Summary
Se optimizó un método para la extracción del cofactor F420 de cultivos puros para la separación cromatográfica líquida y el análisis de la longitud de la cola F420 en cultivo puro y muestras ambientales.
Abstract
El cofactor F420 juega un papel central como portador de hidruro en el metabolismo primario y secundario de muchos taxones bacterianos y arqueales. El cofactor es mejor conocido por su papel en la metanogénesis, donde facilita reacciones termodinámicamente difíciles. Como la cola de poliglutamato varía en longitud entre diferentes organismos, los análisis de perfil de longitud podrían ser una herramienta poderosa para distinguir y caracterizar diferentes grupos y vías en varios hábitats. Aquí, el protocolo describe la extracción y optimización de la detección del cofactor F420 mediante la aplicación de la extracción en fase sólida combinada con el análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento independiente de los enfoques biológicos culturales o moleculares. El método se aplicó para obtener información adicional sobre la expresión del cofactor F420 de las comunidades microbianas en suelos, lodos anaeróbicos y cultivos puros y se evaluó mediante experimentos de aumento. De este modo, el estudio logró generar diferentes perfiles de longitud de cola F420 para metanógenos hidrogenotróficos y acetoclásticos en cultivos puros metanogénicos controlados, así como a partir de muestras ambientales como lodos de digestor anaeróbico y suelos.
Introduction
F420 es un cofactor generalizado pero a menudo descuidado, que funciona como un transportador obligado de hidruro de dos electrones en los procesos metabólicos primarios y secundarios de archaea y bacteria1,2. F420 es una 5-deazaflavina y estructuralmente similar a las flavinas, por lo que sus propiedades químicas y biológicas son más comparables con las de NAD+ o NADP+. Debido a la sustitución del nitrógeno por carbono en la posición 5 del anillo de isoaloxazina, es un fuerte reductor, exhibiendo así un bajo potencial redox estándar de -340 mV1,3. F420 comprende un anillo de 5-deazaflavina y un enlazador de 2-fosfo-L-lactato (F420-0). Una cola de oligoglutamato que contiene n+1 monómeros de glutamato se puede unir a la molécula (F420-n+1)4.
Durante mucho tiempo, el cofactor F420 se ha asociado únicamente con Archaea y Actinobacteria. Esto ha sido revocado en gran medida. Análisis recientes revelaron que F420 se distribuye entre diversos organismos anaeróbicos y aeróbicos del filo Proteobacteria, Chloroflexi y potencialmente Firmicutes que habitan una miríada de hábitats como suelos, lagos y el intestino humano1,5. En 2019, Braga et al.6, demostraron que la proteobacterium Paraburkholderia rhizoxinica produce un derivado F420 único, que contiene un 3-fosfoglicerato en lugar de una cola de 2-fosfolactato, que podría estar muy extendida en varios hábitats. Dentro del dominio Archaea, F420 se ha encontrado en varios linajes, incluyendo órdenes metanogénico7, metanotrófico8,9 y reductor de sulfato10, y se supone que se produce en Thaumarchaeota11. F420 es mejor conocido como una coenzima redox esencial en la metanogénesis hidrogenotrófica y metilotrófica. La forma reducida de F420 (F420H2) funciona como donante de electrones para la reducción de metilentetrahidrometanopterina (metileno-H4MPT, Mer) y metenil-H4MPT12,13. También se puede utilizar como portador de electrones en vías de transporte de electrones independientes de H2 de metanógenos que contienen citocromos12,14. Además, la forma oxidada de F420 tiene una fluorescencia azul-verde característica al excitarse a 420 nm, lo que facilita la detección de metanógenos microscópicamente (Figura 1). Debido a su bajo potencial redox, F420 facilita (i) la reducción exógena de un amplio espectro de compuestos orgánicos recalcitrantes o tóxicos, (ii) la síntesis de antibióticos o fitotoxinas de tetraciclina y lincosamida en estreptomicetos (filo Actinobacteria), y (iii) resistencia al estrés oxidativo o nitrosativo u otras condiciones desfavorables en micobacterias (filo Actinobacteria)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. En consecuencia, las oxidorreductasas dependientes de F420 son biocatalizadores prometedores para fines industriales y farmacéuticos, así como para la biorremediación de ambientes contaminados1,23. A pesar de estos hallazgos recientes, las funciones exactas del cofactor F420 todavía se conocen marginalmente en Actinobacteria u otros filos bacterianos.
