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Immunology and Infection

एक हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज सेल लाइन इन विट्रो में शॉर्ट हेयरपिन आरएनए-मध्यस्थता जीन नॉकडाउन द्वारा डेंड्राइटिक सेल विकास का अध्ययन

Published: March 7, 2022 doi: 10.3791/62730
Automatic Translation
1, 2, 1
1Graduate Institute of Immunology, National Taiwan University College of Medicine, 2Department of Pathology, Division of Microbiology and Immunology, University of Utah

Summary

यहां हम इन विट्रो डीसी भेदभाव के लिए स्थिर नॉकडाउन सेल लाइनों को प्राप्त करने के लिए shRNA के लेंटिवारल ट्रांसडक्शन का उपयोग करके डेंड्राइटिक सेल (डीसी) के विकास में शामिल संभावित प्रतिलेखन कारकों की स्क्रीनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Abstract

डेंड्राइटिक कोशिकाएं (डीसी) महत्वपूर्ण एंटीजन-प्रस्तुत करने वाली कोशिकाएं हैं जो जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को जोड़ती हैं। डीसी विषम हैं और इन्हें पारंपरिक डीसी (सीडीसी) और प्लाज्मासाइटोइड डीसी (पीडीसी) में विभाजित किया जा सकता है। cDCs करने के लिए एंटीजन प्रस्तुत करने और भोले टी कोशिकाओं को सक्रिय करने में माहिर हैं. दूसरी ओर, पीडीसी वायरल संक्रमण के दौरान बड़ी मात्रा में टाइप I इंटरफेरॉन (IFN-I) का उत्पादन कर सकते हैं। डीसी का विनिर्देश अस्थि मज्जा (बीएम) में डीसी पूर्वजों के प्रारंभिक चरण में होता है और प्रतिलेखन कारकों (टीएफ) के नेटवर्क द्वारा परिभाषित किया जाता है। उदाहरण के लिए, cDCs अत्यधिक व्यक्त ID2, जबकि pDCs अत्यधिक E2-2 व्यक्त करते हैं। चूंकि डीसी के अधिक से अधिक सबसेट की पहचान की जा रही है, इसलिए डीसी विकास को नियंत्रित करने वाले विशिष्ट टीएफ को समझने में रुचि बढ़ रही है। यहां, हम एक अमर हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज सेल (आईएचएसपीसी) लाइन में छोटे हेयरपिन आरएनए (shRNA) को ले जाने वाले लेंटीवायरस को वितरित करके विट्रो में डीसी भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण टीएफ को स्क्रीन करने के लिए एक विधि स्थापित करते हैं। चयन और इन विट्रो भेदभाव के बाद, स्थिर नॉकडाउन सेल लाइनों की सीडीसी और पीडीसी क्षमता का विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया जाता है। यह दृष्टिकोण विट्रो में पूर्वजों से संभावित रूप से डीसी भाग्य को नियंत्रित करने वाले जीन की पहचान करने के लिए एक मंच प्रदान करता है।

Introduction

डीसी जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा 1 के प्रमुख नियामक हैं। डीसी को मुख्य रूप से दो कार्यात्मक रूप से अलग-अलग आबादी में वर्गीकृत किया जाता है, अर्थात् पीडीसी और सीडीसी। इसके अलावा, cDCs में दो सबसेट शामिल हैं, अर्थात्, टाइप I और टाइप II cDCs या cDC1s और cDC2s, क्रमशः। पीडीसी, बीएसटी 2, सिग्लेक-एच, और चूहों 3, 4 में सीडी 11 सी के मध्यवर्ती स्तरों को व्यक्त करते हुए, कोशिकाएं हैं जो सूजन और वायरल संक्रमण 5 के दौरान बड़ी मात्रा में आईएफएन-आई का स्राव कर सकती हैं। उनकी मजबूत आईएफएन-आई-उत्पादक क्षमता के कारण, उन्हें ऑटोइम्यून बीमारियों की प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने का भी संदेह है, जिसमें प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमेटोसस (एसएलई) 6 शामिल हैं। cDC1s, XCR1, CD8a, CLEC9A, और MICE7 में CD103 की सतह अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित, एंटीजन क्रॉस-प्रस्तुति के माध्यम से साइटोटोक्सिक CD8 + T कोशिकाओं (CTLs) के सक्रियण और ध्रुवीकरण में विशिष्ट हैं, जिससे इंट्रासेल्युलर रोगजनकों और कैंसर 8,9 के जवाब में प्रकार I प्रतिरक्षा शुरू होती है। दूसरी ओर, CDC2s, दोनों मनुष्यों और चूहों में CD11b और CD172α (जिसे Sirpα के रूप में भी जाना जाता है) को व्यक्त करते हुए, CD4 + T कोशिकाओं को सक्रिय कर सकते हैं और एलर्जीन और परजीवी 10 के खिलाफ टाइप II प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ावा दे सकते हैं, साथ ही साथ बाह्य कोशिकीय बैक्टीरिया और माइक्रोबायोटा मान्यता 11,12 के बाद प्रकार III प्रतिरक्षा को संशोधित कर सकते हैं।

