Summary
Здесь мы предоставляем протокол для скрининга потенциальных факторов транскрипции, участвующих в развитии дендритных клеток (DC), с использованием лентивирусной трансдукции шРНК для получения стабильных нокдаун клеточных линий для дифференцировки dc in vitro .
Abstract
Дендритные клетки (ДК) являются важными антигенпрезентирующими клетками, которые связывают врожденные и адаптивные иммунные реакции. ДК неоднородны и могут быть разделены на обычные ДК (кДК) и плазмоцитоидные ДК (пДК). cDCs специализируется на представлении антигенов и активации наивных Т-клеток. С другой стороны, pDC могут производить большое количество интерферонов типа I (IFN-I) во время вирусной инфекции. Спецификация ДК происходит на ранней стадии предшественников ДК в костном мозге (БМ) и определяется сетью факторов транскрипции (ТФ). Например, кДК высоко экспрессируют ID2, в то время как pDC высоко экспрессируют E2-2. Поскольку выявляется все больше и больше подмножеств РС, растет интерес к пониманию конкретных ТФ, контролирующих разработку ЦОД. Здесь мы устанавливаем метод скрининга ТФ, критически важных для дифференцировки ДК in vitro , путем доставки лентивируса, несущего короткую шпильку РНК (шРНК), в увековеченную линию гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (iHSPC). После селекции и дифференцировки in vitro с помощью проточной цитометрии анализируются потенциал cDC и pDC стабильных нокдаун клеточных линий. Этот подход обеспечивает платформу для идентификации генов, потенциально управляющих судьбами DC от прародителей in vitro.
Introduction
РС являются ключевыми регуляторами врожденного и адаптивного иммунитета1. РС в основном классифицируются на две функционально различные популяции, а именно pDC и cDC. Кроме того, кДК включают два подмножества, а именно кДК типа I и типа II или cDC1 и cDC2, соответственно2. pDCs, экспрессирующие BST2, Siglec-H и промежуточные уровни CD11c у мышей3,4, являются клетками, которые могут секретировать большое количество IFN-I во время воспаления и вирусной инфекции5. Благодаря своей надежной способности производить IFN-I, они также подозреваются в том, что они играют ключевую роль в прогрессировании аутоиммунных заболеваний, включая системную красную волчанку (СКВ)6. cDC1s, определяемые поверхностной экспрессией XCR1, CD8a, CLEC9A и CD103 у мышей7, специализируются на активации и поляризации цитотоксических CD8+ Т-клеток (CTL) через перекрестную презентацию антигена, тем самым инициируя иммунитет типа I в ответ на внутриклеточные патогены и рак8,9. С другой стороны, cDC2s, экспрессирующие CD11b и CD172α (также известные как Sirpα) как у людей, так и у мышей, могут активировать CD4 + Т-клетки и способствовать иммунному ответу типа II против аллергена и паразитов10, а также модулировать иммунитет типа III после распознавания внеклеточных бактерий и микробиоты11,12.
Диверсификация ДК определяется группой ТФ из гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (ГСПЦ) в БМ. Е2-2 (кодируется Tcf4) является главным регулятором дифференцировки и функции пДК13,14. Напротив, ингибитор связывания ДНК 2 (ID2) управляет спецификацией cDC и ингибирует развитие pDC путем блокирования активности белка E15. Кроме того, разработка cDC1 требует IRF8 и BATF3, в то время как дифференциация cDC2 сильно зависит от IRF416. Недавние работы исследовали гетерогенность pDC17 и cDC и их транскрипционное регулирование18. Из-за сложности сети контроллеров домена существует неудовлетворенная потребность в создании платформы для идентификации других TF, контролирующих разработку и функциональность DC.
