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JoVE Journal Genetics
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Genetics

使用済み培地を用いたヒト着床前胚の染色体スクリーニング:サンプル採取と染色体倍数性解析

Published: September 7, 2021 doi: 10.3791/62619
Automatic Translation
*1,2,3,4, *5, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 5, 5, 1,2,3,4, 5
1Centre for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, 2National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology(Peking University Third Hospital), 3Ministry of Education, Key Laboratory of Assisted Reproduction (Peking University), 4Beijing Key Laboratory of Reproductive Endocrinology and Assisted Reproductive Technology, 5Department of Clinical Research, Yikon Genomics Co. Ltd.
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

本研究は、使用済み培地を使用したヒト胚の染色体スクリーニングのプロトコルを報告し、胚生検を回避し、NGSを使用して染色体倍数性を同定できるようにします。本稿では、培地の調製、全ゲノム増幅(WGA)、次世代シーケンシング(NGS)ライブラリの調製、データ解析など、詳細な手順を紹介します。

Abstract

臨床体外受精(IVF)では、PGT-Aの一般的な方法では、栄養外胚葉(TE)からのいくつかの細胞の生検が必要です。これが胎盤を形成する系統です。しかし、この方法は専門的な技術が必要で、侵襲的であり、TEの染色体数と胎児に成長する内部細胞塊(ICM)が常に同じであるとは限らないため、偽陽性と偽陰性に悩まされます。NICS は、TE と ICM の両方から培地に放出された DNA のシーケンシングを必要とする技術であり、これらの問題に対する解決策を提供する可能性がありますが、有効性は限定的であることが以前に示されていました。本研究では、培地サンプリング法、全ゲノム増幅(WGA)およびライブラリ調製、および解析ソフトウェアによるNGSデータ解析を含むNICSの完全なプロトコルを報告します。胚検査室によって凍結保存時間が異なることを考慮し、胚培養士は、体外受精検査室の実際の状況に応じて選択できる胚培養培地を採取するための2つの方法を持っています。

Introduction

生殖補助医療(ART)は、不妊症の治療にますます使用されています。しかし、体外受精などのARTの成功率は限られており、流産率は正常集団よりも有意に高くなっています1。これらの問題の主な原因は染色体異常であり、着床前のヒト胚に一般的に存在します2。PGT-Aは、着床前に胚の染色体バランスをスクリーニングする効果的な方法です3,4。いくつかの研究は、PGT-Aが中絶率を減らし、妊娠率を改善できることを証明しています5,6,7,8。ただし、PGT-Aには、特定のトレーニングと経験を必要とする複雑な技術的専門知識が必要です。侵襲的な胚生検手順も、胚に損傷を与える可能性があります9。研究によると、割球生検はその後の発生を妨げる可能性があり、生検されたTEの数は着床率に影響を与える可能性があります10。胚生検の長期的なバイオセーフティの問題は、ヒトではまだ完全に評価されていませんが、動物実験では、胚の発生に悪影響を与えることが示されています11,12,13。

これまでの報告では、胚発生時に培地に微量のDNA物質が分泌されることが報告されており、使用済み胚培養液14,15,16,17,18を用いて包括的染色体スクリーニング(CCS)を行う取り組みが行われています。しかし、検出率と検査の精度は、広範な臨床使用の要件を満たしていません。本研究は、NICS検査の検出率と精度を向上させるためのNICSアッセイの改善を報告した19。近年、低侵襲PGT-Aの分析サンプルとして割球体液(BF)が研究されています。しかし、胚盤胞液サンプル中のゲノムワイド増幅と検出可能なDNAの割合は、34.8%から82%の範囲です20,21,22。さまざまな研究で報告されているBFの量は、0.3 nLから1 μLの範囲です。BF中のDNA量が少ないため、胚盤胞液と培地を混合することで無細胞DNAの量を増やすことができ、検出の成功率と一貫性を向上させることができます。クズニェツォフ他図23およびLiら24は、透明帯をレーザーで処理し、胚盤胞液を培地に放出して胚性DNAの総量を改善し、WGA後の培地/BFサンプルを組み合わせた増幅率は、それぞれ100%および97.5%であった。Jiao et al.25 も、同じ方法を用いて 100% の増幅成功率を得ました。

本研究では、使用済み培地サンプルの調製、NGSの調製、およびデータ分析を含む詳細なプロトコルを報告します。本研究では、卵母細胞を卵母細胞から慎重に除去し、細胞質内単精子注入(ICSI)と胚盤胞培養を行いました。4日目から5日目/6日目に使用した培地をWGAおよびNGSライブラリ調製のために回収した。NICS技術を用いることで、WGAおよびNGSライブラリ調製ステップを約3時間で合理化し、約9時間で非侵襲的にCCS結果を得た。

