Summary
אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במיקרונדוסקופיית לייזר קונפוקלית סיבים אופטיים (CLM) כדי לחקור באופן לא פולשני את ההתפלגות המרחבית-זמנית של ליפוזומים בעין לאחר הזרקה תת-ימית.
Abstract
הזרקה תת-ימית היא דרך אטרקטיבית למתן תרופות עיניות בשל גישה טרנס-סקלרלית קלה העוקפת מחסומי עיניים קדמיים, כגון הקרנית והלחמית. בעוד השפעות טיפוליות ופרמקוקינטיקה של התרופות על הזרקה תת-כיוונית תוארו במחקרים מסוימים, מעטים מאוד להעריך את ההפצה העין של תרופות או מערכות אספקת תרופות (DDS). זה האחרון הוא קריטי עבור אופטימיזציה של עיצוב DDS תוך עיני וזמינות ביולוגית סמים כדי להשיג את לוקליזציה העין הרצוי ומשך הפעולה (למשל, חריף לעומת ממושך). מחקר זה קובע את השימוש במיקרואנדוסקופיית לייזר קונפוקלית סיבים אופטיים (CLM) כדי לחקור באופן איכותי את התפלגות העין של ליפוזומים פלואורסצנטיים בזמן אמת בעכברים חיים לאחר הזרקת תת-הלחמית. להיות מתוכנן לבדיקה חזותית ויוו של רקמות ברמה המיקרוסקופית, זהו גם התיאור המלא הראשון של שיטת ההדמיה CLM לחקור התפלגות מרחבית-זמנית של הזרקה בעין לאחר הזרקה תת-כיוונית.
Introduction
סיווג הדם, חלוקת הרקמות ותפוסת היעד של תרופות במערכות חיות הם עמודי התווך להבנה בטבע התרופה של vivo. במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים, פרמטרים אלה מוערכים בדרך כלל על ידי דגימת דם ורקמות תכופה בנקודות זמן מסוימות לאחר מתן התרופה. עם זאת, הליכים אלה הם בדרך כלל פולשניים, לעתים קרובות כוללים מדידות שאינן הישרדות, ומחייבים קבוצות גדולות של בעלי חיים להנעה סטטיסטית. ייתכנו עלות וזמן נוספים, יחד עם חששות אתיים לשימוש מופרז בבעלי חיים. כתוצאה מכך, הדמיה לא פולשנית הופכת במהירות לצעד אינטגרלי במחקרים על ייחוס ביולוגי. מיקרונדוסקופיית לייזר קונפוקלית (CLM1,2) מתאימה היטב ליישומי עיניים כדי לדמיין באופן לא פולשני את ההתפלגות המרחבית-זמנית של טיפולים בעיני בעלי חיים חיים בעלי רגישות גבוהה ורזולוציה גבוהה 1,3,4.
CLM יש פוטנציאל להקל על הקרנה חזקה של מערכות אספקת תרופות עינית (DDS), כגון ליפוזומים, לפני כימות מקיף של DDS וזמינות ביולוגית סמים. ליפוזומים אטרקטיביים עבור הגמישות שלהם כוונון התכונות הפיזיקוכימיות והביופיסיות שלהם5,6,7,7,8,9,10,11 כדי לתמצת מגוון גדול של מטען טיפולי ולשלוט באתר הרקמה של שחרור סמים ומשך הפעולה. ליפוזומים שימשו ביישומים עיניים להעברת מולקולות גדולות, כגון נוגדן חד שבטי אווסטין12, ומולקולות קטנות כמו ציקלוספורין13 ו ganciclovir14. ליפוזומים טעונים בתרופות יש מחצית חיים ביולוגית ארוכה יותר, השפעות טיפוליות ממושכות לעומת ניסוחים "תרופה חופשית" לא ליפוזומית. עם זאת, הפצת סמים ברקמת העין מוערכת בדרך כלל מריכוז סמים ברכיבי נוזלים של העין (כלומר, דם, הומור מימי והומור זגוגי15,16,17). כמו הגורל הראשוני ב vivo של מטען התרופה טעון מוגדר על ידי המאפיינים של nanocarrier עצמו, הדמיה CLM של ליפוזומים פלואורסצנטי יכול לשמש פונדקאית עבור התרופה לחשוף מיקוד רקמות בזמני מגורים רקמה במקום. יתר על כן, ראיות חזותיות של משלוח עם CLM יכול לנווט DDS מחדש עיצוב, להעריך את היתרונות הטיפוליים של התרופה, ואולי אפילו לחזות אירועים ביולוגיים שליליים (למשל, רעילות רקמות עקב לוקליזציה לא רצויה של DDS לתקופות ממושכות של זמן).
