Summary
Dette manuskript beskriver intravesisk administration af uropatogene bakterier med en lux operon at fremkalde en urinvejsinfektion i mus og efterfølgende langsgående in vivo analyse af bakteriebelastningen ved hjælp af bioluminescens billeddannelse.
Abstract
Urinvejsinfektioner (UTI) rangerer blandt de mest almindelige bakterielle infektioner hos mennesker og behandles rutinemæssigt med empirisk antibiotika. Men på grund af stigende mikrobiel resistens, effekten af de mest anvendte antibiotika er faldet. For at finde alternative behandlingsmuligheder er der et stort behov for en bedre forståelse af UTI-patogenesen og de mekanismer, der bestemmer UTI-modtagelighed. For at undersøge dette i en dyremodel er en reproducerbar, ikke-invasiv analyse for at studere forløbet af UTI uundværlig.
I årevis har guldstandarden for optælling af bakteriebelastning været bestemmelse af kolonidannende enheder (CFU) for et bestemt prøvevolumen. Denne teknik kræver post mortem organ homogenater og serielle fortyndinger, begrænse data output og reproducerbarhed. Som et alternativ, bioluminescens imaging (BLI) er stigende popularitet til at bestemme bakterielle belastning. Mærkning af patogener med en lux operon giver mulighed for følsom påvisning og kvantificering på en ikke-invasiv måde, hvilket muliggør en langsgående opfølgning. Indtil videre er vedtagelsen af BLI i UTI-forskning fortsat begrænset.
Dette manuskript beskriver den praktiske gennemførelse af BLI i en mus urinvejsinfektion model. Her findes en trinvis vejledning til dyrkning af bakterier, intravesisk instillation og billeddannelse. In vivo-korrelationen med CFU undersøges, og der tilvejebringes et proof-of-concept ved at sammenligne bakteriebelastningen af ubehandlede inficerede dyr med antibiotikabehandlede dyr. Desuden diskuteres de fordele, begrænsninger og overvejelser, der er specifikke for gennemførelsen af BLI i en in vivo UTI-model. Gennemførelsen af BLI på UTI-forskningsområdet vil i høj grad lette forskningen i patogenese af UTI og opdagelsen af nye måder at forebygge og behandle UTI på.
Introduction
Urinvejsinfektioner (UTI) er blandt de mest almindelige bakterielle infektioner hos mennesker. Næsten halvdelen af alle kvinder vil opleve en symptomatisk UTI i løbet af deres levetid1. Infektioner begrænset til blæren kan give anledning til urin symptomer såsom stigning i urin frekvens, haster, hæmaturi, inkontinens, og smerte. Når infektionen stiger op til de øvre urinveje, patienter udvikler pyelonephritis, med utilpashed, feber, kuldegysninger, og rygsmerter. Desuden lider op til 20 % af patienter med UTI af tilbagevendende infektioner, hvilket resulterer i et dramatisk fald i antibiotikafølsomheden2,3,4. I de senere år har der været en stigende interesse for nye behandlingsformer for behandling og forebyggelse af tilbagevendende UTI. På trods af en bedre forståelse af den medfødte og adaptive immunitet i de nedre urinveje og af de bakterielle virulensfaktorer, der er nødvendige for invasion og kolonisering, er ingen radikale ændringer i behandlingsregimet blevet oversat til den daglige urologiske praksis2. For at studere UTI patogenese og modtagelighed in vivo, en reproducerbar og ikke-invasiv analyse er uundværlig.
Flere dyr UTI modeller er blevet beskrevet lige fra nematoder til primater, men murine model er overvejende anvendes5,6. Denne model består af transurethral kateterisering af (kvindelige) mus og efterfølgende instillation af en bakteriel suspension, oftest uropatogene Escherichia coli (UPEC), direkte ind i blæren lumen7. Efter podning er bakteriebelastningen traditionelt blevet kvantificeret ved at bestemme kolonidannende enheder (CFU). Denne teknik kræver, at dyr ofrer for at opnå post mortem organ homogenater og serielle fortyndinger, begrænse dataoutput og reproducerbarhed. Desuden er langsgående opfølgning af bakteriebelastningen hos individuelle dyr ikke mulig ved hjælp af denne teknik.
