Summary
Dette manuskriptet beskriver den intravesiske administrasjonen av uropatogene bakterier med lux operon for å indusere en urinveisinfeksjon hos mus og påfølgende langsgående in vivoanalyse av bakteriebelastningen ved hjelp av bioluminescensavbildning.
Abstract
Urinveisinfeksjoner (UVI) rangerer blant de vanligste bakterielle infeksjonene hos mennesker og behandles rutinemessig med empiriske antibiotika. På grunn av økende mikrobiell resistens har effekten av de mest brukte antibiotika imidlertid gått ned. For å finne alternative behandlingsalternativer er det et stort behov for en bedre forståelse av UVI-patogenesen og mekanismene som bestemmer UVI-følsomhet. For å undersøke dette i en dyremodell er en reproduserbar, ikke-invasiv analyse for å studere UTI-kurset uunnværlig.
I årevis har gullstandarden for opplisting av bakteriebelastning vært bestemmelse av Kolonidannende enheter (CFU) for et bestemt prøvevolum. Denne teknikken krever organhomogenater og serielle fortynninger etter mortem, noe som begrenser datautgang og reproduserbarhet. Som et alternativ blir bioluminescensavbildning (BLI) stadig mer populært for å bestemme bakteriebelastningen. Merking av patogener med lux operon tillater sensitiv deteksjon og kvantifisering på en ikke-invasiv måte, og muliggjør dermed langsgående oppfølging. Så langt er adopsjonen av BLI i UVI-forskning fortsatt begrenset.
Dette manuskriptet beskriver den praktiske implementeringen av BLI i en muse urinveisinfeksjonsmodell. Her gis en trinnvis guide for dyrking av bakterier, intravesisk instillasjon og avbildning. In vivo-korrelasjonen med CFU undersøkes og et konseptbevis er gitt ved å sammenligne bakteriebelastningen til ubehandlede infiserte dyr med antibiotikabehandlede dyr. Videre diskuteres fordelene, begrensningene og hensynene som er spesifikke for implementeringen av BLI i en in vivo UTI-modell. Implementeringen av BLI på UTI-forskningsfeltet vil i stor grad legge til rette for forskning på patogenesen av UVI og oppdagelsen av nye måter å forebygge og behandle UVI på.
Introduction
Urinveisinfeksjoner (UVI) er blant de vanligste bakterielle infeksjonene hos mennesker. Nesten halvparten av alle kvinner vil oppleve en symptomatisk UVI i løpet av livet1. Infeksjoner begrenset til blæren kan gi opphav til urinsymptomer som økning i urinfrekvens, haster, hematuri, inkontinens og smerte. Når infeksjonen stiger opp til øvre urinveier, utvikler pasienter pyelonefritt, med ubehag, feber, frysninger og ryggsmerter. Videre lider opptil 20% av pasientene med UVI av tilbakevendende infeksjoner, noe som resulterer i en dramatisk reduksjon i antibiotikafølsomhet2,3,4. De siste årene har det vært en økende interesse for nye terapier for behandling og forebygging av tilbakevendende UVI. Til tross for en bedre forståelse av den medfødte og adaptive immuniteten i nedre urinveier og av bakterielle virulensfaktorer som er nødvendige for invasjon og kolonisering, har ingen radikale endringer i behandlingsregimet blitt oversatt til den daglige urologiske praksisen2. For å studere UVI patogenese og følsomhet i vivo, er en reproduserbar og ikke-invasiv analyse uunnværlig.
Flere dyr UTI-modeller har blitt beskrevet som spenner fra nematoder til primater, men murinmodellen brukes hovedsakelig5,6. Denne modellen består av transuretral kateterisering av (kvinnelige) mus og etterfølgende instillasjon av en bakteriell suspensjon, oftest uropathogenic Escherichia coli (UPEC), direkte inn i blærelummen7. Etter inokulering har bakteriebelastningen tradisjonelt blitt kvantifisert ved å bestemme kolonidannende enheter (CFU). Denne teknikken krever ofre dyr for å oppnå post-mortem organ homogenater og serielle fortynninger, begrense datautgang og reproduserbarhet. Videre er langsgående oppfølging av bakteriebelastningen hos enkelte dyr ikke mulig ved hjelp av denne teknikken.
