Summary
Vi præsenterer en protokol for brug af fiberoptisk konfokal lasermikroskopi (CLM) til ikke-invasivt at studere den spatio-tidsmæssige fordeling af liposomer i øjet efter subkonjunktival injektion.
Abstract
Subkonjunktival injektion er en attraktiv vej til at administrere okulære lægemidler på grund af nem trans-scleral adgang, der omgår forreste okulære barrierer, såsom hornhinden og bindehinden. Mens terapeutiske virkninger og farmakokinetik af lægemidlerne ved subkonjunktival injektion er blevet beskrevet i nogle undersøgelser, meget få vurdere den okulære fordeling af lægemidler eller narkotika leveringssystemer (DDS). Sidstnævnte er afgørende for optimering af intraokulær DDS design og lægemiddelbiotilgængelighed for at opnå den ønskede okulær lokalisering og varighed af handling (f.eks. akut versus langvarig). Denne undersøgelse etablerer brugen af fiberoptisk konfokal lasermikroskopi (CLM) til kvalitativt at studere den okulære fordeling af fluorescerende liposomer i realtid hos levende mus efter subkonjunktival injektion. Da dette er designet til in vivo visuel inspektion af væv på mikroskopisk niveau, er dette også den første fulde beskrivelse af CLM-billeddannelsesmetoden til at studere spatio-temporal fordeling af injectables i øjet efter subkonjunktival injektion.
Introduction
Blod clearance, væv distribution, og mål belægning af narkotika i levende systemer er søjler til at forstå in vivo narkotika disposition. I prækliniske dyremodeller vurderes disse parametre typisk ved hyppig blodprøvetagning og vævsprøvetagning på bestemte tidspunkter efter lægemiddeladministration. Men disse procedurer er generelt invasive, omfatter ofte ikke-overlevelsesmålinger og nødvendiggør store dyrekohorter til statistisk kraft. Der kan være ekstra omkostninger og tid, sammen med etiske bekymringer for overdreven brug af dyr. Som et resultat, ikke-invasiv billeddannelse er hurtigt ved at blive et integreret skridt i biodistribution undersøgelser. Konfoktal lasermikroskopi (CLM1,2) er velegnet til okulære anvendelser til ikke-invasivt billede spatio-temporal fordeling af terapeutiske i øjnene af levende dyr med høj følsomhed og høj opløsning1,3,4.
CLM har potentiale til at lette robust screening af okulære lægemiddelleveringssystemer (DDS), såsom liposomer, før omfattende kvantificering af DDS og lægemiddelbiotilgængelighed. Liposomer er attraktive for deres fleksibilitet i tuning deres fysisk-kemiske og biofysiske egenskaber5,6,7,8,9,10,11 at indkapsle et stort udvalg af terapeutisk last og kontrollere vævsstedet for lægemiddelfrigivelse og varigheden af handling. Liposomer er blevet anvendt i okulære applikationer til levering af store molekyler, såsom monoklonale antistof bevacizumab12, og små molekyler som cyclosporin13 og ganciclovir14. Lægemiddel-loaded liposomer har længere biologiske halveringstider og langvarige terapeutiske virkninger i forhold til ikke-liposomale "frie stof" formuleringer. Men, lægemiddelfordeling i okulært væv er typisk ekstrapoleret fra lægemiddelkoncentrationer i væskekomponenter i øjet (dvs. blod, vandig humor, og glasagtig humor15,16,17). Som den oprindelige in vivo skæbne lastet stof last er defineret af egenskaberne af nanocarrier selv, CLM billeddannelse af fluorescerende liposomer kan tjene som en surrogat for stoffet til at afsløre væv målretning og in situ væv bopæl gange. Desuden kan visuelle beviser for levering med CLM styre DDS re-design, evaluere terapeutiske fordele ved lægemidlet, og måske endda forudsige negative biologiske hændelser (f.eks væv toksicitet på grund af uønsket lokalisering af DDS for langvarige perioder).