I 1995 foreslog Contag etal. brugen af bioluminescerende patogener til at overvåge sygdomsprocesser hos levende dyr8,9. Siden da er bioluminescensbilleddannelse (BLI) blevet anvendt på adskillige infektionsmodeller som meningitis, endocarditis, osteomyelitis, hud og bløddelsinfektioner osv.10,11,12. I murin UTI model, en UPEC stamme med den komplette lux operon (luxCDABE) fra Photorhabdus luminescens kan anvendes13. En enzymatisk reaktion katalyseret af bakteriel luciferase, som er afhængig af oxidation af langkædede aldehyd, der reagerer med reduceret flavinmonnukleotid i nærværelse af ilt, hvilket giver den oxiderede flavin, en langkædet fedtsyre og lys12. Lux operon koder for luciferase og andre enzymer, der kræves til syntesen af substraterne. Derfor vil alle metabolisk aktive bakterier kontinuerligt udsende blåt grønt (490 nm) lys uden behov for injektion af et udefrakommende substrat12. Fotoner, der udsendes af lux-taggedebakterier, kan fanges ved hjælp af meget følsomme, afkølede opladningskoblede enhedskameraer (CCD).
Brugen af bioluminescerende bakterier i en model for UTI giver mulighed for langsgående, ikke-invasiv kvantificering af bakteriebelastningen, udelade behovet for at ofre dyr på faste tidspunkter under opfølgningen for CFU bestemmelse. På trods af den brede vifte af muligheder, akkumulere beviser for robustheden af denne BLI teknik på andre områder og dens fordele i forhold til klassiske modeller af UTI, er det ikke blevet bredt gennemført i UTI forskning. Protokollen præsenteres her giver en detaljeret trin-for-trin guide og fremhæver fordelene ved BLI for alle fremtidige UTI forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med EU's Retningslinjer fra Det Europæiske Fællesskab og blev godkendt af KU Leuvens Dyreetiske Komité (P158/2018).
1. Dyrkningsbakterier (tilpasset fra7,13,14)
- Præparation
- Vælg en selvlysende UPEC-stamme, der passer bedst til de eksperimentelle behov.
BEMÆRK: Her blev den kliniske blærebetændelseisolat, UTI89 (E. coli), valgt på grund af dens uropatogene kapacitet hos både mennesker og gnavere og dens fælles anvendelse i murin UTI-modeller5,7,15. Den bioluminescerende isogene stamme, der bærer den komplette lux operon (luxCDABE), kaldes yderligere UTI89-lux. Denne operon bærer også kanamycin sulfat (Km) resistens gener. Derfor kan Km bruges til at vælge bioluminescerende kolonier13. - Lav en korrelationskurve for CFU og optisk densitet ved 600 nanometer (OD 600 nm) for den valgte bakteriestamme7.
- For at gøre dette, kultur bakterier (ved hjælp af protokollen nedenfor) og gøre 8 forskellige fortyndinger i fosfat buffered saltvand (PBS). Mål OD ved 600 nm for alle disse fortyndinger og plade dem på Luria-Bertani (LB) plader til bestemmelse af CFU.
- Plot OD 600 nm værdierne og CFU-værdierne for at bestemme korrelationen og for at opnå en standardkurve.
BEMÆRK: For fremtidige eksperimenter skal du måle OD ved 600 nm og bruge denne standardkurve til at få et øjeblikkeligt skøn over CFU i en bakterieopløsning.
FORSIGTIG: UPEC er patogene bakterier, sørg for, at værelserne er korrekt udstyret og bruger personlige værnemidler.
- Vælg en selvlysende UPEC-stamme, der passer bedst til de eksperimentelle behov.
- Tre dage før instillationen
- Opnå enkelte kolonier ved at stribe glycerolbestanden af bakterier ud ved hjælp af en podningsløkke på LB-plader suppleret med 50 μg/mL Km og kultur natten over ved 37 °C. Forsegle disse plader med en paraffin film til opbevaring ved 4 ° C op til 1 uge.
