Summary
Her leverer vi en protokol til screening af potentielle transskriptionsfaktorer, der er involveret i udviklingen af dendritiske celle (DC) ved hjælp af lentiviral transduktion af shRNA for at opnå stabile knockdown cellelinjer til in vitro DC differentiering.
Abstract
Dendritiske celler (DC'er) er vigtige antigen-præsentere celler, der forbinder medfødte og adaptive immunresponser. DCs er heterogene og kan opdeles i konventionelle DCs (cDC'er) og plasmacytoide DCs (pc'er). cDC'er har specialiseret sig i at præsentere antigener for og aktivere naive T-celler. På den anden side kan pc'er producere store mængder type I interferoner (IFN-I) under virusinfektion. Specifikationen af DC'er sker på et tidligt stadium af DC-stamfaderer i knoglemarven (BM) og defineres af et netværk af transskriptionsfaktorer (TF'er). CDC'er udtrykker f.eks. i høj grad ID2, mens pc'er udtrykker E2-2 meget. Da der identificeres flere og flere delmængder af DCs, er der en stigende interesse for at forstå specifikke TF'er, der kontrollerer dc-udvikling. Her etablerer vi en metode til at screene TFs kritisk for DC'er differentiering in vitro ved at levere lentivirus transporterer korte hårnål RNA (shRNA) i en udødeliggjort hæmatopoietic stilk og stamcelle (iHSPCs) linje. Efter udvælgelse og in vitro differentiering, cDC og pDC potentiale af de stabile knockdown cellelinjer analyseres af flow cytometri. Denne tilgang giver en platform til at identificere gener potentielt styre DC skæbner fra forfædre in vitro.
Introduction
DCs er centrale regulatorer af medfødt og adaptiv immunitet1. DCs er hovedsageligt klassificeret i to funktionelt forskellige populationer, nemlig pc'er og cDC'er. CDC'er omfatter desuden to delsæt, nemlig henholdsvis type I og type II cDC1'er eller cDC2'ere2. pc'er, der udtrykker BST2, Siglec-H, og mellemliggende niveauer af CD11c i mice3,4, er de celler, der kan udskille store mængder af IFN-I under betændelse og virusinfektion5. På grund af deres robuste IFN-I-producerende evne mistænkes de også for at spille en central rolle i udviklingen af autoimmune sygdomme, herunder systemisk lupus erythematosus (SLE)6. cDC1'er, der er defineret ved overfladeudtryk af XCR1-, CD8a-, CLEC9A- og CD103 i mus7, er specialiseret i aktivering og polarisering af cytotoksiske CD8+ T-celler (CTL' er) gennem antigenkrydspræsentationen og indleder derved type I-immunitet som reaktion på intracellulære patogener og cancer8,9. På den anden side kan cDC2'er, der udtrykker CD11b og CD172α (også kendt som Sirpα) hos både mennesker og mus, aktivere CD4+ T-celler og fremme type II immunrespons mod allergen og parasitter10 samt modulere type III immunitet efter ekstracellulære bakterier og mikrobiotagenkendelse11,12.
Diversificering af DCs bestemmes af en gruppe TF'er fra hæmatooietiske stamceller og stamceller (HSPCs) i BM. E2-2 (kodet af Tcf4) er en hovedregulator for differentiering og funktion af pc'er13,14. I modsætning hertil driver hæmmeren af DNA-binding 2 (ID2) cDC-specifikationen og hæmmer udviklingen af pDC ved at blokere E-proteinaktivitet15. Desuden kræver udviklingen af cDC1'er IRF8 og BATF3, mens differentiering af cDC2'er i høj grad afhænger af IRF416. Nylige værker har undersøgt heterogeniteten af pc'er17 og cDC'er og deres transskriptionsforordning18. På grund af kompleksiteten af DC-netværket er der et uopfyldt behov for at etablere en platform til at identificere andre TF'er, der styrer udviklingen og funktionaliteten af DC'er.