להלן, הליך שלב אחר שלב מפורט על איך ללמוד את הייחוס הביולוגי העין של ליפוזומים בעכברים חיים עם מערכת CLM כפולת פסים. מערכת CLM ספציפית זו יכולה לזהות פלואורסצנטיות בשני צבעים (עם לייזרי עירור ירוקים ואדומים ב-488 ננומטר ו-660 ננומטר) בזמן אמת, בתדירות של 8 פריימים לשנייה. על ידי הצבה פיזית של גשושית הזיהוי על העין, הפרוטוקול מדגים רכישת תמונה וניתוח של ליפוזומים ירוקים-פלואורסצנטיים על ניהול תת-קומוניאלי בעכברים שהוזרקו מראש תוך ורידי (IV) עם 2% צבע כחול אוונס (EB). צבע EB מסייע לדמיין את המבנים הסקולריים בערוץ הפלואורסצנטיות האדום. אנו מציגים תוצאות מייצגות ממחקר המעריך 100 ננומטר ליפוזומים ניטרליים המורכבים מ- POPC פוספוליפידי (כלומר, 1-פלמיטואיל-2-אולואיל-גליצרו-3-פוספוצולין) ו מסוממים עם פוספוליפיד Fl-DHPE מתויג פלואורסצין (כלומר, N-(פלואורסצ'ין-5-תיוקרבאמול) -1,2-דיהקסה-דקנויל-גליצרו-3-פוספוטהנולמין) ביחס של 95% POPC: 5% Fl-DHPE (איור 1B ). CLM הוא מסוגל ללכוד את ליפוזומים מתויג פלואורסצ'ין ירוק ברזולוציה צירית 15 מיקרומטר ו 3.30 מיקרומטר לרוחב על ידי תיחום של גבולות רקמת העין מוכתמת EB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) ב- SingHealth (סינגפור). נקבות C57BL/6 J עכברים (6- 8 שבועות; 18-20 גרם) התקבלו מ InVivos, סינגפור, ושוכנו ב טמפרטורה ויבריום מבוקר אור של בית הספר לרפואה דיוק-NUS, סינגפור. בעלי חיים טופלו בהתאם להנחיות האגודה לחקר הראייה ורפואת עיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה.
הערה: תרשים זרימה המדגיש את ההליכים העיקריים מוצג באיור 2.
1. הכנת חומרי ניגודיות: אוונס בלו (EB) וליפוזומים
- לתמיסת צבע EB של 2% EB, יש להמיס 1 גרם של EB ב-50 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית. סנן את הפתרון באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר לצינורות סטריליים בגודל 1.5 מ"ל ואחסן אותם בטמפרטורת החדר לשימוש מאוחר יותר.
- לליפוזומים ירוקים-פלואורסצנטיים, הוסיפו את POPC/Fl-DHPE (95:5), כלורופורם/מתנול (2:1) לבקבוקון תחתון עגול של 100 מ"ל. השתמש מאייד סיבובי ב 150 סל"ד ב 40 °C (50 °F) עבור 1 שעות, עם ואקום נשמר ב 0 mbar1 כדי ליצור סרט שומנים דק.
הערה: בעת השוואת ההשפעות של תכונות liposomal (למשל, גודל, מטען, רוויית שומנים בדם, אורך שרשרת השומנים) על הפצה, לשמור על אחוז קבוע של Fl-DHPE או שומנים פלואורסצנטיים אחרים כדי לאשר כי התוצאות שנצפו נובעות ההשפעה של המאפיינים שנבדקו, ולא את העומס המשתנה של צבעים הידרופוביים גדולים. - לחות את סרט השומנים עם תמיסת מלח חוצץ פוספט (כדי להשיג 26.3 מ"מ של ליפוזומים פלואורסצנטיים) ב 40 °C (40 °F) כדי ליצור שלפוחיות רב lamellar (MLV). טען את MLVs לתוך מזרק זכוכית עבור שחול ידני (30 פעמים באמצעות מסנן פוליקרבונט בגודל 0.08 מיקרומטר) כדי להשיג את הגודל הרצוי של 100 ננומטר.
הערה: הטמפרטורה עבור הידרציה חייבת להיות גבוהה יותר מטמפרטורת המעבר של השומנים. - לסנן את הליפוזומים על ידי העברתם דרך מסנן מזרק סטרילי 0.22 מיקרומטר. אשר את הקוטר ההידרודינמי (DH) של הליפוזומים באמצעות מערכת פיזור אור דינמית.
