Summary
Bu makalede, farelerde idrar yolu enfeksiyonuna neden olacak lüks bir operon ile üropatojenik bakterilerin intravesik yönetimi ve daha sonra biyolüminesans görüntüleme kullanılarak bakteri yükünün uzunlamasına in vivo analizi açıklanmaktadır.
Abstract
İdrar yolu enfeksiyonları (UTI) insanlarda en sık görülen bakteriyel enfeksiyonlar arasında yer almaktadır ve rutin olarak ampirik antibiyotiklerle tedavi edilmektedir. Bununla birlikte, artan mikrobiyal direnç nedeniyle, en çok kullanılan antibiyotiklerin etkinliği azaldı. Alternatif tedavi seçenekleri bulmak için, UTI patogenezinin ve UTI duyarlılığını belirleyen mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına büyük ihtiyaç vardır. Bunu bir hayvan modelinde araştırmak için, UTI'nin seyrini incelemek için tekrarlanabilir, invaziv olmayan bir test vazgeçilmezdir.
Yıllardır, bakteri yükünün numaralandırması için altın standart, belirli bir numune hacmi için Koloni Şekillendirme Birimlerinin (CFU) belirlenmesi olmuştur. Bu teknik, ölüm sonrası organ homojenasyonları ve seri seyreltmeler gerektirir, veri çıkışını ve tekrarlanabilirliği sınırlar. Alternatif olarak, biyolüminesans görüntüleme (BLI) bakteri yükünü belirlemek için popülerlik kazanıyor. Patojenlerin lüks bir operon ile etiketlenmesi, hassas algılama ve nicelemenin invaziv olmayan bir şekilde sağlanmasına izin verir, böylece boyuna takip sağlar. Şimdiye kadar, UTI araştırmalarında BLI'nin benimsenmesi sınırlı olmaya devam ediyor.
Bu makalede fare idrar yolu enfeksiyon modelinde BLI'nin pratik uygulaması açıklanmaktadır. Burada bakterileri kültleme, intravesik aşılama ve görüntüleme için adım adım bir rehber sağlanmaktadır. CFU ile in vivo korelasyon incelenir ve tedavi edilmemiş enfekte hayvanların bakteri yükünün antibiyotikle tedavi edilen hayvanlarla karşılaştırılmasıyla bir kavram kanıtı sağlanır. Ayrıca, bir in vivo UTI modelinde BLI uygulamasına özgü avantajlar, sınırlamalar ve hususlar tartışılmıştır. BLI'nin UTI araştırma alanında uygulanması, UTI patogenezinin araştırılmasını ve UTI'yi önlemenin ve tedavi etmenin yeni yollarının keşfedilmesini büyük ölçüde kolaylaştıracaktır.
Introduction
İdrar yolu enfeksiyonları (UTI) insanlarda en sık görülen bakteriyel enfeksiyonlar arasındadır. Tüm kadınların neredeyse yarısı yaşamları boyunca semptomatik bir UTI yaşayacaktır1. Mesane ile sınırlı enfeksiyonlar idrar sıklığında artış, aciliyet, hematüri, idrar kaçırma ve ağrı gibi idrar semptomlarına yol açabilir. Enfeksiyon üst idrar yoluna yükseldiğinde, hastalar halsizlik, ateş, titreme ve sırt ağrısı ile pyelonenfrit geliştirir. Ayrıca, UTI'li hastaların% 20'sine kadarı tekrarlayan enfeksiyonlardan muzdariptir ve antibiyotik duyarlılığında dramatik bir azalmaya neden olan2,3,4. Son yıllarda, tekrarlayan UTI'nin tedavisi ve önlenmesi için yeni tedavilere ilgi artmaktadır. Alt idrar yollarının doğuştan gelen ve uyarlanabilir bağışıklığının ve istila ve kolonileşme için gerekli bakteriyel virülans faktörlerinin daha iyi anlaşılmasına rağmen, tedavi rejiminde radikal bir değişiklik günlük ürolojik uygulamaya çevrilmemiştir2. UTI patogenezini ve duyarlılığını vivoincelemek için tekrarlanabilir ve invaziv olmayan bir test vazgeçilmezdir.
Nematodlardan primatlara kadar birçok hayvan UTI modeli tanımlanmıştır, ancak murine modeli ağırlıklı olarak5,6. Bu model, (dişi) farelerin transüretral kateterizasyonu ve daha sonra bakteriyel süspansiyonun, en yaygın olarak üropatojenik Escherichia coli'nin (UPEC), doğrudan mesane lümenine7. Aşılamadan sonra, bakteri yükü geleneksel olarak koloni şekillendirme üniteleri (CFU) belirlenerek ölçülmüştir. Bu teknik, hayvanların ölüm sonrası organ homojenatları ve seri seyreltmeler elde etmesini, veri çıkışını ve tekrarlanabilirliğini sınırlamasını gerektirir. Ayrıca, bireysel hayvanlarda bakteri yükünün boyuna takibi bu teknik kullanılarak mümkün değildir.
