Summary
Questo manoscritto descrive la somministrazione intravescicale di batteri uropatogeni con un operone lux per indurre un'infezione del tratto urinario nei topi e la successiva analisi longitudinale in vivo della carica batterica utilizzando l'imaging a bioluminescenza.
Abstract
Le infezioni del tratto urinario (UTI) sono tra le infezioni batteriche più comuni negli esseri umani e sono trattate di routine con antibiotici empirici. Tuttavia, a causa dell'aumento della resistenza microbica, l'efficacia degli antibiotici più utilizzati è diminuita. Per trovare opzioni di trattamento alternative, c'è un grande bisogno di una migliore comprensione della patogenesi UTI e dei meccanismi che determinano la suscettibilità UTI. Per indagare su questo in un modello animale, è indispensabile un test riproducibile e non invasivo per studiare il corso dell'UTI.
Per anni, il gold standard per l'enumerazione della carica batterica è stata la determinazione delle unità formanti colonie (CFU) per un particolare volume di campione. Questa tecnica richiede omogeneizzati d'organo post-mortem e diluizioni seriali, limitando l'output e la riproducibilità dei dati. In alternativa, l'imaging a bioluminescenza (BLI) sta guadagnando popolarità per determinare la carica batterica. L'etichettatura dei patogeni con un operone lux consente il rilevamento e la quantificazione sensibili in modo non invasivo, consentendo così un follow-up longitudinale. Finora, l'adozione di BLI nella ricerca UTI rimane limitata.
Questo manoscritto descrive l'implementazione pratica di BLI in un modello di infezione del tratto urinario di topo. Qui viene fornita una guida passo-passo per la coltura di batteri, l'instillazione intravescicale e l'imaging. Viene esaminata la correlazione in vivo con i CFU e viene fornita una prova di concetto confrontando la carica batterica degli animali infetti non trattati con gli animali trattati con antibiotici. Inoltre, vengono discussi i vantaggi, i limiti e le considerazioni specifiche per l'implementazione di BLI in un modello UTI in vivo. L'implementazione di BLI nel campo della ricerca UTI faciliterà notevolmente la ricerca sulla patogenesi delle UTI e la scoperta di nuovi modi per prevenire e curare le UTI.
Introduction
Le infezioni del tratto urinario (UTI) sono tra le infezioni batteriche più comuni negli esseri umani. Quasi la metà di tutte le donne sperimenterà una UTI sintomatica durante la loro vita1. Le infezioni limitate alla vescica possono dare origine a sintomi urinari come aumento della frequenza urinaria, urgenza, ematuria, incontinenza e dolore. Quando l'infezione sale al tratto urinario superiore, i pazienti sviluppano pielonefrite, con malessere, febbre, brividi e mal di schiena. Inoltre, fino al 20% dei pazienti con UTI soffre di infezioni ricorrenti con conseguente drastica diminuzione della sensibilità agli antibiotici2,3,4. Negli ultimi anni, c'è stato un crescente interesse per le nuove terapie per il trattamento e la prevenzione delle infezioni cardiache regressive. Nonostante una migliore comprensione dell'immunità innata e adattativa del tratto urinario inferiore e dei fattori di virulenza batterica necessari per l'invasione e la colonizzazione, nessun cambiamento radicale nel regime di trattamento è stato tradotto nella pratica urologica quotidiana2. Per studiare la patogenesi e la suscettibilità delle UTI in vivo,è indispensabile un test riproducibile e non invasivo.
Sono stati descritti più modelli di UTI animali che vanno dai nematodi ai primati, ma il modello murino è prevalentemente utilizzato5,6. Questo modello consiste nella cateterizzazione transuretrale di topi (femmina) e nella successiva instillazione di una sospensione batterica, più comunemente Escherichia coli uropatogena (UPEC), direttamente nel lume della vescica7. Dopo l'inoculazione, la carica batterica è stata tradizionalmente quantificata determinando le unità formanti colonie (CFU). Questa tecnica richiede il sacrificio di animali per ottenere omogeneizzati di organi post-mortem e diluizioni seriali, limitando l'output e la riproducibilità dei dati. Inoltre, il follow-up longitudinale della carica batterica nei singoli animali non è possibile utilizzando questa tecnica.
