Summary
Presentiamo un protocollo per l'utilizzo della microscopia laser confocale a fibre ottiche (CLM) per studiare in modo non invasivo la distribuzione spazio-temporale dei liposomi nell'occhio dopo iniezione subcongiuntivale.
Abstract
L'iniezione subcongiuntivale è una via interessante per somministrare farmaci oculari a causa del facile accesso trans-sclerale che bypassa le barriere oculari anteriori, come la cornea e la congiuntiva. Mentre gli effetti terapeutici e la farmacocinetica dei farmaci dopo iniezione subcongiuntivale sono stati descritti in alcuni studi, pochissimi valutano la distribuzione oculare dei farmaci o dei sistemi di somministrazione dei farmaci (DDS). Quest'ultimo è fondamentale per l'ottimizzazione della progettazione della DDS intraoculare e della biodisponibilità del farmaco per ottenere la localizzazione oculare desiderata e la durata dell'azione (ad esempio, acuta contro prolungata). Questo studio stabilisce l'uso della microscopia laser confocale a fibre ottiche (CLM) per studiare qualitativamente la distribuzione oculare dei liposomi fluorescenti in tempo reale in topi vivi dopo iniezione sub-congiuntivale. Essendo progettato per l'ispezione visiva in vivo dei tessuti a livello microscopico, questa è anche la prima descrizione completa del metodo di imaging CLM per studiare la distribuzione spazio-temporale degli iniettabili nell'occhio dopo iniezione subcongiuntivale.
Introduction
La clearance del sangue, la distribuzione dei tessuti e l'occupazione target dei farmaci nei sistemi viventi sono pilastri per comprendere la disposizione dei farmaci in vivo. Nei modelli animali preclinici, questi parametri sono tipicamente valutati mediante frequenti campionamenti di sangue e tessuti in particolari momenti successivi alla somministrazione del farmaco. Tuttavia, queste procedure sono generalmente invasive, spesso includono misurazioni di non sopravvivenza e richiedono grandi coorti di animali per l'alimentazione statistica. Potrebbero esserci costi e tempi aggiuntivi sostenuti, insieme a preoccupazioni etiche per l'uso eccessivo di animali. Di conseguenza, l'imaging non invasivo sta rapidamente diventando un passo fondamentale negli studi di biodistribuzione. La microscopia laser confocale (CLM1,2) è adatta per applicazioni oculari per l'immagine non invasiva della distribuzione spazio-temporale delle terapie negli occhi di animali vivi ad alta sensibilità e alta risoluzione1,3,4.
Il CLM ha il potenziale per facilitare uno screening robusto dei sistemi di somministrazione oculare dei farmaci (DDS), come i liposomi, prima della quantificazione completa della DDS e della biodisponibilità dei farmaci. I liposomi sono attraenti per la loro flessibilità nel sintonizzare le loro proprietà fisico-chimiche e biofisiche5,6,7,8,9,10,11 per incapsulare una grande varietà di carico terapeutico e controllare il sito tissutale di rilascio del farmaco e la durata dell'azione. I liposomi sono stati utilizzati in applicazioni oculari per la somministrazione di grandi molecole, come l'anticorpo monoclonale bevacizumab12, e piccole molecole come la ciclosporina13 e il ganciclovir14. I liposomi caricati con farmaci hanno emivite biologiche più lunghe ed effetti terapeutici prolungati rispetto alle formulazioni "free drug" non liposomiali. Tuttavia, la distribuzione del farmaco nel tessuto oculare è tipicamente estrapolata dalle concentrazioni di farmaco nei componenti fluidi dell'occhio (cioè sangue, umore acqueo e umore vitreo15,16,17). Poiché il destino iniziale in vivo del carico di farmaci caricato è definito dalle proprietà del nanovettore stesso, l'imaging CLM dei liposomi fluorescenti può servire come surrogato del farmaco per rivelare il targeting dei tessuti e i tempi di permanenza dei tessuti in situ. Inoltre, l'evidenza visiva della somministrazione con CLM può guidare la riprogettazione della DDS, valutare i benefici terapeutici del farmaco e forse anche prevedere eventi biologici avversi (ad esempio, tossicità tissutale dovuta alla localizzazione indesiderata della DDS per periodi di tempo prolungati).
