Summary
Nous fournissons ici un protocole pour le dépistage des facteurs de transcription potentiels impliqués dans le développement de cellules dendritiques (DC) en utilisant la transduction lentivirale de l’ARNh pour obtenir des lignées cellulaires knockdown stables pour la différenciation DC in vitro .
Abstract
Les cellules dendritiques (DC) sont d’importantes cellules présentatrices d’antigènes qui relient les réponses immunitaires innées et adaptatives. Les DC sont hétérogènes et peuvent être divisés en DC conventionnels (cDC) et en DC plasmocytoïdes (pDC). cDCs se spécialise dans la présentation d’antigènes et l’activation de lymphocytes T naïfs. D’autre part, les pDC peuvent produire de grandes quantités d’interférons de type I (IFN-I) lors d’une infection virale. La spécification des DC se produit à un stade précoce des progéniteurs DC dans la moelle osseuse (BM) et est définie par un réseau de facteurs de transcription (TF). Par exemple, les cDC expriment fortement ID2, tandis que les pDC expriment fortement E2-2. Étant donné que de plus en plus de sous-ensembles de DC sont identifiés, il existe un intérêt croissant pour la compréhension de TF spécifiques contrôlant le développement de DC. Ici, nous établissons une méthode pour dépister les TF critiques pour la différenciation des DC in vitro en délivrant un lentivirus porteur d’ARN en épingle à cheveux court (shRNA) dans une lignée de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques immortalisées (iHSPC). Après la sélection et la différenciation in vitro , le potentiel cDC et pDC des lignées cellulaires stables est analysé par cytométrie en flux. Cette approche fournit une plate-forme pour identifier les gènes potentiellement régissant le destin des DC des progéniteurs in vitro.
Introduction
Les DC sont des régulateurs clés de l’immunité innée et adaptative1. Les PAYS sont principalement classés en deux populations fonctionnellement distinctes, à savoir les PDC et les CDC. En outre, les CDC comprennent deux sous-ensembles, à savoir les CDC de type I et de type II ou cDC1 et cDC2, respectivement2. Les pDC, exprimant BST2, Siglec-H et des niveaux intermédiaires de CD11c chez la souris3,4, sont les cellules qui peuvent sécréter de grandes quantités d’IFN-I lors de l’inflammation et de l’infection virale5. En raison de leur capacité robuste à produire des IFN-I, ils sont également soupçonnés de jouer un rôle clé dans la progression des maladies auto-immunes, y compris le lupus érythémateux disséminé (LED)6. Les cDC1, définis par l’expression de surface de XCR1, CD8a, CLEC9A et CD103 chez la souris7, sont spécialisés dans l’activation et la polarisation des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (CTL) par la présentation croisée de l’antigène, initiant ainsi une immunité de type I en réponse aux agents pathogènes intracellulaires et au cancer8,9. D’autre part, les cDC2, exprimant CD11b et CD172α (également connus sous le nom de Sirpα) chez l’homme et la souris, peuvent activer les lymphocytes T CD4+ et favoriser la réponse immunitaire de type II contre les allergènes et les parasites10, ainsi que moduler l’immunité de type III après la reconnaissance des bactéries extracellulaires et du microbiote11,12.
La diversification des DC est déterminée par un groupe de TF à partir de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) dans le BM. E2-2 (codé par Tcf4) est un régulateur maître pour la différenciation et la fonction des pDC13,14. En revanche, l’inhibiteur de la liaison à l’ADN 2 (ID2) détermine la spécification du cDC et inhibe le développement du pDC en bloquant l’activité de la protéine E15. De plus, le développement des cDC1 nécessite IRF8 et BATF3, tandis que la différenciation des cDC2 dépend fortement de l’IRF416. Des travaux récents ont exploré l’hétérogénéité des pDC17 et des cDC et leur régulation transcriptionnelle18. En raison de la complexité du réseau CC, il existe un besoin non satisfait d’établir une plate-forme pour identifier d’autres TF contrôlant le développement et la fonctionnalité des DC.