2. ניהול של EB וליפוזומים בעכברים חיים
- הזרק עכבר עם EB IV (תוך ורידי) דרך וריד הזנב (2.5 מ"ג / קילוגרם), 2 שעות לפני הזרקת תת-צינור.
- עבור הזרקה תת-כיוונית, ראשית, להרדים את העכבר באמצעות 5% איזופלוריין באמצעות שאיפה בתא אינדוקציה כדי להשיג מישור נאות של הרדמה. מעבירים את העכבר לקונוס אף ושומרים על הרגעה ב-2%-2.5% איזופלוריין בזמן שאתם על כרית חימום לאורך כל ההליך.
- לקצץ את השפם ליד העין כדי להיות מוזרק ולהחדיר טיפה של הרדמה אקטואלי 0.5% proxymetacaine הידרוכלוריד פתרון ישירות על העין.
- לטעון מזרק זכוכית 10 μL (עם מחט 32 G) עם ליפוזומים פלואורסצנטיים (Fl-DHPE: 0.78 מ"ג / קילוגרם) ולהפיג את כל בועות האוויר במזרק לפני ההזרקה.
הערה: עד 20 μL של הזרקה ניתן לאכלס בחלל התת-ימי של עכברים18,19. - באמצעות פינצטה, הרימו מעט את הלחמית והזריקו באיטיות לחלל התת-ימי (איור 1A). הסר את המחט לאט כדי למנוע זרימה אחורית. ודאו שנוצרת בלם גלוי מלא בליפוזומים פלואורסצנטיים (איור 1C).
- תן טיפה של אנטיביוטיקה 1% חומצה fusidic על העין לאחר הזריקה לפקח על העכבר עד שהוא חוזר להכרה.
3. הגדרת CLM
- הפעל את מערכת CLM וודא שגם המחבר וגם הקצה הדיסטלי של בדיקית הסריקה נקיים.
- נקה את המחבר של בדיקית הסריקה באמצעות מנקה מחבר אופטי על-ידי ביצוע הוראות היצרן.
- לחץ על הראצ'ט (לעתים קרובות צבעוני) של מנקה המחברים האופטיים כדי לחשוף רצועת כלים לניקוי.
- מקם את המחבר במגע עם רצועת הכלים לניקוי והחלק את המחבר לאורך רצועת הכלים תוך שמירה על קשר.
- נקו את הקצה הדיסטלי (הידוע גם כקצה הסריקה) של הגשושית על ידי טבילתו בתמיסת הניקוי, ואחריה פתרון השטיפה המסופק על ידי היצרן. אפליקטור קצה כותנה יכול לשמש גם לניקוי יסודי יותר אם הקצה מלוכלך מאוד.
- חבר את הגשוש למערכת CLM. בחר את שדה הראייה (FOV) ואת המיקום עבור קבצי הרכישה בשלב זה.
הערה: התאם את עוצמת הלייזר בשלב זה כדי להבטיח שזיהוי פלואורסצנטיות עבור Fl-DHPE נמצא בטווח הליניארי. יש לשמור על עוצמת הלייזר עקבית להשוואה בין תמונות שצולמו בנקודות זמן שונות. - אפשר למערכת להתחמם במשך 15 דקות לפי ההוראות והשתמש בערכת הכיול לכיול המערכת בהתאם להוראות היצרן.
הערה: בערכת הכיול, ישנם שלושה בקבוקונים לכל לייזר המכילים את הפתרונות הבאים: פתרון ניקוי, פתרון שטיפה ופתרון פלואורופור 488/660 ננומטר לכיול פנימי. שלבי הכיול מתבקשים על-ידי המערכת ויש לבצעם בהתאם.- טבול את הקצה בבקבוקון הניקוי ואחריו בקבוקון השטיפה (5 שניות בכל בקבוקון). השאר אותו באוויר להקלטת רקע עבור שני הערוצים.
הערה: שלב זה חיוני מאוד מכיוון שהוא מנרמל את ערכי הרקע מסיבים שונים של הבדיקה ומבטיח אחידות תמונה. - טבול את הקצה בבקבוקון הניקוי ואחריו בקבוקון השטיפה (5 שניות בכל בקבוקון). טבול את הקצה בבקבוקון פלואורופור 488 ננומטר למשך 5 שניות כדי לנרמל ערכי אות מסיבים שונים בגשוש.
- טבול את הקצה בבקבוקון הניקוי ואחריו בקבוקון השטיפה (5 שניות בכל בקבוקון). טבול את הקצה בבקבוקון השטיפה עד לאות הפלואורסצנטיות שנרשם ב-3.5.2. נעלם. טבול את הקצה בבקבוקון פלואורופור 660 ננומטר כדי לנרמל ערכי אות מסיבים שונים בגשוש.