Heri er en trinvis procedure detaljeret om, hvordan man studerer den okulære biodistribution af liposomer i levende mus med et dual-band CLM-system. Dette specifikke CLM-system kan registrere tofarvet fluorescens (med grønne og røde excitation lasere ved 488 nm og 660 nm) i realtid, med en frekvens på 8 billeder / s. Ved fysisk at placere detektionssonden på øjet demonstrerer protokollen billedopsamling og analyse af grøn-fluorescerende liposomer ved subkonjunktival administration hos mus, der injiceres intravenøst (IV) med 2% Evans Blue (EB) farvestof. EB farvestof hjælper visualisere vascularized strukturer i den røde fluorescens kanal. Vi viser repræsentative resultater fra en undersøgelse, der vurderer 100 nm neutrale liposomer, der består af fosfolipid-POPC (dvs. 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholin) og dopet med fluorescein-tagged fosfolipid Fl-DHPE (dvs. N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glycero-3-fosphoethanolamin) i et forhold på 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Figur 1B ). CLM er i stand til at fange de grønne fluorescein-mærkede liposomer ved 15 μm aksial og 3,30 μm lateral opløsning ved afgrænsning af EB-farvede okulære vævsgrænser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i SingHealth (Singapore). Kvindelige C57BL/6 J mus (6- 8 uger gamle; 18-20 g) blev fremstillet fra InVivos, Singapore, og opstaldes i en temperatur og lys-kontrolleret vivarium af Duke-NUS Medical School, Singapore. Dyr blev behandlet i overensstemmelse med retningslinjerne fra Association for Research in Vision and Oftalmology (ARVO) erklæring om brug af dyr i oftalmisk og visionsforskning.
BEMÆRK: Et rutediagram, der fremhæver hovedprocedurerne, vises i figur 2.
1. Forberedelse af kontrastmidler: Evans Blue (EB) og liposomer
- For 2% EB farveopløsning opløses 1 g EB i 50 mL steril saltvand. Opløsningen filtreres med 0,22 μm filtre i 1,5 mL sterile rør og opbevar dem ved stuetemperatur til senere brug.
- For grøn-fluorescerende liposomer, tilsæt POPC / Fl-DHPE (95:5), chloroform / methanol (2:1) i en 100 mL rund bund kolbe. Brug en roterende fordamper ved 150 omdrejninger ved 40 °C i 1 time, med vakuum vedligeholdt ved 0 mbar1 for at skabe en tynd lipidfilm.
BEMÆRK: Når man sammenligner virkninger af liposomale egenskaber (f.eks. størrelse, ladning, lipidmætning, lipidkædelængde) ved distribution, skal du opretholde en fast procentdel af Fl-DHPE eller andre fluorescerende lipider for at bekræfte, at de observerede resultater skyldes effekten af de testede egenskaber og ikke den variable belastning af store hydrofobiske farvestoffer. - Hydrat lipidfilmen med fosfatbufferet saltvand (for at opnå 26,3 mM fluorescerende liposomer) ved 40 °C for at danne multi-lamellar vesikler (MLV). Læg MLV'erne i en glassprøjte til manuel ekstrudering (30 gange ved hjælp af et polycarbonatfilter i 0,08 μm porestørrelse) for at opnå den ønskede størrelse på 100 nm.
BEMÆRK: Temperaturen for hydrering skal være højere end lipidernes overgangstemperatur. - Filtrer liposomer ved at sende dem gennem et 0,22 μm sterilt sprøjtefilter. Bekræft liposomernes hydrodynamiske diameter (DH) ved hjælp af et dynamisk lysspredningssystem.
2. Administration af EB og liposomer i levende mus
- Indsprøjt musen med EB IV (intravenøs) via halevenen (2,5 mg/kg), 2 timer før injektion under under indsprøjtning.