डीसी का विविधीकरण BM में हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं (HSPCs) से TFs के एक समूह द्वारा निर्धारित किया जाता है। E2-2 (Tcf4 द्वारा एन्कोडेड) pDCs13,14 के विभेदन और कार्य के लिए एक मास्टर नियामक है। इसके विपरीत, डीएनए बाइंडिंग 2 (आईडी 2) का अवरोधक सीडीसी विनिर्देश को चलाता है और ई प्रोटीन गतिविधि को अवरुद्ध करने के माध्यम से पीडीसी विकास को रोकता है। इसके अलावा, cDC1s के विकास के लिए IRF8 और BATF3 की आवश्यकता होती है, जबकि cDC2s का विभेदन अत्यधिक IRF416 पर निर्भर करता है। हाल के कार्यों ने pDCs17 और cDCs की विषमता और उनके ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन 18 का पता लगाया है। डीसी नेटवर्क की जटिलता के कारण, डीसी के विकास और कार्यक्षमता को नियंत्रित करने वाले अन्य टीएफ की पहचान करने के लिए एक मंच स्थापित करने की आवश्यकता है।

यहां, हमने एक आईएचएसपीसी का उपयोग किया जो बीएम कोशिकाओं में होक्सबी 8 के एस्ट्रोजन-विनियमित परमाणु स्थानांतरण को व्यक्त करके उत्पन्न किया गया था (जिसे होक्सबी 8-एफएल कोशिकाओं के रूप में भी जाना जाता है) 19। iHSPCs β-एस्ट्राडियोल और Flt3 लिगैंड (FL) की उपस्थिति में एक अविभाजित चरण में फैल सकते हैं और रह सकते हैं, जबकि वे β-एस्ट्राडियोल 19 की वापसी पर FL की उपस्थिति में विभिन्न डीसी प्रकारों में अंतर करना शुरू करते हैं। इस विशेषता के आधार पर, हम पूर्वज चरण में ब्याज के जीन को खटखटा सकते हैं, इसके बाद पीडीसी और सीडीसी के इन विट्रो भेदभाव पर प्रभाव की जांच कर सकते हैं। इसलिए, यह विधि उन जीनों की खोज करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है जो डीसी के विकास और कार्य को विनियमित करते हैं।

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Protocol

लेंटीवायरस की हैंडलिंग राष्ट्रीय ताइवान यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ मेडिसिन के पर्यावरणीय स्वास्थ्य और सुरक्षा विभाग के विनियमन के अनुसार की जाती है।

1. अमर हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज सेल लाइनों (iHSPCs) की तैयारी

  1. पूर्ण RPMI 1640 माध्यम में iHSPC सेल लाइन बनाए रखें जिसमें 100 ng / mL FL और 1 μM β-estradiol शामिल हैं।
  2. कोशिकाओं को हर 3 दिनों में 1:10 के अनुपात में पारित करें।
    नोट: 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 5 x 10-5 M β-mercaptoethanol, और 10 μg / mL gentamicin के साथ पूरक द्वारा पूर्ण RPMI 1640 माध्यम बनाएं। पुनः संयोजक murine FL भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है.

2. लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन

  1. 1 x 105 कोशिकाओं के घनत्व पर प्लेट iHSPCs / अच्छी तरह से 12-अच्छी तरह से प्लेटों में 100 ng / mL FL, 1 μM β-estradiol, और 8 μg / mL polybrene युक्त पूर्ण माध्यम के 1 mL में अच्छी तरह से प्लेट।
    नोट: polybrene की एकाग्रता सेल प्रकारों पर निर्भर करती है और आमतौर पर 4-8 μg / mL की सीमा में होती है।
  2. 100 के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता पर प्रत्येक कुएं में shRNA-ले जाने वाले lentivirus जोड़ें।
    नोट: lentiviral वेक्टर एक puromycin चयन मार्कर (चित्रा 1) के साथ pLKO.1-Puro है। LacZ, Tcf4, और Id2 के विरुद्ध shRNAs के लक्ष्य अनुक्रम, क्रमशः, सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं। MOI को virions की संख्या से परिभाषित किया जाता है जो संक्रमण के दौरान प्रति सेल जोड़ा जाता है।
    Equation 1
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए 1,100 x g पर प्लेटों को स्पिन करें।
    नोट: स्पिन संक्रमण एक स्विंग बाल्टी रोटर का उपयोग करके किया जाता है।
  4. एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए संक्रमित कोशिकाओं वाली प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    नोट:: यदि कोशिकाओं polybrene के प्रति संवेदनशील हैं, तो स्पिन संक्रमण के बाद polybrene के बिना पूर्ण माध्यम के साथ कोशिकाओं को ताज़ा करें।
  5. संक्रमण के बाद 100 एनजी / एमएल एफएल और 1 μM β-एस्ट्राडियोल 24 घंटे वाले पूर्ण माध्यम के साथ कोशिकाओं को ताज़ा करें।
  6. अतिरिक्त 24 घंटे के बाद संक्रमित कोशिकाओं का चयन करने के लिए माध्यम में प्यूरोमाइसिन के 6 μg / mL जोड़ें।
    नोट: ट्रांसड्यूस्ड लेंटिवायरल वेक्टर आमतौर पर जीन को व्यक्त करने के लिए 48 घंटे लेता है, जिसमें प्यूरोमाइसिन प्रतिरोधी जीन भी शामिल है। सुनिश्चित करें कि प्यूरोमाइसिन की एकाग्रता प्रत्येक सेल लाइन के लिए अनुकूलित है।
  7. 100 ng / mL FL, 1 μM β-estradiol, और 6 μg / mL puromycin युक्त चयन माध्यम को हर 3 दिनों में ताज़ा करें और स्थिर रूप से ट्रांसड्यूस किए गए iHSPC कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए कम से कम एक सप्ताह के लिए कोशिकाओं को बनाए रखें।
    नोट: प्यूरोमाइसिन चयन आमतौर पर 48 घंटे बाद प्रभावी होता है, और चयन की अवधि सेल प्रकारों पर निर्भर करती है।

3. रिवर्स प्रतिलेखन और वास्तविक समय पीसीआर (आरटी-पीसीआर) द्वारा नॉकडाउन दक्षता का मापन

