Summary
Ce manuscrit décrit l’administration intravésicale de bactéries uropathogènes avec un opéron lux pour induire une infection des voies urinaires chez la souris et l’analyse longitudinale in vivo ultérieure de la charge bactérienne à l’aide de l’imagerie par bioluminescence.
Abstract
Les infections des voies urinaires (IVU) se classent parmi les infections bactériennes les plus courantes chez l’homme et sont systématiquement traitées avec des antibiotiques empiriques. Cependant, en raison de l’augmentation de la résistance microbienne, l’efficacité des antibiotiques les plus utilisés a diminué. Pour trouver d’autres options de traitement, il est très nécessaire de mieux comprendre la pathogenèse des infections urinaires et les mécanismes qui déterminent la susceptibilité aux infections urinaires. Afin d’étudier cela dans un modèle animal, un test reproductible et non invasif pour étudier l’évolution de l’infection urinaire est indispensable.
Pendant des années, l’étalon-or pour le dénombrement de la charge bactérienne a été la détermination des unités formant des colonies (UFC) pour un volume d’échantillon particulier. Cette technique nécessite des homogénats d’organes post-mortem et des dilutions en série, ce qui limite la production de données et la reproductibilité. Comme alternative, l’imagerie par bioluminescence (BLI) gagne en popularité pour déterminer la charge bactérienne. Le marquage des agents pathogènes à l’aide d’un opéron lux permet la détection et la quantification sensibles de manière non invasive, permettant ainsi un suivi longitudinal. Jusqu’à présent, l’adoption de l’BLI dans la recherche sur les infections urinaires reste limitée.
Ce manuscrit décrit la mise en œuvre pratique de BLI dans un modèle d’infection des voies urinaires chez la souris. Ici, un guide étape par étape pour la culture des bactéries, l’instillation intravésicale et l’imagerie est fourni. La corrélation in vivo avec l’UFC est examinée et une preuve de concept est fournie en comparant la charge bactérienne d’animaux infectés non traités avec des animaux traités aux antibiotiques. En outre, les avantages, les limites et les considérations spécifiques à la mise en œuvre de BLI dans un modèle d’infection urinaire in vivo sont discutés. La mise en œuvre de l’BLI dans le domaine de la recherche sur les infections urinaires facilitera grandement la recherche sur la pathogenèse des infections urinaires et la découverte de nouvelles façons de prévenir et de traiter les infections urinaires.
Introduction
Les infections des voies urinaires (IVU) sont parmi les infections bactériennes les plus courantes chez l’homme. Près de la moitié des femmes connaîtront une infection urinaire symptomatique au cours de leur vie1. Les infections limitées à la vessie peuvent donner lieu à des symptômes urinaires tels qu’une augmentation de la fréquence urinaire, l’urgence, l’hématurie, l’incontinence et la douleur. Lorsque l’infection monte dans les voies urinaires supérieures, les patients développent une pyélonéphrite, avec malaise, fièvre, frissons et maux de dos. En outre, jusqu’à 20% des patients atteints d’infections urinaires souffrent d’infections récurrentes entraînant une diminution spectaculaire de la sensibilité aux antibiotiques2,3,4. Au cours des dernières années, il y a eu un intérêt croissant pour les nouvelles thérapies pour le traitement et la prévention des infections urinaires récurrentes. Malgré une meilleure compréhension de l’immunité innée et adaptative des voies urinaires inférieures et des facteurs de virulence bactérienne nécessaires à l’invasion et à la colonisation, aucun changement radical dans le régime de traitement n’a été traduit dans la pratique urologique quotidienne2. Afin d’étudier la pathogenèse et la susceptibilité aux infections urinaires in vivo,un test reproductible et non invasif est indispensable.
Plusieurs modèles d’infection urinaire animale ont été décrits allant des nématodes aux primates, mais le modèle murin est principalement utilisé5,6. Ce modèle consiste en un cathétérisme transurétral de souris (femelles) et l’instillation ultérieure d’une suspension bactérienne, le plus souvent escherichia coli uropathogène (UPEC), directement dans la lumière de la vessie7. Après l’inoculation, la charge bactérienne a traditionnellement été quantifiée en déterminant les unités formant des colonies (UFC). Cette technique nécessite de sacrifier des animaux pour obtenir des homogénats d’organes post-mortem et des dilutions en série, ce qui limite la production de données et la reproductibilité. De plus, le suivi longitudinal de la charge bactérienne chez les animaux individuels n’est pas possible en utilisant cette technique.