- For subkonjunktival injektion, først, bedøve musen ved hjælp af 5% isoflurane via indånding i et induktionskammer for at opnå et passende anæstesi. Overfør musen til en næse kegle og opretholde sedation på 2%-2,5% af isoflurane mens på en varmepude under hele proceduren.
- Trim whiskers nær øjet, der skal injiceres og indgyde en dråbe aktuel bedøvelse 0,5% proxymetacain hydrochloridopløsning direkte på øjet.
- Læg en 10 μL glassprøjte (med 32 G nål) med fluorescerende liposomer (Fl-DHPE: 0,78 mg/kg) og fjern alle luftbobler i sprøjten inden injektionen.
BEMÆRK: Der kan indkvarteres op til 20 μL injiceret i underkonjunktivalrummet på mus18,19. - Løft bindehinden lidt ved hjælp af en pincet, og indsprøjt langsomt ind i underkonjunktivalrummet (figur 1A). Træk nålen langsomt tilbage for at forhindre tilbageløb. Sørg for, at der dannes en synlig bleb fyldt med fluorescerende liposomer (figur 1C).
- Giv en dråbe antibiotika 1% fusidisk syre på øjet efter injektionen og overvåge musen, indtil den genvinder bevidstheden.
3. CLM set-up
- Tænd for CLM-systemet, og sørg for, at både stikket og scanningssondens distale spids er rene.
- Rengør scanningssondens stik ved hjælp af en optisk stikrenser ved at følge producentens anvisninger.
- Tryk på racheten (ofte farvet) af den optiske stikrenser for at afsløre et rengøringsbånd.
- Placer forbindelsen i kontakt med rengøringsbåndet, og skub stikket langs båndet, mens kontakten bevares.
- Rengør sondens distale spids (også kendt som scanningsspidsen) ved at dyppe den i renseopløsningen efterfulgt af skylleopløsningen fra producenten. En bomuldsspidsapplikator kan også bruges til mere grundig rengøring, hvis spidsen er meget snavset.
- Tilslut sonden til CLM-systemet. Vælg feltet for visning (FOV) og placeringen af anskaffelsesfilerne på dette tidspunkt.
BEMÆRK: Juster laserintensiteten ved dette trin for at sikre, at fluorescensdetektering for Fl-DHPE er i det lineære område. Laserintensiteten skal holdes konsistent til sammenligning mellem billeder taget på forskellige tidspunkter. - Lad systemet varme op i 15 min som anvist og bruge kalibreringssættet til at kalibrere systemet i overensstemmelse med producentens anvisninger.
BEMÆRK: I kalibreringssættet er der tre hætteglas til hver laser, der indeholder følgende løsninger: renseopløsning, skylleopløsning og fluorophor 488/660 nm opløsning til intern kalibrering. Kalibreringstrinnene er foranlediget af systemet og skal følges i overensstemmelse hermed.- Fordyb spidsen i renseglasset efterfulgt af skylleglasset (5 s i hvert hætteglas). Lad det være i luften til baggrundsoptagelse for begge kanaler.
BEMÆRK: Dette trin er meget afgørende, da det normaliserer baggrundsværdierne fra forskellige fibre i sonden og sikrer billedet ensartethed. - Fordyb spidsen i renseglasset efterfulgt af skylleglasset (5 s i hvert hætteglas). Sænk spidsen i fluorophore 488 nm hætteglas i 5 sekunder for at normalisere signalværdier fra forskellige fibre i sonden.
- Fordyb spidsen i renseglasset efterfulgt af skylleglasset (5 s i hvert hætteglas). Spidsen nedsænkes i skylleglasset, indtil fluorescenssignalet er registreret i 3.5.2. Forsvinder. Sænk spidsen i fluorophore 660 nm hætteglas for at normalisere signalværdier fra forskellige fibre i sonden.
BEMÆRK: Følg alle kalibreringstrin for at opnå korrekt kalibrering og optimal billedkvalitet.