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Protocol

北京大学第三病院の倫理委員会から倫理的許可を取得しました。

1. 事前準備

注意: 必要な材料と機器は 、材料表にリストされています。

  1. 試薬
    1. 20-30μLの配偶子培地/受精培地、切断/胚盤胞段階の培養培地(鉱物油で覆われている)とヒアルロニダーゼ(しっかりとキャップされたチューブ内)を37°C、5%CO2および5%O2で、使用前にトライガスインキュベーターで一晩予温し、平衡化(バランス)する。
    2. ヒアルロニダーゼをドラフト内の作業面で37°Cに予熱する。
    3. ガラス化緩衝液とサンプル採取試薬は、メーカーの指示に従って調製してください。
  2. ツール
    1. サンプル採取・移送用ピペット(内径~200〜250μm)、脱皮/ストリッパーピペット(内径≥150μm、~130-140μm、~120μm)、洗浄用ピペット(内径~150μm)をガラス製パスツールピペットを引っ張って準備し、ファイヤーポリッシュ仕上げのオープンファインチップを生成します。
      注:サンプルの採取/移送、脱皮、洗浄に使用するピペットは、直接購入できます。保持針と注射針は直接購入することもできます。

2.プロトコル1:サンプル収集

  1. ヒアルロニダーゼによる消化前の卵母細胞-コロナ-卵丘複合体(OCCC)の前処理
    1. 卵胞刺激ホルモン(FSH)とヒト更年期ゴナドトロピン(hMG)製剤の両方で卵巣刺激を達成します。鉛卵胞が>18 mmの場合、最終的な卵母細胞の成熟に10,000 IUの絨毛性ゴナドトロピン(hCG)を使用します。
    2. トリガーショットの36時間後に卵母細胞回収を行います。卵母細胞を拾い上げ、鉱物油で覆われた2.5 mLの予熱されたm-HTFで組織培養皿に移します。
    3. トランスファーピペットを使用してOCCCを1mLの受精培地を含む臓器培養皿の中央ウェルに迅速に移し、5%CO2および5%O2インキュベーターで37°Cで卵母細胞と2〜4時間インキュベートします。
  2. OCCCを含む臓器培養皿の中央ウェルに、37°Cで予熱したヒアルロニダーゼ(80 IU/mL)1 mLを添加して、ヒアルロニダーゼでOCCCを消化する(ステップ2.1.3)。ヒアルロニダーゼの最終濃度を40 IU/mLに保ち、十分に混合する。
    1. OCCCを37°Cのサーマルプラットホームで2分間インキュベートします。顆粒膜細胞の1〜2層のみが残るまで、30秒ごとに顕微鏡で変化を観察します。
  3. 顆粒膜細胞の脱皮
    1. 消化したOCCCを培養皿に迅速に移し、卵母細胞を取り扱うために、各ウェルで鉱油で覆います。
    2. 分離した顆粒膜細胞を顕微鏡で観察します。卵母細胞を5回静かに吸引して放出し、卵母細胞の周囲に残っている顆粒膜細胞を除去します。
    3. 残りの3つのウェルで前のステップを繰り返して、顆粒膜細胞を完全に除去します。
      注:上記の手順(2.1〜2.3)は、各ラボの日常的な操作に従って実行できます。
  4. 卵母細胞の評価
    1. 顕微鏡を使用して顆粒膜細胞除去の完全性を評価します。細胞を完全に除去できなかった場合は、現時点では5個以下の顆粒膜細胞の保持が許容されます。
      注:卵丘細胞がまだ卵母細胞に付着している場合は、胚が切断段階の培養液から胚盤胞段階の培養液に移される前に、3日目の後半に残骸を取り除くことができます。
  5. 細胞質内精子注入(ICSI)26を行った後、トランスファーピペットを用いて卵母細胞を20〜30μLの切断胚培養培地の微小液滴(1つの卵母細胞は1つの微小液滴に相当)に移し、37°C、5%CO2および5%O2インキュベーターでインキュベートする。
