Summary
Nous présentons un protocole pour l’utilisation de la microendoscopie laser confocale à fibre optique (CLM) pour étudier de manière non invasive la distribution spatio-temporelle des liposomes dans l’œil après injection sous-conjonctivale.
Abstract
L’injection sous-conjonctivale est une voie attrayante pour administrer des médicaments oculaires en raison de l’accès transscléral facile qui contourne les barrières oculaires antérieures, telles que la cornée et la conjonctive. Bien que les effets thérapeutiques et la pharmacocinétique des médicaments lors de l’injection sous-conjonctivale aient été décrits dans certaines études, très peu évaluent la distribution oculaire des médicaments ou des systèmes d’administration de médicaments (DDS). Ce dernier est essentiel pour l’optimisation de la conception du DDS intraoculaire et de la biodisponibilité du médicament afin d’obtenir la localisation oculaire souhaitée et la durée d’action (par exemple, aiguë ou prolongée). Cette étude établit l’utilisation de la microendoscopie laser confocale à fibre optique (CLM) pour étudier qualitativement la distribution oculaire des liposomes fluorescents en temps réel chez des souris vivantes après injection sous-conjonctivale. Conçu pour l’inspection visuelle in vivo des tissus au niveau microscopique, il s’agit également de la première description complète de la méthode d’imagerie CLM pour étudier la distribution spatio-temporelle des injectables dans l’œil après injection sous-conjonctivale.
Introduction
La clairance sanguine, la distribution tissulaire et l’occupation cible des médicaments dans les systèmes vivants sont des piliers pour comprendre la disposition in vivo des médicaments. Dans les modèles animaux précliniques, ces paramètres sont généralement évalués par des prélèvements sanguins et tissulaires fréquents à des moments particuliers après l’administration du médicament. Cependant, ces procédures sont généralement invasives, incluent souvent des mesures de non-survie et nécessitent de grandes cohortes d’animaux pour l’alimentation statistique. Il peut y avoir des coûts et du temps supplémentaires, ainsi que des préoccupations éthiques pour l’utilisation excessive d’animaux. En conséquence, l’imagerie non invasive devient rapidement une étape essentielle dans les études sur les biodistributions. La microendoscopie laser confocale (CLM1,2) est bien adaptée aux applications oculaires pour imager de manière non invasive la distribution spatio-temporelle des produits thérapeutiques dans les yeux d’animaux vivants avec une sensibilité et une résolution élevées1,3,4.
Le CLM a le potentiel de faciliter le dépistage robuste des systèmes d’administration de médicaments oculaires (DDS), tels que les liposomes, avant la quantification complète du DDS et la biodisponibilité des médicaments. Les liposomes sont attrayants pour leur flexibilité dans le réglage de leurs propriétés physico-chimiques et biophysiques5,6,7,8,9,10,11 pour encapsuler une grande variété de cargaisons thérapeutiques et contrôler le site tissulaire de libération du médicament et la durée d’action. Les liposomes ont été utilisés dans des applications oculaires pour l’administration de grosses molécules, telles que l’anticorps monoclonal bevacizumab12, et de petites molécules comme la cyclosporine13 et le ganciclovir14. Les liposomes chargés de médicaments ont des demi-vies biologiques plus longues et des effets thérapeutiques prolongés par rapport aux formulations non liposomiques de « médicaments libres ». Cependant, la distribution des médicaments dans le tissu oculaire est généralement extrapolée à partir des concentrations de médicaments dans les composants fluides de l’œil (c.-à-d. le sang, l’humeur aqueuse et l’humeur vitrée15,16,17). Comme le devenir initial in vivo de la cargaison de médicament chargée est défini par les propriétés du nanotransporteur lui-même, l’imagerie CLM des liposomes fluorescents peut servir de substitut au médicament pour révéler le ciblage tissulaire et les temps de résidence tissulaire in situ. En outre, les preuves visuelles de l’administration avec CLM peuvent orienter la refonte du DDS, évaluer les avantages thérapeutiques du médicament et peut-être même prédire les événements biologiques indésirables (par exemple, la toxicité tissulaire due à la localisation indésirable du DDS pendant de longues périodes).
