرارة أثناء حصاد الأعضاء عن طريق السماح للعينة بمعايرتها في المرحلة الساخنة (37 درجة مئوية) 5 دقائق قبل التصوير.
التطبيقات المحتملة وأهميتها
وباختصار، فإن الطريقة المرهقة في تعداد ال CFU تحد من إمكانية استنساخ وفعالية البحوث في مجال التهاب المسالك البولية. سوف الإعداد التجريبي مع BLI التقدم في البحوث في الجسم الحي UTI على فسيولوجيا المثانة، مسببات الأمراض UTI، والتعرض من خلال تمكين المتابعة الطولية، مع تقليل عدد الحيوانات اللازمة لهذه الأنواع من الدراسات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل بمنح من مؤسسة البحوث - فلاندرز (FWO فلاندرين؛ G0A6113N)، مجلس البحوث في جامعة لوفين (C1-TRPLe؛ تي في و دبليو إي) وVIB (إلى T.V.). W.E. هو باحث سريري كبير في مؤسسة البحوث - فلاندرز (FWO فلاندرين). سلالة UTI89-لوكس كان هدية سخية من مختبر البروفيسور سيد13.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
References
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).
- O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections. Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).
- Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
- Carey, A. J., et al. Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations. Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).
- Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H.
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Avci, P., et al. In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging. Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).
- Balsara, Z. R., et al. Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder. Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).
- Huang, Y. Y., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model. Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).
- Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
- Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A murine model for E. coli urinary tract infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).
- Zhang, Y., et al. Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis. Infectious Microbes & Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).
- Vanherp, L., et al. Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).
- Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).
- Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).
- Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).
- Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).