I 1995 foreslo Contag et al. bruk av bioluminescent-taggede patogener for å overvåke sykdomsprosesser hos levende dyr8,9. Siden da har bioluminescensavbildning (BLI) blitt brukt på mange infeksjonsmodeller som meningitt, endokarditt, osteomyelitt, hud og bløtvevsinfeksjoner, etc.10,11,12. I murin UTI-modellen kan en UPEC-stamme med hele lux operon (luxCDABE) fra Photorhabdus luminescens brukes13. En enzymatisk reaksjon er katalysert av bakteriell luciferase som er avhengig av oksidasjon av langkjedede aldehyder som reagerer med redusert flavinmononukleotid i nærvær av oksygen, noe som gir den oksiderte flavin, en langkjedet fettsyre og lys12. Lux operonkoder for luciferase og andre enzymer som kreves for syntesen av substratene. Derfor vil alle metabolsk aktive bakterier kontinuerlig avgi blått grønt (490 nm) lys uten behov for injeksjon av et eksogent substrat12. Fotoner som slippes ut av lux-taggedebakterier kan fanges opp ved hjelp av svært følsomme, avkjølte ladekoblede enhetskameraer (CCD).
Bruk av bioluminescerende bakterier i en modell for UVI muliggjør langsgående, ikke-invasiv kvantifisering av bakteriebelastningen, og utelater behovet for å ofre dyr på faste tidspunkter under oppfølgingen av CFU-bestemmelse. Til tross for det brede spekteret av muligheter, akkumulere bevis for robustheten av denne BLI-teknikken på andre felt og dens fordeler i forhold til klassiske modeller av UVI, har den ikke blitt implementert i UTI-forskningen. Protokollen som presenteres her gir en detaljert trinnvis guide og fremhever fordelene med BLI for all fremtidig UVI-forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med EUs fellesskapsråds retningslinjer og ble godkjent av Animal Ethics Committee of KU Leuven (P158/2018).
1. Culturing bakterier (tilpasset fra7,13,14)
- Forberedelse
- Velg en lysende UPEC-stamme som passer best til de eksperimentelle behovene.
MERK: Her ble den kliniske blærebetennelsen isolert, UTI89 (E. coli), ble valgt på grunn av sin uropatogeniske kapasitet hos både mennesker og gnagere, og den vanlige bruken i murine UTI-modeller5,7,15. Den bioluminescerende isogene stammen som bærer hele lux operon (luxCDABE) blir videre referert til som UTI89-lux. Denne operonen bærer også kanamycinsulfat (Km) resistensgener. Derfor kan Km brukes til å velge bioluminescent kolonier13. - Lag en korrelasjonskurve for CFU og optisk tetthet ved 600 nanometer (OD 600 nm) for den valgte bakteriestammen7.
- For å gjøre dette, kulturbakterier (ved hjelp av protokollen nedenfor) og gjør 8 forskjellige fortynninger i fosfatbufret saltvann (PBS). Mål OD ved 600 nm for alle disse fortynningene og plate dem på Luria-Bertani (LB) plater for å bestemme CFU.
- Tegn inn OD 600 nm-verdiene og CFU-verdiene for å bestemme korrelasjonen og for å oppnå en standardkurve.
MERK: For fremtidige eksperimenter måler du OD ved 600 nm og bruker denne standardkurven for å få en umiddelbar estimering av CFU i en bakteriell løsning.
FORSIKTIG: UPEC er patogene bakterier, sørger for at rommene er riktig utstyrt og bruker personlig verneutstyr.
- Velg en lysende UPEC-stamme som passer best til de eksperimentelle behovene.
- Tre dager før innåndingen
- Oppnå enkeltkolonier ved å strekke ut glyserolbestanden av bakterier, ved hjelp av en inokulasjonssløyfe, på LB-plater supplert med 50 μg / ml km og kultur over natten ved 37 °C. Forsegle disse platene med en parafinfilm for lagring ved 4 °C i opptil 1 uke.