Ici, une procédure étape par étape est détaillée sur la façon d’étudier la biodistribution oculaire des liposomes chez les souris vivantes avec un système CLM à double bande. Ce système CLM spécifique peut détecter la fluorescence bicolore (avec des lasers d’excitation vert et rouge à 488 nm et 660 nm) en temps réel, avec une fréquence de 8 images / s. En plaçant physiquement la sonde de détection sur l’œil, le protocole démontre l’acquisition d’images et l’analyse de liposomes fluorescents verts lors de l’administration sous-conjonctivale chez des souris pré-injectées par voie intraveineuse (IV) avec un colorant Evans Blue (EB) à 2%. Le colorant EB aide à visualiser les structures vascularisées dans le canal de fluorescence rouge. Nous montrons les résultats représentatifs d’une étude évaluant des liposomes neutres de 100 nm composés du phospholipide POPC (c.-à-d. 1-palmitoyl-2-oléoyl-glycero-3-phosphocholine) et dopés avec du phospholipide Fl-DHPE marqué à la fluorescéine (c.-à-d. N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glycero-3-phosphoéthanolamine) à un rapport de 95 % POPC : 5 % Fl-DHPE (Figure 1B ). Le CLM est capable de capturer les liposomes verts marqués à la fluorescéine à une résolution axiale de 15 μm et latérale de 3,30 μm par délimitation des limites des tissus oculaires colorés par EB.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de SingHealth (Singapour). Des souris femelles C57BL/6 J (âgées de 6 à 8 semaines; 18 à 20 g) ont été obtenues à InVivos, à Singapour, et logées dans un vivarium à température et à lumière contrôlées de la Duke-NUS Medical School, à Singapour. Les animaux ont été traités conformément aux lignes directrices de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.
REMARQUE : Un organigramme mettant en évidence les principales procédures est illustré à la figure 2.
1. Préparation d’agents de contraste: Evans Blue (EB) et liposomes
- Pour une solution de colorant EB à 2%, dissoudre 1 g d’EB dans 50 mL de solution saline stérile. Filtrer la solution à l’aide de filtres de 0,22 μm dans des tubes stériles de 1,5 mL et les stocker à température ambiante pour une utilisation ultérieure.
- Pour les liposomes fluorescents verts, ajouter POPC/Fl-DHPE (95:5), chloroforme/méthanol (2:1) dans une fiole à fond rond de 100 mL. Utilisez un évaporateur rotatif à 150 tr/min à 40 °C pendant 1 h, avec un vide maintenu à 0 mbar1 pour créer un film lipidique mince.
REMARQUE: Lorsque vous comparez les effets des propriétés liposomales (p. ex., taille, charge, saturation lipidique, longueur de la chaîne lipidique) sur la distribution, maintenir un pourcentage fixe de Fl-DHPE ou d’autres lipides fluorescents pour confirmer que les résultats observés sont dus à l’effet des propriétés testées et non à la charge variable de grands colorants hydrophobes. - Hydrater le film lipidique avec une solution saline tamponnée au phosphate (pour obtenir 26,3 mM de liposomes fluorescents) à 40 °C pour former des vésicules multilamellaires (MLV). Chargez les MLV dans une seringue en verre pour l’extrusion manuelle (30 fois à l’aide d’un filtre en polycarbonate de 0,08 μm de taille de pore) pour atteindre la taille souhaitée de 100 nm.
REMARQUE: La température d’hydratation doit être supérieure à la température de transition des lipides. - Filtrez les liposomes en les faisant passer à travers un filtre à seringue stérile de 0,22 μm. Confirmer le diamètre hydrodynamique (DH) des liposomes à l’aide d’un système de diffusion dynamique de la lumière.
2. Administration d’EB et de liposomes chez des souris vivantes
- Injecter à la souris l’EB IV (intraveineuse) par la veine caudale (2,5 mg/kg), 2 h avant l’injection sous-conjonctivale.