En 1995, Contag et al. ont suggérél’utilisation d’agents pathogènes marqués au bioluminescent pour surveiller les processus pathologiques chez les animaux vivants8,9. Depuis lors, l’imagerie par bioluminescence (BLI) a été appliquée à de nombreux modèles d’infection tels que la méningite, l’endocardite, l’ostéomyélite, les infections de la peau et des tissus mous, etc.10,11,12. Dans le modèle UTI murin, une souche UPEC avec l’opéron lux complet(luxCDABE)de Photorhabdus luminescens peut être utilisée13. Une réaction enzymatique est catalysée par la luciférase bactérienne qui dépend de l’oxydation des aldéhydes à longue chaîne réagissant avec le mononucléotide de flavine réduit en présence d’oxygène, donnant la flavine oxydée, un acide gras à longue chaîne et la lumière12. L’opéron lux code pour la luciférase et d’autres enzymes nécessaires à la synthèse des substrats. Par conséquent, toutes les bactéries métaboliquement actives émettront continuellement de la lumière bleu-vert (490 nm) sans avoir besoin de l’injection d’un substrat exogène12. Les photons émis par les bactéries marquées luxpeuvent être capturés à l’aide de caméras CCD (Charge-Coupled Device) refroidies très sensibles.
L’utilisation de bactéries bioluminescentes dans un modèle d’infection urinaire permet la quantification longitudinale et non invasive de la charge bactérienne, en omettant la nécessité de sacrifier des animaux à des moments fixes pendant le suivi de la détermination de l’UFC. Malgré le large éventail de possibilités, l’accumulation de preuves de la robustesse de cette technique BLI dans d’autres domaines et de ses avantages par rapport aux modèles classiques d’infection urinaire, elle n’a pas été largement mise en œuvre dans la recherche sur les infections urinaires. Le protocole présenté ici fournit un guide détaillé étape par étape et met en évidence les avantages de BLI pour toutes les futures recherches sur les infections urinaires.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux lignes directrices du Conseil communautaire de l’Union européenne et ont été approuvées par le comité d’éthique animale de la KU Leuven (P158/2018).
1. Cultiver des bactéries (adaptées de7,13,14)
- Préparation
- Choisissez une variété UPEC luminescente qui correspond le mieux aux besoins expérimentaux.
NOTE: Ici, l’isolat clinique de cystite, UTI89 (E. coli), a été sélectionné en raison de sa capacité uropathogène chez les humains et les rongeurs, et de son utilisation courante dans les modèles d’infection urinaire murine5,7,15. La souche isogénique bioluminescente portant l’opéron lux complet (luxCDABE) est en outre appelée UTI89-lux. Cet opéron porte également des gènes de résistance au sulfate de kanamycine (Km). Par conséquent, Km peut être utilisé pour sélectionner des colonies bioluminescentes13. - Faire une courbe de corrélation pour l’UFC et la densité optique à 600 nanomètres (OD 600 nm) pour la souche bactérienne choisie7.
- Pour ce faire, cultivez des bactéries (en utilisant le protocole ci-dessous) et faites 8 dilutions différentes dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Mesurer la DO à 600 nm pour toutes ces dilutions et les plaquer sur des plaques de Luria-Bertani (LB) pour déterminer l’UFC.
- Tracez les valeurs OD 600 nm et les valeurs CFU pour déterminer la corrélation et obtenir une courbe standard.
REMARQUE: Pour les expériences futures, mesurez la DO à 600 nm et utilisez cette courbe standard pour obtenir une estimation instantanée de l’UFC dans une solution bactérienne.
ATTENTION: Les UPEC sont des bactéries pathogènes, assurez-vous que les pièces sont correctement équipées et utilisez un équipement de protection individuelle.
- Choisissez une variété UPEC luminescente qui correspond le mieux aux besoins expérimentaux.