Ici, nous avons utilisé un iHSPC qui a été généré en exprimant la translocation nucléaire régulée par les œstrogènes de Hoxb8 dans les cellules BM (également appelées cellules Hoxb8-FL)19. Les iHSPC peuvent proliférer et rester dans un stade indifférencié en présence de β-estradiol et de ligand Flt3 (FL), alors qu’ils commencent à se différencier en différents types DC en présence de FL lors du retrait du β-estradiol19. Sur la base de cette caractéristique, nous pouvons détruire les gènes d’intérêt au stade progéniteur, puis examiner l’effet sur la différenciation in vitro des pDC et des cDC. Par conséquent, cette méthode est un outil puissant pour découvrir les gènes qui régulent le développement et la fonction des DC.
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Protocol
La manipulation du lentivirus est effectuée conformément à la réglementation du Département de la santé et de la sécurité environnementales du Collège de médecine de l’Université nationale de Taiwan.
1. Préparation de lignées cellulaires hématopoïétiques et progénitrices immortalisées (iHSPC)
- Maintenir la lignée cellulaire iHSPC dans un milieu RPMI 1640 complet contenant 100 ng/mL FL et 1 μM β-estradiol.
- Passage des cellules à un rapport de 1:10 tous les 3 jours.
REMARQUE: Rendre le milieu RPMI 1640 complet en complétant avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 5 x 10-5 M β-mercaptoéthanol et 10 μg / mL de gentamicine. Recombinant murin FL est également disponible dans le commerce.
2. Transduction lentivirale
- Plaques iHSPC à une densité de 1 x 105 cellules/puits dans des plaques à 12 puits dans 1 mL de milieu complet contenant 100 ng/mL FL, 1 μM de β-estradiol et 8 μg/mL de polybrene.
REMARQUE: La concentration de polybrene dépend des types de cellules et est généralement comprise entre 4 et 8 μg / mL. - Ajouter le lentivirus porteur d’ARNh dans chaque puits à une multiplicité d’infection (MOI) de 100.
REMARQUE: Le vecteur lentiviral est pLKO.1-Puro avec un marqueur de sélection de puromycine (Figure 1). Les séquences cibles des shRNA contre LacZ, Tcf4 et Id2, respectivement, sont répertoriées dans le tableau des matériaux. Le MOI est défini par le nombre de virions qui sont ajoutés par cellule pendant l’infection.
- Faire tourner les plaques à 1 100 x g pendant 90 min à 37 °C.
REMARQUE: L’infection par rotation est effectuée à l’aide d’un rotor à godet oscillant. - Incuber la plaque contenant les cellules infectées pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur.
REMARQUE: Si les cellules sont sensibles au polybrène, rafraîchissez les cellules avec le milieu complet sans polybrène après l’infection par spin. - Rafraîchir les cellules avec un milieu complet contenant 100 ng/mL FL et 1 μM β-estradiol 24 h après l’infection.
- Ajouter 6 μg/mL de puromycine au milieu pour sélectionner les cellules infectées après 24 h supplémentaires.
REMARQUE: Le vecteur lentiviral transducté prend généralement 48 heures pour exprimer les gènes, y compris le gène résistant à la puromycine. S’assurer que la concentration de puromycine est optimisée pour chaque lignée cellulaire. - Actualiser le milieu de sélection contenant 100 ng/mL FL, 1 μM de β-estradiol et 6 μg/mL de puromycine tous les 3 jours et maintenir les cellules pendant au moins une semaine pour dilater les cellules iHSPC transduites de manière stable.
REMARQUE: La sélection de la puromycine prend généralement effet 48 heures plus tard, et la période de sélection dépend des types de cellules.
3. Mesure de l’efficacité du knockdown par transcription inverse et PCR en temps réel (RT-PCR)
- Extraire l’ARN total de 1 x 107 shLacZ, shTcf4 et shId2 stable knockdown iHSPC cellules à l’aide d’un réactif d’extraction d’ARN commercial et précipiter l’ARN de la couche aqueuse avec de l’isopropanol, puis laver le précipité d’ARN avec de l’éthanol à 75%.
- Dissoudre l’ARN (~ 5 μg) avec 5 μL de H2O traité par DEPC et ajuster la concentration à 1 μg/μL.