- Pour l’injection sous-conjonctivale, commencez par calmer la souris en utilisant 5% d’isoflurane par inhalation dans une chambre d’induction pour obtenir un plan d’anesthésie adéquat. Transférer la souris dans un cône de nez et maintenir la sédation à 2% -2,5% d’isoflurane sur un coussin chauffant tout au long de la procédure.
- Couper les moustaches près de l’œil à injecter et instiller une goutte d’anesthésique topique 0,5% de solution de chlorhydrate de métacaraïne directement sur l’œil.
- Charger une seringue en verre de 10 μL (avec aiguille de 32 G) avec des liposomes fluorescents (Fl-DHPE: 0,78 mg / kg) et dissiper toutes les bulles d’air dans la seringue avant l’injection.
REMARQUE: Jusqu’à 20 μL d’injectate peuvent être logés dans l’espace sous-conjonctival des souris18,19. - À l’aide d’une pince, soulevez légèrement la conjonctive et injectez lentement dans l’espace sous-conjonctival (Figure 1A). Retirez l’aiguille lentement pour éviter tout reflux. Assurez-vous qu’un bleb visible rempli de liposomes fluorescents est formé (Figure 1C).
- Administrer une goutte d’antibiotique 1% d’acide fusidique sur l’œil après l’injection et surveiller la souris jusqu’à ce qu’elle reprenne conscience.
3. Configuration du CLM
- Allumez le système CLM et assurez-vous que le connecteur et l’extrémité distale de la sonde de balayage sont propres.
- Nettoyez le connecteur de la sonde de balayage à l’aide d’un nettoyeur de connecteur optique en suivant les instructions du fabricant.
- Appuyez sur le rachet (souvent coloré) du nettoyeur de connecteur optique pour révéler un ruban de nettoyage.
- Placez le connecteur en contact avec le ruban de nettoyage et faites glisser le connecteur le long du ruban tout en maintenant le contact.
- Nettoyez l’embout distal (également appelé embout de balayage) de la sonde en le trempant dans la solution nettoyante, suivie de la solution de rinçage fournie par le fabricant. Un applicateur de pointe en coton peut également être utilisé pour un nettoyage plus approfondi si la pointe est très sale.
- Connectez la sonde au système CLM. Choisissez le champ de vision (FOV) et l’emplacement des fichiers d’acquisition à ce stade.
REMARQUE: Ajustez l’intensité du laser à cette étape pour vous assurer que la détection de fluorescence pour Fl-DHPE est dans la plage linéaire. L’intensité du laser doit rester constante pour la comparaison entre les images prises à différents moments. - Laissez le système se réchauffer pendant 15 minutes comme indiqué et utilisez le kit d’étalonnage pour calibrer le système conformément aux instructions du fabricant.
REMARQUE: Dans le kit d’étalonnage, il y a trois flacons pour chaque laser contenant les solutions suivantes: solution nettoyante, solution de rinçage et solution de fluorophore 488/660 nm pour l’étalonnage interne. Les étapes d’étalonnage sont demandées par le système et doivent être suivies en conséquence.- Immergez la pointe dans le flacon nettoyant suivi du flacon de rinçage (5 s dans chaque flacon). Laissez-le en l’air pour l’enregistrement en arrière-plan pour les deux canaux.
REMARQUE: Cette étape est très cruciale car elle normalise les valeurs d’arrière-plan des différentes fibres de la sonde et assure l’uniformité de l’image. - Immergez la pointe dans le flacon nettoyant suivi du flacon de rinçage (5 s dans chaque flacon). Immergez la pointe dans un flacon de fluorophore de 488 nm pendant 5 secondes pour normaliser les valeurs de signal de différentes fibres de la sonde.
