Summary
Wir stellen ein Protokoll für den Einsatz der faseroptischen konfokalen Lasermikroendoskopie (CLM) vor, um die räumlich-zeitliche Verteilung von Liposomen im Auge nach subkonjunktivaler Injektion nicht-invasiv zu untersuchen.
Abstract
Die subkonjunktivale Injektion ist ein attraktiver Weg zur Verabreichung von Augenmedikamenten aufgrund des einfachen transskleralen Zugangs, der anteriore Augenbarrieren wie Hornhaut und Bindehaut umgeht. Während therapeutische Wirkungen und Pharmakokinetik der Arzneimittel bei subkonjunktivaler Injektion in einigen Studien beschrieben wurden, beurteilen nur sehr wenige die Augenverteilung von Arzneimitteln oder Drug Delivery Systems (DDS). Letzteres ist entscheidend für die Optimierung des intraokularen DDS-Designs und der Bioverfügbarkeit des Arzneimittels, um die gewünschte Okularlokalisation und Wirkungsdauer (z. B. akut versus verlängert) zu erreichen. Diese Studie etabliert die Verwendung der faseroptischen konfokalen Lasermikroendoskopie (CLM) zur qualitativen Untersuchung der Augenverteilung von fluoreszierenden Liposomen in Echtzeit in lebenden Mäusen nach subkonjunktivaler Injektion. Konzipiert für die visuelle In-vivo-Inspektion von Geweben auf mikroskopischer Ebene, ist dies auch die erste vollständige Beschreibung der CLM-Bildgebungsmethode zur Untersuchung der räumlich-zeitlichen Verteilung von Injektionsmitteln im Auge nach subkonjunktivaler Injektion.
Introduction
Die Blutclearance, die Gewebeverteilung und die Zielbelegung von Medikamenten in lebenden Systemen sind Säulen für das Verständnis der In-vivo-Wirkstoffdisposition. In präklinischen Tiermodellen werden diese Parameter typischerweise durch häufige Blut- und Gewebeentnahmen zu bestimmten Zeitpunkten nach der Verabreichung des Arzneimittels beurteilt. Diese Verfahren sind jedoch im Allgemeinen invasiv, beinhalten oft Nicht-Überlebensmessungen und erfordern große Tierkohorten für die statistische Auswertung. Es können zusätzliche Kosten und Zeit anfallen, zusammen mit ethischen Bedenken für übermäßigen Gebrauch von Tieren. Infolgedessen wird die nicht-invasive Bildgebung schnell zu einem integralen Schritt in Bioverteilungsstudien. Die konfokale Lasermikroendoskopie (CLM1,2) eignet sich gut für okuläre Anwendungen, um die räumlich-zeitliche Verteilung von Therapeutika in den Augen lebender Tiere mit hoher Empfindlichkeit und hoher Auflösung nicht-invasiv abzubilden1,3,4.
CLM hat das Potenzial, ein robustes Screening von okulären Drug Delivery Systemen (DDS) wie Liposomen vor einer umfassenden Quantifizierung des DDS und der Bioverfügbarkeit des Arzneimittels zu erleichtern. Liposomen sind attraktiv für ihre Flexibilität bei der Abstimmung ihrer physikalisch-chemischen und biophysikalischen Eigenschaften5,6,7,8,9,10,11, um eine Vielzahl von therapeutischen Ladungen zu verkapseln und die Gewebestelle der Wirkstofffreisetzung und die Wirkungsdauer zu kontrollieren. Liposomen wurden in okulären Anwendungen zur Abgabe großer Moleküle wie dem monoklonalen Antikörper Bevacizumab12 und kleinen Molekülen wie Cyclosporin13 und Ganciclovir14 eingesetzt. Arzneimittelbeladene Liposomen haben längere biologische Halbwertszeiten und verlängerte therapeutische Wirkungen im Vergleich zu nicht-liposomalen "freien Arzneimittel" -Formulierungen. Die Arzneimittelverteilung im Augengewebe wird jedoch typischerweise aus arzneimittelkonzentrationen in flüssigen Komponenten des Auges (d. H. Blut, Kammerwasser und Glaskörper) extrapoliert15,16,17). Da das anfängliche In-vivo-Schicksal der beladenen Wirkstoffladung durch die Eigenschaften des Nanocarriers selbst definiert wird, kann die CLM-Bildgebung der fluoreszierenden Liposomen als Surrogat für das Medikament dienen, um Gewebe-Targeting und In-situ-Gewebeverweilzeiten aufzudecken. Darüber hinaus kann der visuelle Nachweis der Verabreichung mit CLM das DDS-Redesign steuern, den therapeutischen Nutzen des Arzneimittels bewerten und möglicherweise sogar unerwünschte biologische Ereignisse vorhersagen (z. B. Gewebetoxizität aufgrund unerwünschter Lokalisation von DDS über einen längeren Zeitraum).