- Prélever 1 à 3 μg d’ARN, mélanger avec du H2O traité par DEPC jusqu’à un volume final de 17,4 μL, ajouter 1 μL de DNase I sans RNase 1 unité/μL et incuber pendant 20 min à 37 °C.
REMARQUE: Cette étape consiste à digérer l’ADN génomique dans les échantillons d’ARN. - Ajouter 1 μL d’EDTA de 20 mM aux échantillons d’ARN, incuber à 65 °C pendant 10 min pour inactiver la DNase I, et mettre immédiatement les échantillons d’ARN à 4 °C.
- Ajouter 11,6 μL du mélange réactionnel contenant 1 μL d’amorces oligo(dT) (45 μM), 6 μL de 5x tampon 1er brin, 3 μL de dNTP (2 mM), 0,6 μL d’inhibiteur de la RNase (50 Unité/μL) et 1 μL de transcriptase inverse (200 Unité/μL) aux échantillons d’ARN et incuber à 40 °C pendant 1 h.
- Arrêter la réaction en chauffant à 70 °C pendant 10 min et diluer le mélange réactionnel avec 30 μL de H2O.
- Prendre 2 μL du mélange de réaction RT dilué comme modèle d’ADN et la PCR l’amplifier à l’aide d’amorces contre Tcf4 ou Id2 (voir le tableau 1 pour les conditions du thermocycleur).
REMARQUE : Les séquences d’amorce sont incluses dans la table des matériaux.
4. Différenciation in vitro des lignées cellulaires stables knockdown iHSPC
- Maintenir l’élimination unique stable de LacZ (shLacZ), Tcf4 (shTcf4) ou Id2 (shId2) dans des iHSPC dans un milieu complet contenant 100 ng/mL de FL et 1 μM de β-estradiol.
- Collectez les iHSPC non différenciés shLacZ, shTcf4 et shId2 dans un tube de 15 mL et centrifugez pendant 5 min à 500 x g pour granuler les cellules.
- Jeter le surnageant et ajouter 10 mL de PBS pour laver les cellules. Répétez cette étape deux fois.
- Remettre en suspension et ensemencer les cellules iHSPC à une densité de 2 x 105 cellules/mL dans une plaque de 12 puits dans 1 mL de milieu complet contenant 100 ng/mL FL seulement.
- Ajouter 1 mL de milieu frais complet contenant 100 ng/mL FL trois jours plus tard.
- Analysez les cellules différenciées (shLacZ, shTcf4 et shId2 iHSPC) par cytométrie en flux deux jours plus tard.
5. Analyse cytométrique en flux des DC différenciés
- Recueillir les cellules dans des tubes de 1,5 mL en pipetant les cellules de haut en bas 2-3 fois dans la plaque, et centrifuger pendant 5 min à 500 x g à température ambiante (RT).
REMARQUE: Les DC différenciés in vitro se fixeront légèrement aux plaques. Un pipetage doux aidera à récupérer les DC des plaques. - Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 50 μL de tampon FACS. Ensuite, ajoutez 50 μL de surnageant d’hybridome anti-CD16/32 et incubez pendant 5 à 10 minutes sur de la glace.
REMARQUE: L’anticorps bloquant Fc empêche la liaison non spécifique des anticorps aux récepteurs Fc exprimés sur certaines cellules myéloïdes et cellules B et est disponible dans le commerce auprès de divers fournisseurs. - Ajouter des anticorps conjugués à des colorants fluorescents (0,04 μg pour chaque anticorps) directement dans les cellules et incuber pendant 15 min sur de la glace dans l’obscurité. Les anticorps utilisés sont APC/cy7 anti-souris CD11c, FITC anti-souris CD11b et PE anti-souris B220.
REMARQUE : les pDC sont définis comme CD11c+CD11b-B220+, et les cDC sont définis comme CD11c+CD11b+B220-. - Laver les cellules avec 1 mL de tampon FACS et centrifuger pendant 5 min à 500 x g à RT.
- Remettre en suspension les cellules dans 100 μL de tampon FACS et les analyser par cytométrie en flux.