- To dage før instillationen
- Fyld et sterilt 14 mL polystyren rundt bundrør med dual-position snap caps med 5 mL LB bouillon suppleret med 50 μg/mL Km. Vælg en enkelt bakteriel koloni med en podningsløkke og tilsæt dette til LB bouillon. Vortex i 10 s for at sikre korrekt blanding.
- Kultur statisk med snap cap i åben position ved 37 °C natten over.
BEMÆRK: Statisk vækst af E. coli fremmer udtrykket af type 1-pili, som er afgørende for tilslutning til og invasion af urinepileleceller. - Forbered en steril Erlenmeyer eller kulturkolbe.
- En dag før instillationen
- Efter inkubationen hvirvler røret i 10 s for at sikre korrekt homogenisering af bakteriekulturen. Lav en underkultur i Erlenmeyer ved at tilsætte 25 μL af bakterieops suspensionen til 25 mL frisk LB medium uden antibiotika.
- Luk Erlenmeyer og kultur statisk ved 37 °C natten over.
- På indgydedagen
- Vortex Erlenmeyer i 10 s for at sikre korrekt blanding.
- Hæld kulturen fra Erlenmeyer i et 50 mL kulturrør og centrifuge ved 3.000 x g og 4 °C i 5 min. Dekanter supernatanten og genbrugter bakteriepillen i 10 mL steril PBS og hvirvler igen i 10 s.
- Vælg den eksperimentelle koncentration af inoculum (CFU) og brug standardkurven, der er opnået i trin 1.1.2, til at bestemme den tilsvarende OD 600 nm.
- Tilsæt 1 mL af den genophængte bakteriekultur i 9 mL steril PBS og kontroller OD ved 600 nm. Juster yderligere ved at tilsætte enten steril PBS eller koncentreret bakterieopløsning, indtil den ønskede OD 600 nm er nået7.
BEMÆRK: For eksempel, for UTI89-lux justere kulturen ved at tilføje PBS indtil OD 600 nm når 0,45, svarende til 2 x 107 CFU/50 μL. For at kontrollere antallet af levedygtige CSU'er skal der laves 10 gange serielle fortyndinger og plade 50 μL af femte og sjette 10 gange fortyndinger på LB-plader i tredotel for at opnå mindre end 300 kolonier. Tæl de opnåede kolonier næste dag efter inkubation natten over ved 37 °C. OD 600 nm giver en øjeblikkelig udlæsning, men brug CFU som kvalitetskontrol.
2. Podning af dyrene (tilpasset fra7,16)
- Tilberedning af dyrene
- Vælg den eller de ønskede musestammer afhængigt af forskningsspørgsmål og tilgængelighed af knock-out linjer, eksperimentelle detaljer og forskelle i UTI-modtagelighed5,17. Husk, at transurethral kateterisering er lettere hos hunmus. Brug ikke dyr yngre end 8 uger, da de er immunologisk umodne. Her blev der brugt 12 uger gamle C57Bl/6J-mus.
- Bestil dyr i god tid og lad dem akklimatificer, ideelt i 7 dage. Gruppere husdyr i individuelt ventilerede bure under 12 timers lyse/mørke forhold.
- Barber abdominalområdet af dyrene for at begrænse tabet af signal. Brug ikke hårfjerningscreme, da det hurtigt kan brænde dyrenes hud. Hold dyret fast ved tæt at holde scruff og bagben med den ikke-dominerende hånd, mens det barberer sig med den dominerende hånd. Alternativt barberes under isoflurane anæstesi.
BEMÆRK: Dyr blev barberet 2 dage før billeddannelse, i betragtning af at dyrene vil pleje det barberede område endnu mere. - Giv vand og standard mad ad libitum hele eksperimentet. Fratage dyr fra vand 2 timer før instillation for at minimere blærevolumen under instillation.
- En steril angiokateterspids på en 100 μL-sprøjte monteres, og sprøjten fyldes med bakterieopløsningen, der er fremstillet i trin 1.5.3.
BEMÆRK: For at bestemme baggrundslyscensen skal du anskaffe et baselinebillede før instillationen (se trin 3 nedenfor).