    1. ICSIの日を0日目として記録します。受精の1日目(約18時間)、2日目(約45時間)、および胚の卵割の3日目(約68時間)の胚評価に関するイスタンブールコンセンサスワークショップに従って、胚を確認し、スコアを確認します27。
  6. 胚洗浄
    1. 2日目に37°C、5%CO2および5%O2インキュベーターで、組織培養皿に鉱油で覆われた各胚に対して20〜30μLの胚盤胞培養培地の微小液滴を調製する。
    2. さらに3つの微小液滴を鉱物油で覆い、洗浄用新しい組織培養皿にラベルを付けます。
    3. 3日目の胚を洗浄用微小液滴に移します。脱皮ピペットを使用して、各液滴に胚を3回静かに吸引し、放出します。
      注:この手順は、胚に付着した残留顆粒細胞を除去するのにも役立ちます。
    4. 3日目に顕微鏡で胚を観察し、評価し、形態学的スコアリングのために培地を切断段階の培養培地から胚盤胞培養培地に変更した。卵丘細胞がまだ胚に付着している場合は、卵丘細胞が完全に除去されるまで、鉱油で覆われた別の予熱および平衡化された胚盤胞培養液滴でストリッパーピペットで適切に上下にピペットします。
      注:胚を切断段階の培養培地プレートから胚盤胞段階の培養培地プレートに移す前に、付着したすべての卵丘細胞を3日目に完全に除去する必要がありました。残っている積雲セルは、最終分析に干渉し、偽陰性の結果を生じます。
  7. 培地回収の2つの選択肢
    注:体外受精センターは、センターのリソース、需要、および好みに基づいて、培地収集の2つの方法のいずれかを選択できます。
    1. オプション1:胚の洗浄と培養
      注:このオプションは、5日目の朝にガラス化を行うIVFラボ用です。
      1. 胚を予熱した(37°C)培養液の微小液滴に移し、4日目の午後にピペッティングにより、各胚を3つの微小液滴で連続して静かに洗浄します。
      2. 各胚を、事前に温めた(37°C)単一の微小液滴の培地に移し、サンプルを採取します。培地の1液滴の容量は25μLを超えることはできません。
      3. 胚盤胞胚培養を5日目/6日目に37°C、5%CO2、および5%O2で実施する。
    2. オプション2:胚の洗浄と培養
      注:このオプションは、5日目の午後または6日目にガラス化を行う体外受精ラボ用です。
      1. 胚を10〜15μLの培養培地の予熱(37°C)マイクロドロップレットに移し、5日目にピペッティングにより、各胚を3つのマイクロドロップレットで連続的に静かに洗浄します。
      2. 各胚を、事前に温めた(37°C)単一の微小液滴の培地に移し、サンプルを採取します。培地の1液滴の容量は15μLを超えることはできません。
      3. 胚盤胞胚培養を5日目/6日目に37°C、5%CO2で実施する。
  8. サンプルコレクション
    1. 栄養外胚葉の細胞接合部に焦点を合わせて栄養外胚葉に小さな穴を開けて胚盤胞腔から液体を放出するレーザービームのターゲットポイントからかなりの距離でICMを静かに調整します。次に、胚を凍結液に移し、従来のプロセスに従って凍結保存します。
    2. 培養した各胚から、5 μLの細胞溶解バッファーを含むRNase/DNaseフリーPCRチューブに培養液を移します。
    3. ネガティブコントロールとして胚培養に使用せずに、同量の培地を採取します。採取したサンプルは直ちに液体窒素で凍結し、採取後は-80°CでNICSアッセイにかけるまで保存してください。
  9. プロトコルに記載されているようにガラス化を行います。