Qui, una procedura passo-passo è dettagliata su come studiare la biodistribuzione oculare dei liposomi in topi vivi con un sistema CLM a doppia banda. Questo specifico sistema CLM è in grado di rilevare la fluorescenza bicolore (con laser di eccitazione verde e rosso a 488 nm e 660 nm) in tempo reale, con una frequenza di 8 fotogrammi/s. Posizionando fisicamente la sonda di rilevamento sull'occhio, il protocollo dimostra l'acquisizione e l'analisi delle immagini dei liposomi verde-fluorescenti dopo somministrazione subcongiuntivale in topi pre-iniettati per via endovenosa (IV) con colorante Evans Blue (EB) al 2%. Il colorante EB aiuta a visualizzare le strutture vascolarizzate nel canale di fluorescenza rossa. Mostriamo risultati rappresentativi da uno studio che valuta i liposomi neutri a 100 nm composti dal fosfolipide POPC (cioè 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina) e drogati con fosfolipide Fl-DHPE marcato con fluoresceina (cioè N-(fluoresceina-5-tiocarbamoil)-1,2-diesa-decanoil-glicero-glicero-3-fosfoetanolammina) con un rapporto del 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Figura 1B ). CLM è in grado di catturare i liposomi verdi marcati con fluoresceina a 15 μm assiale e 3,30 μm di risoluzione laterale delineando i confini del tessuto oculare colorato con EB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) di SingHealth (Singapore). Topi femminili C57BL / 6 J (6- 8 settimane di età; 18-20 g) sono stati ottenuti da InVivos, Singapore, e alloggiati in un vivaio a temperatura e luce controllata della Duke-NUS Medical School, Singapore. Gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida della dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva.
NOTA: nella Figura 2 è riportato un diagramma di flusso che evidenzia le procedure principali.
1. Preparazione di mezzi di contrasto: Evans Blue (EB) e liposomi
- Per la soluzione colorante EB al 2%, sciogliere 1 g di EB in 50 ml di soluzione salina sterile. Filtrare la soluzione utilizzando filtri da 0,22 μm in tubi sterili da 1,5 ml e conservarli a temperatura ambiente per un uso successivo.
- Per i liposomi verde-fluorescenti, aggiungere POPC/Fl-DHPE (95:5), cloroformio/metanolo (2:1) in un matraccio a fondo tondo da 100 ml. Utilizzare un evaporatore rotativo a 150 giri/min a 40 °C per 1 ora, con vuoto mantenuto a 0 mbar1 per creare un film lipidico sottile.
NOTA: Quando si confrontano gli effetti delle proprietà liposomiali (ad esempio, dimensioni, carica, saturazione lipidica, lunghezza della catena lipidica) sulla distribuzione, mantenere una percentuale fissa di Fl-DHPE o altri lipidi fluorescenti per confermare che i risultati osservati sono dovuti all'effetto delle proprietà testate e non al carico variabile di coloranti idrofobici di grandi dimensioni. - Idratare il film lipidico con soluzione salina tamponata con fosfato (per ottenere 26,3 mM di liposomi fluorescenti) a 40 °C per formare vescicole multilamellari (MLV). Caricare gli MLV in una siringa di vetro per l'estrusione manuale (30 volte utilizzando un filtro in policarbonato di dimensioni dei pori di 0,08 μm) per ottenere la dimensione desiderata di 100 nm.
NOTA: La temperatura per l'idratazione deve essere superiore alla temperatura di transizione dei lipidi. - Filtrare i liposomi facendoli passare attraverso un filtro a siringa sterile da 0,22 μm. Confermare il diametro idrodinamico (DH) dei liposomi utilizzando un sistema di diffusione dinamica della luce.
2. Somministrazione di EB e liposomi in topi vivi
- Iniettare nel topo EB IV (per via endovenosa) attraverso la vena della coda (2,5 mg/kg), 2 ore prima dell'iniezione subcongiuntivale.