הערה: בצע את כל שלבי הכיול כדי להשיג כיול נכון ואיכות תמונה אופטימלית.
- טבול את הקצה בבקבוקון הניקוי ואחריו בקבוקון השטיפה (5 שניות בכל בקבוקון). השאר אותו באוויר להקלטת רקע עבור שני הערוצים.
- לאחר כיול הגשושית, ודא שערכי הרקע עבור הבדיקות נמוכים ככל האפשר. עבור מערכת CLM המשמשת, שמור את ערכי הרקע מתחת ל- 100. בצע ניקוי חוזר ונשנה של הבדיקה עם אפליקטור וכיול קצה כותנה אם הערכים הם מעל 100/ערך משתמש מוגדר או אם הבדיקה נראית מלוכלכת. זאת כדי להבטיח שרעשי הרקע יישמרו סביב אותו ערך.
הערה: חשוב להגדיר את ערך הרקע המרבי (לדוגמה, 100 כאמור בשלב 3.6) כדי להבטיח שתנאי הבדיקה דומים. הדבר יאפשר השוואה כמותית נכונה בין תמונות שצולמו בנקודות זמן שונות. הערך עשוי להיות שונה במערכות ובתנאי בדיקה שונים. - הפעל את בקר הטמפרטורה של בעלי החיים (ATC). כוונן את ה-ATC ל-37°C(50°F). לכסות את כרית החימום עם וילון כירורגי ולתקן את חרוט האף על כרית החימום.
הערה: ATC עם כרית חימום מחוברת נדרש כדי להבטיח כי החיה נשמרת חמה לאורך כל תקופת ההדמיה. - הדקו את מעמד המיקרוסקופ המנתח לראש השולחן כדי לאבטח אותו. סובב וכוון את העין של המיקרוסקופ כדי להציג את עין העכבר ארגונומית דרך העין כאשר המשתמש יושב (בצע את ההתאמות לאחר הצבת החיה).
- יש להרדים את העכבר באמצעות 5% איזופלוריין בתא אינדוקציה. מעבירים את העכבר לחרוט האף ברגע שהחיה אינה מגיבה ושומרים על הרגעה בטמפרטורה של 2%-2.5% איזופלוריין בזמן שהם על כרית חימום לאורך כל ההליך.
- חותכים את השפם של העכבר ולהחדיר טיפה של הרדמה 0.5% proxymetacaine הידרוכלוריד פתרון על העין.
- כדי לוודא שהעיניים נקיות, טיפה כמה טיפות של תמיסת מלח כדי לשטוף את פני השטח העין.
- התאם את המיקרוסקופ כך שעין העכבר תהיה בפוקוס ישיר בהגדלה של פי 0.67.
הערה: הקפד לשמן את העיניים עם תמיסת מלח. אם העיניים אינן משומנות לאורך כל מפגש ההדמיה, הן יכולות להתייבש ולגרום לעדשה להתגבש. כתוצאה מכך, במהלך הדמיית CLM, העדשה יכולה לפלוט פלואורסצנטיות אדומה ברקע.
4. הדמיה חיה של עיני עכבר עם CLM ורכישה
- הפעילו את הלייזר, הניחו את הגשושית על העין והתחלו להקליט רכישה כדי לבחון את הפלואורסצנטיות בעין באזורים המצוינים במפת העיניים באיור 3.
הערה: החזק את הגשוש כמו עט עם הקצה הדיסטלי של הגשושית ישירות על האזור כדי להיות בתמונה. - הפסק את ההקלטה כאשר כל האזורים סומנו בדגל ותויגו. קבצי הרכישה יישמרו באופן אוטומטי במיקום הקובץ שנבחר בשלב 3.4.
הערה: הקובץ יישמר כקובץ וידאו שניתן לייצא לתמונות בודדות. סמן את הדגל על פי מפת העין כדי לדעת בדיוק את מיקום הגשוש במסגרת המדויקת שההקלטה נעשתה.
5. ניתוח תמונה
- באמצעות אותה תוכנת רכישת CLM, יצא את קבצי רכישת התמונה לניתוח נוסף. לחץ על | קובץ יצא ובחר את התבנית שאליה יש לייצא. קבצי תבנית Mkt יאפשרו התאמות של טבלת חיפוש למעלה (LUT) ויצוא נוסף לתבניות קובץ תמונה באמצעות תוכנת מציג CLM.
- להשוואה מדויקת של עוצמת הפלואורסצנטיות, השתמשו באותו LUT המותאם לכל ערוץ בעת ייצוא כל קבצי התמונה.