Nel 1995, Contag etal. hanno suggerito l'uso di agenti patogeni bioluminescenti per monitorare i processi patologici negli animali viventi8,9. Da allora, l'imaging a bioluminescenza (BLI) è stato applicato a numerosi modelli di infezione come meningite, endocardite, osteomielite, infezioni della pelle e dei tessuti molli, ecc.10,11,12. Nel modello murino UTI, un ceppo UPEC con l'operone lux completo (luxCDABE) di Photorhabdus luminescens può essere utilizzato13. Una reazione enzimatica è catalizzata dalla luciferasi batterica che dipende dall'ossidazione delle aldeidi a catena lunga che reagiscono con un ridotto mononucleotide flavina in presenza di ossigeno, producendo la flavina ossidata, un acido grasso a catena lunga e leggero12. L'operone lux codifica per la luciferasi e altri enzimi necessari per la sintesi dei substrati. Pertanto, tutti i batteri metabolicamente attivi emetteranno continuamente luce verde blu (490 nm) senza la necessità di iniezione di un substrato esogeno12. I fotoni emessi da batteri con tag luxpossono essere catturati utilizzando telecamere CCD (Charge-Coupled Device) altamente sensibili e raffreddate.
L'uso di batteri bioluminescenti in un modello per UTI consente la quantificazione longitudinale e non invasiva della carica batterica, omettendo la necessità di sacrificare animali in punti temporali fissi durante il follow-up per la determinazione del CFU. Nonostante l'ampia gamma di possibilità, accumulando prove per la robustezza di questa tecnica BLI in altri campi e i suoi vantaggi rispetto ai modelli classici di UTI, non è stata ampiamente implementata nella ricerca UTI. Il protocollo qui presentato fornisce una guida dettagliata passo-passo ed evidenzia i vantaggi di BLI per tutte le future UTI ricerche.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida del Consiglio della Comunità europea dell'Unione europea e sono stati approvati dal Comitato etico animale di KU Leuven (P158/2018).
1. Batteri di coltura (adattati da7,13,14)
- Preparazione
- Scegli un ceppo UPEC luminescente che meglio si adatta alle esigenze sperimentali.
NOTA: Qui, l'isolato di cistite clinica, UTI89 (E. coli), è stato selezionato per la sua capacità uropatogena sia nell'uomo che nei roditori e il suo uso comune nei modelli UTI murini5,7,15. Il ceppo isogenico bioluminescente che trasporta l'operone lux completo (luxCDABE) è ulteriormente indicato come UTI89-lux. Questo operone trasporta anche geni di resistenza alla kanamicina solfato (Km). Pertanto, Km può essere utilizzato per selezionare colonie bioluminescenti13. - Fare una curva di correlazione per il CFU e densità ottica a 600 nanometri (OD 600 nm) per il ceppo batterico scelto7.
- Per fare questo, coltivare batteri (utilizzando il protocollo seguente) e fare 8 diverse diluizioni in soluzione salina tamponata fosfato (PBS). Misurare l'OD a 600 nm per tutte queste diluizioni e placcarle su piastre Luria-Bertani (LB) per determinare il CFU.
- Tracciare i valori OD 600 nm e i valori CFU per determinare la correlazione e ottenere una curva standard.
NOTA: Per esperimenti futuri, misurare l'OD a 600 nm e utilizzare questa curva standard per ottenere una stima istantanea del CFU in una soluzione batterica.
ATTENZIONE: gli UPEC sono batteri patogeni, assicurano che le stanze siano adeguatamente attrezzate e utilizzino dispositivi di protezione individuale.
- Scegli un ceppo UPEC luminescente che meglio si adatta alle esigenze sperimentali.
- Tre giorni prima dell'instillazione
- Ottenere singole colonie strisciando lo stock di glicerolo di batteri, utilizzando un anello di inoculazione, su piastre LB integrate con 50 μg/mL Km e coltivando durante la notte a 37 °C. Sigillare queste piastre con un film di paraffina da conservare a 4 °C fino a 1 settimana.