Her brugte vi en iHSPC, der blev genereret ved at udtrykke østrogenreguleret nuklear translokation af Hoxb8 i BM-celler (også kaldet Hoxb8-FL-celler)19. iHSPCs kan formere sig og forblive i en udifferentieret fase i nærværelse af β-estradiol og Flt3 ligand (FL), mens de begynder at differentiere sig til forskellige DC typer i nærværelse af FL ved tilbagetrækning af β-estradiol19. Baseret på denne funktion kan vi slå gener af interesse ned i stamfaderstadiet, efterfulgt af at undersøge effekten på in vitro differentiering af pc'er og CDC'er. Derfor er denne metode et kraftfuldt værktøj til at opdage de gener, der regulerer udviklingen og funktionen af DC'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Håndtering af lentivirus udføres i henhold til reguleringen af Department of Environmental Health and Safety of National Taiwan University College of Medicine.
1. Forberedelse af udødeliggjorte hæmatooietic stilk og stamfader cellelinjer (iHSPCs)
- Vedligehold iHSPC-cellelinje i komplet RPMI 1640-medium, der indeholder 100 ng/mL FL og 1 μM β estradiol.
- Passage cellerne på et forhold på 1:10 hver 3 dage.
BEMÆRK: Lav komplet RPMI 1640 medium ved at supplere med 10% fosterkvægserum (FBS), 5 x 10-5 M β-mercaptoethanol og 10 μg/mL gentamicin. Recombinant murine FL er også kommercielt tilgængelig.
2. Lentiviral transduktion
- Plade iHSPCs ved en densitet på 1 x 105 celler/brønd i 12-brønds plader i 1 mL komplet medium, der indeholder 100 ng/mL FL, 1 μM β-estradiol og 8 μg/mL polybrene.
BEMÆRK: Koncentrationen af polybren afhænger af celletyperne og ligger normalt i intervallet 4-8 μg/mL. - Tilføj shRNA-regnskabsmæssig lentivirus i hver brønd ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 100.
BEMÆRK: Den lentiviral vektor er pLKO.1-Puro med en puromycin udvælgelsesmarkør (Figur 1). Målsekvenserne for shRNA'er mod henholdsvis LacZ, Tcf4 og Id2 er angivet i materialetabellen. MOI defineres af antallet af virions, der tilsættes pr. celle under infektion.
- Drej pladerne ved 1.100 x g i 90 min ved 37 °C.
BEMÆRK: Spininfektion udføres ved hjælp af en svingspandrotor. - Pladen, der indeholder inficerede celler, inkuberes natten over ved 37 °C i en inkubator.
BEMÆRK: Hvis cellerne er følsomme over for polybren, skal cellerne opdateres med hele mediet uden polybrene efter spininfektionen. - Opfrisk celler med komplet medium, der indeholder 100 ng/mL FL og 1 μM β-estradiol 24 timer efter infektionen.
- Der tilsættes 6 μg/mL puromycin til mediet for at vælge de inficerede celler efter yderligere 24 timer.
BEMÆRK: Transduced lentiviral vektor tager normalt 48 timer for at udtrykke gener, herunder puromycin resistente gen. Sørg for, at koncentrationen af puromycin er optimeret til hver cellelinje. - Udfri udvælgelsesmediet, der indeholder 100 ng/mL FL, 1 μM β-estradiol og 6 μg/mL puromycin hver 3. dag, og hold cellerne i mindst en uge for at udvide de stabilt transduced iHSPC-celler.
BEMÆRK: Puromycin-markeringen træder normalt i kraft 48 timer senere, og udvælgelsesperioden afhænger af celletyper.
3. Måling af knockdown effektivitet ved omvendt transskription og real-time PCR (RT-PCR)
- Uddrag i alt RNA fra 1 x 107 shLacZ, shTcf4 og shId2 stabile knockdown iHSPC celler ved hjælp af kommercielle RNA ekstraktion reagens og bundfald RNA fra vandige lag med isopropanol, efterfulgt af vask af RNA bundfald med 75% ethanol.
- RNA (~ 5 μg) opløses med 5 μL DEPC-behandlet H2O og juster koncentrationen til 1 μg/μL.
- Tag 1-3 μg RNA, bland med DEPC-behandlet H2O til et endeligt volumen på 17,4 μL, tilsæt 1 μL 1 enhed/μL RNasefri DNase I og inkuber i 20 min ved 37 °C.
