Summary
이 원고는 생물 발광 이미징을 사용하여 세균 부하의 생체 내 분석에서 마우스의 요로 감염을 유도하기 위해 호화 요법 을 가진 비뇨기과 박테리아의 내막 투여를 설명합니다.
Abstract
요로 감염 (UTI) 인간에서 가장 일반적인 세균 성 감염 중 순위 와 정기적으로 경험적 항생제로 치료. 그러나, 미생물 저항증가 때문에, 가장 많이 사용된 항생제의 효험은 쇠퇴했습니다. 대체 치료 옵션을 찾기 위해, UTI 병인및 UTI 감수성을 결정하는 기계장치의 더 나은 이해를 위한 중대한 필요가 있습니다. 동물 모델에서 이를 조사하기 위해, UTI의 과정을 연구하는 재현 가능한 비침습적 분석은 필수적입니다.
수년 동안, 세균 부하의 열거에 대한 금 본위제는 특정 시료 부피에 대한 콜로니 성형 유닛(CFU)의 결정이었다. 이 기술은 사후 장기 균질화 및 직렬 희석을 요구하여 데이터 출력과 재현성을 제한합니다. 대안으로, 생물 발광 화상 진찰 (BLI)는 세균 부하를 결정하기 위하여 인기를 얻고 있습니다. 럭스 오페론을 가진 병원체를 라벨링하면 비침습적 방식으로 민감한 검출 및 정량화를 허용하여 세로 후속 조치를 가능하게 합니다. 지금까지, UTI 연구에서 BLI의 채택은 제한 남아.
이 원고는 마우스 요로 감염 모델에서 BLI의 실제 구현을 설명합니다. 여기에서, 박테리아를 배양하기위한 단계별 가이드, 내장 주입 및 이미징이 제공됩니다. CFU와의 생체 내 상관 관계를 검사하고 항생제 치료 동물과 치료되지 않은 감염된 동물의 세균 부하를 비교하여 개념 증명이 제공됩니다. 또한 생체 내 UTI 모델에서 BLI 구현과 관련된 장점, 제한 및 고려 사항에 대해 논의합니다. UTI 연구 분야에서 BLI의 구현은 크게 UTI의 병인에 대한 연구와 요로 감염을 예방하고 치료하는 새로운 방법의 발견을 용이하게 할 것입니다.
Introduction
요로 감염 (UTI)은 인간에서 가장 흔한 세균 감염 중 하나입니다. 모든 여성의 거의 절반은 일생 동안 증상 UTI를 경험하게 될 것입니다1. 방광에 국한된 감염은 오줌 주파수, 긴급성, 혈뇨증, 요실금 및 고통의 증가와 같은 오줌 현상을 초래할 수 있습니다. 감염이 위요로 올라갈 때, 환자는 불쾌감, 발열, 오한 및 허리 통증으로 열성염을 일으킵니다. 더욱이, UTI를 가진 환자의 최대 20%는 항생감2,3,4의극적인 감소의 결과로 재발성 감염 때문에 손해를 입습니다. 최근 몇 년 동안, 재발성 UTI의 치료 및 예방을위한 새로운 치료에 대한 관심이 증가하고있다. 하부 요로의 선천적이고 적응력있는 면역력과 침략과 식민지화에 필요한 세균성 독성 요인에 대한 더 나은 이해에도 불구하고, 치료 정권의 급진적인 변화는 매일 비뇨기과 연습2로번역되지 않았다. 유로병증과 생체내감수성을 연구하기 위해서는 재현 가능한 비침습적 분석이 필수적입니다.
여러 동물 UTI 모델은 선충에서 영장류에 이르기까지 설명되었지만, 뮤린 모델은 주로5,6을사용한다. 본 모델은 (여성) 마우스의 경도 카테터삽입과 세균현탁액의 후속 주입, 가장 일반적으로 비뇨기과 성 대장균(UPEC), 방광 루멘7로직접 구성된다. 접종 후, 세균부하는 전통적으로 식민지 형성 단위(CFU)를 결정함으로써 정량화되었다. 이 기술은 동물에게 사후 장기 균질화 및 직렬 희석을 얻기 위해 희생하여 데이터 출력과 재현성을 제한해야 합니다. 더욱이, 개별 동물에서 세균 부하의 세로 후속은이 기술을 사용하여 불가능합니다.