הערה: בחר את סף ה- LUT המינימלי והמקסימלי ביחס לסף של עכבר הבקרה (ללא ליפוזומים מוזרקים) כדי למזער את קריאות הפלואורסצנטיות ברקע. - פתח את התמונה בתוכנת עיבוד תמונה מתאימה / תוכנית freeware (לדוגמה, ImageJ). צייר את אזור העניין (ROI).
הערה: החזר ההשקעה כאן מתייחס לאזור העניין בתוכנית העיבוד. ברוב המקרים, החזר ההשקעה יהיה התמונה כולה נסרקה. עם זאת, במקרה של הדמיה הלימבוס, הבדיקה לא יכולה פשוט לקבל את התמונה של הלימבוס בנפרד. לכן, יש למשוך החזר השקעה כדי 'לכמת' את הפלואורסצנטיות באזור הלימבוס, כפי שצויר באיור 4. כדי לשמור על החזר ההשקעה עקבי, השתמש באותה החזר השקעה על ההשקעה בכל התמונות. - מדוד ורשום את ערכי ההחזר על ההשקעה עבור פלואורסצנטיות ירוקה. הזן את הערכים בגיליון אלקטרוני. סמן את הערכים הממוצעים ואת עוצמת הפלואורסצנטיות (a.u.) של ההחזר על ההשקעה.
6. הערכה היסטולוגית
- הרדים את העכבר באמצעות שיטה שאושרה על-ידי IACUC המקומי.
- לחתוך את העין ולתקן את העין ב 1 מ"ל של 4% פורמלדהיד או 10% פתרון פורמלין בן לילה.
- חותכים שומנים עודפים ומטביעים את העין בתרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT) ושומרים אותה קפואה במקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך יום אחד לפחות.
- חותכים קטעים בעובי 5 מיקרומטר בהקפאה עם טמפרטורת חיתוך שנשמרה ב 20 °C (60 °F). העבר את המקטע לשקופית מיקרוסקופ מצופה פולי-L-ליזין.
הערה: היסטולוגיה יכולה לשמש אימות נוסף של הפצת DDS. עם זאת, זה דורש אופטימיזציה נוספת, מומחיות טכנית, והקרבה של בעלי חיים אשר המחקר שואף להפחית באמצעות CLM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול מדגים את התועלת של CLM כדי להעריך את התפלגות העין המרחבית-זמנית של ליפוזומים פלואורסצנטיים ירוקים המנוהלים באמצעות הזרקה תת-ימית. כדי לעשות שימוש ביכולת הצבע הכפול (488 ננומטר ואורכי גל של 660 ננומטר עירור) של מערכת CLM, 100 ננומטר ליפוזומי POPC ניטרליים להזרקה סוממו עם 5% Fl-DHPE (נתוני הרכב ואפיון מוצגים באיור 1B), ו- EB הוזרק IV כדי לזהות ציוני דרך בעין. נוכחותה של שכבה דקה של אפיזקלרה והלחמית, ששניהם בעלי כלי דם גבוהים, מאפשרת לאזור הסקלרה להיות מוכתם באדום עם EB (איור 4A, המסומן כ-S), בעוד הקרנית שאינה מכילה כלי דם (איור 4A, המסומן כ- C), אינה מוכתמת ונראית שחורה. זה מאפשר הבחנה ברורה בין שני האזורים במהלך הדמיית פלואורסצנטיות.
התוצאות הייצוגיות הן ממחקר הפצה המשתרע על פני 7 ימים (n = 4 עכברים). מכיוון שעוצמות הפלואורסצנטיות בתמונות ליום הראשון וליום השלישי היו גבוהות (איור 5B), עוצמת הפיקסלים צומצמה להדמיה טובה יותר. הערכים בפועל של עוצמת הפלואורסצנטיות משתקפים בתרשימים (איור 6). כדי לוודא שהתצפיות מהתמונות נבעו מפלואורסצנטיות מהליפוזומים ולא מצבע חופשי, שאולי יצא מהליפוזומים, נכללו עכברי בקרה שהוזרקו לצבע פלואורסצ'ין (Fl) (איור 5A).