Hierin wird ein Schritt-für-Schritt-Verfahren beschrieben, wie die okuläre Bioverteilung von Liposomen in lebenden Mäusen mit einem Dual-Band-CLM-System untersucht werden kann. Dieses spezielle CLM-System kann zweifarbige Fluoreszenz (mit grünen und roten Anregungslasern bei 488 nm und 660 nm) in Echtzeit mit einer Frequenz von 8 Bildern/s erkennen. Durch die physische Platzierung der Nachweissonde auf dem Auge demonstriert das Protokoll die Bilderfassung und Analyse von grün fluoreszierenden Liposomen bei subkonjunktivaler Verabreichung in Mäusen, die intravenös (IV) mit 2% Evans Blue (EB) Farbstoff vorinjiziert wurden. EB-Farbstoff hilft, die vaskularisierten Strukturen im roten Fluoreszenzkanal sichtbar zu machen. Wir zeigen repräsentative Ergebnisse aus einer Studie, in der 100 nm neutrale Liposomen untersucht wurden, die aus dem Phospholipid POPC (d.h. 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin) bestehen und mit Fluorescein-markiertem Phospholipid Fl-DHPE (d.h. N-(Fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamin dotiert sind) im Verhältnis von 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Abbildung 1B ). CLM ist in der Lage, die grünen Fluorescein-markierten Liposomen mit 15 μm axialer und 3,30 μm lateraler Auflösung durch Abgrenzung von EB-gefärbten Augengewebegrenzen zu erfassen.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) bei SingHealth (Singapur) genehmigt. Weibliche C57BL/6 J-Mäuse (6-8 Wochen alt; 18-20 g) wurden aus InVivos, Singapur, gewonnen und in einem temperatur- und lichtkontrollierten Vivarium der Duke-NUS Medical School, Singapur, untergebracht. Die Tiere wurden gemäß den Richtlinien der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für den Einsatz von Tieren in der Augen- und Sehforschung behandelt.
HINWEIS: Ein Flussdiagramm, das die wichtigsten Verfahren hervorhebt, ist in Abbildung 2 dargestellt.
1. Herstellung von Kontrastmitteln: Evans Blue (EB) und Liposomen
- Für 2% ige EB-Farbstofflösung 1 g EB in 50 ml steriler Kochsalzlösung auflösen. Die Lösung wird mit 0,22-μm-Filtern in sterile 1,5-ml-Röhrchen filtriert und für die spätere Verwendung bei Raumtemperatur gelagert.
- Für grün fluoreszierende Liposomen POPC/Fl-DHPE (95:5), Chloroform/Methanol (2:1) in einen 100 ml Rundkolben geben. Verwenden Sie einen Rotationsverdampfer mit 150 U / min bei 40 ° C für 1 h, wobei das Vakuum bei 0 mbar1 gehalten wird, um einen dünnen Lipidfilm zu erzeugen.
HINWEIS: Halten Sie beim Vergleich der Auswirkungen liposomaler Eigenschaften (z. B. Größe, Ladung, Lipidsättigung, Lipidkettenlänge) auf die Verteilung einen festen Prozentsatz an Fl-DHPE oder anderen fluoreszierenden Lipiden ein, um zu bestätigen, dass die beobachteten Ergebnisse auf die Wirkung der getesteten Eigenschaften und nicht auf die variable Belastung großer hydrophober Farbstoffe zurückzuführen sind. - Hydratisieren Sie den Lipidfilm mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (um 26,3 mM fluoreszierende Liposomen zu erreichen) bei 40 °C, um mehrlamelläre Vesikel (MLV) zu bilden. Laden Sie die MLVs zur manuellen Extrusion in eine Glasspritze (30 Mal mit einem Polycarbonatfilter mit einer Porengröße von 0,08 μm), um die gewünschte Größe von 100 nm zu erreichen.
HINWEIS: Die Temperatur für die Hydratation muss höher sein als die Übergangstemperatur der Lipide. - Filtern Sie die Liposomen, indem Sie sie durch einen sterilen 0,22 μm-Spritzenfilter führen. Bestätigen Sie den hydrodynamischen Durchmesser (DH) der Liposomen mit einem dynamischen Lichtstreusystem.
2. Verabreichung von EB und Liposomen in lebenden Mäusen
- Der Maus wird EB IV (intravenös) über die Schwanzvene (2,5 mg/kg) 2 h vor der subkonjunktivalen Injektion injiziert.