- Trois jours avant l’instillation
- Obtenir des colonies uniques en striant le stock de glycérol des bactéries, à l’aide d’une boucle d’inoculation, sur des plaques LB complétées par 50 μg/mL Km et en les cultivant pendant la nuit à 37 °C. Scellez ces plaques avec un film de paraffine pour conserver à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
- Deux jours avant l’instillation
- Remplissez un tube de fond rond stérile en polystyrène de 14 mL avec des capuchons à double position avec 5 mL de bouillon LB complété par 50 μg / mL Km. Choisissez une seule colonie bactérienne avec une boucle d’inoculation et ajoutez-la au bouillon LB. Vortex pendant 10 s pour assurer un bon mélange.
- Culture statique avec le capuchon encliquetable en position ouverte à 37 °C pendant la nuit.
REMARQUE: La croissance statique d’E. coli favorise l’expression du type 1-pili, qui sont essentiels à l’adhésion et à l’invasion des cellules épithéliales urinaires. - Préparez un Erlenmeyer stérile ou une fiole de culture.
- Un jour avant l’instillation
- Après l’incubation, vortex le tube pendant 10 s pour assurer une homogénéisation correcte de la culture bactérienne. Faire une sous-culture dans l’Erlenmeyer en ajoutant 25 μL de la suspension bactérienne à 25 mL de milieu LB frais sans antibiotiques.
- Fermer l’Erlenmeyer et cultiver statiquement à 37 °C pendant la nuit.
- Le jour de l’instillation
- Vortex l’Erlenmeyer pendant 10 s pour assurer un bon mélange.
- Verser la culture de l’Erlenmeyer dans un tube de culture de 50 mL et centrifuger à 3 000 x g et 4 °C pendant 5 min. Décantez le surnageant et remettez en suspension la pastille bactérienne dans 10 mL de PBS stérile et vortex à nouveau pendant 10 s.
- Choisissez la concentration expérimentale de l’inoculum (UFC) et utilisez la courbe standard obtenue à l’étape 1.1.2 pour déterminer la DO 600 nm correspondante.
- Ajouter 1 mL de la culture bactérienne remise en suspension dans 9 mL de PBS stérile et vérifier la DO à 600 nm. Ajuster davantage en ajoutant soit du PBS stérile, soit une solution bactérienne concentrée, jusqu’à ce que la DO souhaitée de 600 nm soit atteinteà 7.
REMARQUE: Par exemple, pour UTI89-lux, ajustez la culture en ajoutant PBS jusqu’à ce que le DO 600 nm atteigne 0,45, correspondant à 2 x10 7 UFC / 50 μL. Pour vérifier le nombre d’UFC viables, faites des dilutions en série 10 fois et plaquez 50 μL des cinquième et sixième dilutions 10 fois sur des plaques LB en triple exemplaire pour obtenir moins de 300 colonies. Compter les colonies obtenues le lendemain après l’incubation nocturne à 37 °C. OD 600 nm donne une lecture instantanée mais utiliser l’UFC comme contrôle de qualité.
2. Inoculation des animaux (adapté de7,16)
- Préparation des animaux
- Choisissez la ou les souches de souris souhaitées en fonction de la question de recherche et de la disponibilité des lignes knock-out, des détails expérimentaux et des différences de sensibilité aux infections urinaires5,17. Gardez à l’esprit que le cathétérisme transurétral est plus facile chez les souris femelles. N’utilisez pas d’animaux de moins de 8 semaines, car ils sont immunologiquement immatures. Ici, des souris femelles C57Bl/6J âgées de 12 semaines ont été utilisées.
- Commandez les animaux bien à l’avance et laissez-les s’acclimater, idéalement pendant 7 jours. Regroupez les animaux dans des cages ventilées individuellement, dans des conditions standard de 12 h de lumière et d’obscurité.
- Raser la région abdominale des animaux pour limiter la perte de signal. N’utilisez pas de crème dépilatoire, car elle peut brûler rapidement la peau des animaux. Retenez l’animal en tenant fermement le frottement et les membres postérieurs avec la main non dominante tout en se rasant avec la main dominante. Alternativement, rasez-vous sous anesthésie à l’isoflurane.
REMARQUE: Les animaux ont été rasés 2 jours avant l’imagerie, étant donné que les animaux toiletteront encore plus la zone rasée. - Fournissez de l’eau et de la nourriture standard ad libitum tout au long de l’expérience. Cependant, privez les animaux d’eau 2 h avant l’instillation pour minimiser le volume de la vessie pendant l’instillation.
- Montez une pointe d’angiocathéter stérile de 24 G sur une seringue de 100 μL et remplissez la seringue avec la solution bactérienne préparée à l’étape 1.5.3.