1995년, 전염병 외는 살아있는 동물의 질병 과정을 모니터링하기 위해 생물발광성 태그병원균의 사용을제안8, 9. 그 이후, 생물발광 이미징(BLI)은 뇌막염, 내막염, 골수염, 피부 및 연조직 감염 등과 같은 수많은 감염 모델에 적용되어10,11,12. 뮤린 UTI 모델에서는, Photorhabdus 발광으로부터의 완전한 럭스 오페론(luxCDABE)을 사용한 UPEC 균주를 사용할 수 있다13. 효소 반응은 산소의 존재에 감소 된 플라빈 모노 뉴클레오티드와 반응 긴 사슬 알데히드의 산화에 의존하는 세균 성 루시포라에 의해 촉매, 산화 플라빈을 산출, 긴 사슬 지방산과 빛12. 럭스 오페론은 기판의 합성에 필요한 루시파라제 및 기타 효소에 대한 인코딩. 따라서, 모든 대사 활성 박테리아는 외인성기판(12)의주사를 필요로 하지 않고 지속적으로 청록색(490nm) 빛을 방출한다. 럭스태그 박테리아에 의해 방출 광자를 캡처할 수 있는 매우 민감한, 냉각 충전 결합 장치 (CCD) 카메라를 사용 하 여.
UTI모델에서 생물발광성 박테리아를 사용하면 세균 부하의 세로, 비침습적 정량화를 허용하며, CFU 결정에 대한 후속 조치 중 고정 된 시간 지점에서 동물을 희생할 필요성을 생략합니다. 가능성의 넓은 범위에도 불구하고, 다른 분야에서이 BLI 기술의 견고성과 UTI의 고전적인 모델에 비해 장점에 대한 증거를 축적, 그것은 널리 UTI 연구에서 구현되지 않았습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 상세한 단계별 가이드를 제공하고 모든 미래 UTI 연구에 BLI의 장점을 강조합니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 유럽 연합 지역 사회 위원회 지침에 따라 수행되었으며 KU Leuven의 동물 윤리위원회 (P158/2018)의 승인을 받았습니다.
1. 배양 박테리아(7,13,14에서적응)
- 준비
- 실험적 요구에 가장 적합한 발광 UPEC 변형을 선택하십시오.
참고: 여기서, 임상 방광염 분리, UTI89(대장균)는인간과 설치류 모두에서 비뇨기과증 용량, 그리고 뮤린 UTI 모델5,7,15에서의일반적인 사용으로 인해 선택되었다. 완전한 럭스 오페론(luxCDABE)을 운반하는생물발광 동종 균주는 UTI89-럭스라고 더 합니다. 이 오페론은 또한 카나마이신 황산염 (Km) 저항 유전자를 운반합니다. 따라서, Km은 생물 발광콜로니(13)를선택하는 데 사용할 수 있다. - 선택한세균균7에대해 600나노미터(OD 600 nm)에서 CFU 및 광학 밀도에 대한 상관곡선을 만든다.
- 이를 위해 배양 박테리아(아래 프로토콜사용)를 만들고 인산염 완충식식염수(PBS)에서 8개의 상이한 희석을 한다. 이러한 모든 희석에 대해 600 nm에서 OD를 측정하고 Luria-Bertani (LB) 플레이트에 플레이트를 플레이트하여 CFU를 결정합니다.
- OD 600 nm 값과 CFU 값을 플롯하여 상관 관계를 결정하고 표준 곡선을 가져옵니다.
참고: 향후 실험의 경우 600nm에서 OD를 측정하고 이 표준 곡선을 사용하여 세균 용액에서 CFU를 즉시 추정합니다.
주의: UPEC는 병원성 박테리아이며, 객실이 제대로 갖추어져 있는지 확인하고 개인 보호 장비를 사용합니다.
- 실험적 요구에 가장 적합한 발광 UPEC 변형을 선택하십시오.
- 주입 3일 전
- 접종 루프를 사용하여 50 μg/mL Km로 보충된 LB 플레이트에서 박테리아의 글리세롤 육수를 줄임으로써 단일 콜로니를 얻고 37°C에서 하룻밤 사이에 배양하십시오. 파라핀 필름으로 이 플레이트를 밀봉하여 최대 1주일까지 4°C에 보관하십시오.