3. 議定書2:図書館建設

  1. 培地溶解
    1. 1 μL のポジティブコントロール(10 ng ヒト gDNA)を 199 μL の新鮮培地で希釈します。完全に混合し、チューブを短時間遠心分離します(200 x g で5秒間)。
    2. 5日目から6日目の胚盤胞培養培地10 μL、希釈したポジティブコントロール、および新鮮な培養培地を新しい0.2 mLのPCRチューブに移します。
    3. 各PCRチューブに1 μLのMT酵素ミックスを加え、ピペッティングで完全に混合し、すぐに200 x gで2〜3秒間遠心分離します。
    4. ステップ 3.1.3 の PCR チューブを予熱した NICS サンプル調製ステーションに入れ、次のように溶解プログラムを実行します。 75°Cで10分間。95°Cで4分。22°Cで保持します。
      注:サンプル調製ステーションは、標準的なPCRマシンに匹敵します。
      1. Lysisアイコンをクリックして、セットアップ画面に入ります。
      2. 制御モードに チューブ を選択します。サンプル量は10 μLです。ホットリッド制御(Hotlid control)に オン(On )を選択し、温度(temperature)に 105 °C と入力します。最初のセグメントで一時停止するために [いいえ ] を選択します。「 OK 」をクリックして次に進みます。
      3. [残り時間] にプログラムの終了を示す --:--:-- が表示されるまで待ってから、[停止] をクリックしてプログラムを終了します。
    5. プロセスが完了したら、プログラムを停止します。すぐに次の手順に進みます。
  2. ライブラリ前準備
    1. Pre-Lib Buffer を RT に解凍します。 ピペッティングで十分に混合し、すぐに 200 x g で 2-3 秒間遠心分離します。
    2. 2 μL の Pre-Lib Enzyme Mix を 60 μL の Pre-Lib バッファーに加え、反応液を完全に混合し、短時間遠心分離します。
    3. 前のステップで前処理した各培地サンプルに60 μLのプリライブラリ反応ミックスを加えます。ピペッティングで完全に混合し、すぐに200 x gで2〜3秒間遠心分離します。
    4. ステップ 3.2.3 の PCR チューブをサンプル調製ステーションにセットし、次のようにプレライブラリプログラムを実行します。 95°Cで2分間。15°Cで40秒、22°Cで40秒、33°Cで30秒、65°Cで30秒、72°Cで40秒、95°Cで10秒、63°Cで10秒の12サイクル。4°Cで保持します。
      1. Pre_Libアイコンをクリックして、セットアップ画面に入ります。
      2. 制御モードに チューブ を選択します。サンプル量の場合は70 μLを入力します。ホットリッドコントロールで オン を選択し、温度に105°Cと入力します。最初のセグメントで一時停止するために [いいえ ] を選択します。「 OK 」をクリックして次に進みます。
      3. [残り時間] にプログラムの終了を示す --:--:--- が表示されるまで待ち、[停止] をクリックしてプログラムを終了します。
    5. プロセスが完了したら、プログラムを停止します。すぐに次の手順に進みます。
  3. ライブラリの準備
    1. ライブラリバッファーをRTに融解し、ピペッティングで完全に混合し、すぐに200 x gで2〜3秒間遠心分離します。
    2. ライブラリー反応用のマスターミックスを調製するには、1.6 μLのLibrary Enzyme Mixを60 μLのライブラリーバッファーに加え、反応液を十分に混合し、短時間遠心分離します。
    3. ステップ 3.2.3 の各プレライブラリ製品に、60 μL のライブラリ反応ミックスと 2 μL のバーコードプライマーを加えます。反応液を十分に混合し、短時間遠心分離します。
    4. 手順3.2.3のPCRチューブをサーマルサイクラーに入れ、ライブラリ調製プログラムを次のように実行します:94°Cで30秒。94°Cで25秒、62°Cで30秒、72°Cで45秒の17サイクル。その後、4°Cで保持します。
      1. Lib_Prepアイコンをクリックして、セットアップ画面に入ります。