BEMÆRK: Dette trin er at fordøje det genomiske DNA i RNA-prøverne. - Der tilsættes 1 μL på 20 mM EDTA til RNA-prøverne, inkuberes ved 65 °C i 10 min. for at inaktivere DNase I, og RNA-prøverne straks sættes ved 4 °C.
- Der tilsættes 11,6 μL af reaktionsmikset , der indeholder 1 μL oligo (dT)primere (45 μM), 6 μL på 5x 1st-strengbuffer, 3 μL dNTP (2 mM), 0,6 μL RNase-hæmmer (50 Unit/μL) og 1 μL omvendt transskriptase (200 enhed/μL) til RNA-prøverne og inkuberes ved 40 °C i 1 h.
- Reaktionen standses ved opvarmning ved 70 °C i 10 min og fortynd reaktionsmikset med 30 μL H2O.
- Tag 2 μL af det fortyndede RT-reaktionsmiks som DNA-skabelon, og PCR forstærker den ved hjælp af primere mod Tcf4 eller Id2 (se tabel 1 for termocykelforhold).
BEMÆRK: Primersekvenserne er inkluderet i materialetabellen.
4. In vitro differentiering af de stabile knockdown iHSPC cellelinjer
- Bevar den stabile enkelt knockdown af LacZ (shLacZ), Tcf4 (shTcf4) eller Id2 (shId2) i iHSPCs i komplet medium, der indeholder 100 ng/mL FL og 1 μM β-estradiol.
- Saml shLacZ, shTcf4 og shId2 ikke-differentierede iHSPCs i et 15 mL rør og centrifuge i 5 min ved 500 x g for at pille cellerne.
- Kassér supernatanten, og tilsæt 10 mL PBS for at vaske cellerne. Gentag dette trin to gange.
- Brug og frø iHSPC-cellerne ved en massefylde på 2 x 105 celler/mL i en 12-brønds plade i 1 mL komplet medium, der kun indeholder 100 ng/mL FL.
- Der tilsættes 1 mL frisk komplet medium, der indeholder 100 ng/mL FL tre dage senere.
- Analyser de differentierede celler (shLacZ, shTcf4 og shId2 iHSPCs) efter flowcytometri to dage senere.
5. Flowcytometrisk analyse af de differentierede DCs
- Saml cellerne i 1,5 ML rør ved pipetter cellerne op og ned 2-3 gange i pladen, og centrifuge i 5 min ved 500 x g ved stuetemperatur (RT).
BEMÆRK: In vitro differentierede DCs vil lidt fastgør til pladerne. Blid pipettering hjælper med at gendanne DCs fra pladerne. - Kassér supernatanten og brug cellerne igen i 50 μL FACS-buffer. Derefter tilsættes 50 μL anti-CD16/32 hybridoma supernatant og inkuberes i 5-10 min på is.
BEMÆRK: Det amerikanske antistof forhindrer uspecifik binding af antistoffer mod Fc-receptorer, der udtrykker på nogle myeloidceller og B-celler, og er kommercielt tilgængelig via forskellige leverandører. - Der tilsættes fluorescerende farvekonjugeret antistoffer (0,04 μg for hvert antistof) direkte til cellerne og inkuberes i 15 min. på is i mørke. De anvendte antistoffer er APC/cy7 anti-mus CD11c, FITC anti-mus CD11b, og PE anti-mus B220.
BEMÆRK: PcDC'er defineres som CD11c+CD11b-B220+, og cDC'er defineres som CD11c+CD11b+B220-. - Vask celler med 1 mL FACS buffer og centrifuge i 5 min ved 500 x g ved RT.
