我们提出了一种利用光纤共聚焦激光显微内镜（CLM）无创研究结膜下注射后脂质体在眼部时空分布的实验方案。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
结膜下注射是一种具有吸引力的给药途径，因其可通过巩膜直接进入眼内，从而绕过角膜和结膜等眼前段屏障。尽管已有部分研究描述了药物经结膜下注射后的治疗效果和药代动力学，但极少有研究评估药物或药物递送系统（DDS）在眼内的分布情况。而后者对于优化眼内药物递送系统的设计以及提高药物的生物利用度至关重要，以实现理想的药物眼内定位和作用持续时间（例如急性作用与长效维持）。本研究建立了利用光纤共聚焦激光显微内镜（CLM）在活体小鼠中实时定性研究荧光脂质体经结膜下注射后在眼部分布的方法。该技术设计用于 体内 在显微水平上对组织进行肉眼观察，这也是首次完整描述利用CLM成像方法研究结膜下注射后眼内可注射物质时空分布的研究。
引言
药物在活体系统中的血液清除率、组织分布和靶点占有率是理解药物 体内处置的关键要素。在临床前动物模型中，这些参数通常通过在给药后特定时间点频繁采集血液和组织样本进行评估。然而，这些操作通常具有侵入性，常涉及非存活性测量，并且需要较大的动物群体以满足统计学效能要求。这可能导致额外的成本和时间消耗，同时引发因动物使用过多而带来的伦理问题。因此，非侵入性成像技术正迅速成为生物分布研究中的重要环节。共聚焦激光显微内镜（CLM1,2）特别适用于眼部应用，可对活体动物眼部中药物的时间-空间分布进行高灵敏度、高分辨率的非侵入性成像1,3,4。
共焦激光显微镜（CLM）有望促进对眼用药物递送系统（DDS）的高效筛选，例如 脂质体，在对药物递送系统（DDS）和药物生物利用度进行全面定量之前，因其在调节理化和生物物理性质方面的灵活性而具有吸引力5,6,7,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本文所述所有方法均已获得新加坡SingHealth机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。实验所用6-8周龄、体重18-20 g的雌性C57BL/6 J小鼠购自新加坡InVivos公司，并饲养于新加坡杜克-国大医学院（Duke-NUS Medical School）温度与光照可控的动物实验设施中。动物实验操作均遵循视力与眼科学研究协会（ARVO）关于在眼科学与视觉研究中使用动物的指南声明。
注意：主流程的示意图见图2。
1. 对比剂的制备：伊文思蓝（EB）和脂质体
- 配制2% EB染料溶液：将1 g EB溶解于50 mL无菌生理盐水中。使用0.22 µm滤器过滤溶液，收集至1.5 mL无菌离心管中，室温保存备用。
- 制备绿色荧光脂质体：将POPC/Fl-DHPE（95:5）溶于氯仿/甲醇（2:1）中，加入100 mL圆底烧瓶。在40 °C下以150 rpm转速使用旋转蒸发仪蒸发1小时，维持真空度为0 mbar1，形成均匀的脂质薄膜。
注意：在比较脂质体特性（如粒径、电荷、脂质饱和度、脂质链长度）对分布的影响时，应保持Fl-DHPE或其他荧光脂质的摩尔百分比恒定，以确保观察到的结果是由所测试的脂质体特性引起，而非由疏水性染料负载量的差异所致。
<....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本方案展示了共聚焦激光显微镜（CLM）在评估经结膜下注射给予的绿色荧光脂质体眼部时空分布方面的应用价值。为了利用CLM系统的双色检测能力（激发波长为488 nm和660 nm），将用于注射的100 nm中性POPC脂质体掺入5%的Fl-DHPE（其组成及表征数据见图1B），同时经静脉注射伊文思蓝（EB）以标记眼部解剖结构。由于巩膜上层存在一层较薄的巩膜外层和结膜组织，二者均富含血管，因此EB可使巩膜区域呈现红色（图4A，标记为S）；而角膜无血管分布（图4A，标记为C），不会被染色，呈现黑色。这使得在荧光成像过程中能够清晰区分这两个区域。
代表性结果来自一项持续7天的分布研究（n = 4只小鼠）。由于第1天和第3天图像中的荧光强度较高（图5B），为便于观察，已对像素强度进行了降低处理。荧光强度的实际数值反映在图表中（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
结果表明，共聚焦激光显微镜（CLM）为成像脂质体在眼部的分布提供了一种简单且可行的方法。我们先前已证明可利用CLM随时间表征不同脂质体制剂在小鼠眼内的定位情况1。对于非侵入性应用，CLM能够对同一动物的眼前表面进行实时成像，从而深入了解脂质体在眼内的分布情况。这使得CLM适用于在进行更全面的定量分析之前，对纳米载体/药物递送系统（DDS）进行预筛。鉴于不同DDS具有独特的理化性质，采用传统组织学方法来表征其在眼部亚区室中的分布极具挑战性。后者需要对整个眼球进行 exhaustive 切片，并通过荧光显微镜对各个切片进行单独成像，才能整体评估DDS的清除情况。