Здесь мы использовали iHSPC, который был получен путем экспрессии эстроген-регулируемой ядерной транслокации Hoxb8 в клетках BM (также называемых клетками Hoxb8-FL)19. iHSPC могут размножаться и оставаться в недифференцированной стадии в присутствии β-эстрадиола и лиганда Flt3 (FL), тогда как они начинают дифференцироваться на различные типы DC в присутствии FL при отмене β-эстрадиола19. Основываясь на этой особенности, мы можем сбить гены, представляющие интерес на стадии прародителя, с последующим изучением влияния на дифференцировку pDC и cDC in vitro. Таким образом, этот метод является мощным инструментом для обнаружения генов, которые регулируют развитие и функцию DC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Обращение с лентивирусом осуществляется в соответствии с правилами Департамента гигиены и безопасности окружающей среды Медицинского колледжа Национального университета Тайваня.
1. Подготовка увековеченных гемопоэтических стволовых и клеточных линий-предшественников (iHSPC)
- Поддерживать клеточную линию iHSPC в полной среде RPMI 1640, содержащей 100 нг/мл FL и 1 мкМ β-эстрадиола.
- Проходят клетки в соотношении 1:10 каждые 3 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте полную среду RPMI 1640, добавив 10% фетальную бычью сыворотку (FBS), 5 x 10-5 М β-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл гентамицина. Рекомбинантный мышиный FL также коммерчески доступен.
2. Лентивирусная трансдукция
- Пластинчатые iHSPC при плотности 1 х 105 ячеек/скважина в 12-луночных пластинах в 1 мл полной среды, содержащей 100 нг/мл FL, 1 мкМ β-эстрадиола и 8 мкг/мл полибрена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация полибрена зависит от типов клеток и обычно находится в пределах 4-8 мкг/мл. - Добавьте шРНК-несущий лентивирус в каждую лунку при множественности инфекции (MOI) 100.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лентивирусным вектором является pLKO.1-Puro с маркером отбора пуромицина (рисунок 1). Целевые последовательности шРНК против LacZ, Tcf4 и Id2 соответственно перечислены в Таблице материалов. MOI определяется количеством вирионов, которые добавляются на клетку во время инфекции.
- Вращайте пластины при 1 100 х г в течение 90 мин при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Спиновое заражение осуществляется с помощью ротора поворотного ковша. - Инкубировать пластину, содержащую инфицированные клетки, на ночь при 37 °C в инкубаторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки чувствительны к полибрену, то освежите клетки полной средой без полибрена после спин-инфекции. - Освежите клетки полной средой, содержащей 100 нг/мл FL и 1 мкМ β-эстрадиола через 24 ч после заражения.
- Добавьте 6 мкг/мл пуромицина в среду, чтобы отобрать инфицированные клетки еще через 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трансдуцированному лентивирусному вектору обычно требуется 48 ч для экспрессии генов, включая ген, устойчивый к пуромицину. Убедитесь, что концентрация пуромицина оптимизирована для каждой клеточной линии. - Обновляйте селекционную среду, содержащую 100 нг/мл FL, 1 мкМ β-эстрадиола и 6 мкг/мл пуромицина каждые 3 дня и поддерживайте клетки в течение по меньшей мере одной недели для расширения стабильно трансдуцированных клеток iHSPC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение пуромицина обычно вступает в силу через 48 ч, и период отбора зависит от типов клеток.
3. Измерение эффективности нокдауна методом обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР)
- Экстрагируйте общую РНК из 1 x 107 shLacZ, shTcf4 и shId2 стабильных нокдаун клеток iHSPC с использованием коммерческого реагента экстракции РНК и осадите РНК из водного слоя изопропанолом с последующим промывкой осадка РНК 75% этанолом.
- Растворите РНК (~ 5 мкг) 5 мкл обработанного DEPC H2O и отрегулируйте концентрацию до 1 мкг/мкл.
- Взять 1-3 мкг РНК, смешать с обработанным DEPC H2O до конечного объема 17,4 мкл, добавить 1 мкл 1 единицы/мкл ДНКазы без РНКазы I и инкубировать в течение 20 мин при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг заключается в переваривании геномной ДНК в образцах РНК. - Добавьте 1 мкл 20 мМ ЭДТА к образцам РНК, инкубируйте при 65 °C в течение 10 мин для инактивации ДНКазы I и поместите образцы РНК немедленно при 4 °C.