- 주입 이틀 전
- 멸균 14mL 폴리스티렌 라운드 하단 튜브에 5mLLB 국물 5mL의 이중 위치 스냅 캡을 채우고 접종 루프가 있는 단일 세균 식민지를 선택하고 이를 LB 국물에 추가합니다. 적절한 혼합을 보장하기 위해 10 s용 소용돌이.
- 스냅 캡을 한 자리에 37°C에서 하룻밤 사이에 정적으로 배양한다.
참고: 대장균의 정적 성장은 오줌 상피 세포의 준수 및 침입에 중요한 타입-1-pili의 표현을 촉진합니다. - 멸균 된 에를렌마이어 또는 문화 플라스크를 준비합니다.
- 주입 하루 전
- 인큐베이션 후 세균 배양의 적절한 균질화를 보장하기 위해 튜브를 10 초 동안 소용돌이시다. 항생제없이 신선한 LB 배지의 25 mL에 세균 현탁액의 25 μL을 추가하여 Erlenmeyer에서 하위 배양을 확인하십시오.
- 하룻밤 사이에 37°C에서 에렌마이어와 문화를 정적으로 닫습니다.
- 주입 당일
- 적절한 혼합을 보장하기 위해 10 s에 대한 에를렌 마이어 소용돌이.
- 에를렌마이어의 문화를 50mL 배양 튜브와 원심분리기3,000xg, 4°C로 5분 동안 붓습니다. 상류제를 데칭하고 10 s에 대한 멸균 PBS 및 소용돌이의 10 mL에서 세균 펠릿을 다시 중단합니다.
- 접종(CFU)의 실험 적 농도를 선택하고 1.1.2 단계에서 얻은 표준 곡선을 사용하여 해당 OD 600 nm을 결정한다.
- 재중단된 세균 배양 1mL를 멸균 PBS 9mL에 넣고 600nm에서 OD를 확인합니다. 원하는 OD 600 nm에 도달할 때까지 멸균 PBS 또는 농축 세균용 용액을 추가하여 더조정하십시오.
참고: 예를 들어, UTI89-lux는 OD 600 nm이 0.45에 도달할 때까지 PBS를 추가하여 배양을 조정하여 2 x 107 CFU/50 μL에 해당합니다. 실행 가능한 CFU의 수를 확인하려면, 300 개 미만의 식민지를 얻기 위해 트리플 리케이트에 LB 플레이트에 다섯 번째와 여섯 번째 10 배 희석의 10 배 연속 희석 및 플레이트 50 μL을 확인합니다. 37°C. OD 600 nm에서 하룻밤 잠복 후 다음날 얻은 식민지를 카운트아웃하면 즉시 판독을 제공하지만 CFU를 품질 관리로 사용한다.
2. 동물의 접종(7에서적응,16)
- 동물의 준비
- 연구 질문 및 녹아웃 라인의 가용성, 실험적 세부 사항 및 UTI 감수성5,17의차이에 따라 원하는 마우스 스트레인을 선택한다. 여성 마우스에서 트랜스우레럴 카테터화가 더 쉽다는 점에 유의하십시오. 면역학적으로 미숙하기 때문에 8 주 미만의 동물을 사용하지 마십시오. 여기서, 12주 된 암컷 C57Bl/6J 마우스가 사용되었다.
- 동물을 미리 주문하고 7 일 동안 이상적으로 적응하게하십시오. 표준 12h 빛/어두운 조건에서 개별적으로 통풍이 잘되는 케이지에 있는 동물을 그룹화합니다.
- 신호의 손실을 제한하기 위해 동물의 복부 영역을 면도. 동물의 피부를 빠르게 구울 수 있으므로 제모 크림을 사용하지 마십시오. 지배적 인 손으로 면도하는 동안 비 지배적 인 손으로 스크러프와 뒷다리를 단단히 잡고 동물을 억제하십시오. 또는, 이소플루란 마취 하에 면도.
참고 : 동물은 이미징 2 일 전에 면도했다, 동물을 고려하면 더 면도 영역을 손질합니다. - 실험 전반에 걸쳐 물과 표준 식품 광고 리비도 를 제공합니다. 그러나, 주입 하는 동안 방광 볼륨을 최소화 하기 위해 주입 하기 전에 물 2 시간 에서 동물을 박탈.
- 멸균 24 Gangiocatheter 팁을 100 μL 주사기에 장착하고 1.5.3 단계에서 제조된 세균용 용액으로 주사기를 채웁니다.