1995 yılında Contag ve arkadaşları, canlı hayvanlarda hastalık süreçlerini izlemek için biyolüminesan etiketli patojenlerin kullanılmasınıönerdi 8,9. O zamandan beri, biyolüminesans görüntüleme (BLI) menenjit, endokardit, osteomiyelit, cilt ve yumuşak doku enfeksiyonları gibi çok sayıda enfeksiyon modeline uygulanmıştır10,11,12. Murine UTI modelinde, Photorhabdus lüminesanslarından tam lüks operon (luxCDABE) ile bir UPEC suşukullanılabilir 13. Enzymatic reaksiyon, oksijen varlığında azaltılmış flavin mononükleotid ile reaksiyona giren uzun zincirli aldehitlerin oksidasyonuna bağlı olan bakteriyel luciferaz tarafından katalize edilir, oksitlenmiş flavin, uzun zincirli bir yağ asidi ve ışık12verir. Lüks operon, luciferaz ve substratların sentezi için gerekli diğer enzimler için kodlar. Bu nedenle, metabolik olarak aktif olan tüm bakteriler, eksojen bir substratın enjeksiyonuna gerek kalmadan sürekli olarak mavi yeşil (490 nm) ışık yayar12. Lüksetiketli bakterilerin yaydığı fotonlar, son derece hassas, soğutulmuş şarj bağlantılı cihaz (CCD) kameralar kullanılarak yakalanabilir.
Biyolüminesan bakterilerin UTI için bir modelde kullanılması, bakteri yükünün boyuna, invaziv olmayan niceliğine izin verir ve CFU tayini için takip sırasında sabit zaman noktalarında hayvanları kurban etme ihtiyacını atlar. Bu BLI tekniğinin diğer alanlardaki sağlamlığı ve klasik UTI modellerine göre avantajları için kanıt biriktiren çok çeşitli olanaklara rağmen, UTI araştırmasında yaygın olarak uygulanmamıştır. Burada sunulan protokol, ayrıntılı bir adım adım kılavuz sağlar ve BLI'nin gelecekteki tüm UTI araştırmaları için avantajlarını vurgular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Avrupa Birliği Toplum Konseyi yönergelerine uygun olarak yapılmış ve KU Leuven Hayvan Etik Komitesi (P158/2018) tarafından onaylanmıştır.
1. Kült bakteriler(7,13,14'tenuyarlanmıştır)
- Hazırlık
- Deneysel ihtiyaçlara en uygun parlak upec suşu seçin.
NOT: Burada, klinik sistit izole, UTI89 (E. coli), hem insanlarda hem de kemirgenlerde üropatojenik kapasitesi ve murine UTI modellerinde yaygın kullanımı nedeniyle seçilmiştir5,7,15. Komple lüks operonu (luxCDABE) taşıyan biyolüminesan izojenik suş, UTI89-luxolarak da adlandırılır. Bu operon ayrıca kanamycin sülfat (Km) direnç genleri taşır. Bu nedenle, Km biyolüminesan kolonileri seçmek için kullanılabilir13. - Seçilen bakteri suşu7için 600 nanometrede (OD 600 nm) CFU ve optik yoğunluk için bir korelasyon eğrisi yapın.
- Bunu yapmak için, kültür bakterileri (aşağıdaki protokolü kullanarak) ve fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 8 farklı seyreltme yapın. Tüm bu seyreltmeler için OD'yi 600 nm olarak ölçün ve CFU'yı belirlemek için Luria-Bertani (LB) plakalarına plakalayın.
- Korelasyonu belirlemek ve standart bir eğri elde etmek için OD 600 nm değerlerini ve CFU değerlerini çizin.
NOT: Gelecekteki deneyler için, OD'yi 600 nm olarak ölçün ve CFU'nun bakteriyel bir çözeltide anında tahminini elde etmek için bu standart eğriyi kullanın.
DİkKAT: UPEC patojenik bakterilerdir, odaların uygun şekilde donatılmasına ve kişisel koruyucu ekipman kullanılmasına dikkat edin.
- Deneysel ihtiyaçlara en uygun parlak upec suşu seçin.
- Aşılamadan üç gün önce
- 50 μg/mL Km ile desteklenmiş LB plakaları ve 37 °C'de bir gecede kültür ile desteklenmiş bir aşılama döngüsü kullanarak bakteri gliserol stokunu çizerek tek koloniler elde edin. Bu plakaları 1 haftaya kadar 4 °C'de saklamak için bir parafin filmi ile kapatın.