- Due giorni prima dell'instillazione
- Riempire un tubo a fondo tondo in polistirene sterile da 14 mL con tappi a scatto a doppia posizione con 5 mL di brodo LB integrato con 50 μg/mL Km. Scegliere una singola colonia batterica con un anello di inoculazione e aggiungerlo al brodo LB. Vortice per 10 s per garantire una corretta miscelazione.
- Coltura statica con il tappo a scatto in posizione aperta a 37 °C durante la notte.
NOTA: La crescita statica di E. coli favorisce l'espressione del tipo 1-pili, che sono fondamentali per l'aderenza e l'invasione delle cellule epiteliali urinarie. - Preparare un Erlenmeyer sterile o un pallone di coltura.
- Un giorno prima dell'instillazione
- Dopo l'incubazione, ruotare il tubo per 10 s per garantire una corretta omogeneizzazione della coltura batterica. Effettuare una sottocoltura nell'Erlenmeyer aggiungendo 25 μL della sospensione batterica a 25 mL di terreno LB fresco senza antibiotici.
- Chiudere l'Erlenmeyer e la coltura statica a 37 °C durante la notte.
- Il giorno dell'instillazione
- Vortice dell'Erlenmeyer per 10 s per garantire una corretta miscelazione.
- Versare la coltura dell'Erlenmeyer in un tubo di coltura da 50 ml e centrifugare a 3.000 x g e 4 °C per 5 minuti. Decantare il surnatante e risospesare il pellet batterico in 10 ml di PBS sterile e vortice di nuovo per 10 s.
- Scegliere la concentrazione sperimentale dell'inoculo (CFU) e utilizzare la curva standard ottenuta nel passaggio 1.1.2 per determinare la corrispondente OD 600 nm.
- Aggiungere 1 mL della coltura batterica risospesa in 9 mL di PBS sterile e controllare l'OD a 600 nm. Regolare ulteriormente aggiungendo PBS sterile o soluzione batterica concentrata, fino a raggiungere l'OD 600 nm desiderato7.
NOTA: Ad esempio, per UTI89-lux regolare la coltura aggiungendo PBS fino a quando l'OD 600 nm raggiunge 0,45, corrispondente a 2 x 107 CFU/50 μL. Per verificare il numero di CFU vitali, effettuare diluizioni seriali 10 volte e piastre 50 μL della quinta e sesta diluizione 10 volte su piastre LB in triplice copia per ottenere meno di 300 colonie. Contare le colonie ottenute il giorno successivo dopo l'incubazione notturna a 37 °C. OD 600 nm dà una lettura istantanea ma utilizzare CFU come controllo di qualità.
2. Inoculazione degli animali (adattato da7,16)
- Preparazione degli animali
- Scegli i ceppi di topo desiderati in base alla domanda di ricerca e alla disponibilità di linee knock-out, dettagli sperimentali e differenze nella suscettibilità UTI5,17. Tieni presente che il cateterismo transuretrale è più facile nei topi femmina. Non usare animali di età inferiore alle 8 settimane, in quanto sono immunologicamente immaturi. Qui sono stati utilizzati topi C57Bl / 6J femmina di 12 settimane.
- Ordina gli animali con largo anticipo e lasciali acclimatare, idealmente per 7 giorni. Animali domestici di gruppo in gabbie ventilate individualmente, in condizioni standard di luce/buio di 12 ore.
- Rasare la regione addominale degli animali per limitare la perdita di segnale. Non usare la crema per la depilazione, in quanto può bruciare rapidamente la pelle degli animali. Trattenere l'animale tenendo strettamente la collottola e gli arti posteriori con la mano non dominante mentre si rade con la mano dominante. In alternativa, radersi in anestesia isoflurano.
NOTA: gli animali sono stati rasati 2 giorni prima dell'imaging, considerando che gli animali puliranno ulteriormente l'area rasata. - Fornire acqua e cibo standard ad libitum durante l'esperimento. Tuttavia, privare gli animali dall'acqua 2 ore prima dell'instillazione per ridurre al minimo il volume della vescica durante l'instillazione.
- Montare una punta angiocatetere sterile da 24 G su una siringa da 100 μL e riempire la siringa con la soluzione batterica preparata al punto 1.5.3.
NOTA: per determinare la luminescenza dello sfondo, ottenere un'immagine di base prima dell'instillazione (vedere il passaggio 3 di seguito).