참고: 배경 발광을 확인하려면 주입 전에 기준선 이미지를 가져옵니다(아래 3단계 참조).
- 동물의 주입
- 유도 챔버에 동물을 배치하고 캐리어 가스로 순수한 산소와 이소플루란의 흡입을 사용하여 마취 (유도에서 3 % 및 유지 보수 1.5%).
- 한 동물을 수핀 위치에 있는 작업 표면에 놓고 주입 중에 코 콘을 사용하여 안정적인 이소플루란 마취를 유지합니다. 눈 연고를 바하십시오.
- 완만한 압축을 적용하고 suprapubic 지역에 원형 운동을 함으로써 잔류 소변을 추방하십시오. 주입 하기 전에 70% 에탄올로 하부 복부를 청소하십시오.
- 카테터 팁을 일반 식염수로 윤활합니다. 비 지배적 인 손의 검지 손가락을 복부에 넣고 부드럽게 위로 밀어 넣습니다. 요도의 카테터삽입을 90° 각도(수직)로 시작하고 저항이 발생하면 수평으로 기울어추가 삽입(0.5cm).
참고 : 이것은 요도에 해를 끼칠 수 있기 때문에 카테터를 강제로 밀어 붙이는 것은 마십시오. 부드러운 회전 동작은 카테터 삽입에 도움이 될 수 있습니다. 다른 한편으로는, 저항의 부족은 일반적으로 질로 잘못된 삽입을 나타냅니다. - 세균 접종 (2 x 107 CFU)의 50 μL의 느린 (5 μL /s)를 수행합니다.
참고: 볼륨이 높거나 더 빠른 주입은 신장에 역류를 일으킬 수 있습니다. 기술의 연습 하는 동안, 블루 잉크 역류를 평가 하는 데 사용할 수 있습니다. - 주입 후 주사기와 카테터를 몇 초 더 제자리에 두근 다음 천천히 후퇴하여 누출을 방지합니다. 높은 양의 누출이나 피 묻은 고기와 같은 부정행위를 기록하고 필요한 경우 동물을 배제하십시오.
- 이미징 챔버의 코 콘에 척추 위치에 동물을 배치하고 나머지 모든 동물에 대한 앞단계 2.1.1-2.1.6을 반복한다. 실험 그룹당 카테터 1개를 사용하십시오. 마취가 계속되도록하고 첫 번째 동물과 마지막 동물 사이의 시간을 최소화하십시오.
- 필요한 경우, 화상 진찰 전후(3단계) 항생제 또는 실험 약물을 투여한다. 예를 들어, enrofloxacin을 투여하기 위해, 1/100 희석을 얻기 위해 생리식염수의 3.96 mL에 enrofloxacin (100 mg/mL) 용액의 40 μL을 추가합니다. 오전 9시와 오후 5시에 100 μL/10g을 피하하여 3일 동안 하루에 두 번 10 mg/kg의 enrofloxacin을 투여하십시오.
3. 생물 발광 이미징
- 이미징 매개 변수의 준비 및 선택
- BLI 획득 소프트웨어(재료 표참조)를 열고 이미징 장치(재료 표 참조)에서초기화를 클릭하여 카메라 및 스테이지 컨트롤러 시스템을 테스트하고 CCD 카메라를 -90°C로 냉각시합니다.
참고: 이 과정에서 문이 잠기고 초기화 진행 상황을 제어판에서 따를 수 있습니다. 녹색 표시등은 -90°C의 온도에 도달했음을 나타냅니다. 초기화가 완료되기 전에 이미징을 시도하면 경고가 나타납니다. - 데이터가 자동으로 저장되었는지 확인: 획득 자동 저장을 클릭하고 올바른 폴더를 선택합니다.
- 발광 및 사진을 선택합니다. 기본 발광 설정 확인: 여기 필터를 차단하도록 설정하고 배출 필터를 엽니다.
- 특히 광자 수가 적지 않도록 희미한 신호를 예상할 때 첫 번째 이미지를 촬영할 때 Auto에 노출 시간을 설정합니다. 생체 내 측정 및 밝은 신호의 경우 노출 시간을 ~30s로 설정합니다. 이미지가 포화되면 경고가 나타납니다. 이 경우 노출 시간을 줄입니다.