- Fordyb spidsen i renseglasset efterfulgt af skylleglasset (5 s i hvert hætteglas). Lad det være i luften til baggrundsoptagelse for begge kanaler.
- Når sonden er kalibreret, skal du kontrollere, at baggrundsværdierne for sonderne er så lave som muligt. For det anvendte CLM-system skal baggrundsværdierne holdes under 100. Udfør gentagen rengøring af sonden med en bomuldsspidsapplikator og kalibrering, hvis værdierne er over 100/defineret brugerværdi, eller hvis sonden ser ud til at være snavset. Dette er for at sikre, at baggrundsstøjen holdes omkring samme værdi.
BEMÆRK: Det er vigtigt at definere den maksimale baggrundsværdi (f.eks. 100 som angivet i trin 3.6) for at sikre, at sondeforholdene er ens. Dette vil gøre det muligt at foretage en korrekt kvantitativ sammenligning mellem billeder taget på forskellige tidspunkter. Værdien kan variere i forskellige systemer og sondeforhold. - Tænd for dyrets temperaturregulator (ATC). Juster ATC til 37 °C. Dæk varmepuden med en kirurgisk drapering og fastgør næsekeglen på varmepuden.
BEMÆRK: ATC med en påsat varmepude er nødvendig for at sikre, at dyret holdes varmt under hele billedperioden. - Fastgør stativet på dissekeringmikroskopet til bordpladen for at sikre det. Roter og juster mikroskopets okular for at se museøjet ergonomisk gennem okularet, når brugeren sidder (foretag justeringerne efter placering af dyret).
- Se musen ved hjælp af 5% isoflurane i et induktionskammer. Overfør musen til næsekeglen, når dyret ikke reagerer, og opretholde sedation ved 2%-2,5% isoflurane, mens det er på en varmepude under hele proceduren.
- Trim musiskurhårene og indgyde en dråbe bedøvelsesmiddel 0,5% proxymetacainhydrochloridopløsning på øjet.
- For at sikre, at øjnene er rene, skal du slippe et par dråber saltvand for at vaske den okulære overflade.
- Juster mikroskopet, så museøjet er i direkte fokus ved 0,67x forstørrelse.
BEMÆRK: Sørg for at smøre øjnene med saltvand. Hvis øjnene ikke er smurt i hele billeddannelse session, kan de få tør, forårsager linsen til at krystallisere. Som et resultat, under CLM billeddannelse, linsen kan udsende en baggrund rød fluorescens.
4. Live billeddannelse af museøjne med CLM og erhvervelse
- Tænd for laseren, placer sonden på øjet og begynd at registrere erhvervelse for at observere fluorescensen i øjet i de områder, der er angivet på øjekortet i figur 3.
BEMÆRK: Hold sonden som en pen med den distale ende af sonden direkte på det område, der skal afbildes. - Stop optagelsen, når alle områder er markeret og mærket. Anskaffelsesfilerne gemmes automatisk på den filplacering, der blev valgt i trin 3.4.
BEMÆRK: Filen gemmes som en videofil, der kan eksporteres til individuelle billeder. Mærk flaget i henhold til øjekortet for at kende præcis placeringen af sonden på den nøjagtige ramme optagelsen blev gjort.
5. Billedanalyse
- Brug den samme CLM-anskaffelsessoftware til at eksportere billedopsamlingsfilerne til yderligere analyse. Klik på Fil | Eksporter og vælg det format, der skal eksporteres til. Mkt format filer vil tillade justeringer af slå op tabel (LUT) og yderligere eksport til billedfilformater ved hjælp af CLM viewer software.
- Hvis du vil sammenligne fluorescensintensiteten, skal du bruge den samme LUT justeret for hver kanal, når du eksporterer alle billedfiler.
BEMÆRK: Vælg den mindste og maksimale LUT-tærskel i forhold til kontrolmusens (uden liposomer injiceret) for at minimere baggrundslysstofaflæsninger. - Åbn billedet i et passende billedbehandlingssoftware/freeware-program (f.eks. Tegn interesseområdet( ROI).