- To dager før innåndingen
- Fyll et sterilt 14 ml polystyren rundt bunnrør med doble festehetter med 5 ml LB-buljong supplert med 50 μg/ml km. Velg en enkelt bakteriell koloni med en inokulasjonssløyfe og legg dette til LB-buljongen. Virvel i 10 s for å sikre riktig blanding.
- Kultur statisk med smekkhetten i åpen stilling ved 37 °C over natten.
MERK: Statisk vekst av E. coli fremmer uttrykket av type 1-pili, som er avgjørende for overholdelse og invasjon av urinepiteleceller. - Forbered en steril Erlenmeyer eller kulturflaske.
- En dag før innåndingen
- Etter inkubasjonen, virvel røret i 10 s for å sikre riktig homogenisering av bakteriekulturen. Lag en underkultur i Erlenmeyer ved å legge til 25 μL bakteriell suspensjon til 25 ml friskt LB-medium uten antibiotika.
- Lukk Erlenmeyer og kultur statisk ved 37 °C over natten.
- På innpodingsdagen
- Virvel Erlenmeyer i 10 s for å sikre riktig blanding.
- Hell kulturen fra Erlenmeyer i et 50 ml kulturrør og sentrifuge ved 3000 x g og 4 °C i 5 minutter. Dekanter supernatanten og resuspend bakteriell pellet i 10 ml steril PBS og virvel igjen i 10 s.
- Velg den eksperimentelle konsentrasjonen av inokulum (CFU) og bruk standardkurven oppnådd i trinn 1.1.2 for å bestemme den tilsvarende OD 600 nm.
- Tilsett 1 ml av den gjenbrukte bakteriekulturen i 9 ml steril PBS og kontroller OD ved 600 nm. Juster videre ved å legge til enten steril PBS eller konsentrert bakteriell løsning, til ønsket OD 600 nm er nådd7.
MERK: For eksempel, for UTI89-lux justere kulturen ved å legge til PBS til OD 600 nm når 0,45, tilsvarende 2 x 107 CFU / 50 μL. For å verifisere antall levedyktige CFUer, gjør du 10 ganger seriell fortynning og plate 50 μL av femte og sjette 10 ganger fortynning på LB-plater i triplikat for å oppnå mindre enn 300 kolonier. Tell de oppnådde koloniene neste dag etter overnatting inkubasjon ved 37 °C. OD 600 nm gir en umiddelbar avlesning, men bruker CFU som kvalitetskontroll.
2. Inokulering av dyrene (tilpasset fra7,16)
- Forberedelse av dyrene
- Velg ønsket(e) musebelastning(er) avhengig av forskningsspørsmålet og tilgjengeligheten av utstansingslinjer, eksperimentelle detaljer og forskjeller i UVI-følsomhet5,17. Husk at transuretral kateterisering er lettere hos kvinnelige mus. Ikke bruk dyr yngre enn 8 uker, da de er immunologisk umodne. Her ble 12 uker gamle kvinnelige C57Bl/6J-mus brukt.
- Bestill dyr i god tid og la dem akklimatisere, ideelt i 7 dager. Gruppehusdyr i individuelt ventilerte bur, under standard 12 timers lys / mørke forhold.
- Barber bukområdet til dyrene for å begrense tap av signal. Ikke bruk hårfjerningskrem, da det kan brenne huden på dyrene raskt. Hold dyret ved å holde scruff og bakre lemmer tett med den ikke-dominerende hånden mens du barberer med den dominerende hånden. Alternativt kan du barbere under isofluranbedøvelse.
MERK: Dyr ble barbert 2 dager før avbildning, med tanke på at dyrene vil stelle det barberte området ytterligere. - Gi vann og standard mat annonse libitum gjennom hele eksperimentet. Frata imidlertid dyr fra vann 2 timer før instillasjon for å minimere blærevolumet under instillasjon.
- Monter en steril 24 G angiokateterspiss på en 100 μL sprøyte og fyll sprøyten med bakterieoppløsningen fremstilt i trinn 1.5.3.
MERK: For å bestemme bakgrunnslystettheten, få et grunnlinjebilde før innåndingen (se trinn 3 nedenfor).