- Immergez la pointe dans le flacon nettoyant suivi du flacon de rinçage (5 s dans chaque flacon). Immergez la pointe dans le flacon de rinçage jusqu’au signal de fluorescence enregistré au point 3.5.2. Disparaît. Plongez la pointe dans un flacon de fluorophore de 660 nm pour normaliser les valeurs de signal de différentes fibres de la sonde.
REMARQUE: Suivez toutes les étapes d’étalonnage afin d’obtenir un étalonnage correct et une qualité d’image optimale.
- Immergez la pointe dans le flacon nettoyant suivi du flacon de rinçage (5 s dans chaque flacon). Laissez-le en l’air pour l’enregistrement en arrière-plan pour les deux canaux.
- Après avoir étalonné la sonde, vérifiez que les valeurs d’arrière-plan des sondes sont aussi basses que possible. Pour le système CLM utilisé, maintenez les valeurs d’arrière-plan en dessous de 100. Effectuez un nettoyage répété de la sonde à l’aide d’un applicateur à pointe en coton et un étalonnage si les valeurs sont supérieures à 100/valeur utilisateur définie ou si la sonde semble sale. Il s’agit de s’assurer que le bruit de fond est conservé à peu près à la même valeur.
REMARQUE : Il est important de définir la valeur d’arrière-plan maximale (par exemple, 100 comme indiqué à l’étape 3.6) pour vous assurer que les conditions de la sonde sont similaires. Cela permettra une comparaison quantitative appropriée entre les images prises à différents moments. La valeur peut différer selon les systèmes et les conditions de la sonde. - Allumez le régulateur de température animal (ATC). Réglez l’ATC à 37 °C. Couvrez le coussin chauffant avec un drap chirurgical et fixez le cône de nez sur le coussin chauffant.
REMARQUE: ATC avec un coussin chauffant attaché est nécessaire pour s’assurer que l’animal est maintenu au chaud pendant toute la durée de l’imagerie. - Fixez le support du microscope à dissection sur le dessus de la table pour le fixer. Faites pivoter et ajustez l’oculaire du microscope pour voir l’œil de la souris de manière ergonomique à travers l’oculaire lorsque l’utilisateur est assis (effectuez les ajustements après avoir placé l’animal).
- Calmer la souris en utilisant 5% d’isoflurane dans une chambre à induction. Transférer la souris dans le cône du nez une fois que l’animal ne réagit pas et maintenir la sédation à 2% -2,5% d’isoflurane pendant qu’il est sur un coussin chauffant tout au long de la procédure.
- Couper les moustaches de la souris et instiller une goutte de solution anesthésique de 0,5% de chlorhydrate de métamétacine sur l’œil.
- Pour vous assurer que les yeux sont propres, laissez tomber quelques gouttes de solution saline pour laver la surface oculaire.
- Ajustez le microscope de sorte que l’œil de la souris soit en mise au point directe à un grossissement de 0,67x.
REMARQUE: Assurez-vous de lubrifier les yeux avec une solution saline. Si les yeux ne sont pas lubrifiés tout au long de la séance d’imagerie, ils peuvent devenir secs, ce qui provoque la cristallisation de la lentille. En conséquence, lors de l’imagerie CLM, la lentille peut émettre une fluorescence rouge de fond.
4. Imagerie en direct des yeux de souris avec CLM et acquisition
- Allumez le laser, placez la sonde sur l’œil et commencez à enregistrer l’acquisition pour observer la fluorescence dans l’œil aux régions indiquées sur la carte oculaire de la figure 3.
REMARQUE: Tenez la sonde comme un stylo avec l’extrémité distale de la sonde directement sur la région à imager. - Arrêtez l’enregistrement lorsque toutes les régions ont été marquées et étiquetées. Les fichiers d’acquisition seront enregistrés automatiquement à l’emplacement choisi à l’étape 3.4.
REMARQUE: Le fichier sera enregistré en tant que fichier vidéo qui peut être exporté vers des images individuelles. Étiquetez le drapeau en fonction de la carte des yeux pour connaître exactement l’emplacement de la sonde à la trame exacte où l’enregistrement a été effectué.