- Aşılamadan iki gün önce
- Steril 14 mL polistiren yuvarlak alt tüpü 50 μg/mL Km ile desteklenmiş 5 mL LB suyu ile çift konumlu snap kapaklarla doldurun. Uygun karıştırmayı sağlamak için 10 sn için girdap.
- Bir gecede 37 °C'de açık konumda yapıştırı kapağıyla statik olarak kültüre yerleştirin.
NOT: E. coli'nin statik büyümesi, idrar epitel hücrelerinin yapışma ve istilası için kritik olan tip 1-pili ifadesini teşvik eder. - Steril bir Erlenmeyer veya kültür şişesi hazırlayın.
- Aşılamadan bir gün önce
- Kuluçkadan sonra, bakteri kültürünün uygun homojenizasyonunu sağlamak için tüpü 10 sn boyunca girdap. Antibiyotiksiz 25 mL taze LB ortamına 25 μL bakteri süspansiyonu ekleyerek Erlenmeyer'de bir alt kültür yapın.
- Erlenmeyer ve kültürü statik olarak 37 °C'de bir gecede kapatın.
- Aşılama gününde
- Uygun karıştırmayı sağlamak için 10 sn için Erlenmeyer Girdabı.
- Erlenmeyer'deki kültürü 50 mL'lik bir kültür tüpüne ve 3.000 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüje dökün. Süpernatantı deklare edin ve bakteri peletini 10 mL steril PBS ve girdapta tekrar 10 sn.
- Inoculum 'un (CFU) deneysel konsantrasyonu seçin ve karşılık gelen OD 600 nm'yi belirlemek için 1.1.2 adımında elde edilen standart eğriyi kullanın.
- 9 mL steril PBS'ye 1 mL resüspended bakteri kültürünü ekleyin ve OD'yi 600 nm'de kontrol edin. İstenen OD 600 nm'ye ulaşılana kadar steril PBS veya konsantre bakteri çözeltisi ekleyerek daha fazlaayarlayın.
NOT: Örneğin, UTI89-lux için, OD 600 nm 0,45'e ulaşana kadar PBS ekleyerek kültürü ayarlayın, bu da 2 x 107 CFU/50 μL'ye karşılık gelir. Uygulanabilir CFO'ların sayısını doğrulamak için, 300'den az koloni elde etmek için üç taraflı olarak LB plakalarında beşinci ve altıncı 10 kat seyreltmelerin 10 kat seri seyreltmelerini ve plakasını 50 μL yapın. 37 °C'de gece kuluçkadan sonraki gün elde edilen kolonileri sayın, OD 600 nm anında okuma verir, ancak kalite kontrol olarak CFU kullanır.
2. Hayvanların aşıları(7,16'danuyarlanmıştır)
- Hayvanların hazırlanması
- Araştırma sorusuna ve nakavt hatlarının mevcudiyetine, deneysel ayrıntılara ve UTI duyarlılığındaki farklılıklara bağlı olarak istediğiniz fare zorlanmasını seçin5,17. Transüretral kateterizasyonun dişi farelerde daha kolay olduğunu unutmayın. İmmünolojik olarak olgunlaşmamış oldukları için 8 haftadan küçük hayvanları kullanmayın. Burada 12 haftalık dişi C57Bl/6J fareler kullanıldı.
- Hayvanları önceden sipariş edin ve ideal olarak 7 gün boyunca alışmalarına izin verin. Ev hayvanlarını standart 12 saat açık/karanlık koşullar altında ayrı ayrı havalandırılan kafeslerde gruplandırın.
- Sinyal kaybını sınırlamak için hayvanların karın bölgesini tıraş edin. Hayvanların cildini hızlı bir şekilde yakabileceğinden epilasyon kremi kullanmayın. Baskın elle tıraş olurken scruff ve arka uzuvları baskın olmayan el ile sıkıca tutarak hayvanı zapt edin. Alternatif olarak, izofluran anestezisi altında tıraş edin.
NOT: Hayvanlar, tıraş edilen bölgeyi daha da tımar edecekleri düşünüldüğünde, görüntülemeden 2 gün önce tıraş edildi. - Deney boyunca su ve standart gıda reklam libitum sağlayın. Bununla birlikte, aşılama sırasında mesane hacmini en aza indirmek için aşılamadan önce hayvanları sudan 2 saat mahrum edin.
- Steril 24 G anjiyokateter ucunu 100 μL şırındıya monte edin ve şırınnayı 1.5.3 adımında hazırlanan bakteri çözeltisi ile doldurun.
NOT: Arka plan parlaklığını belirlemek için, aşılamadan önce temel bir görüntü elde edin (aşağıdaki adım 3'e bakın).