  1. 1 x 107 shLacZ, shTcf4, और shId2 स्थिर नॉकडाउन iHSPC कोशिकाओं से कुल आरएनए निकालें वाणिज्यिक आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक का उपयोग करके और आइसोप्रोपेनॉल के साथ जलीय परत से आरएनए को अवक्षेपित करें, इसके बाद 75% इथेनॉल के साथ आरएनए अवक्षेप को धोएं।
  2. आरएनए (~ 5 μg) को डीईपीसी-उपचारित H2O के 5 μL के साथ भंग करें और एकाग्रता को 1 μg / μL में समायोजित करें।
  3. आरएनए के 1-3 μg ले लो, 17.4 μL की एक अंतिम मात्रा के लिए DEPC-उपचारित H2O के साथ मिश्रण, 1 इकाई / μL RNase मुक्त DNase I के 1 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: यह चरण आरएनए नमूनों में जीनोमिक डीएनए को पचाने के लिए है।
  4. आरएनए नमूनों में 20 mM EDTA के 1 μL जोड़ें, DNase I को निष्क्रिय करने के लिए 10 मिनट के लिए 65 °C पर इनक्यूबेट करें, और RNA नमूनों को तुरंत 4 °C पर रखें।
  5. 11.6 μL प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ें जिसमें ओलिगो (dT) प्राइमरों (45 μM) के 1 μL, 5x 1st स्ट्रैंड बफर के 6 μL, dNTP (2 mM) के 3 μL, RNase अवरोधक (50 यूनिट / μL) के 0.6 μL और रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (200 यूनिट / μL) के 1 μL को आरएनए नमूनों में जोड़ें और 1 h के लिए 40 °C पर इनक्यूबेट करें।
  6. 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करके प्रतिक्रिया को रोकें और H2O के 30 μL के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण को पतला करें।
  7. डीएनए टेम्पलेट के रूप में पतला आरटी प्रतिक्रिया मिश्रण के 2 μL लें और पीसीआर इसे Tcf4 या Id2 के खिलाफ प्राइमरों का उपयोग करके बढ़ाएं (थर्मोसाइकिलर स्थितियों के लिए तालिका 1 देखें)।
    नोट: प्राइमर अनुक्रम सामग्री की तालिका में शामिल हैं।

4. स्थिर नॉकडाउन iHSPC सेल लाइनों के इन विट्रो भेदभाव

  1. LacZ (shLacZ), Tcf4 (shTcf4), या Id2 (shId2) के स्थिर एकल नॉकडाउन को iHSPCs में पूर्ण माध्यम में बनाए रखें जिसमें FL के 100 ng / mL और 1 μM β-estradiol शामिल हैं।
  2. shLacZ, shTcf4, और shId2 संयुक्त राष्ट्र-विभेदित iHSPCs को 15 mL ट्यूब में इकट्ठा करें और कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 500 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. supernatant छोड़ें और कोशिकाओं को धोने के लिए PBS के 10 mL जोड़ें। इस चरण को दो बार दोहराएं।
  4. पुन: निलंबित और 2 x 105 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर iHSPC कोशिकाओं को एक 12-अच्छी तरह से प्लेट में 100 ng / mL FL युक्त पूर्ण माध्यम के 1 mL में बीज।
  5. तीन दिन बाद 100 एनजी / एमएल एफएल युक्त ताजा पूर्ण माध्यम के 1 एमएल जोड़ें।
  6. दो दिन बाद प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विभेदित कोशिकाओं (shLacZ, shTcf4, और shId2 iHSPCs) का विश्लेषण करें।

5. विभेदित डीसी के प्रवाह cytometric विश्लेषण

  1. प्लेट में 2-3 बार कोशिकाओं को ऊपर और नीचे पिपेट करके 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और कमरे के तापमान (आरटी) पर 500 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: इन विट्रो विभेदित डीसी प्लेटों के लिए थोड़ा संलग्न होगा। कोमल pipetting प्लेटों से डीसी को ठीक करने में मदद मिलेगी।
  2. supernatant को छोड़ें और FACS बफ़र के 50 μL में कोशिकाओं resuspend. इसके बाद, एंटी-CD16/32 hybridoma supernatant के 50 μL जोड़ें और बर्फ पर 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: Fc अवरुद्ध एंटीबॉडी कुछ माइलॉयड कोशिकाओं और बी कोशिकाओं पर व्यक्त Fc रिसेप्टर्स के लिए एंटीबॉडी के nonspecific बंधन को रोकता है और व्यावसायिक रूप से विभिन्न विक्रेताओं के माध्यम से उपलब्ध है।
  3. फ्लोरोसेंट डाई-संयुग्मित एंटीबॉडी (प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए 0.04 μg) को सीधे कोशिकाओं में जोड़ें और अंधेरे में बर्फ पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी APC/ cy7 एंटी-माउस CD11c, FITC एंटी-माउस CD11b और PE एंटी-माउस B220 हैं।
    नोट:: pDCs CD11c + CD11b-B220 + के रूप में परिभाषित किए गए हैं, और cDCs CD11c + CD11b + B220- के रूप में परिभाषित किए गए हैं।
  4. FACS बफर के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोएं और आरटी पर 500 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. FACS बफर के 100 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण करें।