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Representative Results
La carte du vecteur lentiviral pLKO.1-Puro est montrée (Figure 1). Après l’administration de lentivirus exprimant l’ARNh contre LacZ (un contrôle non ciblé), Tcf4 et Id2 dans les iHSPC, l’efficacité de knockdown confirmée par RT-qPCR a révélé que l’expression de Tcf4 était réduite dans les iHSPC shTcf4, par rapport aux iHSPC shLacZ (Figure 2A). D’autre part, la diminution de l’expression d’Id2 a également été observée chez les iHSPC shId2, par rapport au contrôle des iHSPC shLacZ (Figure 2B). Les lignées cellulaires shLacZ, shTcf4 et shId2 iHSPC ont été différenciées en pDC et cDC in vitro avec FL. Après une culture de cinq jours de shLacZ iHSPC, la fréquence des cellules CD11c+, qui représentent la population DC7, était d’environ 95 % (Figure 3A, panneau de gauche). Cependant, l’élimination de Tcf4 ou Id2 a légèrement réduit la génération de CD11c+ (Figure 3A, panneau central et droit). De plus, une analyse plus approfondie des CD11c+ a révélé que les cSPC shLacZ se différenciaient en 70 % des CDD (CD11c+CD11b+B220+) et 22 % des pDC (CD11c+CD11b-B220+) (Figure 3B, panneau de gauche). Cependant, les iHSPC shTcf4 ont généré un pourcentage significativement plus faible de pDC (4 %) que le contrôle shLacZ (Figure 3B, panneau du milieu). D’autre part, les iHSPC shId2 ont généré un pourcentage significativement plus faible de cDC (54%), mais un pourcentage plus élevé de pDC (39%) que le contrôle shLacZ (Figure 3B, panneau de droite). Par conséquent, ces résultats suggèrent que les iHSPC reflètent fidèlement la même exigence de facteurs de transcription pour contrôler le développement DC.
Figure 1: La construction du vecteur lentiviral pLKO.1-Puro. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 : L’efficacité de knockdown de shTcf4 et shId2. Après l’élimination stable des gènes, les ARN ont été isolés à partir d’iHSPC shLacZ, shTcf4 et shId2 et transcrits inversement en ADNc, et l’expression de Tcf4 et Id2 a été mesurée par RT-qPCR. L’expression génique relative a été normalisée à Rpl7. Un. Expression de Tcf4 dans les iHSPC shLacZ et shTcf4. B. Expression d’Id2 dans shLacZ et shId2 iHSPC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Le knockdown de Tcf4 nuit au développement du pDC, tandis que le knockdown de l’Id2 réduit la génération de cDC à partir d’iHSPC in vitro. Les iHSPC ont été transduites de manière stable avec des lentivirus porteurs de shLacZ, shTcf4 et shId2, puis différenciés in vitro en DC avec FL (100 ng / mL). Après culture pendant 5 jours, les cellules ont été colorées et analysées par cytométrie en flux. Un. Le pourcentage de cellules CD11c+ est indiqué. B. L’analyse des pDC (CD11c+B220+CD11b-) et des cDC (CD11c+B220-CD11b+) est présentée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Réaction pcr | |||
| Escalier | Température | Heure | Cycles |
| Dénaturation initiale | 95°C | 3 minutes | 1 |
| Dénaturation | 95°C | 15 secondes | 35-40 |
| Recuit | 60°C | 20 secondes | |
| Extension | 72°C | 20 secondes | |
| Prolongation finale | 80°C | 20 secondes | 1 |
| Tenir | 4°C | ∞ | 1 |
Tableau 1 : Conditions du thermocycleur pour la PCR.
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Discussion
Les vecteurs shRNA à base de lentivirus sont souvent utilisés pour le silençage génique par transduction virale dans les cellules et permettent une intégration stable dans le génome de l’hôte. Cependant, diverses efficacités de transduction dans différents types de cellules doivent être prises en compte, et un certain nombre d’approches ont été adoptées pour surmonter ce problème.
Le polybrène est un polymère polycationique qui peut neutraliser les charges sur la membrane cellulaire, améliorant ainsi la liaison du virion aux cellules pendant la transduction20. Bien qu’il s’agisse d’un moyen efficace d’augmenter le taux de transduction, il est également toxique pour certains types de cellules lors de l’ajout de quantités excessives. Dans ce cas, il est nécessaire de tester la toxicité du polybrene et d’optimiser la concentration dans différentes cellules. Le sulfate de protamine, un composé cationique, peut-être une approche alternative pour augmenter la viabilité cellulaire21. De plus, rafraîchir le milieu complet le même jour d’infection peut améliorer le taux de survie après la transduction.