- Hayvanların aşılanması
- Hayvanları bir indüksiyon odasına yerleştirin ve taşıyıcı gaz olarak saf oksijenle izofluran soluma kullanarak uyuşturun (% 3'te indüksiyon ve% 1.5'te bakım).
- Bir hayvanı supine pozisyonunda çalışan bir yüzeye yerleştirin ve aşılama sırasında burun konisi kullanarak kararlı bir izofluran anestezisi sağlayın. Göz merhemini uygulayın.
- Hafif kompresyon uygulayarak ve suprapubik bölgeye dairesel hareketler yaparak artık idrarı dışarı atın. Aşılamadan önce alt karnı% 70 etanol ile temizleyin.
- Kateter ucunu normal salin ile yağlayın. Baskın olmayan elin işaret parmağını karın üzerine koyun ve hafifçe yukarı doğru itin. Üretranın kateterizasyonunu 90° açıyla (dikey olarak) başlatın ve dirençle karşılaşıldığında, daha fazla yerleştirmeden önce yatay olarak eğin (0,5 cm).
NOT: Kateteri asla zorla itmeyin, çünkü bu üretraya zarar verecektir. Nazik tornalama hareketleri kateter takılmasında yardımcı olabilir. Öte yandan, direnç eksikliği genellikle vajinaya hatalı yerleştirmeyi gösterir. - Bakteriyel inoculum'un (2 x 107 CFU) 50 μL'lik yavaş (5 μL/s) aşısını gerçekleştirin.
NOT: Daha yüksek hacimlerde veya daha hızlı aşılama böbreklerde reflüye neden olabilir. Tekniğin uygulanması sırasında, reflü değerlendirmek için mavi mürekkep kullanılabilir. - Aşılamadan sonra, şırınna ve kateteri birkaç saniye daha yerinde tutun ve ardından sızıntıyı önlemek için yavaşça geri çek. Yüksek miktarda sızıntı veya kanlı bir meatus gibi düzensizlikleri kaydedin ve gerekirse hayvanları hariç tutun.
- Hayvanı görüntüleme odasının burun konisinde supine pozisyonda konumlandırın ve kalan tüm hayvanlar için önceki 2.1.1-2.1.6 adımlarını tekrarlayın. Deney grubu başına bir kateter kullanın. Anesteziye devam edilip ilk ve son hayvan arasındaki süreyi en aza indirdiğinizi sağlayın.
- Gerekirse, görüntülemeden önce veya sonra antibiyotik veya deneysel ilaçlar sanın (adım 3). Örneğin, enrofloksasin uygulamak için, 1/100 seyreltme elde etmek için 3,96 mL fizyolojik saline 40 μL enrofloksasin (100 mg/mL) çözeltisi ekleyin. 3 gün boyunca günde iki kez 10 mg/kg enrofloksasin uygulamak için 100 μL/10 g deri altından 09:00 ve 17:00'de enjekte edin.
3. Biyolüminesans görüntüleme
- Görüntüleme parametrelerinin hazırlanması ve seçimi
- BLI alma yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu)ve kamera ve sahne kontrol sistemini test etmek ve CCD kamerayı -90 °C'ye soğutmak için görüntüleme cihazında Başlat'a tıklayın (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Bu işlem sırasında kapı kilitlenir ve başlatmanın ilerlemesi kontrol panelinde takip edilebilir. Yeşil ışık -90 °C sıcaklığa ulaşılmasını gösterir. Başlatma tamamlanmadan önce görüntüleme deneniyorsa bir uyarı görüntülenir. - Verilerin otomatik olarak kaydedildik mi: Edinme Otomatik kaydetme'ye tıklayın ve doğru klasörü seçin.
- Lüminesans ve Fotoğraf'ı seçin. Varsayılan lüminesans ayarlarını denetleme: Heyecan filtresini Engelle ve emisyon filtresini Açolarak ayarlayın.
- İlk görüntüyü çekerken, özellikle de yeterli sayıda foton sayımı sağlamak için loş bir sinyal beklerken pozlama süresini Otomatik olarak ayarlayın. In vivo ölçümler ve parlak sinyaller için Pozlama Süresini ~30 s olarak ayarlayın. Görüntü doymuşsa, bir uyarı görüntülenir. Bu durumda, pozlama süresini azaltın.
- Orta Binning, F/stop 1'i seçin ve doğru görüş alanını (FOV) (5 hayvan için D) seçin.
- Fareleri görüntülerken konu yüksekliğini 1 cm olarak ayarlayın.
- Teknik çoğaltma olarak üç görüntüden oluşan bir dizi elde etmek için Edinme Denetim Masası'nda Üç kez ekle'ye tıklayın.