- Instillasjon av dyrene
- Plasser dyrene i et induksjonskammer og bedøv dem ved hjelp av innånding av isofluran med rent oksygen som bærergass (induksjon ved 3% og vedlikehold ved 1,5%).
- Plasser ett dyr på en arbeidsflate i liggende stilling og oppretthold en stabil isofluranbedøvelse ved hjelp av en nesekegle under innåndingen. Påfør øyesalve.
- Utvis gjenværende urin ved å bruke skånsom kompresjon og gjøre sirkulære bevegelser på den suprapube regionen. Rengjør underlivet med 70% etanol før innånding.
- Smør kateterspissen med vanlig saltvann. Sett pekefingeren på den ikke-dominerende hånden på magen og skyv den forsiktig oppover. Start kateteriseringen av urinrøret i en 90° vinkel (vertikalt) og når det oppstår motstand, vipp det horisontalt før du setter det videre (0,5 cm).
MERK: Trykk aldri kateteret kraftig, da dette vil skade urinrøret. Milde dreiebevegelser kan være nyttige ved innsetting av kateteret. På den annen side indikerer mangel på motstand vanligvis feilaktig innsetting i skjeden. - Utfør en langsom (5 μL/s) instillasjon på 50 μL bakteriell inokulum (2 x 107 CFU).
MERK: Høyere volumer eller raskere instillasjon kan føre til refluks på nyrene. Under øvelsen av teknikken kan blå blekk brukes til å evaluere refluks. - Etter innåndingen, hold sprøyten og kateteret på plass i noen sekunder til, og trekk deretter sakte tilbake for å forhindre lekkasje. Registrer eventuelle uregelmessigheter som en høy mengde lekkasje eller en blodig meatus og utelukke dyr, om nødvendig.
- Plasser dyret i liggende stilling ved nesekjeglen i bildekammeret og gjenta de foregående trinnene 2.1.1-2.1.6 for alle de resterende dyrene. Bruk ett kateter per eksperimentell gruppe. Forsikre deg om at anestesi fortsetter og minimere tiden mellom det første og det siste dyret.
- Administrer om nødvendig antibiotika eller eksperimentelle legemidler før eller etter avbildningen (trinn 3). For eksempel, for å administrere enrofloxacin, tilsett 40 μL av enrofloxacin (100 mg / ml) oppløsning til 3,96 ml fysiologisk saltvann for å oppnå en 1/100 fortynning. Injiser 100 μL/10 g subkutant kl. 09.00 og 17.00 for å administrere 10 mg/kg enrofloxacin to ganger daglig i 3 dager.
3. Bilde av bioluminescens
- Forberedelse og valg av avbildningsparametere
- Åpne BLI-anskaffelsesprogramvaren (se Materialfortegnelse) og klikk på Initialiser i bildeenheten (se Materialfortegnelse) for å teste kameraet og scenekontrollersystemet og for å avkjøle CCD-kameraet til -90 °C.
MERK: Under denne prosessen er døren låst, og fremdriften til initialiseringen kan følges på kontrollpanelet. Et grønt lys indikerer at temperaturen på -90 °C er nådd. Det vises en advarsel hvis bildebehandling forsøkes før initialiseringen fullføres. - Sørg for at data lagres automatisk: Klikk på anskaffelse Lagre automatisk i og velg riktig mappe.
- Velg Luminescence og Fotografi. Kontroller standardinnstillingene for lystetthet: Sett eksitasjonsfilteret til Blokk- og utslippsfilter til Åpne.
- Still inn eksponeringstiden til Auto når du tar det første bildet, spesielt når du forventer et dim-signal for å sikre et tilstrekkelig antall fotonantall. For in vivo-målinger og lyse signaler, sett eksponeringstiden til ~30 s. Hvis bildet er mettet, vises en advarsel. Hvis dette skjer, reduser eksponeringstiden.
- Velg middels binning, F/stopp 1 og velg riktig synsfelt (FOV) (D for 5 dyr).
- Sett motivhøyden til 1 cm ved avbildning av mus.