      2. 制御モードに チューブ を選択します。サンプル量は130μL。Hotlid control(ホットリッド制御)で On を選択し、対応する温度に105°Cと入力します。最初のセグメントで一時停止するために [いいえ ] を選択します。「 OK 」をクリックして次に進みます。
      3. [残り時間] にプログラムの終了を示す --:--:--- が表示されるまで待ち、[停止] をクリックしてプログラムを終了します。
  4. ライブラリの精製
    1. 浄化のステップの前に少なくとも20分の2-8 °Cで貯蔵からMagbeadsを取除いて下さい。マグビーズを20秒間ボルテックスして混ぜます。精製ステップに必要な量のビーズを新しい 1.5 mL 微量遠心チューブに分注し、温めて RT に注入します。
    2. 各ライブラリーにマグビーズを1つ追加します。ピペッティングで≥10回混合し、室温で5分間インキュベートします。
      注:例えば、100 μLのライブラリサンプルに100 μLのMagbeadsを加えます。
    3. インキュベーション後、チューブを短時間遠心分離し、磁気スタンドに置きます。
    4. 溶液が明らかになるまで約5分間待ちます。チューブを磁気スタンドに置いたまま、溶液を慎重に吸引して廃棄します。
    5. 調製したばかりの80%エタノール200μLをチューブに加えます。室温で30秒間インキュベートし、上清を慎重に除去します。もう一度繰り返します。
    6. エタノールをできるだけ完全に取り除きます。磁気スタンド上のビーズをRTで約5〜10分間風乾します。
    7. チューブを磁気スタンドから取り外し、17.5 μLの溶出バッファーを添加し、チューブをボルテックスしてビーズを再懸濁します。チューブを短時間遠心分離し、室温で5分間インキュベートします。
    8. チューブを磁気スタンドに置き、溶液が透明になるまで待ちます。上清15μLを新しいチューブに慎重に移します。
  5. ライブラリの定量
    1. 量子ビットdsDNA HSアッセイキット28のユーザーガイドに従って、蛍光光度計を使用して精製されたライブラリを定量します。ライブラリの収量は~15〜300ngの範囲です。
  6. ライブラリー・プーリング
    1. 各ライブラリーサンプルを10ナノグラムでプーリングに用います。
  7. シークエンシング
    1. シーケンシングユーザーガイド(15027617 v01)29を参照してください。
    2. プラットホーム上で片末端に 50 bp の精製ライブラリ配列を添加すると、各サンプルで約 200 万回のリードが得られ、シーケンシング深度は 0.03 × が推奨されました。
  8. データ解析
    1. ログインページにユーザーの名前とパスワードを入力します
    2. システムにログインした後、[ 分析 ]をクリックすると、新しいページが表示されます。[NICS-A] タブの [ 提出書類の作成 ] をクリックします。次に、プラットフォームに NGS 、corporation、試薬に NICSInstを選択し、Project IDの下のボックスにプロジェクト情報を入力し、分析設定を行い、ファイルをアップロードします。すべてのシーケンシングファイルが正常にアップロードされたら、[ Submit ]をクリックして解析を開始します(図3A)。
    3. [ 提出物の表示 ] をクリックして、提出済みプロジェクトの一覧を表示します。分析が完了すると、プロジェクトのステータスが「完了」になり、レポートフィールドに「表示」ボタンが表示されます。 [Show ](表示)ボタンをクリックすると、NICS分析の概要表が表示されます(図3B)。
    4. [ レポートのエクスポート ] ボタンをクリックして、レポートを保存します(図 3C)。
      注: 解析ごとに 3 種類のファイルがエクスポートされます。各染色体と全ゲノムのすべてのコピー数多型(CNV)プロットを含むグラフィックファイルで、「グラフ」フォルダーに保存されます。この分析実行のサンプルQCの詳細を含むスプレッドシート。ユーザーがカスタマイズした NICS レポートを含むドキュメントファイル。この分析実行のサンプル・サマリー情報を含むスプレッドシート。