ירידה בליפוזומים (על ידי פרוקסי של הירידה באות פלואורסצנטי ירוק) נצפתה הן באזור הלימבוס והן באזור סקלרה לאורך זמן. כאשר הליפוזומים הוזרקו מהטמפורל לאזור העליון של החלל התת-ימי (איור 3), הם הונחו באופן טבעי ממש מעל הסקלרה הטמפורלית והעליון (איור 4B) לפני שהגיעו לאזורים אחרים של החלל התת-קומוניאלי. ביום הראשון לאחר ההזרקה, הפלואורסצנטיות שזוהתה בסקלרה הייתה גבוהה עד פי 6 מהלימבוס הן באזורים זמניים והן באזורים עליונים (איור 6). ביום 3 וביום השביעי נצפתה ירידה משמעותית של ליפוזומים בסקלרה (60% מיום 1 ליום 3 (יום 1→3) ו-88% מיום 3 ליום 7 (יום 3→7)) באזור הזמן, עם ירידה של 66% ו-93% ליום הראשון→3 ויום 3→7 באזורים העליונים, בהתאמה, עמ' < 0.001) (איור 6). הפחתה זו יוחסה למנגנוני הסיווג של העין באמצעות דם ו/או כלי לימפה שנמצאו בלחמית ובאפיספלרה. הליפוזומים יכלו גם להתפזר דרך הסקלרה ולנקות על ידי הכורואיד, שהוא גם מאוד וסקולרי.
נמצאו הליפוזומים שהתבהרו בצורה איטית יותר בלימבוס. עבור לימבוס זמני ולימבוס מעולה, השינויים באותות הפלואורסצנטיות מיום 1 עד יום 3 לאחר ההזרקה לא היו משמעותיים, מה שמצביע על כך שלליפוזומים ניטרליים יש העדפה לאזור הלימבוס, במיוחד לפריפריה הקרנית (איור 5B). ליפוזומים באזור הלימבוס החלו להתבהר מיום 3 (d3→7: -89% עבור זמני (p < 0.01), ו -53% עבור מעולה (p < 0.05)). עד היום 7, יותר מ -90% של ליפוזומים פונו מכל אזורי הלימבוס (p < 0.05) למעט לימבוס מעולה 1S, שבו 50% של ליפוזומים עדיין ניתן לזהות (p > 0.05). זוהי אינדיקציה לכך שזמן המגורים של ליפוזומים ניטרליים גבוה בהרבה בפריפריה העליונה של לימבוס/קרנית (איור 5 ואיור 6) בהשוואה לאזורים אחרים. הכמות הנמוכה ביותר של פלואורסצנטיות זוהתה באף ובאזורים הנחותים בכל נקודות הזמן בשל המרחק שלהם מאתר ההזרקה (איור 6A,B).
במחקרים מקיפים יותר של אישור של ליפוזומים בעין שדווחו בעבר1, דנו בכמה מסלולים שבהם ליפוזומים ניתן לנקות מרקמות עינית לאחר הזרקה תת-ימית. בעוד ליפוזומים ניתן לנקות על ידי זרימת דם מערכתית וסילוק הלימפה דרך הלחמית, episclera, ו choroid, אשר הם כלי דם מאוד, הם יכולים גם להגיע לרקמות תוך עיניות עמוקות יותר על ידי דיפוזיה פסיבית דרך הסקלרה. זרימת נוזלים יכולה גם להעביר את הליפוזומים דרך רשת trabecular או זרימת uveosclera, אשר יכול להביא את ליפוזומים בחזרה sclera. חיסול דרך דמעות אפשרי גם, דליפות קלות באתר ההזרקה יכול לאפשר חדירה קרנית באמצעות דיפוזיה פסיבית.
איור 1: הזרקה תת-קומוניאלית של ליפוזומים בעין. (A) ייצוג גרפי של ליפוזומים ירוקים-פלואורסצנטיים והזרקה תת-קומוניאלית. (B) קומפוזיציה ומאפיינים של ניסוח ליפוזומלי מסומם FL-DHPE להדמיית CLM עינית. (C) ליפוזומים ירוקים-פלואורסצנטיים היוצרים bleb על הזרקה תת-כיוונית. נתון זה הותאם באישור צ'או S.Y. et al.1. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ציר הזמן של הליך CLM עיני. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מפת עיניים לסריקות CLM. אזור 1 מתייחס לאזור הלימבוס, בעוד שאזור 2 מתייחס לאזור הסקלרה. סרטונים ותמונות צולמו מ-1T בכיוון אנטי-בכיוון השעון, ואחריהם 2T בכיוון דומה נגד כיוון השעון. כמו המחט הוכנסה להזרקה מ 2T לכיוון 2S, תחומי עניין הם בעיקר 1T, 1S, 2T, ו 2S. האפשרות Insert מציגה את גודל הגשוש ביחס לעין העכבר. נתון זה הותאם באישור צ'או S.Y. et al.1. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח תמונה. (A) ניתוח ImageJ של ליפוזומים בעלי תווית פלואורסצנטית נעשה באמצעות אזורי עניין (ROI) שהוגדרו עבור אזורי הלימבוס (L) והסקלרה (S) (B) (B) אזורי העין המכומתים באזור הלימבוס לנוכחות ליפוזום. מיקומים אפשריים של ליפוזומים שזוהו בלימבוס הם 1) פריפריה הקרנית, 2) לימבוס או 3) פריפריה סקלרה. נתון זה הותאם באישור צ'או S.Y. et al.1. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: התפלגות ניגודיות בלימבוס ובסקלרה. התפלגות ניגודיות בלימבוס (1S: Superior, 1N: Nasal, 1I: נחות, 1T: זמני) וסקלרה (2S: Superior, 2N: Nasal, 2I: נחות, 2T: Temporal) אזורים של עכבר מייצג אחד מכל קבוצה (n = 4) במשך 7 ימים עבור (A) בקרת פלואורסצ'ין (Fl), (B) 100 ננומטר ליפוזומים ניטרליים (POPC-100). צבע אדום מציין כתמי EB. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (ג) תמונות שצולמו מורכבות על מפת העיניים להבנה טובה יותר. נתון זה הותאם באישור צ'או S.Y. et al.1. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: קינטיקה של ליפוזומי POPC ניטרליים של 100 ננומטר באזורי הסקלרה (A) והלימבוס (B) במשך 7 ימים (n=4 עכברים לקבוצה). עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת הושוותה על ידי ANOVA דו-כיווני עם השוואות מרובות ביחס לנקודת הזמן הקודמת; ד1→3 ו-ד3→7; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: תמונות היסטולוגיה מייצגות של קטעים רוחביים (5 מיקרומטר) של עין העכבר יום אחד לאחר הזרקת ליפוזומי Fl-DHPE. קווים מנוקדים מציינים היכן ניתן לראות את הליפוזומים, המצוינים על ידי צבע ירוק. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כפי שמוצג מהתוצאות, CLM מספק שיטה פשוטה וישימה לדמיין את התפלגות העין של ליפוזומים בעין. הדגמנו בעבר את השימוש ב- CLM כדי לאפיין את הלוקליזציה של ניסוחים ליפוזומיים שונים בתוך עין העכבר לאורך זמן1. עבור יישומים לא פולשניים, CLM מאפשר הדמיה בזמן אמת של פני השטח העין הקדמית לקבלת תובנות על אופן הפצת ליפוזומים בעין מאותו בעל חיים. זה הופך את CLM מתאים לננו-קרון/DDS לפני מסך לפני כימות מקיף יותר. בהתחשב בתכונות הפיזיוכימיות הייחודיות של DDS מגוון, זה די מאתגר לאפיין את הפצת תת התא שלה על ידי היסטולוגיה קונבנציונלית. זה האחרון ידרוש חתך ממצה של כל העין וקטעי הדמיה בודדים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לתחושה כוללת של אישור DDS.
בהסכמה עם תמונות CLM (איור 5B,C), יכולנו לצפות באותות פלואורסצנטיים ירוקים על ידי היסטולוגיה באזורי הקרנית, הלימבוס והסקלרה של העין שנאספו ביום הראשון לאחר הזרקת הליפוזומים (איור 7). ראוי לציין כי CLM הראה רגישות טובה יותר מאשר מיקרוסקופיה פלואורסצנטית - ליפוזומים בסקלרה יכולים להיות מזוהים בבירור באמצעות CLM (איור 5) אך בקושי זוהו על ידי מיקרוסקופ הפלואורסצנטיות (איור 7). אובדן האות יכול להיות בגלל הליכי כביסה וחתך שהשפיעו על השמירה של ליפוזומים בחלקי רקמות. למרות CLM מוגבל באיתור שכבת הרקמה המדויקת שבה הליפוזומים מצטברים, זו בהחלט שיטה ריאלית ופשוטה יחסית לסנן ולהעריך טיפולי עיניים מועמדים באופן לא פולשני בזמן אמת.
בעוד שמערכות הדמיה אחרות כמו במערכות הדמיה vivo ופלואורומטרים מאפשרות גם הדמיה חיה או כימות חי של פלואורסצנטיות בעין, הן אינן מתאימות באותה מידה לצורך מחקר זה. במערכות הדמיה של vivo אינן מציעות את הרזולוציה המרחבית הנדרשת כדי להגדיר היכן הטיפולים נמצאים במרחב העין. אפשר רק לקבל מושג אם הטיפולים עדיין נמצאים במרחב העין ואת הייחוס הביולוגי שלהם בעת שימוש במערכת הדמיה vivo20. פלואורומטר מאפשר מדידת פלואורסצנטיות לאורך הציר האופטי של העין ונמצא בשימוש נרחב לחקר שינויים פיזיולוגיים בעין. מכיוון שיש קושי לקבל בדיוק את אותו ציר אופטי נסרק בכל נקודת זמן, נקודת הדמיה עקבית לא ניתן לשמור. זה מאוד קריטי, במיוחד כאשר לומדים את ההפצה של מערכות משלוח סמים שבו זמן המגורים שלהם ואת שיעור הסיווג מאתר ההזרקה אינם ידועים לחלוטין. יתר על כן, אתר ההזרקה ואת ההפצה הצפויה עבור הזרקת subconjunctival הם גם לא בטווח של הציר האופטי.