- 중간 비닝, F/스톱 1을 선택하고 올바른시야(FOV)(5마리의동물에 대한 D)를 선택한다.
- 마우스를 이미징할 때 피사체 높이를 1cm로 설정합니다.
- 획득 제어판에서 세 번 추가를 클릭하여 기술 복제와 같이 세 개의 이미지 시퀀스를 얻습니다.
- BLI 획득 소프트웨어(재료 표참조)를 열고 이미징 장치(재료 표 참조)에서초기화를 클릭하여 카메라 및 스테이지 컨트롤러 시스템을 테스트하고 CCD 카메라를 -90°C로 냉각시합니다.
- 이미징
- 마우스를 흡진챔버에 배치하여 매니폴드 코 콘을 사용하여 마취(isoflurane 1.5%)를 실험 전반에 걸쳐 유지한다. 최대 5마리의 마우스를 동시에 화상화하고 반사를 방지하기 위해 라이트 배플을 사용하여 동물을 분리합니다.
- 문을 닫고 획득을 클릭하여 이미징 시퀀스를 시작합니다.
- 실험에 대한 자세한 정보를 입력하십시오 (야생 유형 및 녹아웃 동물, 치료, 이미징 의 날 등). 노출 시간과 같은 이미징 설정은 자동으로 저장됩니다.
- 이미징 챔버에서 마우스를 제거하고 케이지로 돌려보냅니다. 마취 후 전체 회복을 확인하십시오. 몇 분 안에, 동물은 완전히 깨어 있고 탐구해야한다. 이 UTI 과정을 방해 할 수 있기 때문에 진통을 제공하지 마십시오18.
- 케이지를 다음 이미징 주기까지 통풍랙으로 되돌려 놓습니다. 실험이 완료된 후,CO2 질식 또는 자궁 경부 탈구로 동물을 안락사시한다. 고통을 최소화하기 위해 이소플루란 마취의 회복 전에이 작업을 수행하십시오.
- 이미지 분석
- 이미징 소프트웨어를 시작하고 찾아보기를 클릭하여 실험 파일을 로드합니다.
- 도구 팔레트를 사용하여 이미지의 색상 배율을 조정합니다. 모든 이미지, 즉 최소104 ~107광자를 사용하여 결과의 시각적 측면을 표준화합니다. 이러한 조정은 원시 데이터에영향을 미치지 않지만 그래픽 프레젠테이션에만 영향을 미칩니다.
- ROI 도구를 사용하여 이미지에 관심 영역(ROI)을 그립니다. ROI가 전체 영역을 커버하고 모든 이미지에 동일한 치수를 사용할 수 있을 만큼 충분히 큰지 확인합니다. 여기서, 3.5 cm x 4.5 cm의 사각형 ROI가 하부 복부 위에 배치되었다.
- ROI 측정을 클릭하여 광 강도(개수 또는 총 광자 플럭스)를 정량화합니다. 이러한 데이터를 내보내고 기술 복제의 평균을 사용합니다.
참고: 카운트는 카메라에서 감지한 광자 수를 나타내며 이미지 품질 관리에만 사용해야 합니다. 데이터를 보고하려면 총 광자 플럭스를 사용합니다. 총 광자 플럭스는 표면에서 방출되는 빛을 나타내고 노출 시간(초당)을 위해 보정되는 보정된 장치이기 때문에 생리적으로 더 관련이 있다.
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Representative Results
생체 내 BLI는 주입 시 접종시 접종의 CFU와 상관관계가 있습니다.
생체 내 BLI의 검출 한계및 접종의 CFU와의 상관관계를 평가하기 위해, 마우스는 음의 대조군으로서 UTI89-럭스 및 PBS의 상이한 농도에 감염되었다. 주입하기 전에 감염되지 않은 동물을 스캔하여 배경 발광을 결정했습니다. 후속 이미지는 즉시 주입 후(도1A)을얻었다. UTI89-lux의 주입 후, 생체 발광은 2 x 104 CFU 이상으로 강력하게 검출가능하고 접종과 생물 발광의 CFU 사이의 선형 상관관계가 확립되었다(도1B). 대조적으로, 총 광자 플럭스는 PBS로 주입된 동물및 2 x 103 CFU의 가장 낮은 세균 성 농도에 있는 동물을 위한 배경 신호와 비교되었습니다.