- Indgydelse af dyrene
- Placer dyrene i et induktionskammer, og bedøve dem ved hjælp af indånding af isoflurane med ren ilt som bæregas (induktion ved 3% og vedligeholdelse ved 1,5%).
- Placer et dyr på en arbejdsflade i liggende stilling og opretholde en stabil isoflurane anæstesi ved hjælp af en næse kegle under indgydesættelse. Påfør øjensalen.
- Udvise den resterende urin ved at anvende blid kompression og gøre cirkulære bevægelser på den suprapubic region. Rengør underlivet med 70% ethanol før instillation.
- Smør kateterets spids med normal saltvand. Sæt pegefingeren på den ikke-dominerende hånd på maven og skub den forsigtigt opad. Start kateteriseringen af urinrøret i en 90° vinkel (lodret), og når der er stødt på modstand, vip det vandret, før du indsætter det yderligere (0,5 cm).
BEMÆRK: Skub aldrig kraftigt kateteret, da dette vil skade urinrøret. Blide drejebevægelser kan være nyttige i kateter indsættelse. På den anden side indikerer manglende modstand normalt fejlagtig indsættelse i skeden. - Udfør en langsom (5 μL/s) instillation på 50 μL af bakterieinkumummet (2 x 107 CFU).
BEMÆRK: Højere volumener eller hurtigere instillation kan forårsage tilbagesvaling til nyrerne. Under øvelsen af teknikken kan blåt blæk bruges til at evaluere refluks. - Efter indgydesættelsen skal sprøjten og kateteret holdes på plads i et par sekunder mere og derefter langsomt trække sig tilbage for at forhindre lækage. Registrer eventuelle uregelmæssigheder såsom en høj mængde lækage eller en blodig meatus og udelukker om nødvendigt dyr.
- Dyret placeres i liggende stilling ved billedkammerets næsekegle, og de foregående trin 2.1.1-2.1.6 gentages for alle de resterende dyr. Brug et kateter pr. forsøgsgruppe. Sørg for anæstesi fortsættes og minimere tiden mellem det første og det sidste dyr.
- Om nødvendigt administrere antibiotika eller eksperimentelle lægemidler, før eller efter billeddannelse (trin 3). For eksempel tilsættes 40 μL af enrofloxacinopløsningen (100 mg/mL) til 3,96 mL fysiologisk saltvand for at opnå en fortynding på 1/100. Indsprøjt 100 μL/10 g subkutant ved 9:00 og 17:00 for at give 10 mg/kg enrofloxacin to gange dagligt i 3 dage.
3. Bioluminescensbilleddannelse
- Forberedelse og udvælgelse af billeddiagnostiske parametre
- Åbn BLI-anskaffelsessoftwaren (se Materialetabel), og klik på Initialiser i billedenheden (se Materialetabel) for at teste kamera- og scenecontrollersystemet og for at afkøle CCD-kameraet til -90 °C.
BEMÆRK: Under denne proces er døren låst, og initialiseringens forløb kan følges på kontrolpanelet. Et grønt lys indikerer, at temperaturen på -90 °C er nået. Der vises en advarsel, hvis der forsøges billedbehandling, før initialiseringen er fuldført. - Sørg for, at data gemmes automatisk: Klik på automatisk lagring af anskaffelse, og vælg den korrekte mappe.
- Vælg Luminescens og fotografi. Kontroller standardindstillingerne for luminescens: Indstil excitationsfilteret til Bloker og emissionsfilter til Åbn.
- Indstil eksponeringstiden til Auto, når du tager det første billede, især når du forventer et svagt signal for at sikre et tilstrækkeligt antal fotontællinger. For in vivo målinger og lyse signaler, indstille eksponeringstiden til ~ 30 s. Hvis billedet er mættet, vises der en advarsel. Hvis dette sker, reducere eksponeringstiden.
- Vælg mellemstor binning, F/stop 1, og vælg det korrekte synsfelt (FOV) (D for 5 dyr).
- Indstil motivets højde til 1 cm, når du billeddannelse mus.
- Klik på Tilføj tre gange i Kontrolpanel for at få en sekvens på tre billeder, som tekniske replikerer.