BEMÆRK: ROI her refererer til det område af interesse i forarbejdningsprogrammet. I de fleste tilfælde vil roi være hele billedet scannet. Men i tilfælde af billeddannelse limbus, sonden kan ikke bare få billedet af limbus separat. Der skal derfor udtages et investeringsafkast for at »kvantificere« fluorescensen i limbusregionen, som det er tegnet i figur 4. Hvis du vil bevare investeringsafkastet ensartet, skal du bruge det samme investeringsafkast på tværs af alle billeder. - Mål og registrer INVESTERINGSAFKAST-værdierne for grøn fluorescens. Angiv værdierne i et regneark. Tabuler de gennemsnitlige og fluorescensintensitet (a.u.) værdier af investeringsafkast.
6. Histologivurdering
- Aflive musen ved hjælp af en metode, der er godkendt af det lokale IACUC.
- Enucleate øjet og fastsætte øjet i 1 mL af 4% formaldehyd eller 10% formalin opløsning natten over.
- Trim overskydende fedt og integrer øjet i OCT-forbindelsen (Optimal Cutting Temperature), og opbevar det frosset i en -80 °C-fryser i mindst en dag.
- Skær sektioner på 5 μm tykkelse i kryostat med skæretemperatur opretholdes ved 20 °C. Overfør sektionen til et poly-L-Lysin-belagt mikroskopdias.
BEMÆRK: Histologi kan tjene som yderligere validering af fordelingen af DDS. Det kræver dog yderligere optimering, teknisk ekspertise og offer af dyr, som undersøgelsen har til formål at reducere ved hjælp af CLM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen viser nytten af CLM til at vurdere den spatio-tidsmæssige okulære fordeling af grønne fluorescerende liposomer administreres gennem subkonjunktival injektion. For at gøre brug af dual-color kapacitet (488 nm og 660 nm excitation bølgelængder) af CLM-systemet, 100 nm neutral POPC liposomer, der skal injiceres blev dopet med 5% Fl-DHPE (sammensætning og karakterisering data er vist i figur 1B), og EB blev injiceret IV at identificere landemærker i øjet. Tilstedeværelsen af et tyndt lag af episclera og bindehinden, som begge er stærkt vascularized, gør det muligt for sclera-regionen at blive farvet rød med EB (Figur 4A, mærket som S), mens hornhinden, som ikke indeholder nogen vaskulatur (Figur 4A, mærket som C), ikke bliver farvet og ser sort ud. Dette muliggør en klar differentiering mellem begge regioner under fluorescensbilleddannelse.
De repræsentative resultater er fra en distributionsundersøgelse, der spænder over 7 dage (n = 4 mus). Da fluorescensintensiteterne i billederne for dag 1 og dag 3 var høje (Figur 5B), blev pixelintensiteterne reduceret for bedre visualisering. De faktiske værdier for fluorescensintensiteten afspejles i graferne (figur 6). For at sikre, at observationer fra billederne skyldtes fluorescens fra liposomer og ikke frit farvestof, som kunne have løsnet sig fra liposomer, blev kontrolmus injiceret med fluoresceinfarve (Fl) farvestof inkluderet (figur 5A).
En reduktion i liposomer (ved proxy af faldet i grønt fluorescerende signal) blev observeret i både limbus og sclera regioner over tid. Da liposomer blev injiceret fra det tidsmæssige til det overlegne område af underkonjunktivalrummet (figur 3), blev de naturligt placeret lige oven på den tidsmæssige og overlegne sclera (figur 4B), før de nåede andre regioner i underkonjunktivalrummet. På dag 1 efter injektionen var fluorescensen, der blev påvist i scleraen, op til 6 gange højere end limbuset for både tidsmæssige og overlegne regioner (figur 6). På dag 3 og dag 7 blev der observeret en signifikant reduktion af liposomer i sclera (60% fra dag 1 til dag 3 (dag 1→3) og 88% fra dag 3 til dag 7 (dag3→7)) i den tidsmæssige region med en reduktion på 66% og 93% for dag 1→3 og dag3→7 i de højere regioner, henholdsvis p < 0,001) (figur 6). Denne reduktion blev tilskrevet de okulære clearance mekanismer gennem blod og / eller lymfekar, der findes på bindehinden og episclera. Liposomer kunne også have spredt sig gennem sclera og blive ryddet af choroid, som også er meget vascularized.