치료 중 세로 후속 을위한 도구로 BLI
검증된 항생제 치료의 치료 효과가 세로 BLI를 사용하여 입증될 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 20마리의 동물이 2 x 107 CFU/50 μL의 접종에 감염되었고, 이들 중 10마리는 감염 후 첫 3일 동안 매일 두 번 비로 치료되었다. 감염된 그러나 치료되지 않은 대조군에서의 자연적인 진화와 치료된 군내의 감염 역학에 대한 항생제 치료의 효과는 모두 자세히 시각화될 수있다(도 2). 세균 부하의 즉각적인 감소, 총 광자 플럭스에 의해 측정, enrofloxacin의 첫 번째 복용량 후 보였다. 치료된 동물 중 어느 것도 세균 부하가 후속으로 증가하지 않았습니다. 감염되었지만 처리되지 않은 대조군의 과목 간 가변성은 더 높았으며 세균 부하의 감소는 느려졌습니다. 10일째에 대조군의 동물 10마리 중 8마리가 사전 주입 배경에 필적하는 BLI 신호로 돌아왔다. 각 동물에 대한 전체 세균 부하는 로그 변환 총 광자 플럭스의 곡선(AUC) 아래 영역을 사용하여 계산하였다. 10일 동안 엔로플로록사신으로 치료된 동물과 치료되지 않은 동물 사이에 는 상당한 차이가 관찰되었다. 이러한 결과는 BLI가 UTI의 질병 과정에 대한 잠재적 인 치료의 효과를 평가하는 강력한 도구임을 보여줍니다.
그림 1: 생체 내 BLI는 주입 시 접종의 CFU와 상관관계가 있습니다. (A)방광에서 세균 주입 직후 에 이미지된 접종(2 x 103-2x 108 CFU)의 농도 증가에 감염된 마우스의 생체 내 BLI를 통해 얻은 대표적인 영상. CFU = 식민지 성형 유닛. (b)방광 영역(총 광자 플럭스)을 통해 방출되는 생체 발광의 정량화는 접종(CFU)의 농도에 비해. BLI 신호는 PBS 컨트롤, 페어링되지 않은 t-test에 비해 배경 및 p = 0.015에 비해 2 x 104 CFU(p = 0.0002)를 강력하게 검출하였다. 2 x 103-2 x 108 CFU에 이르는 이노큘리에 대한 Pearson 상관관계는 r = 0.9995(p < 0.0001)였다. BG = 배경, PBS = 인산염 버퍼링 식염수, CFU = 콜로니 성형 유닛. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: BLI는 치료 중 세로 후속을 위한 도구로서. (A)UTI89-lux의 2 x 107 CFU에 감염된 동물에 대한 총 광자 플럭스의 개별 흔적은 3일 동안 매일 10 mg/kg씩 비처리된 대조군(black), n=10으로 치료하였다. BG = 배경. (B)패널 A에 나타난 동물로부터의 흔적분석, 엔로플로록사신(blue) 및 대조군(black)에 대한 로그 변환총 광자 플럭스의 AUC를 보고한다. 그룹당 N = 10, ± SD, 짝이 없는 t-testp < 0.0001을 의미한다. AUC = 곡선 아래 영역입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
CFU 수에 비해 BLI의 장점
세로 데이터
미생물 부담을 정량화하기 위해 CFU를 세는 전통적인 방법의 주요 단점은 동물 당 단면 데이터 포인트만 제공하는 사후 조직 균질화의 요구 사항입니다. 반대로 BLI는 감염된 동물의 비침습적 종방향 후속 조치를 가능하게 합니다. 동물은 감염의 역학에 대한 자세한 통찰력을 제공, 하루에 2 ~ 3 번 이미지 할 수 있습니다. 또한 동일한 동물의 반복적인 측정은 적절하게 구동되는 실험에 필요한 동물의 수를 크게 줄입니다. 또한, 연구원은 개별 간 가변성에 초점을 맞출 수 있고 새로운 에이전트로 동물을 검사하거나 취급하기 전에, 실시간 데이터를 사용하여 미리 지정된 세균 부하를 가진 동물을 선택할 수 있습니다. 다른 한편으로는, 실험의 AUC를 사용하여 연구원은 단단 값이 아니라 전반적인 세균 부하에 집중할 수 있습니다. UTI 설정에서 세로 및 실시간 데이터의 부가 가치를 과대 평가할 수 없습니다.