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Representative Results

本研究では、提案手法を患者に適用した。NICS分析の適用前にIRBの承認とインフォームドコンセントが得られました。本研究では、患者から6つの胚盤胞を取得し、培地4日目から5日目に6つの胚すべてにNICSを実施しました。両親の平衡転座によって引き起こされる染色体異常は、NICSアッセイで5つの染色体で検出されました。そのため、転写には使用できませんでした(図4A-E)。2つの胚のNICSの結果は、同じ核型45を示し、XNと-18(×1)はどちらも18番染色体欠失でした(図4A、B)。核型46、XN、-1p(pter→p21.1、×1)は、染色体1 pter→p21.1領域欠失の短腕にすぎません(図4D)。

NICSの結果は、核型46、XN、+1p(pter→p21.2、×3)、および-18(q21.32→qter、×1)を示し、染色体18 q21.32→qter領域の欠失の長腕と染色体1 pter→p21.2領域の短腕の両方が重複していることを示しました(図4E)。核型46、XN、+5q(×4)、および-8(×1、mos)は5番染色体重複であり、8つのモザイクの違いを示しますが、NICSアッセイは24染色体すべての異数性をスクリーニングできます。このプロセスは、単一の正常な核型胚盤胞を移植するための新しい方法を提供します。

Figure 1
図 1.卵丘細胞の除去の完全性。 (A)卵丘細胞を持つ卵母細胞。(B)卵丘細胞が付着していない卵母細胞。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2.積雲細胞は、BMに移される前にD3で胚から取り除かれます。 胚が8細胞期に達した後、3日目に、最初の卵割胚培養培地プレートから胚盤胞培養培地プレートに培地を交換する前に、付着したすべての卵丘細胞を除去する必要があります。除去されていない積雲細胞は、最終分析に干渉し、偽陰性の結果をもたらします。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3.データ分析。 (A) ユーザーアプリケーションにはさまざまなオプションがあります。シーケンシングプラットフォーム企業の場合、ユーザーはIllumina、Ion Torrent、またはMGIを選択できます。ユーザーは、性別情報を報告するかどうかを選択できます。上記のパラメータ設定が完了したら、[ファイルのアップロード]の下のボックスをクリックし、アップロードする適切なシーケンスファイルを選択します。イルミナの場合は、拡張子がfastq.gzのファイルを選択します。[ 送信(Submit)] をクリックして、アップロードが正常に完了した後、分析を開始します。(B) 集計表のビュー。概要表は、次の情報で構成されています。 サンプル名: 各 NICS サンプルの名前が一覧表示されます。データ QC: シーケンシングファイルが NICS 解析の QC に合格しているかどうかを示します。AI 評価: 各 NICS サンプルの評価 (A、B、または C)。AI_Rating解釈:胚着床の可能性の評価。AI グレーディング: 各 NICS サンプルのスコア。CNVプロット(全ゲノム):すべての染色体のCNVプロファイルを表示します。(c) [レポートの保存] ページ。[結果の概要] の横にある [ レポートのエクスポート] ボタンをクリックします。最終レポートに表示する情報を選択し、「 エクスポート」をクリックします。レポートは、コンピューターの ダウンロードフォルダーに保存されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4.NICSを用いた患者からの胚スクリーニングと選別。 合計6個の胚が胚盤胞期まで正常に発達し、各胚からDay4-Day5の培地を採取してNICSアッセイを行いました。(A)及び(B)は、同じ核型45、XN、-18(×1)がいずれも18番染色体欠失を示した2つの胚盤胞胚のNICS結果である。(C)は核型46、XN、+5q(×4)、-8(×1、mos)が5番染色体重複と8モザイクであることを示した。(D)は核型46、XN、-1p(pter→p21.1、×1)は染色体1 pter→p21.1領域の欠失の短腕のみを示し、(E)は核型46、XN、+1p(pter→p21.2、×3)、-18(q21.32→qter、×1)は染色体1の短腕であるpter→p21.2領域重複を示し、染色体18 q21.32の長腕→qter領域(F)はバランスの取れた染色体組成を示しました。x軸は赤と青で22個の常染色体を意味し、y軸は各常染色体のコピー数を示す。灰色の点は、コピー数応答の各ビンウィンドウの定規スケールであり、コピー数の通常の核型は2でなければなりません。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

表 S1.DNA検出オプション1およびオプション2の成功率。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表 S2.さまざまなオプションでの NICS と PGT-A の一致。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

変更とトラブルシューティング

NICSの結果が親の遺伝物質で汚染されている場合は、すべての積丘-コロナラジアータ細胞が除去されていることを確認し、受精のためにICSIが行われていることを確認してください。DNAを分解する可能性のある不適切な培地保管やテンプレート調製プロセスを回避します。作業空間はDNaseおよびRNase除染試薬で徹底的に浄化されました。他の胚からのコンタミネーションを避けるため、1つの胚を常に1滴の培地で培養し、4日目からクロスコンタミネーションを回避した。汚染の現象は、最終培養液30、31、32、33への胚の配置を遅らせると最小限に抑えられる。母体の汚染を最小限に抑えるために、Kuznyetsov34は、ピペッティングとフラッシングによる残留コロナ細胞の慎重な除去を含む、胚培養手順を0日目から4日目に変更しました。

Lane et al.30 は、胚培養培地を4日目から5日目に採取すると、正倍数性検出の精度が向上し、胚倍数性の一貫性が95%以上であり、性染色体の一貫性が100%に達することを示している。Lledo et al.33 は、胚を4日目から6日目に培養した場合、3日目から5日目の培地とTEサンプルの間の一致率は74.6%および92.0%であることを発見しました。

当社の内部データも、 表S1に示すように、この結論を裏付けています。従来の3日目〜5日目の培養法と比較して、4日目または5日目に培地をもう1回交換したため、顆粒膜細胞がさらに除去されました。2 つの分析法(オプション 1 とオプション 2)は PGT-A と比較して一貫性が良好であり、CC を完全に除去しないサンプリング法よりも優れていることを示す内部データ(表 S1)を提供します。

ネガティブコントロールではIF増幅産物が現れ、外部のDNA物質が試薬または作業空間を汚染した可能性があります。ワークスペースはDNA/RNA除去試薬で洗浄し、ヌクレアーゼフリーの材料を使用し、試薬は最初の使用後に分注する必要があります。