Liposomer viste sig at have ryddet på en langsommere måde i limbus. For tidsmæssige limbus og overlegen limbus var ændringerne i fluorescenssignaler fra dag 1 til dag 3 efter injektionen ikke signifikante, hvilket indikerer, at neutrale liposomer har en præference for limbusregionen, især hornhindeagtig periferi (Figur 5B). Liposomer i limbusregionen begyndte at rydde fra dag 3 (d3→7: -89% for tidsmæssige (p < 0,01) og -53% for overlegen (p < 0,05)). På dag 7 blev mere end 90% af liposomer ryddet fra alle limbus regioner (p < 0,05) bortset fra overlegen limbus 1S, hvor 50% af liposomer stadig kunne påvises (p > 0,05). Dette er et tegn på, at opholdstiden for neutrale liposomer er meget højere i den overlegne limbus /hornhinde periferi (figur 5 og figur 6) sammenlignet med andre regioner. Den laveste mængde fluorescens blev påvist i næse- og ringereområderne på alle tidspunkter på grund af deres afstand fra injektionsstedet (figur 6A,B).
I mere omfattende undersøgelser af clearance af liposomer i øjet tidligere rapporteret1, har vi diskuteret et par ruter, hvor liposomer kunne ryddes fra okulære væv efter subkonjunktival injektion. Mens liposomer kan ryddes ved systemisk cirkulation og lymfe clearance gennem bindehinden, episclera, og choroid, som er meget vascularized, de kunne også nå dybere intraokulære væv ved passiv diffusion gennem sclera. Væskestrøm kan også transportere liposomer gennem trabekulær meshwork eller uveosclera udstrømning, som kan bringe liposomer tilbage til sclera. Eliminering gennem tårer er også muligt, og mindre lækager i injektionsstedet kan tillade hornhinde penetration gennem passiv diffusion.
Figur 1: Subkonjunktival injektion af liposomer i øjet. (A) Grafisk repræsentation af grøn-fluorescerende liposomer og subkonjunktival injektion. (B) Sammensætning og egenskaber af FL-DHPE dopet liposomal formulering til okulær CLM Imaging. (C) Grøn-fluorescerende liposomer danner en bleb ved subkonjunktival injektion. Dette tal er blevet tilpasset med tilladelse fra Chaw S.Y. et al.1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Tidslinje over okulær CLM procedure.