- Für die subkonjunktivale Injektion wird die Maus zunächst mit 5% Isofluran durch Inhalation in einer Induktionskammer sediert, um eine ausreichende Anästhesieebene zu erreichen. Übertragen Sie die Maus auf einen Nasenkegel und halten Sie die Sedierung bei 2% -2,5% Isofluran während des gesamten Eingriffs auf einem Heizkissen.
- Schneiden Sie die Schnurrhaare in der Nähe des zu injizierenden Auges ab und geben Sie einen Tropfen topisches Anästhetikum 0,5% Proxymetacainhydrochlorid-Lösung direkt auf das Auge.
- Bestücken Sie eine 10 μL Glasspritze (mit 32 G Nadel) mit fluoreszierenden Liposomen (Fl-DHPE: 0,78 mg/kg) und entfernen Sie alle Luftblasen in der Spritze vor der Injektion.
HINWEIS: Bis zu 20 μL Injektat können im subkonjunktivalen Raum von Mäusen untergebracht werden18,19. - Heben Sie die Bindehaut mit einer Pinzette leicht an und injizieren Sie langsam in den Subkonjunktivalraum (Abbildung 1A). Ziehen Sie die Nadel langsam zurück, um einen Rückfluss zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass eine sichtbare, mit fluoreszierenden Liposomen gefüllte Blase gebildet wird (Abbildung 1C).
- Verabreichen Sie nach der Injektion einen Tropfen Antibiotikum 1% Fusidinsäure auf das Auge und überwachen Sie die Maus, bis sie das Bewusstsein wiedererlangt hat.
3. CLM-Einrichtung
- Schalten Sie das CLM-System ein und stellen Sie sicher, dass sowohl der Anschluss als auch die distale Spitze der Scansonde sauber sind.
- Reinigen Sie den Anschluss der Scanning-Sonde mit einem optischen Steckerreiniger, indem Sie die Anweisungen des Herstellers befolgen.
- Drücken Sie auf die Rachet (oft farbig) des optischen Anschlussreinigers, um ein Reinigungsband freizulegen.
- Positionieren Sie den Stecker in Kontakt mit dem Reinigungsband und schieben Sie den Stecker entlang des Bandes, während der Kontakt erhalten bleibt.
- Reinigen Sie die distale Spitze (auch als Scanspitze bezeichnet) der Sonde, indem Sie sie in die Reinigungslösung tauchen, gefolgt von der vom Hersteller bereitgestellten Spüllösung. Ein Baumwollspitzenapplikator kann auch für eine gründlichere Reinigung verwendet werden, wenn die Spitze sehr schmutzig ist.
- Schließen Sie die Sonde an das CLM-System an. Wählen Sie an dieser Stelle das Sichtfeld (FOV) und den Speicherort für die Erfassungsdateien aus.
HINWEIS: Stellen Sie die Laserintensität in diesem Schritt ein, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenzdetektion für Fl-DHPE im linearen Bereich liegt. Die Laserintensität ist für den Vergleich zwischen Bildern, die zu verschiedenen Zeitpunkten aufgenommen wurden, konsistent zu halten. - Lassen Sie das System wie angewiesen 15 Minuten lang aufwärmen und verwenden Sie das Kalibrierkit, um das System gemäß den Anweisungen des Herstellers zu kalibrieren.
HINWEIS: Im Kalibrierkit befinden sich für jeden Laser drei Durchstechflaschen, die die folgenden Lösungen enthalten: Reinigungslösung, Spüllösung und Fluorophor 488/660 nm Lösung für die interne Kalibrierung. Die Kalibrierschritte werden vom System vorgefragt und sind entsprechend zu befolgen.- Tauchen Sie die Spitze in die Reinigungsflasche, gefolgt von der Spülflasche (5 s in jeder Durchstechflasche). Lassen Sie es in der Luft für Hintergrundaufnahmen für beide Kanäle.
HINWEIS: Dieser Schritt ist sehr wichtig, da er die Hintergrundwerte aus verschiedenen Fasern der Sonde normalisiert und die Bildgleichmäßigkeit sicherstellt. - Tauchen Sie die Spitze in die Reinigungsflasche, gefolgt von der Spülflasche (5 s in jeder Durchstechflasche). Tauchen Sie die Spitze für 5 Sekunden in eine Fluorophor-488-nm-Durchstechflasche, um die Signalwerte verschiedener Fasern in der Sonde zu normalisieren.