- Добавьте к образцам РНК 11,6 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл олиго (dT) праймеров (45 мкМ), 6 мкл 5x буфера 1-й цепи, 3 мкл dNTP (2 мМ), 0,6 мкл ингибитора РНКазы (50 единиц/мкл) и 1 мкл обратной транскриптазы (200 единиц / мкл) и инкубировать при 40 °C в течение 1 ч.
- Остановить реакцию нагреванием при 70 °C в течение 10 мин и разбавить реакционную смесь 30 мкл H2O.
- Возьмите 2 мкл разбавленной реакционной смеси ОТ в качестве шаблона ДНК и ПЦР амплируйте ее с помощью праймеров против Tcf4 или Id2 (см. Таблицу 1 для термоциклерных условий).
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности грунтовок включены в Таблицу материалов.
4. Дифференцировка in vitro стабильных нокдаун клеточных линий iHSPC
- Поддерживать стабильный одиночный нокдаун LacZ (shLacZ), Tcf4 (shTcf4) или Id2 (shId2) в iHSPC в полной среде, содержащей 100 нг/мл FL и 1 мкМ β-эстрадиола.
- Соберите недифференцированные iHSPC shLacZ, shTcf4 и shId2 в трубку объемом 15 мл и центрифугу в течение 5 мин при 500 х г , чтобы гранулировать клетки.
- Выбросьте супернатант и добавьте 10 мл PBS для промывки клеток. Повторите этот шаг дважды.
- Повторно суспендировать и засеять клетки iHSPC с плотностью 2 х 105 клеток/мл в 12-луночную пластину в 1 мл полной среды, содержащей только 100 нг/мл FL.
- Добавьте 1 мл свежей полной среды, содержащей 100 нг/мл FL через три дня.
- Анализ дифференцированных клеток (shLacZ, shTcf4 и shId2 iHSPCs) методом проточной цитометрии через два дня.
5. Проточный цитометрический анализ дифференцированных ДК
- Соберите ячейки в трубки по 1,5 мл, пипетируя ячейки вверх и вниз 2-3 раза в пластине, и центрифугу в течение 5 мин при 500 х г при комнатной температуре (RT).
ПРИМЕЧАНИЕ: Дифференцированные IN VITRO DC будут слегка прикрепляться к пластинам. Бережное пипетирование поможет восстановить DC с пластин. - Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки в 50 мкл буфера FACS. Затем добавляют 50 мкл супернатанта против CD16/32 гибридомы и инкубируют в течение 5-10 мин на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Fc-блокирующее антитело предотвращает неспецифическое связывание антител с Fc-рецепторами, экспрессирующимися на некоторых миелоидных клетках и В-клетках, и коммерчески доступно через различных поставщиков. - Добавляйте флуоресцентные краситель-конъюгированные антитела (0,04 мкг на каждое антитело) непосредственно в клетки и инкубируйте в течение 15 мин на льду в темноте. Используются антитела APC/cy7 против мыши CD11c, FITC против мыши CD11b и PE против мыши B220.
ПРИМЕЧАНИЕ: pDC определяются как CD11c+CD11b-B220+, а cDC определяются как CD11c+CD11b+B220-. - Промывайте ячейки 1 мл буфера FACS и центрифуги в течение 5 мин при 500 х г при RT.