- Instillazione degli animali
- Mettere gli animali in una camera di induzione e anestetizzarli utilizzando l'inalazione di isoflurano con ossigeno puro come gas vettore (induzione al 3% e mantenimento all'1,5%).
- Posizionare un animale su una superficie di lavoro in posizione supina e mantenere un'anestesia isoflurano stabile usando un cono nasale durante l'instillazione. Applicare l'unguento per gli occhi.
- Espellere l'urina residua applicando una leggera compressione e facendo movimenti circolari sulla regione sovrapubica. Pulire l'addome inferiore con il 70% di etanolo prima dell'instillazione.
- Lubrificare la punta del catetere con soluzione salina normale. Metti l'indice della mano non dominante sull'addome e spingilo delicatamente verso l'alto. Avviare il cateterismo dell'uretra con un angolo di 90° (verticalmente) e una volta riscontrata resistenza, inclinarlo orizzontalmente prima di inserirlo ulteriormente (0,5 cm).
NOTA: Non spingere mai con forza il catetere, poiché ciò causerà danni all'uretra. Movimenti di rotazione delicati possono essere utili nell'inserimento del catetere. D'altra parte, una mancanza di resistenza di solito indica un inserimento errato nella vagina. - Eseguire un'instillazione lenta (5 μL/s) di 50 μL dell'inoculo batterico (2 x 107 CFU).
NOTA: volumi più elevati o instillazione più rapida potrebbero causare reflusso ai reni. Durante la pratica della tecnica, l'inchiostro blu può essere utilizzato per valutare il reflusso. - Dopo l'instillazione, tenere la siringa e il catetere in posizione per qualche altro secondo e poi ritrarre lentamente per evitare perdite. Registrare eventuali irregolarità come un'elevata quantità di perdite o un meato sanguinante ed escludere gli animali, se necessario.
- Posizionare l'animale in posizione supina al cono nasale della camera di imaging e ripetere i passaggi precedenti 2.1.1-2.1.6 per tutti gli animali rimanenti. Utilizzare un catetere per gruppo sperimentale. Assicurarsi che l'anestesia sia continuata e ridurre al minimo il tempo tra il primo e l'ultimo animale.
- Se necessario, somministrare antibiotici o farmaci sperimentali, prima o dopo l'imaging (fase 3). Ad esempio, per somministrare enrofloxacina, aggiungere 40 μL della soluzione di enrofloxacina (100 mg/mL) a 3,96 mL di soluzione fisiologica per ottenere una diluizione di 1/100. Iniettare 100 μL/10 g per via sottocutanea alle 9 e alle 17 per somministrare 10 mg/kg di enrofloxacina due volte al giorno per 3 giorni.
3. Imaging a bioluminescenza
- Preparazione e selezione dei parametri di imaging
- Aprire il software di acquisizione BLI (vedere Tabella dei materiali)e fare clic su Inizializza nel dispositivo di imaging (vedere Tabella dei materiali)per testare il sistema di controllo della telecamera e dello stage e per raffreddare la telecamera CCD a -90 °C.
NOTA: durante questo processo, la porta è bloccata e l'avanzamento dell'inizializzazione può essere seguito sul pannello di controllo. Una luce verde indica che è stata raggiunta la temperatura di -90 °C. Se si tenta di eseguire l'imaging prima del completamento dell'inizializzazione, verrà visualizzato un avviso. - Assicurarsi che i dati vengano salvati automaticamente: fare clic su acquisizione Salvataggio automatico in e selezionare la cartella corretta.
- Selezionare Luminescenza e Fotografia. Controllare le impostazioni di luminescenza predefinite: impostare il filtro di eccitazione su Blocca e il filtro di emissione su Apri.
- Impostare il tempo di esposizione su Auto quando si scatta la prima immagine, soprattutto quando ci si aspetta un segnale debole per garantire un numero adeguato di conteggi di fotoni. Per le misurazioni in vivo e i segnali luminosi, impostare il tempo di esposizione su ~30 s. Se l'immagine è satura, verrà visualizzato un avviso. Se ciò accade, ridurre il tempo di esposizione.
- Selezionare il Binning medio, F/stop 1 e scegliere il campo visivo corretto(FOV)(D per 5 animali).