- Tauchen Sie die Spitze in die Reinigungsflasche, gefolgt von der Spülflasche (5 s in jeder Durchstechflasche). Die Spitze wird in die Spülflasche getaucht, bis das Fluoreszenzsignal in Abschnitt 3.5.2 aufgezeichnet ist. verschwindet. Tauchen Sie die Spitze in eine Fluorophor-660-nm-Durchstechflasche, um die Signalwerte verschiedener Fasern in der Sonde zu normalisieren.
HINWEIS: Befolgen Sie alle Kalibrierungsschritte, um eine ordnungsgemäße Kalibrierung und optimale Bildqualität zu erreichen.
- Tauchen Sie die Spitze in die Reinigungsflasche, gefolgt von der Spülflasche (5 s in jeder Durchstechflasche). Lassen Sie es in der Luft für Hintergrundaufnahmen für beide Kanäle.
- Überprüfen Sie nach der Kalibrierung der Sonde, ob die Hintergrundwerte für die Sonden so niedrig wie möglich sind. Halten Sie für das verwendete CLM-System die Hintergrundwerte unter 100. Führen Sie eine wiederholte Reinigung der Sonde mit einem Baumwollspitzenapplikator durch und kalibrieren Sie sie, wenn die Werte über 100/definiertem Benutzerwert liegen oder wenn die Sonde verschmutzt zu sein scheint. Dadurch soll sichergestellt werden, dass das Hintergrundrauschen in etwa auf dem gleichen Wert gehalten wird.
HINWEIS: Es ist wichtig, den maximalen Hintergrundwert zu definieren (z. B. 100, wie in Schritt 3.6 angegeben), um sicherzustellen, dass die Prüfpunktbedingungen ähnlich sind. Dies ermöglicht einen angemessenen quantitativen Vergleich zwischen Bildern, die zu verschiedenen Zeitpunkten aufgenommen wurden. Der Wert kann in verschiedenen Systemen und Sondenbedingungen unterschiedlich sein. - Schalten Sie den Tiertemperaturregler (ATC) ein. Stellen Sie den ATC auf 37 °C ein. Decken Sie das Heizkissen mit einem CHIRURGISCHEN Vorhang ab und befestigen Sie den Nasenkonus auf dem Heizkissen.
HINWEIS: ATC mit einem angebrachten Heizkissen ist erforderlich, um sicherzustellen, dass das Tier während der gesamten Bildgebungsdauer warm gehalten wird. - Klemmen Sie den Ständer des Seziermikroskops an die Tischplatte, um ihn zu befestigen. Drehen und justieren Sie das Okular des Mikroskops, um das Mausauge ergonomisch durch das Okular zu betrachten, wenn der Benutzer sitzt (nehmen Sie die Einstellungen nach dem Platzieren des Tieres vor).
- Sedieren Sie die Maus mit 5% Isofluran in einer Induktionskammer. Übertragen Sie die Maus auf den Nasenkegel, sobald das Tier nicht ansprechbar ist, und halten Sie die Sedierung während des gesamten Eingriffs bei 2% -2,5% Isofluran aufrecht.
- Schneiden Sie die Schnurrhaare der Maus ab und geben Sie einen Tropfen anästhetische 0,5% ige Proxymetacainhydrochlorid-Lösung auf das Auge.
- Um sicherzustellen, dass die Augen sauber sind, lassen Sie ein paar Tropfen Kochsalzlösung fallen, um die Augenoberfläche zu waschen.
- Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass das Mausauge bei 0,67-facher Vergrößerung direkt fokussiert ist.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die Augen mit Kochsalzlösung schmieren. Wenn die Augen während der gesamten Bildgebungssitzung nicht geschmiert werden, können sie trocken werden, wodurch die Linse kristallisiert. Infolgedessen kann die Linse während der CLM-Bildgebung eine rote Hintergrundfluoreszenz emittieren.
4. Live-Bildgebung von Mausaugen mit CLM und Erfassung
- Schalten Sie den Laser ein, legen Sie die Sonde auf das Auge und beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Erfassung, um die Fluoreszenz im Auge an den in Abbildung 3 angegebenen Bereichen auf der Augenkarte zu beobachten.
HINWEIS: Halten Sie die Sonde wie einen Stift mit dem distalen Ende der Sonde direkt auf den zu fotografierenden Bereich. - Stoppen Sie die Aufzeichnung, wenn alle Regionen gekennzeichnet und gekennzeichnet wurden. Die Erfassungsdateien werden automatisch an dem in Schritt 3.4 ausgewählten Dateispeicherort gespeichert.
HINWEIS: Die Datei wird als Videodatei gespeichert, die in einzelne Bilder exportiert werden kann. Beschriften Sie die Flagge gemäß der Augenkarte, um genau zu wissen, wo sich die Sonde genau in dem Rahmen befindet, in dem die Aufnahme durchgeführt wurde.