5. Analyse d’images
- À l’aide du même logiciel d’acquisition CLM, exportez les fichiers d’acquisition d’images pour une analyse plus approfondie. Cliquez sur File | Exportez et choisissez le format vers lequel exporter. Les fichiers au format Mkt permettront d’ajuster la table de recherche (LUT) et d’autres exportations vers des formats de fichiers image à l’aide du logiciel de visualisation CLM.
- Pour une comparaison précise de l’intensité de fluorescence, utilisez la même LUT ajustée pour chaque canal lors de l’exportation de tous les fichiers image.
REMARQUE: Choisissez le seuil de LUT minimum et maximum par rapport à ceux de la souris témoin (sans liposomes injectés) pour minimiser les lectures de fluorescence de fond. - Ouvrez l’image dans un logiciel de traitement d’image / logiciel gratuit approprié (par exemple, ImageJ). Dessinez la région d’intérêt (ROI).
REMARQUE: Le retour sur investissement fait ici référence à la région d’intérêt dans le programme de traitement. Dans la plupart des cas, le retour sur investissement sera l’ensemble de l’image numérisée. Cependant, dans le cas de l’imagerie du limbe, la sonde ne peut pas simplement obtenir l’image du limbe séparément. Par conséquent, un retour sur investissement doit être dessiné pour « quantifier » la fluorescence dans la région des limbes, comme indiqué à la figure 4. Pour que le retour sur investissement reste cohérent, utilisez le même retour sur investissement pour toutes les images. - Mesurez et enregistrez les valeurs de retour sur investissement pour la fluorescence verte. Entrez les valeurs dans une feuille de calcul. Tabulez les valeurs moyennes et d’intensité de fluorescence (a.u.) du roi.
6. Évaluation histologique
- Euthanasier la souris en utilisant une méthode approuvée par l’IACUC local.
- Énucléez l’œil et fixez l’œil dans 1 mL de solution de formaldéhyde à 4 % ou de formol à 10 % pendant la nuit.
- Coupez l’excès de graisse et incorporez l’œil dans le composé optimal de température de coupe (OCT) et conservez-le congelé dans un congélateur à -80 ° C pendant au moins un jour.
- Couper des sections de 5 μm d’épaisseur dans le cryostat avec une température de coupe maintenue à 20 °C. Transférez la section sur une lame de microscope revêtue de poly-L-lysine.
REMARQUE: L’histologie peut servir de validation supplémentaire de la distribution de DDS. Cependant, cela nécessite une optimisation supplémentaire, une expertise technique et des sacrifices d’animaux que l’étude vise à réduire en utilisant CLM.
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Representative Results
Le protocole démontre l’utilité de la CLM pour évaluer la distribution oculaire spatio-temporale des liposomes fluorescents verts administrés par injection sous-conjonctivale. Pour tirer parti de la capacité bicolore (longueurs d’onde d’excitation de 488 nm et 660 nm) du système CLM, des liposomes POPC neutres de 100 nm à injecter ont été dopés avec 5% de Fl-DHPE (les données de composition et de caractérisation sont montrées à la figure 1B), et EB a été injecté IV pour identifier les points de repère dans l’œil. La présence d’une fine couche d’épisclére et de la conjonctive, qui sont toutes deux très vascularisées, permet à la région de la sclérotique d’être colorée en rouge avec EB (Figure 4A, étiquetée comme S), tandis que la cornée qui ne contient aucun vascularisme (Figure 4A, étiquetée comme C), ne se tache pas et apparaît noire. Cela permet une différenciation distincte entre les deux régions lors de l’imagerie par fluorescence.
Les résultats représentatifs proviennent d’une étude de distribution couvrant plus de 7 jours (n = 4 souris). Comme les intensités de fluorescence dans les images des jours 1 et 3 étaient élevées (Figure 5B), les intensités en pixels ont été réduites pour une meilleure visualisation. Les valeurs réelles de l’intensité de fluorescence sont reflétées dans les graphiques (Figure 6). Pour s’assurer que les observations des images étaient dues à la fluorescence des liposomes et non à un colorant libre, qui aurait pu se déloger des liposomes, des souris témoins injectées avec du colorant fluorescéine (Fl) ont été incluses (Figure 5A).