- Per l'iniezione subcongiuntivale, in primo luogo, sedare il topo usando il 5% di isoflurano per inalazione in una camera di induzione per ottenere un piano di anestesia adeguato. Trasferire il mouse in un cono nasale e mantenere la sedazione al 2% -2,5% di isoflurano mentre si è su una piastra riscaldante durante la procedura.
- Tagliare i baffi vicino all'occhio da iniettare e infondere una goccia di anestetico topico soluzione di proxymetacaina cloridrato allo 0,5% direttamente sull'occhio.
- Caricare una siringa di vetro da 10 μL (con ago da 32 G) con liposomi fluorescenti (Fl-DHPE: 0,78 mg/kg) e dissipare tutte le bolle d'aria nella siringa prima dell'iniezione.
NOTA: Fino a 20 μL di iniettato possono essere alloggiati nello spazio subcongiuntivale dei topi18,19. - Usando una pinzetta, sollevare leggermente la congiuntiva e iniettare lentamente nello spazio subcongiuntivale (Figura 1A). Prelevare l'ago lentamente per evitare il riflusso. Assicurarsi che si formi un bleb visibile pieno di liposomi fluorescenti (Figura 1C).
- Somministrare una goccia di antibiotico acido fusidico all'1% sull'occhio dopo l'iniezione e monitorare il topo fino a quando non riprende conoscenza.
3. Configurazione CLM
- Accendere il sistema CLM e assicurarsi che sia il connettore che la punta distale della sonda di scansione siano puliti.
- Pulire il connettore della sonda di scansione utilizzando un detergente per connettori ottici seguendo le istruzioni del produttore.
- Premere il rachet (spesso colorato) del detergente del connettore ottico per rivelare un nastro di pulizia.
- Posizionare il connettore a contatto con il nastro di pulizia e far scorrere il connettore lungo il nastro mantenendo il contatto.
- Pulire la punta distale (nota anche come punta di scansione) della sonda immergendola nella soluzione detergente, seguita dalla soluzione di risciacquo fornita dal produttore. Un applicatore di punta in cotone può anche essere utilizzato per una pulizia più accurata se la punta è molto sporca.
- Collegare la sonda al sistema CLM. Scegliere il campo visivo (FOV) e la posizione per i file di acquisizione a questo punto.
NOTA: regolare l'intensità del laser in questa fase per garantire che il rilevamento della fluorescenza per Fl-DHPE sia nell'intervallo lineare. L'intensità del laser deve essere mantenuta coerente per il confronto tra immagini scattate in diversi punti temporali. - Lasciare riscaldare il sistema per 15 minuti come indicato e utilizzare il kit di calibrazione per calibrare il sistema secondo le istruzioni del produttore.
NOTA: Nel kit di calibrazione sono presenti tre flaconcini per ogni laser contenenti le seguenti soluzioni: soluzione detergente, soluzione di risciacquo e soluzione di fluoroforo 488/660 nm per la calibrazione interna. Le fasi di calibrazione sono richieste dal sistema e devono essere seguite di conseguenza.- Immergere la punta nel flaconcino detergente seguito dal flaconcino di risciacquo (5 s in ogni flaconcino). Lascialo in aria per la registrazione in background per entrambi i canali.
NOTA: questo passaggio è molto cruciale in quanto normalizza i valori di sfondo da diverse fibre della sonda e garantisce l'uniformità dell'immagine. - Immergere la punta nel flaconcino detergente seguito dal flaconcino di risciacquo (5 s in ogni flaconcino). Immergere la punta in un flaconcino di fluoroforo da 488 nm per 5 secondi per normalizzare i valori del segnale da diverse fibre nella sonda.
- Immergere la punta nel flaconcino detergente seguito dal flaconcino di risciacquo (5 s in ogni flaconcino). Immergere la punta nel flaconcino di risciacquo fino al segnale di fluorescenza registrato al punto 3.5.2. Scompare. Immergere la punta in un flaconcino di fluoroforo da 660 nm per normalizzare i valori del segnale da diverse fibre nella sonda.
NOTA: seguire tutte le fasi di calibrazione per ottenere una calibrazione corretta e una qualità dell'immagine ottimale.
- Immergere la punta nel flaconcino detergente seguito dal flaconcino di risciacquo (5 s in ogni flaconcino). Lascialo in aria per la registrazione in background per entrambi i canali.