- Повторное суспендирование клеток в 100 мкл буфера FACS и анализ с помощью проточной цитометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Показана карта лентивирусного вектора pLKO.1-Puro (рисунок 1). После доставки лентивируса, экспрессирующего шРНК против LacZ (нецелевой контроль), Tcf4 и Id2 в iHSPC, эффективность нокдауна, подтвержденная RT-qPCR, показала, что экспрессия Tcf4 была снижена в shTcf4 iHSPC по сравнению с shLacZ iHSPC (рисунок 2A). С другой стороны, снижение экспрессии Id2 также наблюдалось в shId2 iHSPC по сравнению с контролем shLacZ iHSPCs (рисунок 2B). Клеточные линии shLacZ, shTcf4 и shId2 iHSPC были дифференцированы на pDC и cDC in vitro с FL. После пятидневной культивирования shLacZ iHSPC частота клеток CD11c+, которые представляют популяцию постоянного тока7, составила около 95% (рисунок 3A, левая панель). Однако нокдаун Tcf4 или Id2 немного уменьшил генерацию CD11c+ DC (рисунок 3A, средняя и правая панель). Кроме того, дальнейший анализ CD11c+ DC показал, что shLacZ iHSPC дифференцируются на 70% cDC (CD11c + CD11b + B220 +) и 22% pDC (CD11c + CD11b-B220 +) (рисунок 3B, левая панель). Тем не менее, shTcf4 iHSPC генерировали значительно более низкий процент pDC (4%), чем контроль shLacZ (рисунок 3B, средняя панель). С другой стороны, iHSPC shId2 генерировали значительно более низкий процент cDC (54%), но более высокий процент pDC (39%), чем контроль shLacZ (рисунок 3B, правая панель). Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что iHSPC точно отражают одно и то же требование к факторам транскрипции для контроля развития DC.
Рисунок 1: Конструкция лентивирусного вектора pLKO.1-Puro. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Эффективность нокдауна shTcf4 и shId2. После стабильного нокдауна генов РНК выделяли из shLacZ, shTcf4 и shId2 iHSPC и обратно транскрибировали в кДНК, а экспрессию Tcf4 и Id2 измеряли с помощью RT-qPCR. Относительная экспрессия генов была нормализована до Rpl7. A. Экспрессия Tcf4 в shLacZ и shTcf4 iHSPC. В. Выражение Id2 в shLacZ и shId2 iHSPCs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Нокдаун Tcf4 ухудшает развитие pDC, тогда как нокдаун Id2 уменьшает генерацию cDC от iHSPC in vitro. iHSPC стабильно трансдуцировались с shLacZ, shTcf4 и shId2-несущими лентивирусами, а затем in vitro дифференцировали на DC с FL (100 нг/мл). После культивирования в течение 5 дней клетки окрашивали и анализировали методом проточной цитометрии. A. Показан процент клеток CD11c+. В. Показан анализ pDC (CD11c+B220+CD11b-) и cDC (CD11c+B220-CD11b+). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Реакция ПЦР | |||
| Стремянка | Температура | Время | Циклов |
| Начальная денатурация | 95°С | 3 минуты | 1 |
| Денатурация | 95°С | 15 секунд | 35-40 |
| Отжиг | 60°С | 20 секунд | |
| Расширение | 72°С | 20 секунд | |
| Окончательное расширение | 80°С | 20 секунд | 1 |
| Держать | 4°С | ∞ | 1 |
Таблица 1: Термоциклические условия для ПЦР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Векторы шРНК на основе лентивируса часто используются для глушения генов путем вирусной трансдукции в клетки и обеспечивают стабильную интеграцию в геном хозяина. Тем не менее, необходимо учитывать различную эффективность трансдукции в разных типах клеток, и для преодоления этой проблемы был принят ряд подходов.
Полибрен представляет собой поликатионный полимер, который может нейтрализовать заряды на клеточной мембране, тем самым усиливая связывание вириона с клетками во время трансдукции20. Хотя это эффективный способ увеличить скорость трансдукции, он также токсичен для некоторых типов клеток при добавлении чрезмерных количеств. В этом случае требуется проверить токсичность полибрена и оптимизировать концентрацию в разных клетках. Сульфат протамина, катионное соединение, возможно, альтернативный подход для повышения жизнеспособности клеток21. Кроме того, обновление полной среды в тот же день заражения может улучшить выживаемость после трансдукции.
Большинство систем доставки шРНК имеют селективный маркер для устранения клеток, которые не были успешно инфицированы. Лентивирусная система, которую мы использовали, содержит ген, устойчивый к пуромицину, так что инфицированные клетки могут быть выбраны после трансдукции. Кроме того, лентивирус, экспрессирующий GFP, также является еще одним вариантом для выбора. Тем не менее, у обоих методов есть как преимущества, так и недостатки. Использование пуромицина в качестве метода отбора трудно непосредственно измерить эффективность трансдукции, если экспрессия генов-мишеней не была подтверждена qPCR. Но пуромицин обеспечивает стресс для отбора, чтобы сохранить чужеродную ДНК внутри клеток и поддерживать фенотип нокдауна. Напротив, GFP также является методом отбора, который не обеспечивает нагрузку на клетки, хотя эффективность трансдукции может быть немедленно оценена с помощью проточной цитометрии.