- Klikk på Legg til tre ganger i Acquisition Control Panel for å få en sekvens med tre bilder, som tekniske replikerer.
- Åpne BLI-anskaffelsesprogramvaren (se Materialfortegnelse) og klikk på Initialiser i bildeenheten (se Materialfortegnelse) for å teste kameraet og scenekontrollersystemet og for å avkjøle CCD-kameraet til -90 °C.
- Imaging
- Plasser mus i bildekammeret i liggende stilling og bruk manifold nesekjeglen for å opprettholde anestesi (isofluran 1,5%) gjennom hele eksperimentet. Bilde opptil 5 mus samtidig og skille dyrene ved hjelp av lyshvelvet for å forhindre refleksjon.
- Lukk døren og klikk på Hent for å starte bildesekvensen.
- Fyll ut detaljert informasjon om eksperimentet (vill type og knockout dyr, behandlinger, dag for avbildning, etc.). Bildeinnstillingene, for eksempel eksponeringstid, lagres automatisk.
- Fjern mus fra bildekammeret og returner dem til buret. Se etter full gjenoppretting etter anestesi. I løpet av få minutter bør dyrene være helt våken og utforskende. Ikke gi analgesi, da dette kan forstyrre UVI-kurset18.
- Returner burene til de ventilerte stativene til neste bildesyklus. Etter ferdigstillelse av eksperimentet, euthanize dyrene ved CO2 kvelning eller Cervical dislokasjon. Gjør dette før gjenvinning av isofluranbedøvelse for å minimere nød.
- Analyse av bildene
- Start bildebehandlingsprogramvaren og last inn den eksperimentelle filen ved å klikke Bla gjennom.
- Bruk verktøypaletten til å justere fargeskalaen for bildet. Standardiser det visuelle aspektet av resultatene ved å bruke de samme innstillingene for alle bildene, det vil si bruk en logaritmisk skala med minimum 104 til maksimalt 107 fotoner. Disse justeringene påvirker ikke rådataene, men bare den grafiske presentasjonen.
- Bruk roi-verktøyene til å tegne et område av interesse (ROI) på bildet. Forsikre deg om at avkastningen er stor nok til å dekke hele området og bruk de samme dimensjonene for alle bildene. Her ble en firkantet avkastning på 3,5 cm x 4,5 cm plassert over underlivet.
- Klikk på avkastningsmål for å kvantifisere lysintensiteten (antall eller total fotonfluks). Eksporter disse dataene og bruk gjennomsnittet av de tekniske replikeringene.
MERK: Tellinger representerer antall fotoner som oppdages av kameraet, og skal bare brukes til bildekvalitetskontroll. Hvis du vil rapportere data, bruker du total fotonfluks. Total fotonfluks er mer fysiologisk relevant da den representerer lyset som slippes ut fra overflaten, og det er en kalibrert enhet, som korrigeres for eksponeringstiden (per sekund).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo BLI korrelerer med CFU av inokulumet ved instillasjonstidspunktet.
For å evaluere deteksjonsgrensen for BLI in vivo og korrelasjonen med CFU i inokulumet, ble mus smittet med forskjellige konsentrasjoner av UTI89-lux og PBS som en negativ kontroll. Før instillasjon ble uinferte dyr skannet for å bestemme bakgrunnslystettheten. Etterfølgende bilder ble innhentet umiddelbart etter innånding (Figur 1A). Etter innånding av UTI89-lux var bioluminescens robust påviselig over 2 x 104 CFU og en lineær korrelasjon mellom inokulumets CFU og bioluminescensen ble etablert (Figur 1B). Til sammenligning var total fotonfluks sammenlignbar med bakgrunnssignaler for dyr innpodet med PBS og ved lavest bakteriekonsentrasjon på 2 x 103 CFU.