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Representative Results

लेंटिवायरल वेक्टर pLKO.1-Puro का नक्शा दिखाया गया है (चित्र 1)। LacZ (एक गैर-लक्ष्यीकरण नियंत्रण), Tcf4, और iHSPCs में Id2 के खिलाफ shRNA व्यक्त lentivirus के वितरण के बाद, RT-qPCR द्वारा पुष्टि की नॉकडाउन दक्षता से पता चला है कि Tcf4 की अभिव्यक्ति shTcf4 iHSPCs में कम हो गई थी, shLacZ iHSPCs (चित्रा 2A) की तुलना में। दूसरी ओर, ShLacZ iHSPCs नियंत्रण (चित्रा 2B) की तुलना में, Id2 iHSPCs में Id2 की कम अभिव्यक्ति भी देखी गई थी। shLacZ, shTcf4, और shId2 iHSPCs सेल लाइनों को FL के साथ विट्रो में pDCs और cDCs में विभेदित किया गया था। shLacZ iHSPCs की पांच दिन की संस्कृति के बाद, CD11c+ कोशिकाओं की आवृत्ति, जो डीसी जनसंख्या 7 का प्रतिनिधित्व करती है, लगभग 95% (चित्रा 3A, बाएं पैनल) थी। हालांकि, Tcf4 या Id2 के नॉकडाउन ने CD11c + DC (चित्रा 3A, मध्य और दाएं पैनल) की पीढ़ी को थोड़ा कम कर दिया। इसके अलावा, CD11c + DC के आगे के विश्लेषण से पता चला है कि shLacZ iHSPCs cDCs के 70% (CD11c + CD11b + B220 +) और pDCs के 22% (CD11c + CD11b-B220 +) (चित्रा 3B, बाएं पैनल) में विभेदित है। हालांकि, shTcf4 iHSPCs ने shLacZ नियंत्रण (चित्रा 3B, मध्य पैनल) की तुलना में pDCs (4%) का काफी कम प्रतिशत उत्पन्न किया। दूसरी ओर, shId2 iHSPCs ने cDCs (54%) का काफी कम प्रतिशत उत्पन्न किया, लेकिन shLacZ नियंत्रण (चित्रा 3B, दाएं पैनल) की तुलना में pDCs (39%) का एक उच्च प्रतिशत उत्पन्न किया। इसलिए, इन परिणामों से पता चलता है कि आईएचएसपीसी डीसी विकास को नियंत्रित करने के लिए प्रतिलेखन कारकों की समान आवश्यकता को ईमानदारी से प्रतिबिंबित करते हैं।

Figure 1
चित्र 1: लेंटिवायरल वेक्टर pLKO.1-Puro का निर्माण। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: shTcf4 और shId2 की नॉकडाउन दक्षता। स्थिर जीन नॉकडाउन के बाद, आरएनए को shLacZ, shTcf4, और shId2 iHSPCs से अलग किया गया था और cDNA में उलटा ट्रांसक्रिप्ट किया गया था, और Tcf4 और Id2 की अभिव्यक्ति को RT-qPCR द्वारा मापा गया था। सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति को Rpl7 के लिए सामान्यीकृत किया गया था। एक। shLacZ और shTcf4 iHSPCs में Tcf4 की अभिव्यक्ति। बी। ShLacZ और shId2 iHSPCs में Id2 की अभिव्यक्ति. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: Tcf4 का नॉकडाउन पीडीसी विकास को बाधित करता है, जबकि Id2 का नॉकडाउन विट्रो में iHSPCs से cDC पीढ़ी को कम करता है। iHSPCs को shLacZ, shTcf4, और shId2-ले जाने वाले लेंटिवायरस के साथ स्थिर रूप से ट्रांसड्यूस किया गया था, फिर इन विट्रो को FL (100 ng / mL) के साथ डीसी में विभेदित किया गया था। 5 दिनों के लिए संस्कृति के बाद, कोशिकाओं को फ्लो साइटोमेट्री द्वारा दाग और विश्लेषण किया गया था। एक। CD11c+ कक्षों का प्रतिशत दिखाया गया है। बी। pDCs (CD11c+B220+CD11b-), और cDCs (CD11c+B220-CD11b+) के लिए विश्लेषण दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पीसीआर अभिक्रिया
सीढ़ी तापमान समय चक्र
प्रारंभिक विकृतीकरण 95°C 3 मिनट 1
विकृतीकरण 95°C 15 सेकंड 35-40
एनीलिंग 60°C 20 सेकंड
विस्तार 72°C 20 सेकंड
अंतिम विस्तार 80°C 20 सेकंड 1
पकड 4°C ∞ 1