与共聚焦激光显微（CLM）图像结果一致（图5B、C），在注射脂质体后第1天采集的眼组织中，通过组织学方法可在角膜、角膜缘和巩膜区域观察到绿色荧光信号（图7）。值得注意的是，CLM的检测灵敏度优于荧光显微镜——在巩膜区域的脂质体可.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由南洋理工大学-西北大学纳米医学研究所（NNIN）提供的资助（授予SV）以及新加坡国家研究基金会资助AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2部分支持，并由中国台湾星集团（A*STAR）管理的新加坡卫生与生物医学科学（HBMS）产业对接基金前期布局（IAF-PP）资助H18/01/a0/018支持（授予AMC）。感谢杜克-国大转化与分子影像学实验室（LTMI）成员在研究的后勤协调、实施、设备培训方面提供的协助。特别感谢Wisna Novera女士在编辑方面提供的帮助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.08 µm 聚碳酸酯滤膜 | Whatman, 美国 | 110604 | |
| 0.22 µm 注射器滤器 | Fisherbrand, 爱尔兰 | 09-720-3 | |
| 0.5% 盐酸丙美卡因无菌眼用溶液 | Alcon, 新加坡 | ||
| 10 µL 玻璃注射器 | Hamilton, 美国 | 65460-06 | |
| 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC） | Avanti, 美国 | 850457 | |
| 32 G 针头（Hamilton, 0.5” PT4） | Hamilton, 美国 | 7803-04 | |
| 带加热板的动物体温控制器（15 cm × 20 cm） | WPI, 美国 | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio 双波段系统，S1500 探头及 Quantikit（第 3.5 步校准套件） | Mauna Kea Technologies, 法国 | 探头直径：1.5 mm，视场：600 µm × 500 µm，轴向分辨率：15 µm，横向分辨率：3.3 µm | |
| 氯仿 | Sigma Aldrich, 美国 | 472476 | |
| Dumont #5 镊子，Dumostar | WPI, 美国 | 500233 | 11 cm，直头，尖端尺寸：0.1 mm × 0.06 mm |
| 伊文思蓝 | Sigma Aldrich, 美国 | E2129 | |
| 夫西地酸滴眼液 | LEO Pharma, 丹麦 | ||
| ImageJ | 美国国立卫生研究院，美国 | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| 异氟烷 | Piramal, 美国 | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, 英国 | ||
| 甲醇 | Sigma Aldrich, 美国 | 179337 | |
| 小型挤出器（Mini Extruder） | Avanti, 美国 | 610020 | |
| N-(荧光素-5-硫代氨基甲酰基)-1,2-二十六酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（三乙基铵盐）（FL-DHPE） | Invitrogen, 美国 | F362 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco, 美国 | 10010023 | |
| 带台夹支架的体视显微镜系统 | Olympus, 东京, 日本 | SZ51 & SZ2-STU3 |
参考文献
- Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery. Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).
- Kuo, J. C. -H., et al. Detection of colorectal dysplasia using....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