감염 의 보급의 식별
BLI로 얻은 이미지의 공간 해상도는 럭스 또는 FLuc태그병원균(19)에 의해 식민지화되는 다른 부위를 식별하기에 적절하다. UTI의 경우 신장에 대한 감염이 상승하거나 혈액에 보급하는 것은 매우 관련성이 높은 발견입니다. 이 실험 환경에서, UTI89-더 낮은 요로를 넘어럭스에 의해 유도된 감염의 어떤 확산도 관찰되지 않았다. 이것은 이 긴장이 주로 방광염을 일으키는 원인이 되는 고려를 고려하기 위하여 예상되었습니다.
데이터 재현성 및 비교
CFU 수에 비해 BLI를 사용할 때 실험의 재현성이 더 높습니다. 고전적으로, 균질화의 직렬 10배 희석제는 도금되고 30~300CFU를 가진 플레이트만 계산되어 총 CFU 수를 계산합니다. 이 방법은 번거롭고, 가변성이 높고, 많은 쓸데없는 판을 초래하며, 인간의 실수에 매우 취약합니다. 게다가, CFU를 보고하는 방법에 대한 합의가 없다, 즉, 그램 방광 조직 당, 방광 당, 또는 1 mL 균등동화 당. 이렇게 하면 서로 다른 그룹의 결과를 비교하기가 매우 어렵고 BLI 및 총 광자 플럭스를 사용하여 개선될 수 있습니다.
방법의 고려 사항 및 제한 사항
모피 또는 헤모글로빈에 의한 광자 흡수와 같은 생체 내 BLI와 관련된 고전적인 고려 사항 외에도 희생 시 BLI 및 CFU 수를 상호 연관시키는 몇 가지 고려 사항이 있습니다.
첫째, 희생시에 두 방법 사이의 불일치가 발생20,특히 항생제 치료가 사용되는 경우. 따라서 희생 시 BLI와 CFU 카운트 간의 상관 관계는 최적이 아니며 반드시 관련이 있는 것은 아닙니다. BLI의 경우, 도전한 박테리아가 빛 방출보다는 회복 및 수리 과정으로 신진 대사를 리디렉션할 수 있기 때문에 총 광자 플럭스가 예상보다 낮을 수 있습니다. 또한 BLI 측정은 박테리아와 신진 대사의 스냅샷을 생체 내에서 실시간으로 캡처하여 이미징 시 박테리아가 휴면 상태이거나 길쭉한 상태에 있는 경우 BLI 신호가 낮아집니다. 한편, CFU 판정을 위해, 약물 에 도전한 박테리아는 감염성 서식지(즉, 생물막)에서 제거되고 도금된 후 전부 또는 전혀 반응하지 않습니다. 일단 한천에 도금되면, 도전한 박테리아는 돌이킬 수 없는 부상을 입고 관찰 가능한 식민지로 발전할 수 없을 수 있으며, 그 결과 CFU 수가21개낮아집니다. 또한, 도전 된 박테리아는 실행 가능하지만 비 culturable 상태 (VBNC)를 입력 할 수 있습니다. 그(것)들은 신진 대사 활동적이고 실행 가능한 남아 있지만 표준 실험실 매체에 더 이상 컬터러스없습니다. VBNC 상태에 들어가거나 생물막으로 조직되는 박테리아는 BLI로 쉽게 검출될 수 있으며, CFU의 열거량은 추가 처리21,22,23이필요하다. 결론적으로, 생물 발광 및 실행 가능한 카운트는 세포 생리학의 다른 양상을 측정하고 어느 쪽도 세포 생존가능성의 확실한 지표로 간주되어서는 안된다21.
더욱이, BLI 또는 CFU 수에 의해 측정된 세균 부하의 정의는 견본 처리의 차이로 인해 다릅니다. CFU 카운트를 사용하는 경우 방광 벽 내에 있는 박테리아만 동종 에 포함되고 계산됩니다. 대조적으로, BLI는 또한 소변과 요도에 있는 박테리아에 의해 방출된 광자를 포착합니다. 우리의 의견으로는, 후자는 모든 해부학적으로 관련 있는 구획 (방광, 소변 및 요도)를 포함하기 때문에 총 세균부하의 생리학적으로 더 정확한 표현입니다.