- BLI alma yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu)ve kamera ve sahne kontrol sistemini test etmek ve CCD kamerayı -90 °C'ye soğutmak için görüntüleme cihazında Başlat'a tıklayın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Görüntüleme
- Fareleri supine pozisyonunda görüntüleme odasına yerleştirin ve deney boyunca anesteziyi (%1,5) korumak için manifold burun konisini kullanın. Aynı anda 5 fareye kadar görüntü ve yansımayı önlemek için ışık şaşkınlıklarını kullanarak hayvanları ayırın.
- Kapıyı kapatın ve görüntüleme sırasını başlatmak için Edin'e tıklayın.
- Deney hakkında ayrıntılı bilgi (vahşi tip ve nakavt hayvanları, tedaviler, görüntüleme günü vb.) doldurun. Pozlama süresi gibi görüntüleme ayarları otomatik olarak kaydedilir.
- Fareleri görüntüleme odasından çıkarın ve kafeslerine geri verin. Anesteziden sonra tam iyileşme olup olmadığını kontrol edin. Birkaç dakika içinde, hayvanlar tamamen uyanık ve araştırmacı olmalıdır. UTI kursuna müdahale edebileceğinden analjezi sağlamayın18.
- Kafesleri bir sonraki görüntüleme döngüsüne kadar havalandırılan raflara geri verin. Deney tamamlandıktan sonra, hayvanları CO2 boğulma veya servikal çıkık ile ötenazi yapın. Sıkıntıyı en aza indirmek için izofluran anestezisinin iyileşmesinden önce bunu yapın.
- Görüntülerin analizi
- Görüntüleme yazılımını başlatın ve Gözat 'ı tıklatarak deneysel dosyayı yükleyin.
- Görüntünün renk ölçeğini ayarlamak için Araç Paleti'ni kullanın. Tüm görüntüler için aynı ayarları kullanarak sonuçların görsel yönünü standartlaştırın, yani en az 104 ila en fazla 107 foton içeren logaritmik bir ölçek kullanın. Bu ayarlamalar ham verileri değil, yalnızca grafiksel sunuyu etkiler.
- Görüntüye ilgi çekici bir bölge (YATıRıMGK) çizmek için yatırım getirisi araçlarını kullanın. Yatırım getirisinin tüm alanı kaplayacak kadar büyük olduğundan emin olun ve tüm görüntüler için aynı boyutları kullanın. Burada alt karın bölgesi üzerine 3,5 cm x 4,5 cm kare YÇ yerleştirildi.
- Işık yoğunluğunu (sayımlar veya toplam foton akısı) ölçmek için yatırım getirisi ölçümüne tıklayın. Bu verileri dışa aktar ve teknik çoğaltmaların ortalamasını kullan.
NOT: Sayımlar kamera tarafından algılanan foton sayısını temsil eder ve yalnızca görüntü kalitesi kontrolü için kullanılmalıdır. Verileri raporlamak için toplam foton akısını kullanın. Toplam foton akısı, yüzeyden yayılan ışığı temsil ettiği için fizyolojik olarak daha alakalıdır ve maruz kalma süresi (saniyede) için düzeltilen kalibre edilmiş bir ünitedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo BLI, aşılama anında inoculumun CFU'su ile ilişkilidir.
Vivo BLI'nin algılama sınırını ve inoculumun CFU ile korelasyonunu değerlendirmek için, farelere negatif kontrol olarak farklı UTI89-lux ve PBS konsantrasyonları bulaştı. Aşılamadan önce, enfekte olmayan hayvanlar arka plan lüminesansını belirlemek için tarandı. Sonraki görüntüler aşılamadan hemen sonra elde edildi (Şekil 1A). UTI89-lux'unaşılanmasından sonra, biyolüminesans 2 x 104 CFU'nun üzerinde sağlam bir şekilde tespit edildi ve inoculum ve biyolüminesans CFU'su arasında doğrusal bir korelasyon kuruldu (Şekil 1B). Buna karşılık, toplam foton akısı PBS ile aşılanan hayvanlar için arka plan sinyalleriyle ve 2 x 103 CFU'luk en düşük bakteri konsantrasyonunda karşılaştırılabilirdi.