5. Bildanalyse
- Exportieren Sie die Bilderfassungsdateien mit derselben CLM-Erfassungssoftware zur weiteren Analyse. Klicken Sie auf Datei | Exportieren Sie und wählen Sie das Format aus, in das exportiert werden soll. Mkt-Formatdateien ermöglichen Anpassungen der Nachschlagetabelle (LUT) und weitere Exporte in Bilddateiformate mit der CLM-Viewer-Software.
- Für einen genauen Vergleich der Fluoreszenzintensität verwenden Sie beim Exportieren aller Bilddateien die gleiche LUT, die für jeden Kanal angepasst ist.
HINWEIS: Wählen Sie den minimalen und maximalen LUT-Schwellenwert in Bezug auf den der Kontrollmaus (ohne injizierte Liposomen), um die Hintergrundfluoreszenzwerte zu minimieren. - Öffnen Sie das Bild in einer geeigneten Bildverarbeitungssoftware/Freeware(z.B. ImageJ). Zeichnen Sie die Region of Interest (ROI).
HINWEIS: Der ROI bezieht sich hier auf die Region, die im Verarbeitungsprogramm von Interesse ist. In den meisten Fällen wird der ROI das gesamte gescannte Bild sein. Bei der Abbildung des Limbus kann die Sonde jedoch nicht einfach das Bild des Limbus separat erhalten. Daher muss ein ROI gezogen werden, um die Fluoreszenz in der Limbusregion zu "quantifizieren", wie in Abbildung 4 dargestellt. Um den ROI konsistent zu halten, verwenden Sie den gleichen ROI für alle Bilder. - Messen und erfassen Sie die ROI-Werte für die grüne Fluoreszenz. Geben Sie die Werte in eine Kalkulationstabelle ein. Tabellieren Sie die durchschnittlichen und Fluoreszenzintensitätswerte (a.u.) des ROI.
6. Histologische Beurteilung
- Die Maus wird mit einer von der örtlichen IACUC zugelassenen Methode eingeschläfert.
- Enukleieren Sie das Auge und fixieren Sie das Auge in 1 ml 4% igem Formaldehyd oder 10% iger Formalinlösung über Nacht.
- Schneiden Sie überschüssige Fette ab und betten Sie das Auge in die Optimum Cutting Temperature (OCT) -Verbindung ein und bewahren Sie es mindestens einen Tag lang in einem Gefrierschrank von -80 ° C auf.
- Schnittabschnitte von 5 μm Dicke im Kryostaten bei einer Schnitttemperatur von 20 °C. Übertragen Sie den Schnitt auf einen Poly-L-Lysin-beschichteten Objektträger.
HINWEIS: Die Histologie kann als zusätzliche Validierung der Verteilung von DDS dienen. Es erfordert jedoch zusätzliche Optimierung, technisches Fachwissen und Tieropfer, die die Studie durch den Einsatz von CLM reduzieren will.
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Representative Results
Das Protokoll zeigt den Nutzen von CLM zur Beurteilung der räumlich-zeitlichen Augenverteilung von grün fluoreszierenden Liposomen, die durch subkonjunktivale Injektion verabreicht werden. Um die zweifarbige Fähigkeit (488 nm und 660 nm Anregungswellenlängen) des CLM-Systems zu nutzen, wurden 100 nm neutrale POPC-Liposomen, die injiziert werden sollten, mit 5% Fl-DHPE dotiert (Zusammensetzungs- und Charakterisierungsdaten sind in Abbildung 1B dargestellt), und EB wurde IV injiziert, um Landmarken im Auge zu identifizieren. Das Vorhandensein einer dünnen Schicht aus Episklera und Bindehaut, die beide stark vaskularisiert sind, ermöglicht es, die Skleraregion rot mit EB zu färben (Abbildung 4A, als S gekennzeichnet), während die Hornhaut, die kein Gefäßsystem enthält (Abbildung 4A, gekennzeichnet als C), nicht gefärbt wird und schwarz erscheint. Dies ermöglicht eine deutliche Differenzierung zwischen beiden Regionen bei der Fluoreszenzbildgebung.
Die repräsentativen Ergebnisse stammen aus einer 7-tägigen Verbreitungsstudie (n = 4 Mäuse). Da die Fluoreszenzintensitäten in den Bildern für Tag 1 und Tag 3 hoch waren (Abbildung 5B), wurden die Pixelintensitäten für eine bessere Visualisierung reduziert. Die tatsächlichen Werte der Fluoreszenzintensität werden in den Diagrammen wiedergegeben (Abbildung 6). Um sicherzustellen, dass die Beobachtungen aus den Bildern auf Fluoreszenz aus den Liposomen und nicht auf freien Farbstoff zurückzuführen waren, der sich möglicherweise von den Liposomen gelöst hat, wurden Kontrollmäuse, denen Fluorescein (Fl) -Farbstoff injiziert wurde, eingeschlossen (Abbildung 5A).