- Brug cellerne igen i 100 μL FACS-buffer og analyseres efter flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kortet over lentiviral vektor pLKO.1-Puro er vist (Figur 1). Efter levering af lentivirus, der udtrykker shRNA mod LacZ (en ikke-målretningskontrol), Tcf4 og Id2 i iHSPCs, viste knockdown-effektiviteten, der blev bekræftet af RT-qPCR, at Tcf4's udtryk blev reduceret i shTcf4 iHSPCs sammenlignet med shLacZ iHSPCs (Figur 2A). På den anden side blev det reducerede udtryk for Id2 også observeret i shId2 iHSPCs sammenlignet med shLacZ iHSPCs control (Figur 2B). ShLacZ-, shTcf4- og shId2 iHSPCs-cellelinjerne blev differentieret i pc'er og cDC'er in vitro med FL. Efter fem-dages kultur shLacZ iHSPCs, hyppigheden af CD11c + celler, som repræsenterer DC befolkning7, var omkring 95% (Figur 3A, venstre panel). Knockdown af Tcf4 eller Id2 faldt dog en smule i produktionen af CD11c+ DCs (Figur 3A, mellem- og højrepanel). Desuden viste yderligere analyse af CD11c+ DCs, at shLacZ iHSPCs differentierede i 70% af cDC'er (CD11c+CD11b+B220+) og 22 % af pc'er (CD11c+CD11b-B220+) (figur 3B, venstre panel). ShTcf4 iHSPCs genererede dog en betydeligt lavere procentdel af pc'er (4 %) end shLacZ-styring (Figur 3B, mellempanel). På den anden side genererede shId2 iHSPCs en betydeligt lavere procentdel af cDC'er (54%), men en højere procentdel af pc'er (39%) end shLacZ-styring (Figur 3B, højre panel). Derfor tyder disse resultater på, at iHSPCs trofast afspejler det samme krav om transskriptionsfaktorer til styring af dc-udvikling.
Figur 1: Konstruktionen af lentiviral vektor pLKO.1-Puro. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Knockdown effektiviteten af shTcf4 og shId2. Efter stabil gen knockdown blev RNA'er isoleret fra shLacZ, shTcf4 og shId2 iHSPCs og omvendt transskriberet til cDNA, og udtrykket Tcf4 og Id2 blev målt ved RT-qPCR. Relativ genekspression blev normaliseret til Rpl7. En. Udtrykket Tcf4 i shLacZ og shTcf4 iHSPCs. B. Udtrykket id2 i shLacZ og shId2 iHSPCs. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Knockdown af Tcf4 svækker udviklingen af PDC, mens knockdown af Id2 reducerer cDC-generering fra iHSPCs in vitro. iHSPCs blev stabilt transduced med shLacZ, shTcf4, og shId2-regnskabsmæssige lentivirus, derefter in vitro differentieret i DC'er med FL (100 ng/mL). Efter kultur i 5 dage blev cellerne farves og analyseret af flowcytometri. En. Procentdelen af CD11c+-celler vises. B. Analysen af pc'er (CD11c+B220+CD11b-) og cDC'er (CD11c+B220-CD11b+) vises. Klik her for at se en større version af dette tal.
| PCR-reaktion | |||
| Trin | Temperatur | Tidspunkt | Cykler |
| Indledende denaturering | 95 °C | 3 minutter | 1 |
| Denaturering | 95 °C | 15 sekunder | 35-40 |
| Udglødning | 60°C | 20 sekunder | |
| Forlængelse | 72 °C | 20 sekunder | |
| Endelig forlængelse | 80 °C | 20 sekunder | 1 |
| Holde | 4°C | ∞ | 1 |
Tabel 1: Termocykelforhold for PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lentivirus-baserede shRNA vektorer bruges ofte til genhæmning ved viral transduktion i celler og tillader stabil integration i værtsgenomet. Der skal dog tages hensyn til forskellige transduktionseffektivitet i forskellige celletyper, og der er taget en række metoder til at løse dette problem.
Polybrene er en polycationisk polymer, der kan neutralisere afgifterne på cellemembranen og derved øge bindingen af virionen til cellerne under transduktion20. Selv om det er en effektiv måde at øge transduktion sats, Det er også giftigt for nogle celletyper, når du tilføjer store mængder. I dette tilfælde er det nødvendigt at teste polybrenes toksicitet og optimere koncentrationen i forskellige celler. Protamin sulfat, en kationisk forbindelse, måske en alternativ tilgang til at øge celle levedygtighed21. Desuden kan opdatere komplette medier på samme dag med infektion forbedre represent overlevelsesraten efter transduktion.