Tedavi sırasında boyuna takip için bir araç olarak BLI
Doğrulanmış bir antibiyotik tedavisinin iyileştirici etkisinin boyuna BLI kullanılarak gösterilip gösterilemeyeceğini belirlemek için, 20 hayvana 2 x 107 CFU/50 μL'lik bir inokülyum bulaştı ve bu hayvanlardan 10'u enfeksiyon sonrası ilk 3 gün boyunca günde iki kez enrofloksasin 10 mg/kg deri altı ile tedavi edildi. Hem enfekte ancak tedavi edilmemiş kontrol grubundaki doğal evrim hem de antibiyotik tedavisinin tedavi edilen gruptaki enfeksiyon kinetiği üzerindeki etkisi ayrıntılı olarak görselleştirilebilir (Şekil 2). Toplam foton akısı ile ölçülen bakteriyel yükte hemen bir azalma, ilk doz enrofloksasinden sonra görüldü. Tedavi edilen hayvanların hiçbirinde bakteri yükünde daha sonra bir artış olmadı. Enfekte ancak tedavi edilmeyen kontrol grubundaki denekler arası değişkenlik daha yüksekti ve bakteri yükündeki azalma daha yavaştı. 10. günde, kontrol grubunun 10 hayvanından 8'i, aşılama öncesi geçmişleriyle karşılaştırılabilir bir BLI sinyaline geri dönmüştü. Her hayvan için genel bakteri yükü, kütükle dönüştürülmüş toplam foton akısının eğrisi (AUC) altındaki alan kullanılarak hesaplandı. 10 gün boyunca enrofloksasin ile tedavi edilen hayvanlar ve tedavi edilmeyen hayvanlar arasında önemli bir fark gözlendi. Bu sonuçlar, BLI'nin potansiyel bir tedavinin bir UTI'nin hastalık seyri üzerindeki etkisini değerlendirmek için güçlü bir araç olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: In vivo BLI, aşılama sırasında inoculumun CFU'su ile ilişkilidir. (A) Artan inoculum konsantrasyonları (2 x 103-2 x 108 CFU) ile enfekte olmuş farelerin in vivo BLI ile elde edilen temsili görüntüler mesaneye bakteriyel aşılamadan hemen sonra görüntülenmiştir. CFU = Koloni Şekillendirme Birimleri. (B) Mesane bölgesine yayılan biyolüminesans miktarının (toplam foton akısı) inoculum (CFU) konsantrasyonuna göre ölçülmesi. BLI sinyali 2 x 104 CFU'nun üzerinde güçlü bir şekilde tespit edildi (arka plana kıyasla p = 0.0002 ve PBS kontrolüne kıyasla p = 0.015, eşleşmeyen t-test). 2 x 103-2 x 108 CFU arasında değişen inokuli için Pearson korelasyonu r = 0.9995 idi (p < 0.0001). BG = arka plan, PBS = Fosfat Tamponlu Salin, CFU = Koloni Şekillendirme Üniteleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tedavi sırasında boyuna takip için bir araç olarak BLI. (A) UTI89-lux'un 2 x 107 CFU'su ile enfekte olan ve3 gün boyunca günde iki kez enrofloksasin 10 mg/kg ile tedavi edilen hayvanlar için toplam foton akısının bireysel izleri (mavi) ve tedavi edilmemiş bir kontrol grubuna (siyah), n = grup başına 10. BG = arka plan. (B) Panel A'da gösterilen hayvanlardan elde edilen izlerin analizi, hem enrofloksasin (mavi) hem de kontrol grubu (siyah) için log dönüştürülmüş toplam foton akısının AUC'sini bildirir. N = Grup başına 10, ortalama ± SD, eşleşmeyen t-test p < 0.0001. AUC = Eğrinin altındaki alan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BLI'nin CFU sayılarına göre avantajları
Boyuna veriler
Mikrobiyal yükü ölçmek için geleneksel CFU sayma yönteminin en büyük dezavantajı, hayvan başına sadece bir kesitsel veri noktası sağlayan ölüm sonrası organ homojenatlarının gereksinimidir. Tersine, BLI enfekte hayvanların invaziv olmayan boyuna takibini sağlar. Hayvanlar günde 2 ila 3 kez görüntülenebilir ve enfeksiyonun kinetiği hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Ek olarak, aynı hayvanın tekrarlanan önlemleri, yeterli güçlendirilmiş deneyler için gereken hayvan sayısını büyük ölçüde azaltır. Ayrıca, araştırmacılar bireyler arası değişkenliğe odaklanabilir ve hayvanları yeni bir ajanla incelemeden veya tedavi etmeden önce, gerçek zamanlı verileri kullanarak önceden belirlenmiş bakteri yüklerine sahip hayvanları seçebilirler. Öte yandan, bir deneyin AUC'sini kullanmak, araştırmacıların tek bir kesitsel değere değil, genel bakteri yüküne odaklanmalarını sağlar. UTI ayarındaki uzunlamasına ve gerçek zamanlı verilerin katma değeri fazla tahmin edilemez.