Eine Verringerung der Liposomen (durch Proxy der Abnahme des grün fluoreszierenden Signals) wurde im Laufe der Zeit sowohl in der Limbus- als auch in der Skleraregion beobachtet. Als die Liposomen aus dem temporalen in den oberen Bereich des subkonjunktivalen Raums injiziert wurden (Abbildung 3), wurden sie auf natürliche Weise direkt über der temporalen und oberen Sklera platziert (Abbildung 4B), bevor sie andere Regionen des subkonjunktivalen Raums erreichten. Am Tag 1 nach der Injektion war die in der Sklera nachgewiesene Fluoreszenz sowohl für die temporalen als auch für die oberen Regionen bis zu 6-mal höher als der Limbus (Abbildung 6). Bei Tag 3 und Tag 7 wurde eine signifikante Reduktion der Liposomen in der Sklera beobachtet (60% von Tag 1 bis Tag 3 (Tag1→3) und 88% von Tag 3 bis Tag 7 (Tag3→7)) im temporalen Bereich, mit einer Reduktion von 66% und 93% für Tag1→3 und Tag3→7 in den oberen Regionen. p < 0,001) (Abbildung 6). Diese Reduktion wurde auf die okulären Clearance-Mechanismen durch Blut und/oder Lymphgefäße zurückgeführt, die an der Bindehaut und Episklera gefunden wurden. Die Liposomen könnten auch durch die Sklera diffundiert und von der Aderhaut, die ebenfalls stark vaskularisiert ist, gereinigt worden sein.
Es wurde festgestellt, dass sich die Liposomen im Limbus langsamer geklärt hatten. Für den Limbus temporalis und den Limbus superior waren die Veränderungen der Fluoreszenzsignale von Tag 1 bis Tag 3 nach der Injektion nicht signifikant, was darauf hindeutet, dass neutrale Liposomen die Limbusregion, insbesondere die Hornhautperipherie, bevorzugen (Abbildung 5B). Liposomen in der Limbusregion begannen sich ab Tag 3 zu klären (d3→7: -89% für temporal (p < 0,01) und -53% für superior (p < 0,05)). Bis Tag 7 wurden mehr als 90% der Liposomen aus allen Limbusregionen entfernt (p < 0,05) mit Ausnahme des oberen Limbus 1S, wo noch 50% der Liposomen nachgewiesen werden konnten (p > 0,05). Dies ist ein Hinweis darauf, dass die Verweilzeit für neutrale Liposomen an der oberen Limbus/Hornhaut-Peripherie (Abbildung 5 und Abbildung 6) im Vergleich zu anderen Regionen viel höher ist. Die geringste Menge an Fluoreszenz wurde zu allen Zeitpunkten in den nasalen und unteren Regionen aufgrund ihrer Entfernung von der Injektionsstelle nachgewiesen (Abbildung 6A,B).
In umfassenderen Studien zur Clearance von Liposomen im Auge, die zuvor berichtet wurden1, haben wir einige Wege diskutiert, auf denen Liposomen nach subkonjunktivaler Injektion aus dem Augengewebe entfernt werden könnten. Während Liposomen durch systemische Zirkulation und lymphatische Clearance durch die Bindehaut, Episklera und Aderhaut, die stark vaskularisiert sind, beseitigt werden können, könnten sie auch tiefere intraokulare Gewebe durch passive Diffusion durch die Sklera erreichen. Der Flüssigkeitsfluss könnte die Liposomen auch durch das trabekuläre Geflecht oder den Uveosklera-Abfluss transportieren, der die Liposomen zurück in die Sklera bringen kann. Eine Eliminierung durch Risse ist ebenfalls möglich, und geringfügige Leckagen in der Injektionsstelle könnten eine Hornhautpenetration durch passive Diffusion ermöglichen.