オプション 1 とオプション 2 の成功率の違いについては、表 S1 と表 S2 で説明します。

NICSアッセイの限界

NICS には、主に 2 つの制限があります。1)顕微授精の前に、すべての卵丘細胞(通常は母体由来、通常は正常な染色体組成)を除去する必要があります。除去が不完全な場合、卵丘細胞は胚発生中にDNAを放出し、外部DNAが増幅され、偽陰性検出の原因となる可能性があります。2)透明帯に付着した精子の除去は困難であり、NICS手術は顕微授精で行うことを強く推奨する。3日目に切断培地を定期的に交換することで、卵丘細胞や冗長精子による汚染の可能性を減らすことができますが、NICSを臨床体外受精で使用する場合は、この汚染を最小限に抑える必要があります。しかし、体外受精胚のNICSを検出する方法が開発されており、外因性DNAを認識する機能も開発されており、近い将来実証される予定です。

この研究では、大規模な臨床試験で培地を比較しているため、異なる培地の違いを比較しませんでした。8つの施設では、4つの異なる培地(逐次的および連続的)と2つの異なる割合のアルブミン補給(5%および10%)を使用し、これらの違いは胚性cfDNA結果の精度に有意な影響を及ぼさなかった31。これらの知見は、特定のプロトコルの下で作業する場合、すべての体外受精ラボに胚性cfDNA分析を適用できる可能性を裏付けています。

既存の手法に対する意義

NICS法は胚生検を回避し、使用の安全性を大幅に向上させます。胚盤胞と比較して、NICSは、異数性の可能性が高い生殖補助医療集団に適した、シンプルで時間を節約し、感度と再現性のある着床前スクリーニング技術です。胚盤胞生検手順にかなりの専門知識を必要とする侵襲的生検とは異なり、NICSは、使用済み培地の単純な収集がIVF19 の通常の操作に従うのみであり、一部の国ではPGS / PGD資格を必要としないため、広く適用できます。

将来のアプリケーション

NICSは、顕微授精だけでなく、体外受精胚など、体外受精における染色体スクリーニングに幅広く適用できる可能性を秘めています。顕微授精が強く推奨されていますが、精子の影響を防ぐためには、透明帯に付着した精子を除去する方法が必要です。

形態学的評価は胚評価の伝統的な方法ですが、ほとんどの場合、染色体異常胚は染色体的に正常(正倍数体)胚と形態学的に類似しているように見えることがあります。形態が良好な倍数体胚を子宮に移植する際に、形態学的評価とNICSアッセイを組み合わせることで、進行中の妊娠率と出生率が向上する可能性があります。NICS技術を使用した単一胚移植の臨床効果を評価するために、無作為化臨床試験が実施されます。

プロトコルの重要なステップ

すべての卵丘-コロナラジアータ細胞は、受精前に卵母細胞から除去する必要があります。卵母細胞は、細胞質内精子注入(ICSI)によって受精しました。培地にヒト由来のタンパク質/サプリメントを添加することは避けられました。培地は4日目に交換し、胚盤胞が完全に増殖した5〜6日目に採取した。胚は、4日目から培地の個々の液滴で培養した。培地を回収する際は、コンタミネーションを避けるためにサンプル間の移送ピペットを交換しました。