- Åbn BLI-anskaffelsessoftwaren (se Materialetabel), og klik på Initialiser i billedenheden (se Materialetabel) for at teste kamera- og scenecontrollersystemet og for at afkøle CCD-kameraet til -90 °C.
- Imaging
- Placer mus i billedkammeret i liggende stilling og bruge manifold næse kegle til at opretholde anæstesi (isoflurane 1,5%) i hele eksperimentet. Billede op til 5 mus samtidigt og adskille dyrene ved hjælp af lys baffel for at forhindre refleksion.
- Luk døren, og klik på Hent for at starte billedsekvensen.
- Udfyld detaljerede oplysninger om eksperimentet (vilde type- og knockoutdyr, behandlinger, billeddag osv.). Billedindstillingerne, f.eks. eksponeringstid, gemmes automatisk.
- Fjern mus fra billedkammeret og returnere dem til deres bur. Kontroller for den fulde helbredelse efter anæstesi. Inden for få minutter skal dyrene være helt vågne og udforskende. Giv ikke smertestillende, da dette kan forstyrre UTI-kursus18.
- Returner burene til de ventilerede stativer indtil næste billedcyklus. Efter afslutningen af forsøget aflives dyrene ved CO 2-kvælning eller cervikal dislokation. Gør dette før inddrivelse af isoflurane anæstesi for at minimere nød.
- Analyse af billederne
- Start billedsoftwaren, og indlæs forsøgsfilen ved at klikke på Gennemse.
- Brug værktøjspaletten til at justere billedets farveskala. Standardisere det visuelle aspekt af resultaterne ved at bruge de samme indstillinger for alle billederne, dvs bruge en logaritmisk skala med mindst 104 til et maksimum på 107 fotoner. Disse justeringer påvirker ikke de rå data, men kun den grafiske præsentation.
- Brug ROI-værktøjerne til at tegne et interesseområde (ROI) på billedet. Sørg for, at investeringsafkast er stort nok til at dække hele området og bruge de samme dimensioner til alle billederne. Her blev der placeret et firkantet roi på 3,5 cm x 4,5 cm over underlivet.
- Klik på ROI-måling for at kvantificere lysintensiteten (antal eller total fotonflux). Eksporter disse data, og brug gennemsnittet af de tekniske replikter.
BEMÆRK: Optællinger repræsenterer antallet af fotoner, der registreres af kameraet, og bør kun bruges til kvalitetskontrol af billedkvaliteten. Hvis du vil rapportere data, skal du bruge den samlede fotonflux. Total foton flux er mere fysiologisk relevant, da det repræsenterer det lys, der udsendes fra overfladen, og det er en kalibreret enhed, som korrigeres for eksponeringstiden (pr. Sekund).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo korrelerer BLI med CFU af inoculum på tidspunktet for instillation.
For at vurdere påvisningsgrænsen for BLI in vivo og korrelationen med CFU af inoculum blev mus inficeret med forskellige koncentrationer af UTI89-lux og PBS som en negativ kontrol. Før indgydelse blev ikke-inficerede dyr scannet for at bestemme baggrunden luminescens. Efterfølgende billeder blev straks indhentet efter instillation (Figur 1A). Efter indgydelse af UTI89-luxblev bioluminescensen robust påviselig over 2 x 104 CFU, og der blev etableret en lineær korrelation mellem inoculumets CFU og bioluminescensen (figur 1B). I modsætning hertil kunne den samlede fotonflux sammenlignes med baggrundssignaler for dyr indpodet med PBS og ved den laveste bakteriekoncentration på 2 x 103 CFU.