Une réduction des liposomes (par procuration de la diminution du signal fluorescent vert) a été observée dans les régions des limbes et de la sclérotique au fil du temps. Comme les liposomes ont été injectés de la région temporale à la région supérieure de l’espace sous-conjonctival (Figure 3), ils ont été naturellement placés juste au-dessus de la sclérotique temporale et supérieure (Figure 4B) avant d’atteindre d’autres régions de l’espace sous-conjonctival. Le jour 1 après l’injection, la fluorescence détectée dans la sclérotique était jusqu’à 6 fois plus élevée que dans les limbes pour les régions temporales et supérieures (Figure 6). Au jour 3 et au jour 7, une réduction significative des liposomes a été observée dans la sclérotique (60% du jour 1 au jour 3 (jour 1→3) et 88% du jour 3 au jour 7 (jour3→7)) dans la région temporale, avec une réduction de 66% et 93% pour le jour 1→3 et le jour3→7 dans les régions supérieures, respectivement, p < 0,001) (figure 6). Cette réduction a été attribuée aux mécanismes de clairance oculaire à travers les vaisseaux sanguins et/ou lymphatiques présents au niveau de la conjonctive et de l’épisclére. Les liposomes pourraient également s’être diffusés à travers la sclérotique et être éliminés par la choroïde, qui est également très vascularisée.
Les liposomes se sont avérés s’être dégagés plus lentement dans les limbes. Pour les limbes temporaux et les limbes supérieurs, les changements dans les signaux de fluorescence du jour 1 au jour 3 après l’injection n’étaient pas significatifs, ce qui indique que les liposomes neutres ont une préférence pour la région des limbes, en particulier la périphérie cornéenne (Figure 5B). Les liposomes dans la région des limbes ont commencé à disparaître à partir du jour 3 (d3→7: -89% pour le temporal (p < 0,01) et -53% pour le supérieur (p < 0,05)). Au jour 7, plus de 90% des liposomes ont été éliminés de toutes les régions des limbes (p < 0,05) à l’exception des limbes supérieurs 1S, où 50% des liposomes pouvaient encore être détectés (p > 0,05). Cela indique que le temps de séjour des liposomes neutres est beaucoup plus élevé à la périphérie supérieure des limbes et de la cornée (figure 5 et figure 6) par rapport à d’autres régions. La plus faible quantité de fluorescence a été détectée dans les régions nasales et inférieures à tous les points temporels en raison de leur distance par rapport au site d’injection (Figure 6A, B).
Dans des études plus complètes sur la clairance des liposomes dans l’œil précédemment rapportées1, nous avons discuté de quelques voies dans lesquelles les liposomes pourraient être éliminés des tissus oculaires après une injection sous-conjonctivale. Alors que les liposomes peuvent être éliminés par la circulation systémique et la clairance lymphatique à travers la conjonctive, l’épisclére et la choroïde, qui sont très vascularisées, ils pourraient également atteindre les tissus intraoculaires plus profonds par diffusion passive à travers la sclérotique. L’écoulement de fluide pourrait également transporter les liposomes à travers le maillage trabéculaire ou l’écoulement de l’uvéosclére, ce qui peut ramener les liposomes à la sclérotique. L’élimination par les larmes est également possible, et des fuites mineures dans le site d’injection pourraient permettre la pénétration cornéenne par diffusion passive.