Enfeksiyonun yayılmasının tanımlanması
BLI ile elde edilen görüntülerin mekansal çözünürlüğü, lüks veya FLuc etiketlipatojenler tarafından kolonize edilen diğer bölgeleri tanımlamak için yeterlidir19. UTI için, böbreklere artan enfeksiyonlar veya kana yayılma son derece alakalı bulgulardır. Bu deneysel ortamda, UTI89-lux'un neden olduğu enfeksiyonların alt idrar yollarının ötesine yayıldığı gözlenmedi. Bu suş ağırlıklı olarak sistite neden olduğu düşünüldüğüde bu bekleniyordu.
Veri tekrarlanabilirliği ve karşılaştırması
BLI kullanırken deneylerin tekrarlanabilirliği CFU sayılarına kıyasla daha yüksektir. Klasik olarak, homojenatların seri 10 kat seyreltmelerinin triplikatları kaplanır ve sadece 30 ila 300 CFU'lu plakalar toplam CFU sayısını hesaplamak için sayılır. Bu yöntem hantaldır, yüksek değişkenliğe eğilimlidir, birçok beyhude plaka ile sonuçlanır ve insan hatalarına son derece eğilimlidir. Ayrıca, CFU'nun gram mesane dokusu başına, mesane başına veya 1 mL homojenatı başına nasıl bildirilir konusunda bir fikir birliği yoktur. Bu, farklı grupların sonuçlarının karşılaştırılmasını son derece zorlaştırır ve BLI ve toplam foton akısı kullanılarak düzeltilebilir.
Yöntemin dikkat edilmesi gereken noktalar ve sınırlamaları
Fotonların kürk veya hemoglobin ile emilimi gibi BLI in vivo ile ilgili klasik hususların yanı sıra, kurban anında BLI ve CFU sayılarını ilişkilendirirken yapılması gereken bazı hususlar vardır.
İlk olarak, kurban sırasında her iki yöntem arasındaki tutarsızlıklarla karşılaşılır20Özellikle antibiyotik tedavileri kullanıldığında. Bu nedenle, kurban anında BLI ve CFU sayıları arasındaki korelasyon yetersiz olabilir ve mutlaka ilgili değildir. BLI için, toplam foton akısı beklenenden daha düşük olabilir, çünkü zorlanan bakteriler metabolizmalarını ışık emisyonu yerine iyileşme ve onarım süreçlerine yönlendirebilir. Ek olarak, BLI ölçümü, bakterilerin ve metabolizmalarının bir anlık görüntüsünü gerçek zamanlı in vivo olarak yakalar ve bakteriler görüntüleme sırasında uykuda veya uzun durumdaysa daha düşük BLI sinyalleri ile sonuçlanır. Öte yandan, CFU tayini için, ilaca meydan okuyan bakteriler bulaşıcı yaşam alanlarından (yani bir biyofilm) çıkarıldıktan ve kaplandıktan sonra ya hep ya hiç şeklinde tepki verirler. Agar üzerine kaplandıktan sonra, meydan okuyan bakteriler geri alınamaz şekilde yaralanabilir ve gözlemlenebilir kolonilere dönüşemez, bu da daha düşük CFU sayısı21ile sonuçlanır. Ek olarak, meydan okuyan bakteriler uygulanabilir ancak kült olmayan bir duruma (VBNC) girebilir. Metabolik olarak aktif ve uygulanabilir kalırlar, ancak artık standart laboratuvar ortamlarında kültleşemezler. VBNC durumuna giren veya biyofilmlerde organize olan bakteriler BLI ile kolayca tespit edilebilirken, CFU'nun numaralandırması21 , 22,23ek işlem gerektirir. Sonuç olarak, biyolüminesans ve uygulanabilir sayımlar hücre fizyolojisinin farklı yönlerini ölçmektedir ve ikisi de hücre canlılığının kesin göstergesi olarak kabul edilmemelidir21.
Ayrıca, BLI veya CFU sayımları ile ölçülen bakteri yükünün tanımı, numune işlemedeki farklılıklar nedeniyle farklıdır. CFU sayımları kullanırken, sadece mesane duvarında bulunan bakteriler homojeneye dahil edilir ve sayılır. Bunun aksine, BLI ayrıca idrar ve üretradaki bakterilerin yaydığı fotonları da yakalar. Bize göre, ikincisi anatomik olarak ilgili tüm bölmeleri (mesane, idrar ve üretra) içerdiğinden, toplam bakteri yükünün fizyolojik olarak daha doğru bir temsilidir.
CFU sayılarının aksine, BLI genetik olarak değiştirilmiş lüminesan bakterilerin üretilmesini gerektirir. Ekleme bölgesine bağlı olarak, lux operon'un genoma girmesinin bakteri türünün virülans potansiyelini değiştirebileceği akla yatkındır. Bu nedenle, yeni bir biyolüminesans suşu geliştirirken, virülansı ve büyüme özellikleri ebeveyn suşu ile karşılaştırılmalıdır10,13. Bununla birlikte, genom düzenlemedeki son gelişmeler, tüm büyük bakteriyel patojenlerin verimli ve izsiz etiketlenmesine izin verir, böylece virülans veya tedavi yanıtları üzerindeki etkiyi sınırlar. Ayrıca, genetik mühendisliği biyolüminesans muhabiri genlerinin koşullu ekspresyona ve bu nedenle ilgili bakteri üremelerinin in vivo ölçümüne, genekspresyonlarınavb.