BLI som et redskab til langsgående opfølgning under behandlingen
For at afgøre, om den helbredende virkning af en valideret antibiotikabehandling kan påvises ved hjælp af langsgående BLI, blev 20 dyr inficeret med et inoculum på 2 x 107 CFU/50 μL, og 10 af disse dyr blev behandlet med enrofloxacin 10 mg/kg subkutant to gange dagligt i løbet af de første 3 dage efter infektionen. Både den naturlige udvikling i den inficerede, men ubehandlede kontrolgruppe og virkningen af antibiotikabehandling på infektionskonetik i den behandlede gruppe kunne visualiseres i detaljer (Figur 2). Et øjeblikkeligt fald i bakteriebelastningen, målt ved den samlede fotonflux, blev set efter den første dosis enrofloxacin. Ingen af de behandlede dyr havde en efterfølgende stigning i bakteriebelastningen. Den inter-subject variabilitet i den inficerede, men ubehandlede kontrolgruppe var højere, og faldet i bakteriebelastningen var langsommere. På dag 10 var 8 ud af 10 dyr i kontrolgruppen vendt tilbage til et BLI-signal, der kunne sammenlignes med deres baggrund for instillation. Den samlede bakteriebelastning for hvert dyr blev beregnet ved hjælp af området under kurven (AUC) af den log-transformerede samlede foton flux. Der blev observeret en signifikant forskel mellem dyr, der blev behandlet med enrofloxacin og ubehandlede dyr i løbet af 10 dage. Disse resultater viser, at BLI er et effektivt redskab til at vurdere effekten af en potentiel behandling på sygdomsforløbet af en UTI.
Figur 1: In vivo BLI korrelerer med CFU af inoculum på tidspunktet for instillation. (A) Repræsentative billeder, der er fremstillet med in vivo BLI af mus, der er inficeret med stigende koncentrationer af inoculum (2 x 103 -2x 108 CFU), der er afbildet umiddelbart efter bakterieinstillation i blæren. CFU = Koloni danner enheder. (B) Kvantificering af bioluminescens, der udledes over blæreregionen (total fotonflux) sammenlignet med koncentrationen af inoculum (CFU). BLI-signalet blev robust detekteret over 2 x 104 CFU (p = 0,0002 sammenlignet med baggrund og p = 0,015 sammenlignet med PBS-styringen, umalet t-test). Pearson korrelation for inokuli spænder fra 2 x 103-2 x 108 CFU var r = 0,9995 (p < 0,0001). BG = baggrund, PBS = Fosfat Buffered Saltvand, CFU = Koloni danner enheder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: BLI som et redskab til langsgående opfølgning under behandlingen. (A) Individuelle spor af den samlede foton flux for dyr inficeret med 2 x 107 CFU af UTI89-lux og behandlet med enrofloxacin 10 mg/kg to gange dagligt i 3 dage (blå) versus en ubehandlet kontrolgruppe (sort), n = 10 pr. gruppe. BG = baggrund. (B) Analyse af spor fra dyr vist i panel A, rapportering AUC af log-forvandlet samlede foton flux for både enrofloxacin (blå) og kontrolgruppe (sort). N = 10 pr. gruppe, gennemsnit ± SD, umalet t-testp < 0,0001. AUC = Område under kurven. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordele ved BLI i forhold til CFU tæller
Langsgående data
En væsentlig ulempe ved den traditionelle metode til optælling af CFU til kvantificering af mikrobielle byrder er kravet om post mortem organ homogenater, der kun giver et tværsnitsdatapunkt pr. dyr. Omvendt muliggør BLI ikke-invasiv langsgående opfølgning af inficerede dyr. Dyrene kan afbildes 2 til 3 gange om dagen, hvilket giver detaljeret indsigt i infektionens kinetika. Derudover reducerer gentagne foranstaltninger af det samme dyr drastisk antallet af dyr, der er nødvendige for tilstrækkeligt drevne eksperimenter. Desuden kan forskerne fokusere på den inter-individuelle variation, og før de undersøger eller behandler dyr med et nyt middel, kan de vælge dyr med forudspecificerede bakteriebelastninger ved hjælp af realtidsdata. På den anden side, ved hjælp af AUC af et eksperiment giver forskerne mulighed for at fokusere på den samlede bakterielle belastning og ikke på en enkelt tværsnit værdi. Merværdien af data i længderetningen og realtid i indstillingen for uti'en kan ikke overvurderes.