REMARQUE: Pour déterminer la luminescence d’arrière-plan, obtenez une image de référence avant l’instillation (voir l’étape 3 ci-dessous).
- Instillation des animaux
- Placer les animaux dans une chambre d’induction et les anesthésier par inhalation d’isoflurane avec de l’oxygène pur comme gaz porteur (induction à 3% et entretien à 1,5%).
- Placez un animal sur une surface de travail en position couchée et maintenez une anesthésie stable à l’isoflurane à l’aide d’un cône nasal pendant l’instillation. Appliquez la pommade pour les yeux.
- Expulser l’urine résiduelle en appliquant une compression douce et en effectuant des mouvements circulaires sur la région suprapubienne. Nettoyez le bas-ventre avec de l’éthanol à 70% avant l’instillation.
- Lubrifiez l’extrémité du cathéter avec une solution saline normale. Placez l’index de la main non dominante sur l’abdomen et poussez-le doucement vers le haut. Commencez le cathétérisme de l’urètre dans un angle de 90° (verticalement) et une fois la résistance rencontrée, inclinez-le horizontalement avant de l’insérer davantage (0,5 cm).
REMARQUE: Ne poussez jamais le cathéter avec force, car cela causerait des dommages à l’urètre. Des mouvements de rotation doux peuvent être utiles dans l’insertion du cathéter. D’autre part, un manque de résistance indique généralement une insertion erronée dans le vagin. - Effectuer une instillation lente (5 μL/s) de 50 μL de l’inoculum bactérien (2 x 107 UFC).
REMARQUE: Des volumes plus élevés ou une instillation plus rapide peuvent provoquer un reflux dans les reins. Pendant la pratique de la technique, l’encre bleue peut être utilisée pour évaluer le reflux. - Après l’instillation, maintenez la seringue et le cathéter en place pendant quelques secondes de plus, puis rétractez-vous lentement pour éviter les fuites. Enregistrez toute irrégularité telle qu’une grande quantité de fuite ou un méat sanglant et excluez les animaux, si nécessaire.
- Placer l’animal en position couchée au niveau du cône nasal de la chambre d’imagerie et répéter les étapes précédentes 2.1.1-2.1.6 pour tous les animaux restants. Utilisez un cathéter par groupe expérimental. Assurez-vous que l’anesthésie se poursuit et minimisez le temps entre le premier et le dernier animal.
- Si nécessaire, administrer des antibiotiques ou des médicaments expérimentaux, avant ou après l’imagerie (étape 3). Par exemple, pour administrer l’enrofloxacine, ajouter 40 μL de la solution d’enrofloxacine (100 mg/mL) à 3,96 mL de solution saline physiologique pour obtenir une dilution de 1/100. Injecter 100 μL/10 g par voie sous-cutanée à 9 h et 17 h pour administrer 10 mg/kg d’enrofloxacine deux fois par jour pendant 3 jours.
3. Imagerie par bioluminescence
- Préparation et sélection des paramètres d’imagerie
- Ouvrez le logiciel d’acquisition BLI (voir Table des matériaux)et cliquez sur Initialiser dans le dispositif d’imagerie (voir Tableau des matériaux)pour tester la caméra et le système de contrôleur de scène et refroidir la caméra CCD à -90 °C.
REMARQUE: Au cours de ce processus, la porte est verrouillée et la progression de l’initialisation peut être suivie sur le panneau de commande. Un voyant vert indique que la température de -90 °C est atteinte. Un avertissement s’affiche si une tentative d’imagerie est effectuée avant la fin de l’initialisation. - Assurez-vous que les données sont enregistrées automatiquement: Cliquez sur acquisition Enregistrement automatique dans et sélectionnez le bon dossier.
- Sélectionnez Luminescence et Photographie. Vérifiez les paramètres de luminescence par défaut : Réglez le filtre d’excitation sur Bloquer et le filtre d’émission sur Ouvrir.
- Réglez le temps d’exposition sur Auto lors de la prise de la première image, en particulier lorsque vous attendez un signal faible pour assurer un nombre adéquat de photons. Pour les mesures in vivo et les signaux lumineux, réglez le temps d’exposition sur ~30 s. Si l’image est saturée, un avertissement s’affiche. Si cela se produit, réduisez le temps d’exposition.