CFU 수와는 대조적으로, BLI는 유전으로 변경된 발광 박테리아의 생성을 요구합니다. 삽입 부위에 따라 게놈에 럭스 오페론을 도입하면 세균균의 독성 잠재력을 변화시킬 수 있습니다. 따라서, 새로운 생물발광균을 개발할 때, 그 독성 및 성장 특성은 부모균주(10,13)에비교되어야 한다. 그러나, 게놈 편집에 있는 최근 어드밴스는 모든 중요한 세균성 병원체의 효율적이고 무심한 태깅을 허용하여, 그에 의하여 독성 또는 처리 반응에 충격을 제한합니다. 더욱이, 유전공학은 생체발광 기자 유전자의 조건부 발현을 향한 가능성을 열어주며, 따라서 관련 세균성 하위집단, 유전자 발현 등의 생체 측정, 유전자 발현 등24,25.
마지막으로, 생체 내 BLI를 위한 고급 이미징 장치 및 획득 소프트웨어에 대한 액세스는 CFU 열거에 필요한 기본 장비에 비해 제한요인이 될 수 있다. 그러나 이미징 코어와의 협업은 BLI에 필요한 비용과 투자를 최소화할 수 있습니다.
생체 내 UTI 모델에서 BLI 구현에 대한 고려 사항
동물 모델
뮤린 UTI 모델의 장점은 세 배입니다 : 그것은 포유류 요로에서 질병 진행의 모니터링을 허용, 동물과 그 유지 보수는 상대적으로 저렴, 돌연변이 라인을 사용할 수 있습니다. 한편, 감염의 유도는 일반적으로 방광 루멘내로 직접 박테리아의 높은 투여량의 트랜스우더럴 카테터삽입 및 후속 주입을 수반하여 요도5를통해 승천의 자연적인 과정을 우회한다.
동물 주택
동물은 실험 중에 수용 할 수 있습니다. 우리는 감염된 동물을 가진 새장에 파수꾼 동물을 소개하여 같은 케이지의 동물 사이 전송의 발생을 검토했습니다. 센티넬 동물 중 어느 것도 CFU와 BLI로 측정된 검출 가능한 세균 부하가 없었습니다.
방광 부피
Murine UTI 모델을 BLI와 결합할 때, 연구원은 방광의 독특한 해부학적 특성을 염두에 두어야 합니다. 방광은 소변의 다양한 양을 포함하는 중공 기관입니다. UTI 동안 박테리아에 감염된 소변의 존재는 이론적으로 방광 충전 정도에 따라 총 광자 수에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 방광 부피의 표준화는 실용적이지 않으며 실험 설계에 개입 할 수 있습니다. 더욱이, 우리의 경험에서, 방광 부피의 다름은 총 광자 플럭스의 통계적으로 유의한 차이 귀착되지 않습니다.
샘플 온도
시험관 내 BLI(또는 요광계에서 생물발광을 측정하는 간단하고 저렴한 대안으로서)은 UTI89-lux를 함유한 균질성, 소변 또는 세균현탁액에 대한 세균부하를 결정하는 데도 사용될 수있다. 그러나, 광자의 방출이 효소 반응에서 발생하므로 대사 활동과 산소의 존재가 요구되므로 시료의 온도가 중요하다. 장기 수확 시 온도의 급격한 변화는 시료가 이미징 5분 전에 가열된(37°C) 단계에서 보정할 수 있도록 함으로써 피해야 한다.
잠재적인 응용 프로그램 및 중요성
요약하자면, CFU의 열거의 번거로운 방법은 UTI 분야에서 연구의 재현성과 효능을 제한하였다. BLI를 가진 실험적인 설치는 연구 결과의 이 모형에 필요한 동물의 수를 감소시키면서 경도 후속을 가능하게 하여 방광 생리학, UTI 병기 및 감수성에 대한 생체 내 UTI 연구에서 발전할 것입니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 연구 재단의 보조금에 의해 지원되었다 - 플랑드르 (FWO 블라안데렌; G0A6113N, KU 루벤 연구 위원회 (C1-TRPLe; T.V. 및 W.E.) 및 VIB (T.V.에). W.E.는 연구 재단의 수석 임상 연구원입니다 - 플랑드르 (FWO 블라안데렌). 변형 UTI89-럭스는 교수 의 실험실에서 관대 한 선물이었다13.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
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