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Disclosures

Yaxin Yao氏、Jieliang Ma氏、Jing Wang氏、Sijia Lu氏は、Yikon Genomics Co., Ltd.の従業員です。

Acknowledgments

著者らは、NGSデータ解析に協力してくれたShiping Bo氏とShujie Ma氏に感謝します。資金提供:この研究は、国家重点研究開発プログラム(助成金番号2018YFC1003100)の支援を受けました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tube Axygen MCT-150-C, PCR-02-C DNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended.
10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free Tips Axygen T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S This can be replaced by other brand/For sample transfer
100 % ethanol Sinopharm Chemical 10009218 This can be replaced by other brand/For DNA library purification
Barcode Primer1-48 Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
BD Falcon Organ Culture Dish, Sterile BD Bioscience 363037 This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip) , Sterile BD Bioscience 353001 This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes, Sterile BD Bioscience 353002 This can be replaced by other brand/For embryo culture
Cell Lysis Buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
Cell Lysis Enzyme Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
ChromGo software Yikon Genomics Data analysis
CMPure Magbeads Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library purification
Cryotop open systerm  KITAZATO BioPharma 81110 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Distill water Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit To dissolve DNA
ES (Vitrification kit)  KITAZATO BioPharma Reagent inVitrification kit This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
HOLDNIG ORIGIO MPH-MED-35 This can be replaced by other
brand/For ICSI
Hyaluronidase solution, 80 U/mL SAGE ART4007-A This can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex
ICSI ORIGIO MPH-35-35 This can be replaced by other brand/For ICSI
Illumina MiSeq® System Illumina SY-410-1001 For library sequencing
Incubator Labotect Inkubator C16 This can be replaced by other brand/For embryo culture
Library buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
Library Enzyme Mix Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
Magnetic Stand DynaMagTM-2 12321D For library purification
Microscope OLYMPUS 1X71 This can be replaced by other brand/For embryo observation
Mini-centrifuge ESSENSCIEN ELF6 For separation
MT Enzyme Mix Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
NICSInst library preparation kit Yikon Genomics KT1000800324 Whole genome amplification and library construction
NICSInst Sample Prep Station Yikon Genomics  ME1001003 Amplificate DNA
Nunc IVF 4-Well Dish Thermo Scientific 144444 This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture
Pasteur Pipette Oirgio  MXL3-IND-135 This can be replaced by other brand/For embryo tansfer
Pasteur pipettes ORIGIO PP-9-1000 This can be replaced by other brand/For IVF laboratory
Pre-Lib Buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit Pre-library preparation
Pre-Lib Enzyme Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit Pre-library preparation
Qubit® 3.0 Fluorometer Thermo Scientific Q33216 For library quantification
Quinn's Advantage Blastocyst Medium SAGE ART-1029 For embryo blastocyst stage culture
Quinn's Advantage Cleavage Medium SAGE ART-1026 This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture
Quinn's Advantage Fertilization Medium SAGE ART-1020 This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization
Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES SAGE ART-1023 This can be replaced by other brand/For embryo clutrure
Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit SAGE ART-3010 This can be replaced by other brand/To denude the oocyte
Quinn's Advantage Tissue culture mineral oil SAGE ART-4008P This can be replaced by other brand/To cover the culture medium
STRIPPER TIPS ORIGIO MXL3-IND-135 This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells
Vitrification Cryotop Open systerm KIZTAZATO 81111 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Vitrification kit  KITAZATO BioPharma VT101 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Vortexer Qilinbeier DNYS8 Sample mix
VS (Vitrification kit)  KITAZATO BioPharma Reagent inVitrification kit This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
ZILOS-tk Laser System Hamilton Thorne CLASS 1 laser This can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse

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Tags

染色体スクリーニング、ヒト着床前胚、使用済み培地、サンプル採取、染色体倍数性解析、体外受精(IVF)、異数性着床前遺伝子検査(PGT-A)、栄養外胚葉(TE)、内細胞塊(ICM)、偽陽性および陰性、NICS技術、DNAシーケンシング、培地サンプリング、全ゲノム増幅(WGA)、ライブラリ調製、NGSデータ解析、凍結保存、体外受精ラボ

Erratum

Formal Correction: Erratum: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis
Posted by JoVE Editors on 10/01/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. The Protocol and Representaive Results sections were updated.

In the Protocol, step 3.8.2 was updated from:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS tab. Then, select the sequencing platform, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

to:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS-A tab. Then, choose NGS for the platform, select corporation, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

In the Representative Results, Figure 3 was updated from:

Figure 3
Figure 3. Data Analysis. (A) The page of Create Submission. There are different options for the user application. For sequencing platform, users can choose Illumina or Ion Torrent. For analysis criterion, there are two length detection resolution for selection, the whole chromosome and whole arm level. The users also can choose whether the mosaicism or gender information is reported. Finished the above parameter setting,click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. For Ion Torrent platform, choose files with an extension of bam. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; Conclusion: Indicates whether the NICS analysis is normal or abnormal, "N/A" indicates no conclusive result is available; Gender: If the user chooses to report the sex information, this column will appear in the summary table; Karyotype: Shows the analysis results; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; CNV plot (By Chromosome): View the CNV profiles of each chromosome. (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. Select Save File in the appearing dialog window and then click OK. The reports will be saved to the Download folder of the computer. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3. Data Analysis. (A) There are different options for the user application. For sequencing platform corporation, users can choose Illumina, Ion Torrent or MGI. The users can choose whether the gender information is reported. Finished the above parameter setting, click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; AI Rating: The rating (A, B or C) for each NICS sample; AI_Rating Interpretation: Evaluation of embryo implantation potential; AI Grading: The score for each NICS sample; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. The reports will be saved to the Download folder of your computer. Please click here to view a larger version of this figure.

使用済み培地を用いたヒト着床前胚の染色体スクリーニング:サンプル採取と染色体倍数性解析
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Huang, J., Yao, Y., Jia, J., Zhu,… More

Huang, J., Yao, Y., Jia, J., Zhu, X., Ma, J., Wang, J., Liu, P., Lu, S. Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. J. Vis. Exp. (175), e62619, doi:10.3791/62619 (2021).

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