- Sélectionnez le support Binning, F/stop 1 et choisissez le bon champ de vision(FOV)(D pour 5 animaux).
- Réglez la hauteur du sujet sur 1 cm lors de l’imagerie de souris.
- Cliquez sur Ajouter trois fois dans le Panneau de configuration d’acquisition pour obtenir une séquence de trois images, en tant que répliques techniques.
- Ouvrez le logiciel d’acquisition BLI (voir Table des matériaux)et cliquez sur Initialiser dans le dispositif d’imagerie (voir Tableau des matériaux)pour tester la caméra et le système de contrôleur de scène et refroidir la caméra CCD à -90 °C.
- Imagerie
- Placez les souris dans la chambre d’imagerie en position couchée et utilisez le cône de nez collecteur pour maintenir l’anesthésie (isoflurane 1,5%) tout au long de l’expérience. Imagez jusqu’à 5 souris simultanément et séparez les animaux à l’aide du déflecteur de lumière pour empêcher la réflexion.
- Fermez la porte et cliquez sur Acquérir pour démarrer la séquence d’imagerie.
- Remplissez des informations détaillées sur l’expérience (types sauvages et animaux knock-out, traitements, jour d’imagerie, etc.). Les paramètres d’imagerie, tels que le temps d’exposition, sont enregistrés automatiquement.
- Retirez les souris de la chambre d’imagerie et retournez-les dans leur cage. Vérifiez la récupération complète après l’anesthésie. En quelques minutes, les animaux devraient être complètement éveillés et explorateurs. Ne fournissez pas d’analgésie car cela pourrait interférer avec le cours d’infection urinaire18.
- Retournez les cages dans les racks ventilés jusqu’au prochain cycle d’imagerie. Une fois l’expérience terminée, euthanasier les animaux par asphyxie au CO2 ou luxation cervicale. Faites-le avant la récupération de l’anesthésie à l’isoflurane pour minimiser la détresse.
- Analyse des images
- Démarrez le logiciel d’imagerie et chargez le fichier expérimental en cliquant sur Parcourir.
- Utilisez la palette d’outils pour ajuster l’échelle de couleurs de l’image. Standardisez l’aspect visuel des résultats en utilisant les mêmes réglages pour toutes les images, c’est-à-dire utiliser une échelle logarithmique avec un minimum de 104 à un maximum de 107 photons. Ces ajustements n’affectent pas les données brutes mais uniquement la présentation graphique.
- Utilisez les outils de retour sur investissement pour dessiner une région d’intérêt (ROI) sur l’image. Assurez-vous que le retour sur investissement est suffisamment important pour couvrir toute la zone et utilisez les mêmes dimensions pour toutes les images. Ici, un ROI carré de 3,5 cm x 4,5 cm a été placé sur le bas-ventre.
- Cliquez sur mesure du ROI pour quantifier l’intensité lumineuse (nombre ou flux total de photons). Exportez ces données et utilisez la moyenne des répliques techniques.
REMARQUE: Les comptages représentent le nombre de photons détectés par la caméra et ne doivent être utilisés que pour le contrôle de la qualité de l’image. Pour générer des données, utilisez le flux total de photons. Le flux total de photons est plus pertinent physiologiquement car il représente la lumière émise par la surface et il s’agit d’une unité calibrée, qui est corrigée pour le temps d’exposition (par seconde).
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Representative Results
In vivo BLI est en corrélation avec l’UFC de l’inoculum au moment de l’instillation.
Pour évaluer la limite de détection de BLI in vivo et la corrélation avec l’UFC de l’inoculum, des souris ont été infectées par différentes concentrations d’UTI89-lux et de PBS comme témoin négatif. Avant l’instillation, les animaux non infectés ont été scannés pour déterminer la luminescence de fond. Les images suivantes ont été obtenues immédiatement après l’instillation (Figure 1A). Après l’instillation de l’UTI89-lux, la bioluminescence était solidement détectable au-dessus de 2 x10 4 UFC et une corrélation linéaire entre l’UFC de l’inoculum et la bioluminescence a été établie(Figure 1B). En revanche, le flux total de photons était comparable aux signaux de fond pour les animaux instillés avec PBS et à la concentration bactérienne la plus faible de 2 x 103 UFC.