Одним из ограничений этого метода является относительно небольшое количество клеток cDC1, генерируемых iHSPC in vitro19. Хотя iHSPC имеют потенциал pDC и cDC, управляемый FL in vitro, большинство генерируемых подтипов cDC - это cDC2s, но не cDC1. Вероятно, это связано с потребностью в передаче сигналов Notch во время дифференцировки in vitro cDC122. Таким образом, кокультура со стромальными клетками OP9-DL1, которые экспрессируют лиганд Notch Delta-like 1, может восстанавливать потенциал cDC1 iHSPC, тем самым улучшая механистические исследования cDC1s.
Применение этого протокола не только для исследования роли TF, но и для других генов, таких как метаболические гены, которые могут участвовать в разработке DC или других типов клеток. Новая концепция подчеркивает, что путь развития DC связан с различным клеточным метаболизмом23,24. Таким образом, нокдаун генов у предшественников DC является мощной стратегией для изучения метаболической регуляции в ответ на сигналы окружающей среды и определения того, как различные метаболические пути регулируют дифференцировку DC, сбивая критические гены в метаболизме25. С другой стороны, iHSPC обладают способностью дифференцироваться в миелоидные клетки за пределами линий DC, используя специфические факторы дифференцировки. Использование макрофагального колониестимулирующего фактора (М-СМЖ) и гранулоцитарно-колониестимулирующего фактора (G-CSF) приводит к развитию макрофагов и гранулоцитов, соответственно, из iHSPC19. Основываясь на той же стратегии, этот метод может также применяться к исследованию развития миелоидных клеток.
В совокупности описанный протокол от нокдауна гена до дифференцировки iHSPC in vitro обеспечивает быстрый и эффективный способ облегчить изучение развития DC и отвечает на фундаментальные вопросы развития иммунных клеток в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарны за техническую поддержку д-ру Ц-Лин Чену. Мы благодарим Национальный основной фонд RNAi (Academia Sinica, Тайвань) за предоставление дРНК-лентивируса (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Эта работа была поддержана Министерством науки и технологий Тайваня (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 и MOST 109-2320-B-002-054-MY3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117324 | (Clone: N418) |
| FITC anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101206 | (Clone: M1/70) |
| PE anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103208 | (Clone: RA3-6B2) |
| Cell culture | |||
| 1.5 mL Micro tube | ExtraGene | TUBE-170-C | |
| 12-well tissue culture-treated plate | Falcon | 353043 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| RPMI 1640 medium | gibco | 11875-085 | |
| Reagent | |||
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758-250MG | |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| FACS buffer | home-made | Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3 | |
| Flt3 ligand (FL) | home-made | ||
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| TRIsure | BIOLINE | BIO-38032 | |
| shRNA (Taregt sequence/clone ID) | Company | ||
| shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) | The RNAi Consortium (TRC) |
References
- Steinman, R. M., Witmer, M. D. Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).
- Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
- Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12. Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).
- Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).
- Liu, Y. -J. IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).
- Panda, S. K., Kolbeck, R., Sanjuan, M. A.
- Durai, V., Murphy, K. M.
- Mashayekhi, M., et al. CD8α(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites. Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. -A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
- Persson, E. K., et al. IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation. Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).
- Kumamoto, Y., et al. CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity. Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Grajkowska, L. T., et al. Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification. Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).
- Jackson, J. T., et al. Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8α+ and CD103+ dendritic cell lineages. The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).
- Suzuki, S., et al. Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).
- Rodrigues, P. F., et al. Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells. Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).
- Brown, C. C., et al. Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity. Cell. 179 (4), 846-863 (2019).
- Redecke, V., et al. Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential. Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection. Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).
- Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer. Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).
- Kirkling, M. E., et al. Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells. Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).
- Pearce, E. J., Everts, B.
- Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information. Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).
- Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