- Dopo aver calibrato la sonda, verificare che i valori di sfondo per le sonde siano il più bassi possibile. Per il sistema CLM utilizzato, mantenere i valori di sfondo al di sotto di 100. Eseguire la pulizia ripetuta della sonda con un applicatore a punta di cotone e la calibrazione se i valori sono superiori a 100 / valore utente definito o se la sonda sembra essere sporca. Questo per garantire che il rumore di fondo sia mantenuto intorno allo stesso valore.
NOTA: è importante definire il valore di sfondo massimo (ad esempio, 100 come indicato nel passaggio 3.6) per garantire che le condizioni della sonda siano simili. Ciò consentirà un corretto confronto quantitativo tra immagini scattate in diversi punti temporali. Il valore può differire in diversi sistemi e condizioni della sonda. - Accendere il regolatore di temperatura animale (ATC). Regolare l'ATC a 37 °C. Coprire la piastra riscaldante con un telo chirurgico e fissare il cono del naso sulla piastra riscaldante.
NOTA: l'ATC con una piastra riscaldante collegata è necessario per garantire che l'animale sia tenuto al caldo per tutta la durata dell'imaging. - Fissare il supporto del microscopio di dissezione al piano del tavolo per fissarlo. Ruotare e regolare l'oculare del microscopio per visualizzare ergonomicamente l'occhio del mouse attraverso l'oculare quando l'utente è seduto (effettuare le regolazioni dopo aver posizionato l'animale).
- Sedare il mouse usando il 5% di isoflurano in una camera di induzione. Trasferire il mouse al cono del naso una volta che l'animale non risponde e mantenere la sedazione al 2% -2,5% di isoflurano mentre si trova su una piastra riscaldante durante la procedura.
- Tagliare i baffi del topo e instillare una goccia di soluzione anestetica di proxymetacaina cloridrato allo 0,5% sull'occhio.
- Per assicurarsi che gli occhi siano puliti, lasciare cadere alcune gocce di soluzione salina per lavare la superficie oculare.
- Regolare il microscopio in modo che l'occhio del mouse sia a fuoco diretto con un ingrandimento di 0,67x.
NOTA: Assicurarsi di lubrificare gli occhi con soluzione salina. Se gli occhi non sono lubrificati durante la sessione di imaging, possono asciugarsi, causando la cristallizzazione della lente. Di conseguenza, durante l'imaging CLM, l'obiettivo può emettere una fluorescenza rossa di fondo.
4. Imaging dal vivo degli occhi di topo con CLM e acquisizione
- Accendere il laser, posizionare la sonda sull'occhio e iniziare a registrare l'acquisizione per osservare la fluorescenza nell'occhio nelle regioni indicate sulla mappa oculare nella Figura 3.
NOTA: tenere la sonda come una penna con l'estremità distale della sonda direttamente sulla regione da visualizzare. - Interrompere la registrazione quando tutte le regioni sono state contrassegnate ed etichettate. I file di acquisizione verranno salvati automaticamente nella posizione del file scelta nel passaggio 3.4.
NOTA: Il file verrà salvato come file video che può essere esportato in singole immagini. Etichettare la bandiera in base alla mappa oculare per conoscere esattamente la posizione della sonda nel fotogramma esatto in cui è stata eseguita la registrazione.
5. Analisi delle immagini
- Utilizzando lo stesso software di acquisizione CLM, esportare i file di acquisizione delle immagini per ulteriori analisi. Clicca su File | Esporta e scegli il formato in cui esportare. I file in formato MKT consentiranno regolazioni della tabella di ricerca (LUT) e ulteriori esportazioni in formati di file immagine utilizzando il software di visualizzazione CLM.
- Per un confronto accurato dell'intensità di fluorescenza, utilizzare la stessa LUT regolata per ciascun canale durante l'esportazione di tutti i file di immagine.
NOTA: Scegliere la soglia minima e massima LUT rispetto a quelle del mouse di controllo (senza liposomi iniettati) per ridurre al minimo le letture di fluorescenza di fondo. - Aprire l'immagine in un software di elaborazione delle immagini appropriato / programma freeware (ad esempio, ImageJ). Disegna la regione di interesse (ROI).
