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방법 논문

광섬유 공초점 레이저 미세 내시경 검사를 사용하여 안구 약물 전달 시스템의 생체 내 측두 체 이미징

2.1K 조회수

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DOI:

10.3791/62685

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2021년 9월 27일

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이 논문에서

요약

우리는 경내 주입 후 눈에 리포좀의 스파티오 측두분포를 비침습적으로 연구하기 위해 광섬유 공초점 레이저 미세 내시경 검사(CLM)의 사용을 위한 프로토콜을 제시한다.

초록

수축기 주사는 각막및 결막과 같은 전방 안구 장벽을 우회하는 쉬운 트랜스 경피성 접근으로 인해 안구 약물을 투여하는 매력적인 경로입니다. 구축 주사 시 약물의 치료 효과 및 약동학은 일부 연구에서 설명되었지만 약물 또는 약물 전달 시스템 (DDS)의 안구 분포를 평가하는 것은 거의 없습니다. 후자는 원하는 안구 국소화 및 작용 기간(예: 급성 대 장시간)을 달성하기 위해 내구 DDS 설계 및 약물 생체 이용률의 최적화에 매우 중요합니다. 이 연구는 섬유섬유 공초점 레이저 미세 내시경 검사(CLM)를 사용하여 항결체 주입 후 살아있는 마우스에서 실시간으로 형광 리포좀의 안구 분포를 질적으로 연구합니다. 현미경 수준에서 조직의 생체 내육검사를 위해 설계되고, 이것은 또한 수축 주사 후 눈에 주사의 주체의 현수체 분포를 연구하는 CLM 이미징 방법의 첫 번째 전체 설명이다.

서론

혈액 정리, 조직 분포 및 살아있는 시스템에서 약물의 표적 점유율은 생체 내 약물 처분에 대한 이해를 위한 기둥입니다. 전임상 동물 모델에서, 이러한 매개 변수는 전형적으로 약물 투여 후 특정 시점에서 빈번한 혈액 및 조직 샘플링에 의해 평가된다. 그러나, 이 절차는 일반적으로 침략적입니다, 수시로 비 생존 측정을 포함하고, 통계적인 전원을 위한 큰 동물 집단을 필요로 합니다. 동물의 과도한 사용에 대한 윤리적 우려와 함께 추가 비용과 시간이 발생할 수 있습니다. 그 결과, 비침습적 이미징은 빠르게 바이오 유통 연구에서 필수적인 단계가 되고 있습니다. 공초점 레이저 미세 내시경검사(CLM1,2)는 높은 감도와 고해상도를 가진 살아있는 동물의 눈에 치료제의 스파티오-측두형 분포를 비침습적으로 이미지화하기 위해 안구 응용 분야에 적합합니다1,3,4.

CLM은 DDS 및 약물 생체 이용률의 포괄적 인 정량화 전에 리포솜과 같은 안구 약물 전달 시스템 (DDS)의 ....

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프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 SingHealth (싱가포르)에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 여성 C57BL/6 J 마우스(6-8주 전, 18-20g)는 싱가포르 인비보스에서 수득되었으며 싱가포르 듀크-NUS 의과대학의 온도 및 빛 제어 생체관리에 보관되었다. 동물은 안과 및 시력 연구에서 동물의 사용을위한 비전과 안과 (ARVO) 성명서에 대한 연구를위한 협회의 지침에 따라 치료되었다.

참고: 주 프로시저를 강조 표시하는 플로우 차트가 그림 2에 표시됩니다.

1. 조영제 준비: 에반스 블루 (EB) 및 리포솜

  1. EB 염료 용액 2%의 경우 멸균 식염수 50mL에 EB 1 g을 녹입니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 용액을 1.5mL 멸균 튜브로 필터링하고 나중에 사용할 수 있도록 실온에 보관하십시오.
  2. 녹색 형광 리포솜의 경우 POPC / Fl-DHPE (95:5), 클로로폼 / 메탄올 (2:1)을 100 mL 라운드 바닥 플라스크에 추가하십시오. 1h에 40°C에서 150rpm의 회전 증발기를 사용하고 진공은 0 mbar1 ....