- Impostare l'altezza del soggetto su 1 cm durante l'imaging dei mouse.
- Fare clic su Aggiungi tre volte nel Pannello di controllo di acquisizione per ottenere una sequenza di tre immagini, come repliche tecniche.
- Aprire il software di acquisizione BLI (vedere Tabella dei materiali)e fare clic su Inizializza nel dispositivo di imaging (vedere Tabella dei materiali)per testare il sistema di controllo della telecamera e dello stage e per raffreddare la telecamera CCD a -90 °C.
- Imaging
- Posizionare i topi nella camera di imaging in posizione supina e utilizzare il cono del naso del collettore per mantenere l'anestesia (isoflurano 1,5%) durante l'esperimento. Immagina fino a 5 topi contemporaneamente e separa gli animali usando il deflettore di luce per impedire la riflessione.
- Chiudi la porta e fai clic su Acquisisci per avviare la sequenza di imaging.
- Inserisci informazioni dettagliate sull'esperimento (animali selvatici e knockout, trattamenti, giorno di imaging, ecc.). Le impostazioni di imaging, come il tempo di esposizione, vengono salvate automaticamente.
- Rimuovere i topi dalla camera di imaging e riportarli nella loro gabbia. Verificare il pieno recupero dopo l'anestesia. In pochi minuti, gli animali dovrebbero essere completamente svegli ed esplorativi. Non fornire analgesia in quanto ciò potrebbe interferire con il corso UTI18.
- Riportare le gabbie ai rack ventilati fino al successivo ciclo di imaging. Dopo il completamento dell'esperimento, eutanasizzare gli animali mediante asfissia di CO2 o lussazione cervicale. Fallo prima del recupero dell'anestesia isoflurano per ridurre al minimo l'angoscia.
- Analisi delle immagini
- Avviare il software di imaging e caricare il file sperimentale facendo clic su Sfoglia.
- Utilizzate la tavolozza degli strumenti per regolare la scala dei colori dell'immagine. Standardizzare l'aspetto visivo dei risultati utilizzando le stesse impostazioni per tutte le immagini, ovvero utilizzare una scala logaritmica con un minimo di 104 ad un massimo di 107 fotoni. Queste regolazioni non influiscono sui dati grezzi ma solo sulla presentazione grafica.
- Utilizza gli strumenti ROI per disegnare una regione di interesse (ROI) sull'immagine. Assicurati che il ROI sia abbastanza grande da coprire l'intera area e utilizza le stesse dimensioni per tutte le immagini. Qui, un ROI quadrato di 3,5 cm x 4,5 cm è stato posizionato sopra l'addome inferiore.
- Fare clic su Misurazione del ROI per quantificare l'intensità luminosa (conteggi o flusso totale di fotoni). Esporta questi dati e utilizza la media delle repliche tecniche.
NOTA: i conteggi rappresentano il numero di fotoni rilevati dalla fotocamera e devono essere utilizzati solo per il controllo della qualità dell'immagine. Per riportare i dati, utilizzare il flusso totale di fotoni. Il flusso totale di fotoni è più fisiologicamente rilevante in quanto rappresenta la luce emessa dalla superficie ed è un'unità calibrata, che viene corretta per il tempo di esposizione (al secondo).
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Representative Results
In vivo BLI correla con CFU dell'inoculo al momento dell'instillazione.
Per valutare il limite di rilevazione di BLI in vivo e la correlazione con CFU dell'inoculo, i topi sono stati infettati con diverse concentrazioni di UTI89-lux e PBS come controllo negativo. Prima dell'instillazione, gli animali non infetti sono stati scansionati per determinare la luminescenza di fondo. Le immagini successive sono state ottenute immediatamente dopo l'instillazione (Figura 1A). Dopo l'instillazione di UTI89-lux, la bioluminescenza è stata robustamente rilevabile sopra 2 x 104 CFU ed è stata stabilita una correlazione lineare tra il CFU dell'inoculo e la bioluminescenza (Figura 1B). Al contrario, il flusso totale di fotoni era paragonabile ai segnali di fondo per gli animali instillati con PBS e alla più bassa concentrazione batterica di 2 x 103 CFU.