BLI som verktøy for langsgående oppfølging under behandling
For å avgjøre om den kurative effekten av en validert antibiotikabehandling kan påvises ved hjelp av langsgående BLI, ble 20 dyr smittet med et inokulum på 2 x 107 CFU/50 μL, og 10 av disse dyrene ble behandlet med enrofloxacin 10 mg/kg subkutant to ganger daglig i løpet av de første 3 dagene etter infeksjon. Både den naturlige utviklingen i den infiserte, men ubehandlede kontrollgruppen og effekten av antibiotikabehandling på infeksjonskinetikken i den behandlede gruppen kan visualiseres i detalj (Figur 2). En umiddelbar reduksjon i bakteriell belastning, målt ved total fotonfluks, ble sett etter den første dosen av enrofloxacin. Ingen av de behandlede dyrene hadde en påfølgende økning i bakteriebelastningen. Variasjonen mellom fagene i den infiserte, men ubehandlede kontrollgruppen var høyere og nedgangen i bakteriebelastningen var langsommere. På dag 10 hadde 8 av 10 dyr i kontrollgruppen returnert til et BLI-signal som kan sammenlignes med deres førinnåndingsbakgrunn. Den totale bakteriebelastningen for hvert dyr ble beregnet ved hjelp av området under kurven (AUC) av den log-transformerte totale fotonfluksen. Det ble observert en signifikant forskjell mellom dyr behandlet med enrofloxacin og ubehandlede dyr i løpet av 10 dager. Disse resultatene viser at BLI er et kraftig verktøy for å evaluere effekten av en potensiell behandling på sykdomsforløpet til en UVI.
Figur 1: In vivo BLI korrelerer med CFU i inokulumet ved innånding. (A) Representative bilder oppnådd med in vivo BLI av mus infisert med økende konsentrasjoner av inoculum (2 x 103-2 x 108 CFU) avbildet umiddelbart etter bakteriell instillasjon i blæren. CFU = Kolonidannende enheter. (B) Kvantifisering av bioluminescens som slippes ut over blæreområdet (total fotonfluks) sammenlignet med konsentrasjonen av inoculum (CFU). BLI-signalet ble robust påvist over 2 x 104 CFU (p = 0,0002 sammenlignet med bakgrunn og p = 0,015 sammenlignet med PBS-kontrollen, uparret t-test). Pearson korrelasjon for inoculi fra 2 x 103-2 x 108 CFU var r = 0,9995 (p < 0,0001). BG = bakgrunn, PBS = Fosfat bufret saltvann, CFU = Kolonidannende enheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: BLI som verktøy for langsgående oppfølging under behandlingen. (A) Individuelle spor av den totale fotonfluksen for dyr som er smittet med 2 x 107 CFU av UTI89-lux og behandlet med enrofloxacin 10 mg/kg to ganger daglig i 3 dager (blå) versus en ubehandlet kontrollgruppe (svart), n = 10 per gruppe. BG = bakgrunn. (B) Analyse av spor fra dyr vist i panel A, rapportering av AUC av log-transformert total foton flux for både enrofloxacin (blå) og kontrollgruppe (svart). N = 10 per gruppe, gjennomsnitt ± SD, uparret t-testp < 0,0001. AUC = Areal under kurven. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordeler med BLI sammenlignet med CFU teller
Langsgående data
En stor ulempe ved den tradisjonelle metoden for å telle CFU for å kvantifisere mikrobiell byrde er kravet om organhomogenater etter mortem, og gir bare ett tverrsnittsdatapunkt per dyr. På den annen side muliggjør BLI ikke-invasiv langsgående oppfølging av infiserte dyr. Dyrene kan avbildes 2 til 3 ganger om dagen, og gir detaljert innsikt i infeksjonens kinetikk. I tillegg reduserer gjentatte tiltak av samme dyr drastisk antall dyr som trengs for tilstrekkelig drevne eksperimenter. Videre kan forskere fokusere på den inter-individuelle variasjonen og før de undersøker eller behandler dyr med et nytt middel, kan de velge dyr med forhåndsspesifisert bakteriebelastning ved å bruke sanntidsdata. På den annen side, ved hjelp av AUC for et eksperiment, kan forskere fokusere på den generelle bakteriebelastningen og ikke på en enkelt tverrsnittsverdi. Merverdien av langsgående data og sanntidsdata i UTI-innstillingen kan ikke overvurderes.