तालिका 1: पीसीआर के लिए थर्मोसाइकिलर की स्थिति।

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Discussion

लेंटिवायरस-आधारित एसएचआरएनए वैक्टर का उपयोग अक्सर कोशिकाओं में वायरल ट्रांसडक्शन द्वारा जीन मौन के लिए किया जाता है और मेजबान जीनोम में स्थिर एकीकरण की अनुमति देता है। हालांकि, विभिन्न सेल प्रकारों में विभिन्न ट्रांसडक्शन दक्षता पर विचार करने की आवश्यकता है, और इस समस्या को दूर करने के लिए कई दृष्टिकोण अपनाए गए हैं।

Polybrene एक polycationic बहुलक है कि कोशिका झिल्ली पर आरोप बेअसर कर सकते हैं, जिससे transduction20 के दौरान कोशिकाओं के लिए virion के बंधन में वृद्धि. यद्यपि यह ट्रांसडक्शन दर को बढ़ाने का एक प्रभावी तरीका है, लेकिन अत्यधिक मात्रा में जोड़ते समय यह कुछ सेल प्रकारों के लिए भी विषाक्त है। इस मामले में, पॉलीब्रेन की विषाक्तता का परीक्षण करना और विभिन्न कोशिकाओं में एकाग्रता का अनुकूलन करना आवश्यक है। Protamine सल्फेट, एक catyonic यौगिक, शायद सेल viability21 बढ़ाने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण। इसके अलावा, संक्रमण के एक ही दिन पर पूर्ण मीडिया को ताज़ा करने से ट्रांसडक्शन के बाद जीवित रहने की दर का प्रतिनिधित्व किया जा सकता है।

अधिकांश shRNA वितरण प्रणालियों में उन कोशिकाओं को समाप्त करने के लिए एक चयनात्मक मार्कर होता है जो सफलतापूर्वक संक्रमित नहीं हुए हैं। हमारे द्वारा उपयोग की जाने वाली लेंटिवायरल प्रणाली में एक प्यूरोमाइसिन-प्रतिरोधी जीन होता है ताकि संक्रमित कोशिकाओं को ट्रांसडक्शन के बाद चुना जा सके। इसके अलावा, जीएफपी को व्यक्त करने वाला लेंटीवायरस भी चयन के लिए एक और विकल्प है। हालांकि, दोनों तरीकों के फायदे और नुकसान दोनों हैं। एक चयन विधि के रूप में प्यूरोमाइसिन का उपयोग करना सीधे ट्रांसडक्शन दक्षता को मापना मुश्किल है जब तक कि लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति की पुष्टि क्यूपीसीआर द्वारा नहीं की गई थी। लेकिन प्यूरोमाइसिन कोशिकाओं के अंदर विदेशी डीएनए को रखने और नॉकडाउन फेनोटाइप को बनाए रखने के लिए चयन के लिए तनाव प्रदान करता है। इसके विपरीत, जीएफपी भी एक चयन विधि है जो कोशिकाओं को तनाव प्रदान नहीं करती है, भले ही ट्रांसडक्शन दक्षता का तुरंत प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है।