Figur 3: Øjekort til CLM-scanninger. Område 1 refererer til limbus-regionen, mens område 2 refererer til sclera-regionen. Videoer og billeder blev taget fra 1T i en retning mod uret, efterfulgt af 2T i en lignende retning mod uret. Da nålen blev indsat til injektion fra 2T til 2S, er interesseområder hovedsageligt 1T, 1S, 2T og 2S. Indsæt viser størrelsen af sonden i forhold til museøjet. Dette tal er blevet tilpasset med tilladelse fra Chaw S.Y. et al.1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Billedanalyse. (A) ImageJ-analyse af fluorescerende liposomer blev udført ved hjælp af interesseområder (ROI), der er defineret for limbus (L) og sclera (S) (B) Okulære regioner kvantificeret i limbusregionen for liposomtilstedeværelse. Mulige steder af liposomer opdaget i limbus er 1) hornhinde periferi, 2) limbus eller 3) sclera periferi. Dette tal er blevet tilpasset med tilladelse fra Chaw S.Y. et al.1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Kontrastfordelinger ved limbus og sclera. Kontrastfordeling ved limbus (1S: Superior, 1N: Nasal, 1I: Inferior, 1T: Temporal) og sclera (2S: Superior, 2N: Nasal, 2I: Inferior, 2T: Temporal) regioner af en repræsentativ mus fra hver kohorte (n=4) over 7 dage for (A) Fluorescein (Fl) kontrol, (B) 100 nm neutrale liposomer (POPC-100). Rød farve angiver EB-farvning. Skalalinjen = 50 μm. (C) Billeder taget samles på øjekortet for bedre forståelse. Dette tal er blevet tilpasset med tilladelse fra Chaw S.Y. et al.1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Clearance kinetik af 100 nm neutrale POPC liposomer i sclera (A) og limbus (B) regioner over 7 dage (n = 4 mus pr gruppe). Den gennemsnitlige fluorescensintensitet blev sammenlignet med 2-vejs ANOVA med flere sammenligninger med hensyn til det foregående tidspunkt. d1→3 og d3→7; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Repræsentative histologibilleder af tværgående sektioner (5 μm) af museøjet en dag efter injektion af Fl-DHPE-liposomer. Stiplede linjer angiver, hvor liposomer kan observeres, angivet med grøn farve. Skalalinje = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som det fremgår af resultaterne, CLM giver en enkel og mulig metode til at billedet den okulære fordeling af liposomer i øjet. Vi har tidligere demonstreret brugen af CLM til at karakterisere lokaliseringen af forskellige liposomale formuleringer i museøjet over tid1. Til ikke-invasive anvendelser tillader CLM realtidsbilleddannelse af den forreste okulære overflade for indsigt i, hvordan liposomer fordeles i øjet fra det samme dyr. Dette gør CLM egnet til pre-screen nanocarrier / DDS før mere omfattende kvantificering. I betragtning af de unikke fysiokemiske egenskaber ved forskellige DDS er det ret udfordrende at karakterisere sin underrumsfordeling ved konventionel histologi. Sidstnævnte ville kræve udtømmende afsnit af hele øjet og individuelle billeddannelse sektioner ved fluorescens mikroskopi for en samlet følelse af DDS clearance.
Efter aftale med CLM-billeder (Figur 5B,C) kunne vi observere grønne fluorescerende signaler ved histologi ved hornhinden, limbus og sclera-regionerne i øjet indsamlet ved dag 1 efter injektion af liposomer (Figur 7). Clm viste især bedre følsomhed end fluorescerende mikroskopi - liposomer ved scleraen kunne tydeligt påvises ved hjælp af CLM (figur 5), men næppe opdaget af fluorescensmikroskopet (figur 7). Signaltabet kan skyldes de vaske- og sektionsprocedurer, der påvirkede fastholdelsen af liposomer i vævssektioner. Selv om CLM er begrænset til at lokalisere det nøjagtige væv lag, hvor liposomer ophobes, det er absolut en mulig og relativt ligetil metode til at screene og vurdere kandidat okulære therapeutics ikke-invasivt i realtid.
Mens andre billeddannelsessystemer som in vivobilledsystemer og fluorometre også muliggør levende billeddannelse eller levende kvantificering af fluorescens i øjet, er de ikke så velegnede til formålet med denne undersøgelse. In vivo imaging systemer tilbyder ikke den rumlige opløsning, der kræves for at definere, hvor de terapeutiske er i det okulære rum. Man kan kun få en idé om, hvorvidt de terapeutiske er stadig til stede i det okulære rum og deres biodistribution, når du bruger in vivo imaging system20. Et fluorometer gør det muligt at måle fluorescens langs øjets optiske akse og bruges i vid udstrækning til at studere fysiologiske ændringer i øjet. Da det er vanskeligt at få nøjagtig den samme optiske akse scannet på hvert tidspunkt, kan et ensartet billedbillede ikke opretholdes. Dette er meget afgørende, især når man studerer fordelingen af narkotikaleveringssystemer, hvor deres opholdstid og clearance rate fra injektionsstedet er helt ukendt. Desuden ligger injektionsstedet og den fordeling, der forventes for subkonjunktival injektion, heller ikke inden for rækkevidden af den optiske akse.