השלבים הקריטיים בפרוטוקול כוללים מעקב קפדני אחר מפת הדמיה הדומה למפת העיניים המוצגת באיור 3 ותיוג מדויק של המיקומים. תיוג שגוי או סטייה ממיקום הדמיה יביאו לחוסר עקביות של התוצאות. מכיוון שניתן לכוונן את עוצמת הלייזר עבור כל סריקה, חשוב שהעוצמה תהיה עקבית כדי שהכימות של נקודות זמן שונות יהיה דומה. חשוב גם כי הבדיקה נשמרת ללא פסולת במהלך תהליך ההדמיה. כמו ריר העין יכול להיתפס על הבדיקה בעת הדמיה, שטיפה הבדיקה מלוחה מומלץ אם ערכי הרקע לעלות מעל הערך המוגדר על ידי המשתמש.
מלבד הזרקה תת-ימית, למערכת CLM זו יש גם פוטנציאל לשמש לחקר נתיבי אספקה עיניים אחרים כגון מתן טיפת עיניים והזרקה תוך-ויטמית (IVT). עם זאת, בשל המגבלה בעומק ההדמיה, זה לא יכול להיות שימושי כמו IVT אם אתר ההזרקה ורקמות עיניים עמוקות יותר הם תחומי העניין העיקריים. CLM יכול לשמש גם כצורה של הדמיה תוך וחיונית כדי ללמוד את ההתפלגות של DDS באיברים או רקמות אחרים. למרות שזה רק לעתים רחוקות הועסק כדי ללמוד הפצת DDS, מיקרוסקופיה קונפוקלי אנדוסקופית שימשה לתמונה דלקת הנגרמת על ידי חניכיים21, לפקח על דלקת ריאתית וזיהומים22,23 וההשפעה של תרופות על אנגיוגנזה בגידולים24, המציין מגוון של יישומים אפשריים אחרים עבור מערכת CLM זו.
בסך הכל, פרוטוקול זה יכול לשמש כשלב סינון כדי לגלות כיצד שינויים בניסוחי DDS משפיעים על המקום שבו הם מתגוררים או מצטברים, אשר יכול להיות קריטי בעיצוב של DDS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי מענק NTU-Northwestern של מכון ננו-רפואה (NNIN) שהוענק (ל- SV) ובחלקו על ידי מענק קרן המחקר הלאומית של סינגפור GRANT AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2 וקרן הבריאות והמדעים הביו-רפואיים של סינגפור (HBMS) מענק מימון מקדים למיצוב (IAF-PP) H18/01/a0/018 המנוהל על ידי הסוכנות למדע, טכנולוגיה ומחקר (A*STAR) (A*STAR) (ל- AMC). תודה לחברי מעבדת Duke-NUS להדמיה תרגומית ומולקולרית (LTMI) על הסיוע הלוגיסטי והביצוע של המחקרים וההכשרה על ציוד. תודה מיוחדת לגברת ויסנה נוברה על עזרתה במערכת.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
References
- Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery. Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).
- Kuo, J. C. -H., et al. Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins. Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).
- Wu, Y. -F., et al. A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).
- Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. In vivo confocal microscopy of the ocular surface. The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).
- Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system. Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).
- Sercombe, L., et al. Advances and challenges of liposome assisted drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).
- Koning, G. A., Storm, G. Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs. Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).
- Metselaar, J. M., Storm, G.
- Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium. Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).
- Hua, S., Wu, S. Y. The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies. Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).
- Sharma, A., Sharma, U. S. Liposomes in drug delivery: Progress and limitations. International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).
- Abrishami, M. M., et al. Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration. Retina. 29 (5), 699-703 (2009).
- Pleyer, U., et al. Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields. Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).
- Shen, Y., Tu, J. Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes. The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).
- Weijtens, O., et al. High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection. American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).
- Voss, K., et al. Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment. Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).
- Giarmoukakis, A., et al. Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results. Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).
- Shah, N. V., et al. Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice. Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).
- Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).
- Ezra-Elia, R., et al. Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice. Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).
- Movila, A., et al. Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis. Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).
- Vanherp, L., et al. Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice. Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).
- Chagnon, F., et al. In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs. Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).
- Yun, J. Y., et al. The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab. Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).