इस विधि की सीमाओं में से एक विट्रो 19 में iHSPCs द्वारा उत्पन्न cDC1 कोशिकाओं की अपेक्षाकृत कम संख्या है। यद्यपि iHSPCs में विट्रो में FL द्वारा संचालित pDCs और cDCs क्षमता होती है, लेकिन उत्पन्न अधिकांश cDC उपप्रकार cDC2s होते हैं, लेकिन cDC1s नहीं होते हैं। यह इन विट्रो cDC1 differentiation22 के दौरान नॉच सिग्नलिंग की आवश्यकता के कारण होने की संभावना है। इसलिए, OP9-DL1 स्ट्रोमल कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति जो नॉच लिगैंड डेल्टा-जैसे 1 को व्यक्त करती है, आईएचएसपीसी की cDC1 क्षमता को बहाल कर सकती है, जिससे cDC1s पर यांत्रिक अध्ययन में सुधार हो सकता है।

इस प्रोटोकॉल का अनुप्रयोग न केवल टीएफ की भूमिका की जांच के लिए बल्कि अन्य जीनों के लिए भी, जैसे चयापचय जीन डीसी या अन्य सेल प्रकारों के विकास में भाग लेने की संभावना है। एक उभरती हुई अवधारणा पर प्रकाश डाला गया है कि डीसी विकास मार्ग विभिन्न सेलुलर चयापचय 23,24 के साथ जुड़ा हुआ है। इसलिए, डीसी पूर्वजों में जीन नॉकडाउन पर्यावरणीय संकेतों के जवाब में चयापचय विनियमन का अध्ययन करने और यह निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली रणनीति है कि विभिन्न चयापचय मार्ग चयापचय में महत्वपूर्ण जीन को खटखटाकर डीसी भेदभाव को कैसे विनियमित करते हैं25। दूसरी ओर, आईएचएसपीसी में विशिष्ट भेदभाव कारकों का उपयोग करके डीसी वंशों से परे माइलॉयड कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता है। मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) और ग्रैनुलोसाइट्स-कॉलोनी उत्तेजक कारक (जी-सीएसएफ) के उपयोग के परिणामस्वरूप क्रमशः मैक्रोफेज और ग्रैनुलोसाइट्स के विकास में परिणाम होता है, क्रमशः, आईएचएसपीसी 19 से। एक ही रणनीति के आधार पर, यह विधि माइलॉयड सेल विकास के अनुसंधान पर भी लागू हो सकती है।

सामूहिक रूप से, जीन नॉकडाउन से आईएचएसपीसी के इन विट्रो भेदभाव तक वर्णित प्रोटोकॉल डीसी विकास के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने और भविष्य में प्रतिरक्षा कोशिका विकास के मौलिक सवालों के जवाब देने के लिए एक त्वरित और प्रभावी तरीका प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम डॉ Tz-Ling चेन से तकनीकी सहायता के लिए आभारी हैं। हम shRNA lentivirus (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw) प्रदान करने के लिए राष्ट्रीय आरएनएई कोर सुविधा (अकादमिक Sinica, ताइवान) को धन्यवाद देते हैं। इस काम को विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय, ताइवान (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 और MOST 109-2320-B-002-054-MY3) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody Biolegend 117324 (Clone: N418)
FITC anti-mouse/human CD11b Antibody Biolegend 101206 (Clone: M1/70)
PE anti-mouse/human B220 Antibody Biolegend 103208 (Clone: RA3-6B2)
Cell culture
1.5 mL Micro tube  ExtraGene TUBE-170-C
12-well tissue culture-treated plate Falcon 353043
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV
RPMI 1640 medium gibco 11875-085
Reagent
β-estradiol Sigma-Aldrich E2758-250MG
β-mercaptoethanol (β-ME) Sigma-Aldrich M6250
FACS buffer home-made Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3
Flt3 ligand (FL) home-made
Polybrene Sigma-Aldrich TR-1003-G
Puromycin Invivogen ant-pr-1
TRIsure BIOLINE BIO-38032
shRNA (Taregt sequence/clone ID) Company
shId2  (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) The RNAi Consortium (TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) The RNAi Consortium (TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) The RNAi Consortium (TRC)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steinman, R. M., Witmer, M. D. Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).
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Hsiao, Y. L., Häcker, H., Lee,… More

Hsiao, Y. L., Häcker, H., Lee, C. K. Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro. J. Vis. Exp. (181), e62730, doi:10.3791/62730 (2022).

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