Figure 1 : Injection sous-conjonctivale de liposomes dans l’œil. (A) Représentation graphique des liposomes fluorescents verts et injection sous-conjonctivale. (B) Composition et propriétés de la formulation liposomale dopée au FL-DHPE pour l’imagerie CLM oculaire. (C) Liposomes fluorescents verts formant un bleb lors de l’injection sous-conjonctivale. Ce chiffre a été adapté avec la permission de Chaw S.Y. et al.1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Chronologie de la procédure CLM oculaire. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Carte oculaire pour les scans CLM. La zone 1 fait référence à la région des limbes, tandis que la zone 2 fait référence à la région de la sclérotique. Les vidéos et les images ont été prises à partir de 1T dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, suivi de 2T dans un sens anti-horaire similaire. Comme l’aiguille a été insérée pour injection de 2T vers 2S, les zones d’intérêt sont principalement 1T, 1S, 2T et 2S. Insert indique la taille de la sonde par rapport à l’œil de la souris. Ce chiffre a été adapté avec la permission de Chaw S.Y. et al.1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Analyse d’image. (A) L’analyse ImageJ des liposomes marqués par fluorescence a été effectuée à l’aide de régions d’intérêt (ROI) définies pour les régions oculaires des limbes (L) et de la sclérotique (S) (B) quantifiées à la région des limbes pour la présence de liposomes. Les emplacements possibles des liposomes détectés dans les limbes sont 1) la périphérie cornéenne, 2) le limbe ou 3) la périphérie de la sclérotique. Ce chiffre a été adapté avec la permission de Chaw S.Y. et al.1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Distributions de contraste au niveau des limbes et de la sclérotique. Distribution du contraste au niveau des limbes (1S: Supérieur, 1N: Nasal, 1I: Inférieur, 1T: Temporal) et de la sclérotique (2S: Supérieur, 2N: Nasal, 2I: Inférieur, 2T: Temporal) d’une souris représentative de chaque cohorte (n = 4) sur 7 jours pour (A) contrôle de la fluorescéine (Fl), (B) liposomes neutres de 100 nm (POPC-100). La couleur rouge indique une coloration EB. Barre d’échelle = 50 μm. (C) Les images prises sont assemblées sur la carte des yeux pour une meilleure compréhension. Ce chiffre a été adapté avec la permission de Chaw S.Y. et al.1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Cinétique de clairance des liposomes POPC neutres de 100 nm dans les régions de la sclérotique (A) et des limbes (B) sur 7 jours (n = 4 souris par groupe). L’intensité moyenne de fluorescence a été comparée par ANOVA à 2 voies avec des comparaisons multiples par rapport au point de temps précédent; d1→3 et d3→7; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Images histologiques représentatives de coupes transversales (5 μm) de l’œil de souris un jour après l’injection de liposomes Fl-DHPE. Les lignes pointillées indiquent où les liposomes peuvent être observés, indiqués par la couleur verte. Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Comme le montrent les résultats, CLM fournit une méthode simple et réalisable pour imager la distribution oculaire des liposomes dans l’œil. Nous avons déjà démontré l’utilisation du CLM pour caractériser la localisation de diverses formulations liposomales dans l’œil de la souris au fil du temps1. Pour les applications non invasives, le CLM permet une imagerie en temps réel de la surface oculaire antérieure pour mieux comprendre comment les liposomes sont distribués dans l’œil à partir du même animal. Cela rend le CLM adapté au pré-criblage de nanotransporteurs/DDS avant une quantification plus complète. Compte tenu des propriétés physiochimiques uniques de divers DDS, il est plutôt difficile de caractériser sa distribution sous-compartiment par histologie conventionnelle. Ce dernier nécessiterait une section exhaustive de l’ensemble de l’œil et des sections d’imagerie individuelles par microscopie à fluorescence pour une vue d’ensemble de la clairance DDS.
En accord avec les images CLM (Figure 5B,C), nous avons pu observer des signaux fluorescents verts par histologie au niveau des régions de la cornée, des limbes et de la sclérotique de l’œil prélevés au jour 1 après l’injection des liposomes (Figure 7). Notamment, le CLM a montré une meilleure sensibilité que la microscopie fluorescente - les liposomes au niveau de la sclérotique pouvaient être clairement détectés à l’aide du CLM (Figure 5) mais à peine détectés par le microscope à fluorescence (Figure 7). La perte de signal pourrait être due aux procédures de lavage et de sectionnement qui ont affecté la rétention des liposomes dans les sections de tissus. Bien que le CLM soit limité dans l’identification de la couche tissulaire exacte dans laquelle les liposomes s’accumulent, il s’agit certainement d’une méthode réalisable et relativement simple pour dépister et évaluer les thérapies oculaires candidates de manière non invasive en temps réel.