Existen al menos tres vías para la biosíntesis F4202,6,24. Al principio, la vía de biosíntesis se divide en una biosíntesis de 5-deazaflavina y una rama del metabolismo de 2-fosfolactato. La parte reactiva de la molécula F420 se sintetiza a través de la FO-sintasa utilizando los sustratos tirosina y 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pirimidinediona. El resultado es el cromóforo de nivel de riboflavina FO. Dentro de la rama del metabolismo del lactato actualmente aceptada, el L-lactato es fosforilado a 2-fosfo-L-lactato por una L-lactato quinasa (CofB); El 2-fosfo-L-lactato, a su vez, es guanilado a L-lactilo-2-difosfo-5'-guanosina por la 2-fosfo-L-lactato guanililtransferasa (CofC). En el siguiente paso, L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine está unida a FO por una 2-fosfo-L-lactato transferasa (CofD) para formar F420-02. Finalmente, la enzima F420-0:ɣ-glutamil ligasa (CofE) liga los monómeros de glutamato a F420-0, formando el cofactor final6 en números variables23,25. Diferentes organismos muestran diferentes patrones en el número de residuos de glutamato adheridos, encontrándose colas más cortas para los metanógenos que en las micobacterias2,25,26. En general, los metanógenos muestran longitudes de cola de dos a tres, con hasta cinco en el metanógeno acetoclástico, Methanosarcina sp., mientras que las longitudes de cola encontradas en Mycobacterium sp. variaron de cinco a siete residuos de glutamato2,25,26,27. Sin embargo, hallazgos recientes mostraron que F420 de cadena larga se une a oxidorreductasas dependientes de F420 con una afinidad más alta que F420 de cadena corta; además, F420 de cadena larga unida aumenta la afinidad del sustrato pero disminuye la tasa de recambio de las enzimas respectivas23.
La detección del cofactor F420 a menudo se basa en su fluorescencia. De este modo, sus derivados de oligo glutamato se separaron mediante hplc27,28 de fase invertida (RP). Recientemente, Ney et al. utilizaron hidróxido de tetrabutilamonio como reactivo de emparejamiento de iones para la cola de glutamato cargada negativamente para mejorar la separación en RP-HLPC con éxito5. Aquí, presentamos un método para la preparación de muestras, lisis posterior, extracción, purificación, separación y cuantificación del cofactor F420 no solo de cultivos puros sino también de diferentes muestras ambientales (es decir, suelos y lodos digestores).
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Protocol
NOTA: La extracción y el análisis del cofactor F420 es un proceso de tres pasos que incluye la lisis de la muestra, la prepurificación del cofactor a través de la extracción en fase sólida (SPE) y la detección del cofactor a través de RP-HPLC emparejado con iones (IP-RP-HPLC) con detección de fluorescencia. Antes de comenzar, prepare los materiales y reactivos como se indica en la Tabla 1.
1. Lisis de la muestra
- Agregue hasta 5 g de muestra a los tubos apropiados (por ejemplo, tubos cónicos de 50 ml).
- Añadir 5 ml del tampón de lisis (solución madre 2x, Tabla 1) a las muestras.
- Llevar a un volumen final de 10 mL con agua destilada para alcanzar una concentración final de 0,5 g·mL-1.
- Vórtice las muestras diluidas durante 20 s.