NOTA: il ROI qui si riferisce alla regione di interesse nel programma di elaborazione. Nella maggior parte dei casi, il ROI sarà l'intera immagine scansionata. Tuttavia, nel caso dell'imaging del limbus, la sonda non può semplicemente ottenere l'immagine del limbus separatamente. Pertanto, è necessario disegnare un ROI per "quantificare" la fluorescenza nella regione del limbus, come disegnato nella Figura 4. Per mantenere coerente il ROI, utilizza lo stesso ROI su tutte le immagini. - Misura e registra i valori di ROI per la fluorescenza verde. Immettere i valori in un foglio di calcolo. Tabulare i valori medi e di intensità di fluorescenza (u.a.) del ROI.
6. Valutazione istologica
- Eutanasia del mouse utilizzando un metodo approvato dalla IACUC locale.
- Enucleare l'occhio e fissare l'occhio in 1 mL di soluzione di formaldeide al 4% o formalina al 10% durante la notte.
- Tagliare i grassi in eccesso e incorporare l'occhio nel composto OCT (Optimal Cutting Temperature) e tenerlo congelato in un congelatore a -80 °C per almeno un giorno.
- Tagliare sezioni di spessore 5 μm nel criostato con temperatura di taglio mantenuta a 20 °C. Trasferire la sezione su un vetrino per microscopio rivestito con Poly-L-Lysine.
NOTA: l'istologia può servire come ulteriore convalida della distribuzione di DDS. Tuttavia, richiede ulteriore ottimizzazione, competenza tecnica e sacrificio di animali che lo studio mira a ridurre utilizzando CLM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il protocollo dimostra l'utilità della LMC per valutare la distribuzione oculare spazio-temporale dei liposomi fluorescenti verdi somministrati attraverso l'iniezione subcongiuntivale. Per sfruttare la capacità a doppio colore (lunghezze d'onda di eccitazione di 488 nm e 660 nm) del sistema CLM, i liposomi POPC neutri da 100 nm da iniettare sono stati drogati con il 5% di Fl-DHPE (i dati di composizione e caratterizzazione sono mostrati nella Figura 1B) e EB è stato iniettato IV per identificare i punti di riferimento nell'occhio. La presenza di un sottile strato di episclera e della congiuntiva, entrambi altamente vascolarizzati, permette di colorare di rosso la regione della sclera con EB (Figura 4A, etichettata come S), mentre la cornea che non contiene alcuna vascolarizzazione (Figura 4A, etichettata come C), non si macchia e appare nera. Ciò consente una netta differenziazione tra le due regioni durante l'imaging a fluorescenza.
I risultati rappresentativi provengono da uno studio di distribuzione che si estende su 7 giorni (n = 4 topi). Poiché le intensità di fluorescenza nelle immagini per il giorno 1 e il giorno 3 erano elevate (Figura 5B), le intensità dei pixel sono state ridotte per una migliore visualizzazione. I valori effettivi dell'intensità di fluorescenza si riflettono nei grafici (Figura 6). Per garantire che le osservazioni delle immagini fossero dovute alla fluorescenza dei liposomi e al colorante non libero, che potrebbe essere stato rimosso dai liposomi, sono stati inclusi topi di controllo iniettati con colorante fluoresceina (Fl) (Figura 5A).
Una riduzione dei liposomi (per procura della diminuzione del segnale fluorescente verde) è stata osservata nel tempo sia nella regione del limbus che della sclera. Poiché i liposomi sono stati iniettati dalla regione temporale alla regione superiore dello spazio subcongiuntivale (Figura 3), sono stati naturalmente posizionati proprio sopra la sclera temporale e superiore (Figura 4B) prima di raggiungere altre regioni dello spazio subcongiuntivale. Il giorno 1 dopo l'iniezione, la fluorescenza rilevata nella sclera era fino a 6 volte superiore al limbus sia per le regioni temporali che per quelle superiori (Figura 6). Entro il giorno 3 e il giorno 7, è stata osservata una significativa riduzione dei liposomi nella sclera (60% dal giorno 1 al giorno 3 (giorno 1→3) e 88% dal giorno 3 al giorno 7 (giorno3→7)) nella regione temporale, con una riduzione del 66% e del 93% per il giorno1→3 e il giorno3→7 nelle regioni superiori, rispettivamente, p < 0,001) (Figura 6). Questa riduzione è stata attribuita ai meccanismi di clearance oculare attraverso i vasi sanguigni e/o linfatici presenti nella congiuntiva e nell'episclera. I liposomi potrebbero anche essersi diffusi attraverso la sclera ed essere eliminati dalla coroide, che è anche altamente vascolarizzata.