De fleste shRNA-leveringssystemer har en selektiv markør for at eliminere celler, der ikke er blevet inficeret med succes. Det lentiviral system, vi brugte, indeholder et puromycinresistent gen, så de inficerede celler kunne vælges efter transduktion. Desuden lentivirus udtrykker GFP er også en anden mulighed for udvælgelsen. Der er dog både fordele og ulemper ved begge metoder. Brug af puromycin som udvælgelsesmetode er svært at måle transduktionseffektiviteten direkte, medmindre udtrykket af målgener blev bekræftet af qPCR. Men puromycin giver stress for udvælgelse for at holde den udenlandske DNA inde i cellerne og opretholde knockdown fænotype. I modsætning hertil er GFP også en udvælgelsesmetode, der ikke giver stress til cellerne, selvom transduktionseffektiviteten straks kan evalueres ved flowcytometri.
En af begrænsningerne ved denne metode er det relativt lille antal cDC1-celler, der genereres af iHSPCs in vitro19. Selvom iHSPCs har pc'er og cDC'er potentiale drevet af FL in vitro, er de fleste af de genererede cDC-undertyper cDC2s, men ikke cDC1s. Dette skyldes sandsynligvis kravet om Notch-signalering under in vitro cDC1 differentiering22. Derfor kan samkultur med OP9-DL1 stromale celler, der udtrykker Notch ligand Delta-lignende 1 genoprette cDC1 potentiale i IHSPCs, og dermed forbedre de mekanistiske undersøgelser af cDC1s.
Anvendelsen af denne protokol ikke kun til undersøgelse af TFs rolle, men også for andre gener, som metaboliske gener, der sandsynligvis vil deltage i udviklingen af DC'er eller andre celletyper. Et nyt koncept fremhæver, at DC udviklingsmæssige vej er forbundet med forskellige cellulære metabolisme23,24. Derfor gen knockdown i DC forfædre er en stærk strategi for at studere metabolisk regulering som reaktion på miljømæssige signaler og bestemme, hvordan forskellige metaboliske veje regulere DC differentiering ved at vælte kritiske gener i stofskiftet25. På den anden side har iHSPCs kapacitet til at differentiere sig til myeloide celler ud over DC slægter ved at udnytte specifikke differentiering faktorer. Brugen af makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og granulocytekolonistimulerende faktor (G-CSF) resulterer i udvikling af henholdsvis makrofager og granulocytter fra iHSPCs19. Baseret på den samme strategi, denne metode kunne også gælde for forskning i myeloid celle udvikling.
Samlet set giver den beskrevne protokol fra gen knockdown til in vitro differentiering af iHSPCs en hurtig og effektiv måde at lette studiet af DC udvikling og besvarer grundlæggende spørgsmål om immuncelleudvikling i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for teknisk support fra Dr. Tz-Ling Chen. Vi takker National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taiwan) for at levere shRNA lentivirus (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 og MOST 109-2320-B-002-054-MY3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117324 | (Clone: N418) |
| FITC anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101206 | (Clone: M1/70) |
| PE anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103208 | (Clone: RA3-6B2) |
| Cell culture | |||
| 1.5 mL Micro tube | ExtraGene | TUBE-170-C | |
| 12-well tissue culture-treated plate | Falcon | 353043 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| RPMI 1640 medium | gibco | 11875-085 | |
| Reagent | |||
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758-250MG | |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| FACS buffer | home-made | Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3 | |
| Flt3 ligand (FL) | home-made | ||
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| TRIsure | BIOLINE | BIO-38032 | |
| shRNA (Taregt sequence/clone ID) | Company | ||
| shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) | The RNAi Consortium (TRC) |
References
- Steinman, R. M., Witmer, M. D. Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).
- Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
- Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12. Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).
- Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).
- Liu, Y. -J. IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).
- Panda, S. K., Kolbeck, R., Sanjuan, M. A.
- Durai, V., Murphy, K. M.
- Mashayekhi, M., et al. CD8α(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites. Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. -A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
- Persson, E. K., et al. IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation. Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).
- Kumamoto, Y., et al. CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity. Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Grajkowska, L. T., et al. Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification. Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).
- Jackson, J. T., et al. Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8α+ and CD103+ dendritic cell lineages. The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).
- Suzuki, S., et al. Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).
- Rodrigues, P. F., et al. Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells. Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).
- Brown, C. C., et al. Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity. Cell. 179 (4), 846-863 (2019).
- Redecke, V., et al. Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential. Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection. Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).
- Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer. Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).
- Kirkling, M. E., et al. Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells. Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).
- Pearce, E. J., Everts, B.
- Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information. Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).
- Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