BLI come strumento per il follow-up longitudinale durante il trattamento
Per determinare se l'effetto curativo di un trattamento antibiotico convalidato può essere dimostrato utilizzando BLI longitudinale, 20 animali sono stati infettati da un inoculo di 2 x 107 CFU / 50 μL e 10 di questi animali sono stati trattati con enrofloxacina 10 mg / kg per via sottocutanea due volte al giorno durante i primi 3 giorni dopo l'infezione. Sia l'evoluzione naturale nel gruppo di controllo infetto ma non trattato che l'effetto del trattamento antibiotico sulla cinetica dell'infezione nel gruppo trattato potrebbero essere visualizzati in dettaglio (Figura 2). Una diminuzione immediata della carica batterica, misurata dal flusso totale di fotoni, è stata osservata dopo la prima dose di enrofloxacina. Nessuno degli animali trattati ha avuto un successivo aumento della carica batterica. La variabilità tra soggetti nel gruppo di controllo infetto ma non trattato era più alta e la diminuzione della carica batterica era più lenta. Al giorno 10, 8 animali su 10 del gruppo di controllo erano tornati a un segnale BLI paragonabile al loro background pre-instillazione. La carica batterica complessiva per ciascun animale è stata calcolata utilizzando l'area sotto la curva (AUC) del flusso totale di fotoni trasformati in log. È stata osservata una differenza significativa tra gli animali trattati con enrofloxacina e gli animali non trattati nel corso di 10 giorni. Questi risultati dimostrano che BLI è un potente strumento per valutare l'effetto di un potenziale trattamento sul decorso della malattia di una UTI.
Figura 1: BlI in vivo correla con CFU dell'inoculo al momento dell'instillazione. (A) Immagini rappresentative ottenute con BLI in vivo di topi infetti da concentrazioni crescenti di inoculo (2 x 103-2 x 108 CFU) fotografate immediatamente dopo l'instillazione batterica nella vescica. CFU = Unità formanti colonie. (B) Quantificazione della bioluminescenza emessa sulla regione della vescica (flusso totale di fotoni) rispetto alla concentrazione dell'inoculo (CFU). Il segnale BLI è stato rilevato in modo robusto sopra 2 x10 4 CFU (p = 0,0002 rispetto allo sfondo e p = 0,015 rispetto al controllo PBS, t-testspaiato). La correlazione di Pearson per gli inoculi che vanno da 2 x10 3-2 x 108 CFU era r = 0,9995 (p < 0,0001). BG = sfondo, PBS = soluzione salina tamponata con fosfato, CFU = unità formanti colonie. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: BLI come strumento per il follow-up longitudinale durante il trattamento. (A) Tracce individuali del flusso totale di fotoni per animali infetti da 2 x 107 CFU di UTI89-lux e trattati con enrofloxacina 10 mg/kg due volte al giorno per 3 giorni (blu) rispetto a un gruppo di controllo non trattato (nero), n = 10 per gruppo. BG = sfondo. (B) Analisi delle tracce di animali mostrate nel pannello A, riportando l'AUC del flusso totale di fotoni log-trasformati sia per l'enrofloxacina (blu) che per il gruppo di controllo (nero). N = 10 per gruppo, media ± SD, t-test p non accoppiato < 0,0001. AUC = Area sotto la curva. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Vantaggi di BLI rispetto ai conteggi CFU
Dati longitudinali
Uno dei principali svantaggi del metodo tradizionale di conteggio dei CFU per quantificare il carico microbico è il requisito degli omogeneizzati d'organo post-mortem, fornendo un solo punto di dati trasversale per animale. Al contrario, BLI consente un follow-up longitudinale non invasivo degli animali infetti. Gli animali possono essere ripresi 2 o 3 volte al giorno, fornendo informazioni dettagliate sulla cinetica dell'infezione. Inoltre, le misure ripetute dello stesso animale riducono drasticamente il numero di animali necessari per esperimenti adeguatamente alimentati. Inoltre, i ricercatori possono concentrarsi sulla variabilità interindividuale e prima di esaminare o trattare gli animali con un nuovo agente, possono selezionare animali con cariche batteriche prespecificate utilizzando i dati in tempo reale. D'altra parte, l'utilizzo dell'AUC di un esperimento consente ai ricercatori di concentrarsi sulla carica batterica complessiva e non su un singolo valore di sezione trasversale. Il valore aggiunto dei dati longitudinali e in tempo reale nell'impostazione UTI non può essere sopravvalutato.