Si è scoperto che i liposomi si sono eliminati in modo più lento nel limbus. Per il limbus temporale e il limbus superiore, i cambiamenti nei segnali di fluorescenza dal giorno 1 al giorno 3 post-iniezione non sono stati significativi, indicando che i liposomi neutri hanno una preferenza per la regione del limbus, in particolare la periferia corneale (Figura 5B). I liposomi nella regione del limbus hanno iniziato a schiarirsi dal giorno 3 (d3→7: -89% per il temporale (p < 0,01) e -53% per superiore (p < 0,05)). Al giorno 7, oltre il 90% dei liposomi è stato eliminato da tutte le regioni del limbus (p < 0,05) ad eccezione del limbus superiore 1S, dove il 50% dei liposomi poteva ancora essere rilevato (p > 0,05). Questa è un'indicazione che il tempo di permanenza per i liposomi neutri è molto più alto alla periferia superiore del limbus / cornea (Figura 5 e Figura 6) rispetto ad altre regioni. La quantità più bassa di fluorescenza è stata rilevata nelle regioni nasali e inferiori in tutti i punti temporali a causa della loro distanza dal sito di iniezione (Figura 6A, B).
In studi più completi sulla clearance dei liposomi nell'occhio precedentemente riportati1, abbiamo discusso alcune vie in cui i liposomi potrebbero essere eliminati dai tessuti oculari dopo iniezione subcongiuntivale. Mentre i liposomi possono essere eliminati dalla circolazione sistemica e dalla clearance linfatica attraverso la congiuntiva, l'episclera e la coroide, che sono altamente vascolarizzate, potrebbero anche raggiungere i tessuti intraoculari più profondi mediante diffusione passiva attraverso la sclera. Il flusso di fluido potrebbe anche trasportare i liposomi attraverso la rete trabecolare o il deflusso dell'uveosclera, che può riportare i liposomi alla sclera. È anche possibile l'eliminazione attraverso le lacrime e piccole perdite nel sito di iniezione potrebbero consentire la penetrazione corneale attraverso la diffusione passiva.
Figura 1: Iniezione subcongiuntivale di liposomi nell'occhio. (A) Rappresentazione grafica di liposomi verde-fluorescenti e iniezione subcongiuntivale. (B) Composizione e proprietà della formulazione liposomiale drogata FL-DHPE per l'imaging CLM oculare. (C) Liposomi verde-fluorescenti che formano un bleb dopo iniezione subcongiuntivale. Questa figura è stata adattata con il permesso di Chaw S.Y. et al.1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Cronologia della procedura CLM oculare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Mappa oculare per le scansioni CLM. L'area 1 si riferisce alla regione del limbus, mentre l'area 2 si riferisce alla regione della sclera. Video e immagini sono stati ripresi da 1T in senso antiorario, seguito da 2T in una direzione antiorario simile. Poiché l'ago è stato inserito per iniezione da 2T a 2S, le aree di interesse sono principalmente 1T, 1S, 2T e 2S. Inserisci mostra la dimensione della sonda rispetto all'occhio del mouse. Questa figura è stata adattata con il permesso di Chaw S.Y. et al.1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi delle immagini. (A) L'analisi ImageJ dei liposomi con tag fluorescenti è stata effettuata utilizzando le regioni di interesse (ROI) definite per le regioni limbus (L) e sclera (S) (B) Ocular quantificate nella regione limbus per la presenza di liposomi. Le possibili posizioni dei liposomi rilevati nel limbus sono 1) periferia corneale, 2) limbus o 3) periferia sclera. Questa figura è stata adattata con il permesso di Chaw S.Y. et al.1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Distribuzioni di contrasto al limbus e alla sclera. Distribuzione del contrasto al limbus (1S: Superior, 1N: Nasale, 1I: Inferiore, 1T: Temporale) e sclera (2S: Superior, 2N: Nasale, 2I: Inferiore, 2T: Temporale) regioni di un topo rappresentativo di ciascuna coorte (n = 4) per 7 giorni per (A) controllo della fluoresceina (Fl), (B) 100 nm liposomi neutri (POPC-100). Il colore rosso indica la colorazione