Abbildung 1: Subkonjunktivale Injektion von Liposomen in das Auge. (A) Grafische Darstellung von grün fluoreszierenden Liposomen und subkonjunktivaler Injektion. (B) Zusammensetzung und Eigenschaften der FL-DHPE dotierten liposomalen Formulierung für die okuläre CLM-Bildgebung. (C) Grün fluoreszierende Liposomen, die bei subkonjunktivaler Injektion einen Bleb bilden. Diese Figur wurde mit Genehmigung von Chaw S.Y. et al.1 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Zeitleiste des OKULÄREN CLM-Verfahrens. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Übersichtskarte für CLM-Scans. Bereich 1 bezieht sich auf die Limbusregion, während Bereich 2 sich auf die Skleraregion bezieht. Videos und Bilder wurden von 1T in einer Richtung gegen den Uhrzeigersinn aufgenommen, gefolgt von 2T in einer ähnlichen Richtung gegen den Uhrzeigersinn. Da die Nadel zur Injektion von 2T in Richtung 2S eingeführt wurde, sind bereiche von Interesse hauptsächlich 1T, 1S, 2T und 2S. Insert zeigt die Größe der Sonde relativ zum Mausauge an. Diese Figur wurde mit Genehmigung von Chaw S.Y. et al.1 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Bildanalyse. (A) Die Bild-J-Analyse von fluoreszenzmarkierten Liposomen wurde unter Verwendung von Regionen von Interesse (ROI) durchgeführt, die für den Limbus (L) und die Sklera (S) (B) definiert sind. Mögliche Orte von Liposomen, die im Limbus nachgewiesen werden, sind 1) Hornhautperipherie, 2) Limbus oder 3) Sklera-Peripherie. Diese Figur wurde mit Genehmigung von Chaw S.Y. et al.1 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Kontrastverteilungen an Limbus und Sklera. Kontrastverteilung am Limbus (1S: Superior, 1N: Nasal, 1I: Inferior, 1T: Temporal) und Sklera (2S: Superior, 2N: Nasal, 2I: Inferior, 2T: Temporal) Regionen einer repräsentativen Maus aus jeder Kohorte (n=4) über 7 Tage für (A) Fluorescein (Fl) Kontrolle, (B) 100 nm neutrale Liposomen (POPC-100). Rote Farbe zeigt EB-Färbung an. Maßstabsbalken = 50 μm. (C) Die aufgenommenen Bilder werden zum besseren Verständnis auf der Eyemap zusammengestellt. Diese Figur wurde mit Genehmigung von Chaw S.Y. et al.1 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Clearance-Kinetik von 100 nm neutralen POPC-Liposomen an den Regionen Sklera (A) und Limbus (B) über 7 Tage (n=4 Mäuse pro Gruppe). Die mittlere Fluoreszenzintensität wurde durch 2-Wege-ANOVA mit mehreren Vergleichen in Bezug auf den vorherigen Zeitpunkt verglichen; d1→3 und d3→7; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Repräsentative histologische Aufnahmen von Querschnitten (5 μm) des Mausauges eines Tages nach der Injektion von Fl-DHPE-Liposomen. Gepunktete Linien zeigen an, wo die Liposomen beobachtet werden können, gekennzeichnet durch grüne Farbe. Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wie aus den Ergebnissen hervorgeht, bietet CLM eine einfache und praktikable Methode, um die Augenverteilung von Liposomen im Auge abzubilden. Wir haben zuvor die Verwendung von CLM demonstriert, um die Lokalisation verschiedener liposomaler Formulierungen im Mausauge im Laufe der Zeit zu charakterisieren1. Für nicht-invasive Anwendungen ermöglicht CLM die Echtzeit-Bildgebung der vorderen Augenoberfläche, um Erkenntnisse darüber zu erhalten, wie Liposomen vom selben Tier im Auge verteilt sind. Dies macht CLM geeignet, um Nanocarrier/DDS vor einer umfassenderen Quantifizierung vorzusieben. Angesichts der einzigartigen physiochemischen Eigenschaften verschiedener DDS ist es ziemlich schwierig, ihre Subkompartimentverteilung durch konventionelle Histologie zu charakterisieren. Letzteres würde eine umfassende Schnittung des gesamten Auges und einzelner Bildgebungsabschnitte durch Fluoreszenzmikroskopie erfordern, um ein Gesamtgefühl der DDS-Clearance zu erhalten.
In Übereinstimmung mit CLM-Bildern (Abbildung 5B,C) konnten wir grün fluoreszierende Signale durch Histologie an den Hornhaut-, Limbus- und Skleraregionen des Auges beobachten, die an Tag 1 nach der Injektion der Liposomen gesammelt wurden (Abbildung 7). Bemerkenswerterweise zeigte CLM eine bessere Empfindlichkeit als die Fluoreszenzmikroskopie - Liposomen an der Sklera konnten mit CLM eindeutig nachgewiesen werden (Abbildung 5), aber vom Fluoreszenzmikroskop kaum nachgewiesen werden (Abbildung 7). Der Signalverlust könnte auf die Wasch- und Schnittverfahren zurückzuführen sein, die die Retention von Liposomen in Gewebeschnitten beeinflussten. Obwohl CLM bei der Bestimmung der genauen Gewebeschicht, in der sich die Liposomen ansammeln, begrenzt ist, ist es definitiv eine praktikable und relativ einfache Methode, um okuläre Therapeutika nicht-invasiv in Echtzeit zu screenen und zu bewerten.