BLI comme outil de suivi longitudinal pendant le traitement
Pour déterminer si l’effet curatif d’un traitement antibiotique validé peut être démontré à l’aide de l’BLI longitudinale, 20 animaux ont été infectés par un inoculum de 2 x10 7 UFC/50 μL, et 10 de ces animaux ont été traités avec de l’enrofloxacine 10 mg/kg par voie sous-cutanée deux fois par jour au cours des 3 premiers jours suivant l’infection. L’évolution naturelle dans le groupe témoin infecté mais non traité et l’effet du traitement antibiotique sur la cinétique de l’infection dans le groupe traité ont pu être visualisés en détail (Figure 2). Une diminution immédiate de la charge bactérienne, mesurée par le flux total de photons, a été observée après la première dose d’enrofloxacine. Aucun des animaux traités n’a connu une augmentation ultérieure de la charge bactérienne. La variabilité inter-sujets dans le groupe témoin infecté mais non traité était plus élevée et la diminution de la charge bactérienne était plus lente. Au jour 10, 8 animaux sur 10 du groupe témoin étaient revenus à un signal BLI comparable à leur fond d’instillation. La charge bactérienne globale pour chaque animal a été calculée en utilisant l’aire sous la courbe (ASC) du flux total de photons log-transformé. Une différence significative a été observée entre les animaux traités par l’enrofloxacine et les animaux non traités sur une période de 10 jours. Ces résultats démontrent que le BLI est un outil puissant pour évaluer l’effet d’un traitement potentiel sur l’évolution de la maladie d’une infection urinaire.
Figure 1: BLI in vivo est en corrélation avec l’UFC de l’inoculum au moment de l’instillation. (A) Images représentatives obtenues avec BLI in vivo de souris infectées avec des concentrations croissantes d’inoculum (2 x 103-2 x 108 UFC) imagées immédiatement après l’instillation bactérienne dans la vessie. UFC = Unités formant des colonies. (B) Quantification de la bioluminescence émise sur la région de la vessie (flux total de photons) par rapport à la concentration de l’inoculum (UFC). Le signal BLI a été détecté de manière robuste au-dessus de 2 x10 4 UFC (p = 0,0002 par rapport à l’arrière-plan et p = 0,015 par rapport au contrôle PBS, test tnon apparié). La corrélation de Pearson pour les inoculi allant de 2 x 103-2 x 108 UFC était r = 0,9995 (p < 0,0001). BG = fond, PBS = solution saline tamponnée au phosphate, UFC = unités formant des colonies. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: BLI comme outil de suivi longitudinal pendant le traitement. (A) Traces individuelles du flux total de photons pour les animaux infectés par 2 x10 7 UFC d’UTI89-lux et traités par l’enrofloxacine 10 mg/kg deux fois par jour pendant 3 jours (bleu) par rapport à un groupe témoin non traité (noir), n = 10 par groupe. BG = arrière-plan. (B) Analyse des traces d’animaux montrées dans le panneau A, rapportant l’ASC du flux total de photons log-transformés pour l’enrofloxacine (bleu) et le groupe témoin (noir). N = 10 par groupe, moyenne ± ET, test tnon apparié p < 0,0001. ASC = Aire sous la courbe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Avantages de BLI par rapport au nombre d’UFC
Données longitudinales
Un inconvénient majeur de la méthode traditionnelle de comptage de l’UFC pour quantifier la charge microbienne est l’exigence d’homogénats d’organes post-mortem, ne fournissant qu’un seul point de données transversale par animal. Inversement, BLI permet un suivi longitudinal non invasif des animaux infectés. Les animaux peuvent être photographiés 2 à 3 fois par jour, fournissant un aperçu détaillé de la cinétique de l’infection. De plus, les mesures répétées du même animal réduisent considérablement le nombre d’animaux nécessaires pour des expériences suffisamment puissantes. En outre, les chercheurs peuvent se concentrer sur la variabilité interindividuelle et, avant d’examiner ou de traiter les animaux avec un nouvel agent, ils peuvent sélectionner des animaux avec des charges bactériennes prédéfinies en utilisant les données en temps réel. D’autre part, l’utilisation de l’ASC d’une expérience permet aux chercheurs de se concentrer sur la charge bactérienne globale et non sur une seule valeur transversale. La valeur ajoutée des données longitudinales et en temps réel dans le contexte de l’infection urinaire ne peut être surestimée.