Identificazione della diffusione dell'infezione
La risoluzione spaziale delle immagini ottenute con BLI è adeguata per identificare altri siti colonizzati da patogeni con tag lux o FLuc19. Per UTI, le infezioni ascendenti ai reni o la diffusione al sangue sono risultati altamente rilevanti. In questo contesto sperimentale, non è stata osservata alcuna diffusione di infezioni indotte da UTI89-lux oltre il tratto urinario inferiore. Questo ci si aspettava considerando che questo ceppo causa prevalentemente cistite.
Riproducibilità e confronto dei dati
La riproducibilità degli esperimenti è maggiore quando si utilizza BLI rispetto ai conteggi CFU. Classicamente, i triplicati delle diluizioni seriali 10 volte degli omogeneizzati sono placcati e solo quelle piastre con 30-300 CFU vengono quindi conteggiate per calcolare il numero totale di CFU. Questo metodo è ingombrante, incline ad alta variabilità, si traduce in molte piastre futili ed è estremamente soggetto a errori umani. Inoltre, non vi è consenso su come segnalare il CFU, vale a dire, per grammo di tessuto vescicale, per vescica o per 1 mL di omogeneizzato. Ciò rende estremamente difficile il confronto dei risultati di diversi gruppi e potrebbe essere migliorato dall'uso di BLI e flusso totale di fotoni.
Considerazioni e limitazioni del metodo
Oltre alle classiche considerazioni relative al BLI in vivo come l'assorbimento dei fotoni da pelliccia o emoglobina, ci sono alcune considerazioni da fare quando si correlano i conteggi BLI e CFU al momento del sacrificio.
In primo luogo, le discrepanze tra i due metodi al momento del sacrificio si incontrano20, specialmente quando vengono utilizzate terapie antibiotiche. Pertanto, la correlazione tra i conteggi BLI e CFU al momento del sacrificio può essere non ottimale e non è necessariamente rilevante. Per BLI, il flusso totale di fotoni può essere inferiore al previsto, perché i batteri sfidati possono reindirizzare il loro metabolismo verso processi di recupero e riparazione, piuttosto che l'emissione di luce. Inoltre, la misurazione BLI acquisisce un'istantanea dei batteri e del loro metabolismo in tempo reale in vivo, con conseguente segnale BLI inferiore se i batteri sono in uno stato dormiente o allungato al momento dell'imaging. D'altra parte, per la determinazione del CFU, i batteri sfidati dai farmaci reagiscono in modo tutto o niente dopo essere stati rimossi dal loro habitat infettivo (cioè un biofilm) e placcati. Una volta placcati sull'agar, i batteri sfidati possono essere irrimediabilmente feriti e incapaci di svilupparsi in colonie osservabili, con conseguente riduzione dei conteggi di CFU21. Inoltre, i batteri sfidati possono entrare in uno stato vitale ma non coltivabile (VBNC). Rimangono metabolicamente attivi e vitali ma non sono più coltivabili su supporti di laboratorio standard. I batteri che entrano nello stato VBNC o che sono organizzati in biofilm possono essere rilevati facilmente con BLI, mentre l'enumerazione dei CFU richiede un'elaborazione aggiuntiva21,22,23. In conclusione, la bioluminescenza e i conteggi vitali misurano diversi aspetti della fisiologia cellulare e nessuno dei due dovrebbe essere considerato l'indicatore definitivo della vitalità cellulare21.
Inoltre, la definizione di carica batterica misurata dai conteggi BLI o CFU è diversa a causa delle differenze nell'elaborazione del campione. Quando si utilizzano conteggi CFU, solo i batteri che risiedono all'interno della parete della vescica sono inclusi nell'omogeneizzato e contati. Al contrario, BLI cattura anche i fotoni emessi dai batteri nelle urine e nell'uretra. A nostro avviso, quest'ultima è una rappresentazione fisiologicamente più corretta della carica batterica totale in quanto comprende tutti i compartimenti anatomicamente rilevanti (vescica, urina e uretra).