Son olarak, in vivo BLI için gelişmiş görüntüleme cihazına ve satın alma yazılımına erişim, CFU numaralandırması için gereken temel ekipmana kıyasla sınırlayıcı bir faktör olabilir. Bununla birlikte, görüntüleme çekirdekleriyle yapılan işbirlikleri BLI için gerekli giderleri ve yatırımları en aza indirebilir.
Vivo UTI modelinde BLI uygulamasına özgü hususlar
Hayvan modeli
Bir murine UTI modelinin avantajları üç kattır: Memeli idrar yollarındaki hastalığın ilerlemesinin izlenmesine izin verir, hayvanlar ve bakımları nispeten ucuzdur ve mutant çizgileri mevcuttur. Öte yandan, enfeksiyonun indüksiyonu genellikle transüretral kateterizasyon ve daha sonra yüksek dozda bakterinin doğrudan mesane lümenine aşılanmasını gerektirir, böylece üretra yoluyla doğal yükseliş sürecini atlar5.
Hayvan konutları
Deney sırasında hayvanlar grup olarak barındırılabilir. Sentinel hayvanlarını enfekte hayvanların olduğu kafeslere sokarak, aynı kafesteki hayvanlar arasında bulaşma oluşumunu inceledik. Nöbetçi hayvanların hiçbirine hem CFU hem de BLI ile ölçülen tespit edilebilir bakteri yükü yoktu.
Mesane hacmi
Murine UTI modelini BLI ile birleştirirken, araştırmacılar mesanenin benzersiz anatomik özelliklerini akılda tutmalıdır. Mesane, değişen miktarda idrar içeren içi boş bir organdır. UTI sırasında, bakteri istilası altındaki idrarın varlığı, mesane dolgusunun dereceye bağlı olarak teorik olarak toplam foton sayısını etkileyebilir. Bununla birlikte, mesane hacminin standardizasyonu pratik değildir ve deneysel tasarıma müdahale edebilir. Ayrıca, deneyimlerimize göre, mesane hacmindeki farklılıklar toplam foton akısında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklara neden olmaz.
Numune sıcaklığı
Tüp bebek BLI (veya daha basit ve daha ucuz bir alternatif olarak, bir luminometrede biyolüminesansı ölçmek) homojenatlar, idrar veya UTI89-lux içeren bakteriyel süspansiyonlar üzerindeki bakteri yükünü belirlemek için de kullanılabilir. Bununla birlikte, fotonların emisyonu enzymatic reaksiyondan sonuç olarak numunenin sıcaklığı önemlidir ve bu nedenle metabolik aktivite ve oksijenin varlığını gerektirir. Numunenin görüntülemeden 5 dakika önce ısıtılmış (37 °C) aşamada kalibre edilmesine izin vererek organ hasadı sırasında sıcaklıktaki sert değişikliklerden kaçınılmalıdır.
Potansiyel uygulamalar ve önem
Özetle, CFU'nun hantal numaralandırma yöntemi, UTI alanındaki araştırmaların tekrarlanabilirliğini ve etkinliğini sınırlıyordu. BLI ile deneysel kurulum, bu tür çalışmalar için gerekli hayvan sayısını azaltırken, boyuna takip sağlayarak mesane fizyolojisi, UTI patogenez ve duyarlılık üzerine vivo UTI araştırmalarında ilerleyecek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Bu çalışma Araştırma Vakfı tarafından desteklendi - Flanders (FWO Vlaanderen; G0A6113N), KU Leuven Araştırma Konseyi (C1-TRPLe; T.V. ve W.E.) ve VIB (T.V.'ye). W.E., Flanders (FWO Vlaanderen) Araştırma Vakfı'nın kıdemli klinik araştırmacısıdır. UTI89-lux türü, Prof. Seed'in laboratuvarından cömert bir hediyeydi13.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
References
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).
- O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections. Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).
- Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
- Carey, A. J., et al. Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations. Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).
- Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H.
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Avci, P., et al. In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging. Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).
- Balsara, Z. R., et al. Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder. Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).
- Huang, Y. Y., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model. Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).
- Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
- Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A murine model for E. coli urinary tract infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).
- Zhang, Y., et al. Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis. Infectious Microbes & Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).
- Vanherp, L., et al. Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).
- Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).
- Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).
- Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).
- Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).