Bien que d’autres systèmes d’imagerie tels que les systèmes d’imagerie in vivo et les fluoromètres permettent également l’imagerie en direct ou la quantification en direct de la fluorescence dans l’œil, ils ne conviennent pas aussi bien aux fins de cette étude. Les systèmes d’imagerie in vivo n’offrent pas la résolution spatiale nécessaire pour définir où se trouvent les thérapies dans l’espace oculaire. On ne peut qu’avoir une idée de la présence des produits thérapeutiques dans l’espace oculaire et de leur biodistribution lors de l’utilisation d’un système d’imagerie in vivo20. Un fluoromètre permet de mesurer la fluorescence le long de l’axe optique de l’œil et est largement utilisé pour étudier les changements physiologiques dans l’œil. Comme il est difficile d’obtenir exactement le même axe optique scanné à chaque point temporel, un point d’imagerie cohérent ne peut pas être maintenu. Ceci est très crucial, en particulier lors de l’étude de la distribution des systèmes d’administration de médicaments dans lesquels leur temps de séjour et leur taux de clairance du site d’injection sont totalement inconnus. De plus, le site d’injection et la distribution attendue pour l’injection sous-conjonctivale ne sont pas non plus dans la plage de l’axe optique.
Les étapes critiques du protocole comprennent le suivi strict d’une carte d’imagerie similaire à la carte oculaire illustrée à la figure 3 et l’étiquetage précis des emplacements. Un étiquetage erroné ou un écart par rapport à l’emplacement de l’imagerie entraînerait une incohérence des résultats. Comme l’intensité du laser peut être ajustée pour chaque balayage, il est important que l’intensité soit cohérente pour que la quantification des différents points temporels soit comparable. Il est également important que la sonde soit exempte de débris pendant le processus d’imagerie. Comme le mucus oculaire peut se coincer sur la sonde lors de l’imagerie, il est recommandé de rincer la sonde dans une solution saline si les valeurs de fond dépassent la valeur définie par l’utilisateur.
Outre l’injection sous-conjonctivale, ce système CLM a également le potentiel d’être utilisé pour étudier d’autres voies d’administration oculaire telles que l’administration de gouttes oculaires et l’injection intravitréenne (IVT). Cependant, en raison de la limitation de la profondeur d’imagerie, il pourrait ne pas être aussi utile pour la TIV si le site d’injection et les tissus oculaires plus profonds sont les principaux domaines d’intérêt. Le CLM peut également être utilisé comme une forme d’imagerie intravitale pour étudier la distribution de DDS dans d’autres organes ou tissus. Bien qu’elle ait rarement été utilisée pour étudier la distribution du DDS, la microscopie confocale endoscopique a été utilisée pour imager l’inflammation causée par la parodontite21, surveiller l’inflammation pulmonaire et les infections22,23 et l’effet des médicaments sur l’angiogenèse dans les tumeurs24, indiquant une gamme d’autres applications possibles pour ce système CLM.
Dans l’ensemble, ce protocole pourrait servir d’étape de dépistage pour déterminer comment les modifications apportées aux formulations de DDS affectent l’endroit où elles résident ou s’accumulent, ce qui pourrait être essentiel dans la conception d’une DDS.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par la subvention NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) accordée (à SV) et en partie par la subvention AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2 et la subvention H18/01/01/01/01/01/018 de l’Agence pour la science, la technologie et la recherche (A*STAR) de Singapour (A*STAR) (à AMC). Merci aux membres du Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) d’avoir facilité la logistique et l’exécution des études et de la formation sur les équipements. Un merci spécial à Mme Wisna Novera pour son aide éditoriale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
References
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