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결과

이 프로토콜은 경내 주입을 통해 투여된 녹색 형광 리포솜의 스파티오 측두엽 안구 분포를 평가하기 위해 CLM의 유용성을 입증한다. CLM 시스템의 듀얼 컬러 기능(488nm 및 660 nm 포크 파장)을 사용하기 위해 주입할 100nm 중립 POPC 리포솜은 5% Fl-DHPE( 도 1B에 도시됨)로 도핑되었고, EB는 눈의 랜드마크를 식별하기 위해 IV를 주입하였다. 에피클레라의 얇은 층과 결막의 존재는 모두 높은 혈관화되어 있으며, clera 영역은 EB (도 4A, S로 표시됨)로 빨간색으로 염색 될 수 있으며, 혈관을 포함하지 않는 각막 (그림 4A, C로 표시됨), 얼룩을 얻지 못하고 검은 색으로 나타납니다. 이것은 형광 화상 진찰 도중 두 지구 사이 명백한 분화를 가능하게 합니다.

대표적인 결과는 7일(n=4마.......

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토론

결과에서 볼 수 있듯이 CLM은 눈에서 리포솜의 안구 분포를 이미지화하는 간단하고 실행 가능한 방법을 제공합니다. 앞서 CLM의 사용을 통해 시간이 지남에 따라 마우스 눈 내의 다양한 리포소말 제형의 국소화를 특징으로 하는 것을 입증하였다1. 비침습적 응용 프로그램의 경우 CLM은 리포솜이 동일한 동물의 눈에 어떻게 분포되는지에 대한 통찰력을 위해 전방 안구 표면의 실시간 이미징을 허용합니다. 따라서 CLM은 보다 포괄적인 정량화 전에 화면 전 나노 캐리어/DDS에 적합합니다. 다양한 DDS의 독특한 생리학적 특성을 감안할 때, 기존의 히스토로지에 의한 하위 구획 분포를 특성화하는 것은 오히려 어렵습니다. 후자는 DDS 클리어런스의 전반적인 감각을 위해 형광 현미경 검사법에 의한 전체 눈과 개별 이미징 섹션의 철저한 단면이 필요합니다.

CLM 이미지(도 5B,C)와

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 NTU-노스웨스턴 나노의학 연구소(NNIN)가 (SV에) 수여하고 싱가포르 국립 연구 재단 보조금 AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2및 싱가포르의 보건 생물 의학 과학(HBMS) 산업 정렬 사전 포집(IAF-PP) 보조금 H18/01/01/01에 의해 지원되었습니다. 기술 및 연구(A*STAR) (AMC). 듀크-NUS 번역 및 분자 이미징 연구소(LTMI)의 회원덕분에 장비에 대한 연구 및 교육의 물류 및 실행을 용이하게 합니다. 그녀의 편집 지원에 대한 위스타 노파 양에게 특별한 감사.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.08 & 마이크로; m 폴리 카보네이트 필터Whatman, 미국110604
0.22 µ m 주사기 필터Fisherbrand, 아일랜드09-720-3
0.5% Proxymetacaine hydrochloride 멸균 안과 용액Alcon, Singapore
10 µ L 유리 주사기Hamilton, USA65460-06
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)Avanti, USA850457
32 G 바늘 (Hamilton, 0.5" PT4)Hamilton, USA7803-04
가열판이 있는 동물 온도 조절기(15cm x 20cm)WPI, USAATC 2000 & 61800
Cellvizio 듀얼 밴드, S1500 프로브 및 Quantikit(3.5단계의 교정 키트)Mauna Kea Technologies, France팁 직경: 1.5mm, 시야: 600 & 마이크로; m x 500 &마이크로; m, 축 분해능: 15 & 마이크로; m, 측면 해상도: 3.3 &마이크로; m
클로로포름Sigma Aldrich, 미국472476
Dumont Tweezers #5, DumostarWPI, 미국50023311cm, 스트레이트, 0.1mm x 0.06mm 팁
Evans BlueSigma Aldrich, 미국E2129
Fusidic acid 점안 LEOPharma, 덴마크
ImageJNational Institutes of Health, 미국https://imagej.nih.gov/ij/
IsofluranePiramal, 미국
Malvern Zetasizer Nano ZSMalvern Panalytical, 영국
메탄올시그마 Aldrich, 미국179337
MiniExtruder Avanti, 미국610020
N-(플루오레세인-5-티오카르바모일)-1,2-디헥사데칸오일-글리세로-3-포스포에탄올아민(트리에틸암모늄염) (플로리다-DHPE)Invitrogen, 미국F362
인산염 완충 식염수Gibco, 미국10010023
테이블 클램프 스탠드가 있는 실체현미경 시스템Olympus, Tokyo, JapanSZ51 & SZ2-STU3

참고문헌

  1. Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery. Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).
  2. Kuo, J. C. -H., et al. Detection of colorectal dysplasia using....

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