Identification de la dissémination de l’infection
La résolution spatiale des images obtenues avec BLI est suffisante pour identifier d’autres sites colonisés par des agents pathogènes marqués lux ou FLuc19. Pour les infections urinaires, les infections ascendantes aux reins ou la dissémination dans le sang sont des résultats très pertinents. Dans ce cadre expérimental, aucune propagation d’infections induites par l’infection urinaire 89-lux au-delà des voies urinaires inférieures n’a été observée. On s’y attendait étant donné que cette souche provoque principalement une cystite.
Reproductibilité et comparaison des données
La reproductibilité des expériences est plus élevée lors de l’utilisation de BLI par rapport au nombre d’UFC. Classiquement, les triplettes de dilutions en série 10 fois des homogénats sont plaquées et seules les plaques avec 30 à 300 UFC sont ensuite comptées pour calculer le nombre total d’UFC. Cette méthode est lourde, sujette à une grande variabilité, donne de nombreuses plaques futiles et est extrêmement sujette aux erreurs humaines. De plus, il n’y a pas de consensus sur la façon de déclarer l’UFC, à savoir par gramme de tissu vésical, par vessie ou par homogénat de 1 mL. Cela rend la comparaison des résultats de différents groupes extrêmement difficile et pourrait être améliorée par l’utilisation de BLI et du flux total de photons.
Considérations et limites de la méthode
Outre les considérations classiques liées à la BLI in vivo telles que l’absorption des photons par la fourrure ou l’hémoglobine, il y a quelques considérations à prendre en compte lors de la corrélation des comptes BLI et CFU au moment du sacrifice.
Tout d’abord, des écarts entre les deux méthodes au moment du sacrifice sont rencontrés20, en particulier lorsque des antibiothérapies sont utilisées. Par conséquent, la corrélation entre le nombre de BLI et de CFU au moment du sacrifice peut être sous-optimale et n’est pas nécessairement pertinente. Pour BLI, le flux total de photons peut être plus faible que prévu, car les bactéries en difficulté peuvent rediriger leur métabolisme vers des processus de récupération et de réparation, plutôt que vers l’émission de lumière. De plus, la mesure BLI capture un instantané des bactéries et de leur métabolisme en temps réel in vivo, ce qui entraîne une baisse des signaux BLI si les bactéries sont dans un état dormant ou allongé au moment de l’imagerie. D’autre part, pour la détermination de l’UFC, les bactéries qui ont des problèmes de médicament réagissent tout ou rien après avoir été retirées de leur habitat infectieux (c.-à-d. un biofilm) et plaquées. Une fois plaquées sur une gélose, les bactéries contestées peuvent être irrémédiablement blessées et incapables de se développer en colonies observables, ce qui entraîne une baisse dunombre d’UFC 21. De plus, les bactéries déficientes peuvent entrer dans un état viable mais non cultivable (VBNC). Ils restent métaboliquement actifs et viables, mais ne sont plus cultivables sur des milieux de laboratoire standard. Les bactéries qui entrent dans l’état VBNC ou qui sont organisées en biofilms peuvent être détectées facilement avec BLI, tandis que le dénombrement de cFU nécessite un traitement supplémentaire21,22,23. En conclusion, la bioluminescence et les comptages viables mesurent différents aspects de la physiologie cellulaire et ni l’un ni l’autre ne doit être considéré comme l’indicateur définitif de la viabilité cellulaire21.
De plus, la définition de la charge bactérienne mesurée par les comptages BLI ou CFU est différente en raison des différences dans le traitement des échantillons. Lors de l’utilisation des numérations UFC, seules les bactéries qui résident dans la paroi de la vessie sont incluses dans l’homogénat et comptées. En revanche, BLI capture également les photons émis par les bactéries dans l’urine et l’urètre. À notre avis, ce dernier est une représentation physiologiquement plus correcte de la charge bactérienne totale car il comprend tous les compartiments anatomiquement pertinents (vessie, urine et urètre).