La plupart des systèmes d’administration d’ARNh ont un marqueur sélectif pour éliminer les cellules qui n’ont pas été infectées avec succès. Le système lentiviral que nous avons utilisé contient un gène résistant à la puromycine afin que les cellules infectées puissent être sélectionnées après transduction. De plus, le lentivirus exprimant la GFP est également une autre option pour la sélection. Cependant, il y a à la fois des avantages et des inconvénients aux deux méthodes. L’utilisation de la puromycine comme méthode de sélection est difficile de mesurer directement l’efficacité de la transduction à moins que l’expression des gènes cibles n’ait été confirmée par qPCR. Mais la puromycine fournit un stress pour la sélection afin de garder l’ADN étranger à l’intérieur des cellules et de maintenir le phénotype knockdown. En revanche, la GFP est également une méthode de sélection qui ne fournit pas de stress aux cellules même si l’efficacité de la transduction peut être immédiatement évaluée par cytométrie en flux.
L’une des limites de cette méthode est le nombre relativement faible de cellules cDC1 générées par les iHSPC in vitro19. Bien que les iHSPC aient un potentiel de pDC et de cDC piloté par FL in vitro, la plupart des sous-types de cDC générés sont des cDC2, mais pas des cDC1. Cela est probablement dû à l’exigence de signalisation Notch lors de la différenciation in vitro cDC122. Par conséquent, la co-culture avec des cellules stromales OP9-DL1 qui expriment le ligand Notch Delta-like 1 peut restaurer le potentiel cDC1 des iHSPC, améliorant ainsi les études mécanistes sur les cDC1.
L’application de ce protocole non seulement pour étudier le rôle des TF mais aussi pour d’autres gènes, comme les gènes métaboliques susceptibles de participer au développement des DC ou d’autres types de cellules. Un concept émergent souligne que la voie de développement DC est associée à différents métabolismes cellulaires23,24. Par conséquent, l’élimination des gènes chez les progéniteurs DC est une stratégie puissante pour étudier la régulation métabolique en réponse aux signaux environnementaux et déterminer comment différentes voies métaboliques régulent la différenciation DC en détruisant les gènes critiques du métabolisme25. D’autre part, les iHSPC ont la capacité de se différencier en cellules myéloïdes au-delà des lignées DC en utilisant des facteurs de différenciation spécifiques. L’utilisation du facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) et du facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF) entraîne le développement de macrophages et de granulocytes, respectivement, à partir d’iHSPC19. Basée sur la même stratégie, cette méthode pourrait également s’appliquer à la recherche sur le développement des cellules myéloïdes.
Collectivement, le protocole décrit, de l’élimination des gènes à la différenciation in vitro des iHSPC, fournit un moyen rapide et efficace de faciliter l’étude du développement des DC et répond aux questions fondamentales du développement des cellules immunitaires à l’avenir.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants du soutien technique du Dr Tz-Ling Chen. Nous remercions le National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taïwan) d’avoir fourni le lentivirus shRNA (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Ce travail a été soutenu par le ministère de la Science et de la Technologie de Taïwan (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 et MOST 109-2320-B-002-054-MY3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117324 | (Clone: N418) |
| FITC anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101206 | (Clone: M1/70) |
| PE anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103208 | (Clone: RA3-6B2) |
| Cell culture | |||
| 1.5 mL Micro tube | ExtraGene | TUBE-170-C | |
| 12-well tissue culture-treated plate | Falcon | 353043 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| RPMI 1640 medium | gibco | 11875-085 | |
| Reagent | |||
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758-250MG | |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| FACS buffer | home-made | Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3 | |
| Flt3 ligand (FL) | home-made | ||
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| TRIsure | BIOLINE | BIO-38032 | |
| shRNA (Taregt sequence/clone ID) | Company | ||
| shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) | The RNAi Consortium (TRC) |
References
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