EB. Barra della scala = 50 μm. (C) Le immagini scattate sono assemblate sulla mappa oculare per una migliore comprensione. Questa figura è stata adattata con il permesso di Chaw S.Y. et al.1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Cinetica di clearance dei liposomi POPC neutri a 100 nm nelle regioni sclera (A) e limbus (B) nell'arco di 7 giorni (n=4 topi per gruppo). L'intensità media di fluorescenza è stata confrontata da ANOVA a 2 vie con confronti multipli rispetto al punto temporale precedente; d1→3 e d3→7; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Immagini istologiche rappresentative di sezioni trasversali (5 μm) dell'occhio di topo un giorno dopo l'iniezione di liposomi Fl-DHPE. Le linee tratteggiate indicano dove si possono osservare i liposomi, indicati dal colore verde. Barra della scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Come mostrato dai risultati, CLM fornisce un metodo semplice e fattibile per visualizzare la distribuzione oculare dei liposomi nell'occhio. In precedenza abbiamo dimostrato l'uso della LMC per caratterizzare la localizzazione di varie formulazioni liposomiali all'interno dell'occhio del topo nel tempo1. Per le applicazioni non invasive, CLM consente l'imaging in tempo reale della superficie oculare anteriore per approfondimenti su come i liposomi sono distribuiti nell'occhio dallo stesso animale. Ciò rende CLM adatto al pre-screening di nanocarrier/DDS prima di una quantificazione più completa. Date le proprietà fisiochimiche uniche di diversi DDS, è piuttosto difficile caratterizzare la sua distribuzione sotto-compartimentale mediante l'istologia convenzionale. Quest'ultimo richiederebbe un sezionamento esaustivo dell'intero occhio e delle singole sezioni di imaging mediante microscopia a fluorescenza per un senso generale della clearance DDS.
In accordo con le immagini CLM (Figura 5B,C), abbiamo potuto osservare segnali fluorescenti verdi mediante istologia alle regioni corneali, limbus e sclera dell'occhio raccolte al giorno 1 post-iniezione dei liposomi (Figura 7). In particolare, la LMC ha mostrato una sensibilità migliore rispetto alla microscopia fluorescente: i liposomi della sclera potevano essere chiaramente rilevati utilizzando il LMC (Figura 5) ma appena rilevati dal microscopio a fluorescenza (Figura 7). La perdita di segnale potrebbe essere dovuta alle procedure di lavaggio e sezionamento che hanno influenzato la ritenzione di liposomi nelle sezioni tissutali. Sebbene la LMC sia limitata nell'individuare l'esatto strato tissutale in cui si accumulano i liposomi, è sicuramente un metodo fattibile e relativamente semplice per lo screening e la valutazione delle terapie oculari candidate in modo non invasivo in tempo reale.
Mentre altri sistemi di imaging come i sistemi di imaging in vivo e i fluorometri consentono anche l'imaging dal vivo o la quantificazione dal vivo della fluorescenza nell'occhio, non sono adatti allo scopo di questo studio. I sistemi di imaging in vivo non offrono la risoluzione spaziale necessaria per definire dove si trovano le terapie nello spazio oculare. Si può solo avere un'idea se le terapie sono ancora presenti nello spazio oculare e la loro biodistribuzione quando si utilizza il sistema di imaging in vivo20. Un fluorometro consente la misurazione della fluorescenza lungo l'asse ottico dell'occhio ed è ampiamente utilizzato per studiare i cambiamenti fisiologici nell'occhio. Poiché vi è difficoltà a ottenere la scansione dello stesso asse ottico in ogni punto temporale, non è possibile mantenere un punto di imaging coerente. Questo è molto importante, soprattutto quando si studia la distribuzione dei sistemi di somministrazione dei farmaci in cui il loro tempo di residenza e il tasso di clearance dal sito di iniezione sono totalmente sconosciuti. Inoltre, anche il sito di iniezione e la distribuzione prevista per l'iniezione subcongiuntivale non rientrano nell'intervallo dell'asse ottico.