Kritiske trin i protokollen omfatter nøje at følge et billedkort svarende til det øjekort, der vises i figur 3 , og mærkning af placeringerne nøjagtigt. Forkert mærkning eller afvigelse fra billeddannelsesstedet ville resultere i inkonsekvens i resultaterne. Da laserintensiteten kan justeres for hver scanning, er det vigtigt, at intensiteten er konsistent, for at kvantificeringen af forskellige tidspunkter kan sammenlignes. Det er også vigtigt, at sonden holdes fri for snavs under billeddannelsesprocessen. Da øjenslim kan blive fanget på sonden under billeddannelse, anbefales skylning af sonden i saltvand, hvis baggrundsværdierne stiger over den brugerdefinerede værdi.
Bortset fra subkonjunktival injektion har dette CLM-system også potentiale til at blive brugt til at studere andre okulære leveringsruter såsom administration af øjendråber og intravitreal injektion (IVT). Men på grund af begrænsningen i billeddannelse dybde, Det kan ikke være så nyttigt for IVT hvis injektionsstedet og dybere okulære væv er de vigtigste områder af interesse. CLM kan også bruges som en form for intravital billeddannelse til at studere fordelingen af DDS i andre organer eller væv. Selv om det sjældent har været ansat til at studere DDS distribution, endoskopisk konfokal mikroskopi er blevet brugt til billede betændelse forårsaget af parodontitis21, overvåge lungebetændelse og infektioner22,23 og effekten af lægemidler på angiogenese i tumorer24, hvilket indikerer en række andre mulige anvendelser for dette CLM-system.
Samlet set kan denne protokol tjene som et screeningstrin for at finde ud af, hvordan ændringer i DDS-formuleringer påvirker, hvor de bor eller akkumuleres, hvilket kan være afgørende for udformningen af et DDS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af NTU-Northwestern Institute for Nanomedicin (NNIN) tilskud tildelt (til SV) og dels af Singapore National Research Foundation Grant AG / CIV / GC70-C/NRF/2013/2 og Singapores Health and Biomedical Sciences (HBMS) Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) tilskud H18/01/a0/018 administreres af Agency for Science, Technology and Research (A*STAR) (til AMC). Tak til medlemmer fra Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) for at lette logistikken og udførelsen af studierne og træningen af udstyr. Særlig tak til Ms Wisna Novera for hendes redaktionelle bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
References
- Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery. Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).
- Kuo, J. C. -H., et al. Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins. Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).
- Wu, Y. -F., et al. A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).
- Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. In vivo confocal microscopy of the ocular surface. The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).
- Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system. Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).
- Sercombe, L., et al. Advances and challenges of liposome assisted drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).
- Koning, G. A., Storm, G. Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs. Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).
- Metselaar, J. M., Storm, G.
- Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium. Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).
- Hua, S., Wu, S. Y. The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies. Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).
- Sharma, A., Sharma, U. S. Liposomes in drug delivery: Progress and limitations. International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).
- Abrishami, M. M., et al. Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration. Retina. 29 (5), 699-703 (2009).
- Pleyer, U., et al. Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields. Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).
- Shen, Y., Tu, J. Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes. The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).
- Weijtens, O., et al. High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection. American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).
- Voss, K., et al. Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment. Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).
- Giarmoukakis, A., et al. Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results. Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).
- Shah, N. V., et al. Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice. Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).
- Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).
- Ezra-Elia, R., et al. Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice. Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).
- Movila, A., et al. Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis. Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).
- Vanherp, L., et al. Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice. Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).
- Chagnon, F., et al. In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs. Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).
- Yun, J. Y., et al. The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab. Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).