Identifisering av formidling av infeksjonen
Den romlige oppløsningen til bildene oppnådd med BLI er tilstrekkelig til å identifisere andre steder som koloniseres av lux- eller FLuc-taggedepatogener19. For UVI er stigende infeksjoner til nyrene eller spredning til blodet svært relevante funn. I denne eksperimentelle settingen ble det ikke observert spredning av infeksjoner forårsaket av UVI89-lux utover nedre urinveier. Dette var forventet med tanke på at denne stammen hovedsakelig forårsaker blærebetennelse.
Datareroduserbarhet og sammenligning
Reproduserbarheten av eksperimenter er høyere ved bruk av BLI sammenlignet med CFU-tellinger. Klassisk er triplikater av serielle 10 ganger fortynning av homogenater belagt, og bare de platene med 30 til 300 CFU telles deretter for å beregne det totale antall CFU. Denne metoden er tungvint, utsatt for høy variasjon, resulterer i mange ubrukelige plater, og er ekstremt utsatt for menneskelige feil. Videre er det ingen konsensus om hvordan man rapporterer CFU, nemlig per gram blærevev, per blære eller per 1 ml homogenat. Dette gjør sammenligningen av resultatene fra ulike grupper ekstremt vanskelig og kan forbedres ved bruk av BLI og total fotonfluks.
Vurderinger og begrensninger ved metoden
Foruten de klassiske hensynene knyttet til BLI in vivo som absorpsjon av fotoner ved pels eller hemoglobin, er det noen hensyn som må tas når man korrelerer BLI og CFU teller på offertidspunktet.
For det første oppstår avvik mellom begge metodene på offertidspunktet20, spesielt når antibiotikabehandlinger brukes. Derfor kan sammenhengen mellom BLI og CFU på offertidspunktet være suboptimal og er ikke nødvendigvis relevant. For BLI kan den totale fotonfluksen være lavere enn forventet, fordi utfordrede bakterier kan omdirigere stoffskiftet mot utvinnings- og reparasjonsprosesser, i stedet for lysutslipp. I tillegg fanger BLI-målingen et øyeblikksbilde av bakteriene og stoffskiftet i sanntid in vivo, noe som resulterer i lavere BLI-signaler hvis bakterier er i sovende eller langstrakt tilstand på tidspunktet for avbildning. På den annen side, for CFU-besluttsomhet, reagerer stoffutfordrerte bakterier på en alt-eller-ingenting-måte etter å ha blitt fjernet fra deres smittsomme habitat (dvs. en biofilm) og belagt. Når de er belagt på agar, kan de utfordrede bakteriene bli uopprettelig skadet og ute av stand til å utvikle seg til observerbare kolonier, noe som resulterer i lavere CFU teller21. I tillegg kan utfordrede bakterier gå inn i en levedyktig, men ikke dyrkbar tilstand (VBNC). De forblir metabolsk aktive og levedyktige, men er ikke lenger dyrkbare på standard laboratoriemedier. Bakterier som kommer inn i VBNC-tilstanden eller som er organisert i biofilmer, kan enkelt oppdages med BLI, mens opplisting av CFU krever ytterligere behandling21,22,23. Til slutt måler bioluminescens og levedyktige tellinger forskjellige aspekter av cellefysiologi, og ingen av dem bør betraktes som den definitive indikatoren for celle levedyktighet21.
Videre er definisjonen av bakteriebelastning målt ved BLI- eller CFU-telling forskjellig på grunn av forskjeller i prøvebehandling. Ved bruk av CFU teller bare bakterier som ligger i blæreveggen, inkluderes i homogenatet og telles. Til sammenligning fanger BLI også fotoner som slippes ut av bakterier i urinen og urinrøret. Etter vår mening er sistnevnte en fysiologisk mer korrekt representasjon av den totale bakteriebelastningen, da den inkluderer alle anatomisk relevante rom (blære, urin og urinrør).