A differenza dei conteggi CFU, BLI richiede la generazione di batteri luminescenti geneticamente modificati. A seconda del sito di inserimento, è plausibile che l'introduzione dell'operone lux nel genoma possa alterare il potenziale di virulenza del ceppo batterico. Pertanto, quando si sviluppa un nuovo ceppo bioluminescente, la sua virulenza e le sue caratteristiche di crescita devono essere confrontate con il ceppo parentale10,13. Tuttavia, i recenti progressi nell'editing del genoma consentono un tagging efficiente e senza cicatrici di tutti i principali patogeni batterici, limitando così l'impatto sulla virulenza o sulle risposte al trattamento. Inoltre, l'ingegneria genetica apre possibilità verso l'espressione condizionale di geni reporter di bioluminescenza e, quindi, la misurazione in vivo di sottopopolazioni batteriche rilevanti, espressione genica,ecc. 24,25.
Infine, l'accesso al dispositivo di imaging avanzato e al software di acquisizione per BLI in vivo potrebbe essere un fattore limitante rispetto alle apparecchiature di base richieste per l'enumerazione CFU. Tuttavia, le collaborazioni con i core di imaging possono ridurre al minimo le spese e gli investimenti necessari per BLI.
Considerazioni specifiche per l'implementazione di BLI in un modello UTI in vivo
Modello animale
I vantaggi di un modello UTI murino sono triplici: consente il monitoraggio della progressione della malattia in un tratto urinario di mammifero, gli animali e il loro mantenimento sono relativamente economici e sono disponibili linee mutanti. D'altra parte, l'induzione dell'infezione di solito comporta il cateterismo transuretrale e la successiva instillazione di un alto dosaggio di batteri direttamente nel lume della vescica, bypassando così il naturale processo di ascensione attraverso l'uretra5.
Alloggiamento per animali
Gli animali possono essere ospitati in gruppo durante l'esperimento. Abbiamo esaminato il verificarsi della trasmissione tra animali della stessa gabbia, introducendo animali sentinella in gabbie con animali infetti. Nessuno degli animali sentinella aveva una carica batterica rilevabile, misurata sia con CFU che con BLI.
Volume della vescica
Quando si combina il modello UTI murino con BLI, i ricercatori dovrebbero tenere a mente le proprietà anatomiche uniche della vescica. La vescica è un organo cavo che contiene un volume variabile di urina. Durante l'UTI, la presenza di urina infestata da batteri potrebbe teoricamente influenzare la conta totale dei fotoni a seconda del grado di riempimento della vescica. Tuttavia, la standardizzazione del volume della vescica non è pratica e potrebbe intervenire con la progettazione sperimentale. Inoltre, nella nostra esperienza, le differenze nel volume della vescica non si traducono in differenze statisticamente significative nel flusso totale di fotoni.
Temperatura del campione
In vitro BLI (o come alternativa più semplice ed economica, misurando la bioluminescenza in un luminometro) può anche essere utilizzato per determinare la carica batterica su omogeneizzati, urina o sospensioni batteriche contenenti UTI89-lux. Tuttavia, la temperatura del campione è importante in quanto l'emissione di fotoni deriva da una reazione enzimatica e quindi richiede attività metabolica e presenza di ossigeno. Drastici cambiamenti di temperatura durante il prelievo di organi devono essere evitati consentendo al campione di calibrare sullo stadio riscaldato (37 ° C) 5 minuti prima dell'imaging.
Potenziali applicazioni e importanza
In sintesi, l'ingombrante metodo di enumerazione dei CFU limitava la riproducibilità e l'efficacia della ricerca nel campo delle UTI. La configurazione sperimentale con BLI farà progredire la ricerca UTI in vivo sulla fisiologia della vescica, la patogenesi UTI e la suscettibilità consentendo il follow-up longitudinale, riducendo al contempo il numero di animali necessari per questi tipi di studi.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione per la ricerca - Fiandre (FWO Vlaanderen; G0A6113N), il Consiglio di ricerca di KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. e W.E.) e il VIB (a T.V.). W.E. è un ricercatore clinico senior della Fondazione di ricerca - Fiandre (FWO Vlaanderen). Il ceppo UTI89-lux è stato un generoso dono del laboratorio del Prof. Seed13.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
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