Während andere Bildgebungssysteme wie In-vivo-Bildgebungssysteme und Fluorometer auch eine Live-Bildgebung oder Live-Quantifizierung der Fluoreszenz im Auge ermöglichen, sind sie für den Zweck dieser Studie nicht so geeignet. In-vivo-Bildgebungssysteme bieten nicht die räumliche Auflösung, die erforderlich ist, um zu definieren, wo sich die Therapeutika im Augenraum befinden. Eine Vorstellung davon, ob die Therapeutika noch im Augenraum vorhanden sind und ihre Bioverteilung, kann man nur bekommen, wenn man in vivo Bildgebungssystem verwendet20. Ein Fluorometer ermöglicht die Messung der Fluoreszenz entlang der optischen Achse des Auges und wird häufig verwendet, um physiologische Veränderungen im Auge zu untersuchen. Da es schwierig ist, zu jedem Zeitpunkt genau die gleiche optische Achse zu scannen, kann ein konsistenter Bildpunkt nicht aufrechterhalten werden. Dies ist sehr wichtig, insbesondere wenn man die Verteilung von Medikamentenverabreichungssystemen untersucht, bei denen ihre Verweilzeit und die Aufklärungsrate von der Injektionsstelle völlig unbekannt sind. Darüber hinaus liegen die Injektionsstelle und die für die subkonjunktivale Injektion erwartete Verteilung ebenfalls nicht im Bereich der optischen Achse.
Zu den kritischen Schritten im Protokoll gehört es, einer Abbildungskarte ähnlich der in Abbildung 3 gezeigten Augenkarte strikt zu folgen und die Standorte genau zu beschriften. Eine falsche Kennzeichnung oder Abweichung vom Bildort würde zu einer Inkonsistenz der Ergebnisse führen. Da die Laserintensität für jeden Scan eingestellt werden kann, ist es wichtig, dass die Intensität konsistent ist, damit die Quantifizierung verschiedener Zeitpunkte vergleichbar ist. Es ist auch wichtig, dass die Sonde während des Bildgebungsprozesses frei von Ablagerungen gehalten wird. Da sich Augenschleim während der Bildgebung auf der Sonde verfangen kann, wird empfohlen, die Sonde in Kochsalzlösung zu spülen, wenn die Hintergrundwerte über den benutzerdefinierten Wert steigen.
Abgesehen von der subkonjunktivalen Injektion hat dieses CLM-System auch das Potenzial, zur Untersuchung anderer okulärer Verabreichungswege wie der Verabreichung von Augentropfen und der intravitrealen Injektion (IVT) eingesetzt zu werden. Aufgrund der Begrenztheit der Bildgebungstiefe ist es für die IVT jedoch möglicherweise nicht so nützlich, wenn die Injektionsstelle und das tiefere Augengewebe die Hauptinteressengebiete sind. CLM kann auch als eine Form der intravitalen Bildgebung verwendet werden, um die Verteilung von DDS in anderen Organen oder Geweben zu untersuchen. Obwohl sie selten zur Untersuchung der DDS-Verteilung eingesetzt wurde, wurde die endoskopische konfokale Mikroskopie eingesetzt, um entzündungen durch Parodontitis21 verursachte Entzündungen abzubilden, Lungenentzündungen und Infektionen zu überwachen22,23 und die Wirkung von Arzneimitteln auf die Angiogenese bei Tumoren24, was auf eine Reihe weiterer möglicher Anwendungen für dieses CLM-System hinweist.
Insgesamt könnte dieses Protokoll als Screening-Schritt dienen, um herauszufinden, wie sich Modifikationen in DDS-Formulierungen darauf auswirken, wo sie sich befinden oder ansammeln, was für das Design eines DDS entscheidend sein könnte.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch den Zuschuss des NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) (an SV) und zum Teil durch den Grant der Singapore National Research Foundation AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2 und den Singapore Health and Biomedical Sciences (HBMS) Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) Grant H18/01/a0/018 finanziert, der von der Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung (A * STAR) (an AMC) verwaltet wird. Vielen Dank an die Mitglieder des Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) für die Erleichterung der Logistik und Durchführung der Studien und Schulungen an Geräten. Besonderer Dank geht an Frau Wisna Novera für ihre redaktionelle Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
References
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