I motsetning til CFU-tellinger krever BLI generering av genetisk endrede luminescerende bakterier. Avhengig av innsettingsstedet er det sannsynlig at innføringen av lux operon i genomet kan endre virulenspotensialet til bakteriestammen. Derfor, når du utvikler en ny bioluminescent stamme, bør dens virulens og vekstegenskaper sammenlignes med foreldrestammen10,13. Imidlertid tillater nylige fremskritt innen genomredigering effektiv og skremmende merking av alle store bakterielle patogener, og begrenser dermed virkningen på virulens eller behandlingsresponser. Videre åpner genteknologi muligheter mot betinget uttrykk for bioluminescensreportergener og derfor in vivo-måling av relevante bakterielle subpopulasjoner, genuttrykk, etc24,25.
Endelig kan tilgang til den avanserte bildeenheten og anskaffelsesprogramvaren for in vivo BLI være en begrensende faktor sammenlignet med det grunnleggende utstyret som kreves for CFU-opplisting. Samarbeid med bildekjerner kan imidlertid minimere utgiftene og investeringene som er nødvendige for BLI.
Hensyn som er spesifikke for implementeringen av BLI i en in vivo UTI-modell
Dyremodell
Fordelene med en murine UTI-modell er tredelt: Det tillater overvåking av sykdomsprogresjon i et pattedyr urinveier, dyrene og vedlikeholdet er relativt billige, og mutantlinjer er tilgjengelige. På den annen side innebærer induksjon av infeksjonen vanligvis transuretral kateterisering og etterfølgende instillasjon av en høy dose bakterier direkte inn i blærelumen, og dermed omgå den naturlige prosessen med oppstigning via urinrøret5.
Dyrehus
Dyr kan grupperes under eksperimentet. Vi har undersøkt forekomsten av overføring mellom dyr i samme bur, ved å introdusere sentinel dyr i bur med smittede dyr. Ingen av sentineldyrene hadde en påviselig bakteriebelastning, målt med både CFU og BLI.
Blærevolum
Når man kombinerer den murine UVI-modellen med BLI, bør forskerne huske på de unike anatomiske egenskapene til blæren. Blæren er et hult organ som inneholder et varierende volum urin. Under UVI kan tilstedeværelsen av bakterieinfisert urin teoretisk påvirke det totale fotonantallet avhengig av graden av blærefylling. Standardisering av blærevolumet er imidlertid upraktisk og kan gripe inn i eksperimentell design. Videre, etter vår erfaring, resulterer forskjeller i blærevolum ikke i statistisk signifikante forskjeller i total fotonfluks.
Prøvetemperatur
Introduksjon BLI (eller som et enklere og billigere alternativ, måling av bioluminescens i et luminometer) kan også brukes til å bestemmebakteriell belastning på homogenater, urin eller bakterielle suspensjoner som inneholder UTI89-lux . Imidlertid er temperaturen på prøven viktig da utslipp av fotoner skyldes en enzymatisk reaksjon og krever dermed metabolsk aktivitet og tilstedeværelse av oksygen. Drastiske temperaturendringer under organhøsting bør unngås ved å la prøven kalibrere på det oppvarmede (37 °C) stadiet 5 min før avbildning.
Potensielle applikasjoner og viktighet
Oppsummert begrenset den tungvinte metoden for opplisting av CFU reproduserbarheten og effekten av forskning på UVI-feltet. Det eksperimentelle oppsettet med BLI vil fremme in vivo UVI-forskning på blærefysiologi, UVI-patogenese og følsomhet ved å muliggjøre langsgående oppfølging, samtidig som antall dyr som trengs for denne typen studier reduseres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Forskningsstiftelsen - Flandern (FWO Vlaanderen; G0A6113N), Forskningsrådet for KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. og W.E.) og VIB (til T.V.). W.E. er senior klinisk forsker ved Forskningsstiftelsen - Flandern (FWO Vlaanderen). Belastningen UTI89-lux var en sjenerøs gave fra Prof. Seeds laboratorium13.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
References
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).
- O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections. Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).
- Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
- Carey, A. J., et al. Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations. Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).
- Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H.
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Avci, P., et al. In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging. Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).
- Balsara, Z. R., et al. Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder. Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).
- Huang, Y. Y., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model. Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).
- Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
- Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A murine model for E. coli urinary tract infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).
- Zhang, Y., et al. Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis. Infectious Microbes & Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).
- Vanherp, L., et al. Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).
- Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).
- Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).
- Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).
- Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).