Identifikation af smittespredning
Den rumlige opløsning af de billeder, der er opnået med BLI, er tilstrækkelig til at identificere andre steder, der koloniseres af lux- eller FLuc-taggedpatogener19. For UTI, stigende infektioner i nyrerne eller formidling til blodet er meget relevante resultater. I denne eksperimentelle indstilling blev enhver spredning af infektioner forårsaget af UTI89-lux ud over de nedre urinveje ikke observeret. Dette var forventet i betragtning af denne stamme overvejende forårsager blærebetændelse.
Data reproducerbarhed og sammenligning
Reproducerbarheden af eksperimenter er højere, når du bruger BLI i forhold til CFU tæller. Klassisk tælles triplikater af seriel 10 gange fortyndinger af homogenater, og kun de plader med 30 til 300 CFU tælles derefter for at beregne det samlede antal CFU. Denne metode er besværlig, tilbøjelig til høj variation, resulterer i mange forgæves plader og er ekstremt tilbøjelig til menneskelige fejl. Desuden er der ingen konsensus om, hvordan man rapporterer CFU, nemlig pr gram blærevæv, per blære, eller pr 1 mL homogenat. Dette gør sammenligningen af resultaterne af forskellige grupper yderst vanskelig og kan forbedres ved brug af BLI og total foton flux.
Overvejelser og begrænsninger af metoden
Ud over de klassiske overvejelser i forbindelse med BLI in vivo såsom absorption af fotoner af pels eller hæmoglobin, er der nogle overvejelser, der skal foretages, når korrelerende BLI og CFU tæller på tidspunktet for ofring.
For det første opstår der20uoverensstemmelser mellem begge metoder på offertidspunktet – især når der anvendes antibiotikabehandlinger. Derfor kan sammenhængen mellem BLI og CFU tælle på offertidspunktet være suboptimal og er ikke nødvendigvis relevant. For BLI kan den samlede fotonstrøm være lavere end forventet, fordi udfordrede bakterier kan omdirigere deres stofskifte mod genopretnings- og reparationsprocesser i stedet for lysemission. Derudover fanger BLI-målingen et øjebliksbillede af bakterierne og deres stofskifte i realtid in vivo, hvilket resulterer i lavere BLI-signaler, hvis bakterier er i en sovende eller langstrakt tilstand på tidspunktet for billeddannelse. På den anden side reagerer lægemiddel-udfordrede bakterier til bestemmelse af CFU på en alt-eller-intet-måde efter at være blevet fjernet fra deres smitsomme habitat (dvs. en biofilm) og forgyldt. Når belagt på agar, de udfordrede bakterier kan være uigenkaldeligt såret og ude af stand til at udvikle sig til observerbare kolonier, hvilket resulterer i lavere CFU tæller21. Derudover kan udfordrede bakterier komme ind i en levedygtig, men ikke kultbar tilstand (VBNC). De forbliver metabolisk aktive og levedygtige, men kan ikke længere dyrkes på standard laboratoriemedier. Bakterier, der kommer ind i VBNC-tilstanden, eller som er organiseret i biofilm, kan nemt detekteres med BLI, mens optælling af CFU kræver yderligere behandling21,22,23. Afslutningsvis vil jeg sige, at bioluminescens og levedygtige optællinger måler forskellige aspekter af cellefysiologi, og ingen af dem bør betragtes som den endelige indikator for celle levedygtighed21.
Desuden er definitionen af bakteriebelastning målt ved BLI- eller CFU-optællinger forskellig på grund af forskelle i prøvebehandling. Ved brug af CFU tæller, kun bakterier, der bor i blærevæggen er inkluderet i homogenatet og tælles. I modsætning hertil fanger BLI også fotoner, der udsendes af bakterier i urinen og urinrøret. Efter vores mening er sidstnævnte en fysiologisk mere korrekt repræsentation af den samlede bakteriebelastning, da den omfatter alle anatomisk relevante rum (blære, urin og urinrøret).