I passaggi critici nel protocollo includono seguire rigorosamente una mappa di imaging simile alla mappa oculare mostrata nella Figura 3 ed etichettare le posizioni in modo accurato. L'errata etichettatura o la deviazione dalla posizione di imaging comporterebbero l'incoerenza dei risultati. Poiché l'intensità del laser può essere regolata per ogni scansione, è importante che l'intensità sia coerente affinché la quantificazione di diversi punti temporali sia comparabile. È anche importante che la sonda sia mantenuta priva di detriti durante il processo di imaging. Poiché il muco oculare può essere catturato sulla sonda durante l'imaging, si consiglia di risciacquare la sonda in soluzione salina se i valori di fondo superano il valore definito dall'utente.
Oltre all'iniezione subcongiuntivale, questo sistema CLM ha anche il potenziale per essere utilizzato per studiare altre vie di consegna oculare come la somministrazione di collirio e l'iniezione intravitreale (IVT). Tuttavia, a causa della limitazione della profondità di imaging, potrebbe non essere così utile per iVT se il sito di iniezione e i tessuti oculari più profondi sono le principali aree di interesse. CLM può anche essere utilizzato come una forma di imaging intravitale per studiare la distribuzione di DDS in altri organi o tessuti. Sebbene sia stato raramente impiegato per studiare la distribuzione della DDS, la microscopia confocale endoscopica è stata utilizzata per visualizzare l'infiammazione causata dalla parodontite21, monitorare l'infiammazione polmonare e le infezioni22,23 e l'effetto dei farmaci sull'angiogenesi nei tumori24, indicando una serie di altre possibili applicazioni per questo sistema CLM.
Nel complesso, questo protocollo potrebbe servire come fase di screening per scoprire come le modifiche nelle formulazioni DDS influenzano dove risiedono o si accumulano, il che potrebbe essere fondamentale nella progettazione di un DDS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dalla sovvenzione NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) assegnata (a SV) e in parte dalla sovvenzione della Singapore National Research Foundation Grant AG / CIV / GC70-C / NRF / 2013 / 2 e dalla sovvenzione Health and Biomedical Sciences (HBMS) Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) di Singapore H18/01/a0/018 amministrata dall'Agenzia per la scienza, la tecnologia e la ricerca (A * STAR) (ad AMC). Grazie ai membri del Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) per aver facilitato la logistica e l'esecuzione degli studi e della formazione sulle attrezzature. Un ringraziamento speciale alla signora Wisna Novera per la sua assistenza editoriale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
References
- Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery. Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).
- Kuo, J. C. -H., et al. Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins. Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).
- Wu, Y. -F., et al. A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).
- Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. In vivo confocal microscopy of the ocular surface. The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).
- Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system. Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).
- Sercombe, L., et al. Advances and challenges of liposome assisted drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).
- Koning, G. A., Storm, G. Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs. Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).
- Metselaar, J. M., Storm, G.
- Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium. Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).
- Hua, S., Wu, S. Y. The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies. Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).
- Sharma, A., Sharma, U. S. Liposomes in drug delivery: Progress and limitations. International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).
- Abrishami, M. M., et al. Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration. Retina. 29 (5), 699-703 (2009).
- Pleyer, U., et al. Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields. Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).
- Shen, Y., Tu, J. Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes. The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).
- Weijtens, O., et al. High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection. American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).
- Voss, K., et al. Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment. Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).
- Giarmoukakis, A., et al. Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results. Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).
- Shah, N. V., et al. Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice. Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).
- Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).
- Ezra-Elia, R., et al. Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice. Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).
- Movila, A., et al. Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis. Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).
- Vanherp, L., et al. Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice. Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).
- Chagnon, F., et al. In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs. Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).
- Yun, J. Y., et al. The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab. Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).