Contrairement au nombre d’UFC, le BLI nécessite la génération de bactéries luminescentes génétiquement modifiées. Selon le site d’insertion, il est plausible que l’introduction de l’opéron lux dans le génome puisse altérer le potentiel de virulence de la souche bactérienne. Par conséquent, lors du développement d’une nouvelle souche bioluminescente, ses caractéristiques de virulence et de croissance doivent être comparées à la souche parentale10,13. Cependant, les progrès récents dans l’édition du génome permettent un marquage efficace et sans cicatrice de tous les principaux agents pathogènes bactériens, limitant ainsi l’impact sur la virulence ou les réponses au traitement. De plus, le génie génétique ouvre des possibilités d’expression conditionnelle des gènes rapporteurs de bioluminescence et, par conséquent, de mesure in vivo des sous-populations bactériennes pertinentes, de l’expression des gènes,etc. 24,25.
Enfin, l’accès au dispositif d’imagerie avancé et au logiciel d’acquisition pour les BLI in vivo pourrait être un facteur limitant par rapport à l’équipement de base requis pour le dénombrement des UFC. Cependant, les collaborations avec les cœurs d’imagerie peuvent minimiser les dépenses et les investissements nécessaires pour BLI.
Considérations spécifiques à la mise en œuvre de BLI dans un modèle d’UTI in vivo
Modèle animal
Les avantages d’un modèle d’infection urinaire murine sont triples: il permet de surveiller la progression de la maladie dans les voies urinaires d’un mammifère, les animaux et leur entretien sont relativement peu coûteux et des lignées mutantes sont disponibles. D’autre part, l’induction de l’infection implique généralement un cathétérisme transurétral et l’instillation ultérieure d’une dose élevée de bactéries directement dans la lumière de la vessie, contournant ainsi le processus naturel d’ascension via l’urètre5.
Logement des animaux
Les animaux peuvent être logés en groupe pendant l’expérience. Nous avons examiné l’occurrence de la transmission entre les animaux d’une même cage, en introduisant des animaux sentinelles dans des cages avec des animaux infectés. Aucun des animaux sentinelles n’avait de charge bactérienne détectable, mesurée à la fois avec de l’UFC et de l’BLI.
Volume de la vessie
Lorsqu’ils combinent le modèle murin d’infection urinaire avec BLI, les chercheurs doivent garder à l’esprit les propriétés anatomiques uniques de la vessie. La vessie est un organe creux qui contient un volume variable d’urine. Au cours de l’infection urinaire, la présence d’urine infestée de bactéries pourrait théoriquement influencer le nombre total de photons en fonction du degré de remplissage de la vessie. Cependant, la normalisation du volume de la vessie n’est pas pratique et pourrait intervenir avec la conception expérimentale. De plus, d’après notre expérience, les différences de volume de la vessie n’entraînent pas de différences statistiquement significatives dans le flux total de photons.
Température de l’échantillon
In vitro BLI (ou comme alternative plus simple et moins chère, mesurant la bioluminescence dans un luminomètre) peut également être utilisé pourdéterminer la charge bactérienne sur les homogénats, l’urine ou les suspensions bactériennes contenant UTI89-lux . Cependant, la température de l’échantillon est importante car l’émission de photons résulte d’une réaction enzymatique et nécessite donc une activité métabolique et la présence d’oxygène. Il faut éviter les changements drastiques de température pendant le prélèvement d’organes en permettant à l’échantillon de s’étalonner sur l’étape chauffée (37 °C) 5 min avant l’imagerie.
Applications potentielles et importance
En résumé, la méthode fastidieuse de dénombrement de l’UFC limitait la reproductibilité et l’efficacité de la recherche dans le domaine des infections urinaires. La configuration expérimentale avec BLI fera progresser la recherche in vivo sur les infections urinaires sur la physiologie de la vessie, la pathogenèse des infections urinaires et la susceptibilité en permettant un suivi longitudinal, tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires pour ces types d’études.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation pour la recherche - Flandre (FWO Vlaanderen; G0A6113N), le Conseil de recherche de la KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. et W.E.) et le VIB (à la télévision). W.E. est chercheur clinique senior de la Research Foundation - Flanders (FWO Vlaanderen). La souche UTI89-lux était un don généreux du laboratoire du professeur Seed13.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
References
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).
- O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections. Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).
- Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
- Carey, A. J., et al. Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations. Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).
- Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H.
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Avci, P., et al. In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging. Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).
- Balsara, Z. R., et al. Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder. Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).
- Huang, Y. Y., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model. Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).
- Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
- Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A murine model for E. coli urinary tract infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).
- Zhang, Y., et al. Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis. Infectious Microbes & Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).
- Vanherp, L., et al. Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).
- Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).
- Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).
- Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).
- Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).