I modsætning til CFU-optællinger kræver BLI dannelsen af genetisk ændrede selvlysende bakterier. Afhængigt af indsættelsesstedet er det sandsynligt, at indførelsen af lux operon i genomet kan ændre virulenspotentialet i bakteriestammen. Derfor skal dens virulens og vækstegenskaber sammenlignes med forældrenes belastning10,13,når der udvikles en ny bioluminescerende stamme. Men de seneste fremskridt inden for genomredigering giver mulighed for effektiv og arfri mærkning af alle større bakteriepatogener, hvilket begrænser virkningen på virulens eller behandlingsresponser. Desuden åbner genteknologi muligheder for betinget udtryk for bioluminescens reporter gener og derfor in vivo måling af relevante bakterielle delpopulationer, genekspression, etc24,25.
Endelig kan adgang til den avancerede billedbehandlingsenhed og anskaffelsessoftware til in vivo BLI være en begrænsende faktor i forhold til det grundlæggende udstyr, der kræves til CFU-optælling. Samarbejde med billedkerner kan dog minimere de udgifter og investeringer, der er nødvendige for BLI.
Overvejelser, der er specifikke for gennemførelsen af BLI i en in vivo UTI-model
Dyremodel
Fordelene ved en murin UTI-model er tre gange: Det giver mulighed for overvågning af sygdomsprogression i et pattedyrs urinveje, dyrene og deres vedligeholdelse er relativt billige, og mutantlinjer er tilgængelige. På den anden side indebærer induktion af infektionen normalt transurethral kateterisering og efterfølgende instillation af en høj dosis bakterier direkte ind i blære lumen, hvorved omgå den naturlige opstigningsproces via urinrøret5.
Dyrestalde
Dyr kan grupperes under forsøget. Vi har undersøgt forekomsten af overførsel mellem dyr i samme bur ved at indføre sentineldyr i bure med inficerede dyr. Ingen af vagtdyrene havde en påviselig bakteriebelastning, målt med både CFU og BLI.
Blærevolumen
Når man kombinerer murin UTI-modellen med BLI, bør forskerne huske blærens unikke anatomiske egenskaber. Blæren er et hult organ, der indeholder en varierende mængde urin. Under UTI, tilstedeværelsen af bakterier-inficeret urin kunne teoretisk påvirke den samlede foton tæller afhængigt af graden af blære påfyldning. Men standardisering af blæren volumen er upraktisk og kunne gribe ind med den eksperimentelle design. Desuden er det vores erfaring, forskelle i blærevolumen ikke resulterer i statistisk signifikante forskelle i den samlede foton flux.
Prøvetemperatur
In vitro BLI (eller som et enklere og billigere alternativ, måling af bioluminescens i et luminometer) kan også bruges til at bestemme bakteriebelastningen på homogenater, urin eller bakteriel suspensioner, der indeholder UTI89-lux. Men temperaturen i prøven er vigtig, da emissionen af fotoner skyldes en enzymatisk reaktion og kræver derfor metabolisk aktivitet og tilstedeværelsen af ilt. Drastiske temperaturændringer under organhøsten bør undgås ved at lade prøven kalibrere på det opvarmede (37 °C) stadium 5 min før billeddannelse.
Potentielle anvendelser og betydning
Sammenfattende begrænsede den besværlige metode til optælling af CFU reproducerbarheden og effekten af forskning på UTI-området. Den eksperimentelle opsætning med BLI vil fremme in vivo UTI forskning i blærefysiologi, UTI patogenese, og modtagelighed ved at muliggøre langsgående opfølgning, samtidig med at antallet af dyr er nødvendige for disse typer af undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af bevillinger fra Research Foundation - Flanders (FWO Vlaanderen; G0A6113N), Ku Leuvens Forskningsråd (C1-TRPLe; T.V. og W.E.) og VIB (til T.V.). W.E. er senior klinisk forsker ved Research Foundation - Flanders (FWO Vlaanderen). Stammen UTI89-lux var en generøs gave fra Prof. Seed's laboratorium13.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
References
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).
- O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections. Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).
- Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
- Carey, A. J., et al. Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations. Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).
- Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H.
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Avci, P., et al. In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging. Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).
- Balsara, Z. R., et al. Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder. Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).
- Huang, Y. Y., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model. Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).
- Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
- Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A murine model for E. coli urinary tract infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).
- Zhang, Y., et al. Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis. Infectious Microbes & Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).
- Vanherp, L., et al. Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).
- Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).
- Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).
- Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).
- Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).