- Autoclave durante 30 min a 121 °C.
- Para muestras secas como el suelo forestal, lleve a un volumen final de 20 ml con agua destilada después del autoclave y vórtice la muestra diluida.
PRECAUCIÓN: El aumento de la temperatura durante el autoclave puede hacer que los tubos se rompan.
2. Prepurificación del cofactor F 420 mediante extracción en fase sólida (SPE)
NOTA: Todos los pasos de SPE se llevan a cabo a temperatura ambiente
- Enfríe las muestras a temperatura ambiente.
- Centrifugar las muestras en autoclave durante 5 min a 11.000 x g.
- Prepare columnas SPE de 5 ml llenas con 100 mg de sorbente polimérico de modo mixto de aniones débiles.
- Acondicionar el intercambiador de aniones con 3 ml de metanol (solución de condición, Tabla 1).
- Equilibrar el intercambiador de aniones con 3 ml de agua destilada (solución de equilibrio, Tabla 1).
- Cargue hasta 9,0 ml del sobrenadante desde el lisado centrifugado en la columna SPE.
- Lave las impurezas con 5 ml de acetato de amonio de 25 mM (solución de lavado SPE 1, Tabla 1).
- Lave las impurezas con 5 ml de metanol (solución de lavado SPE 2, Tabla 1).
- Elute el cofactor F420 en 1,0 mL de tampón de elución (Tabla 1).
NOTA: Prepare un nuevo búfer de elución. Debido al vacío aplicado y la alta presión de vapor del tampón de elución, los volúmenes de elución pueden diferir de una muestra a otra. Para asegurar el mismo volumen final en todas las muestras, se recomienda pesar los recipientes de recolección antes y después de la elución y calcular el volumen de elución efectivo. Equilibre las diferencias mediante la adición de un búfer de elución.
3. Detección del cofactor F420
- Ajuste el horno a 40 °C y el detector de fluorescencia a 420 nm de longitud de onda de extinción y 470 nm de longitud de onda de emisión. Lograr la separación mediante modo de gradiente utilizando las fases móviles A y B (Tabla 1): 0-3 min: 26% B; 3-24 min: 26%-50% B; 24-25 min: 50% B; 25-27 min: 50%-26% B; 27-35 min: 26% B a un caudal de 0,75 mL·min-1.
NOTA: Garantizar el equilibrio de las condiciones de la columna antes de inyectar las muestras enjuagando la columna al menos con 3 volúmenes de columna de 74% móvil fase A y 26% móvil fase B (Tabla 1).- Filtre las muestras eluidas de la SPE en viales de HPLC utilizando un filtro de PTFE con un tamaño de poro de 0,22 μm.
NOTA: Se recomiendan filtros de PTFE con un tamaño de poro de 0,22 μm. - Inyecte 50 μL de la muestra eluida en el sistema HPLC para analizar la composición y concentración del cofactor F420 .
NOTA: Como no se utiliza ningún estándar cuantitativo en este protocolo, las muestras y variantes deben compararse por área de pico.
- Filtre las muestras eluidas de la SPE en viales de HPLC utilizando un filtro de PTFE con un tamaño de poro de 0,22 μm.
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Representative Results
Los cultivos puros de Methanosarcina thermophila y Methanoculleus thermophilus, ambos arqueas metanogénicas termófilas, se cultivaron en medios adecuados como se describió anteriormente29,30. Para Methanosarcina thermophila, el metanol se utilizó como fuente de energía, mientras que Methanoculleus thermophilus se cultivó con H2 / CO2. El crecimiento se comprobó mediante evaluación microscópica, mientras que la actividad se examinó mediante la medición de metano (CH4) mediante cromatografía de gases como se describió anteriormente31. Se utilizaron cultivos puros para la extracción del cofactor F420 según el protocolo presentado. Además, en otoño de 2020 se tomaron muestras ambientales que incluían muestras de lodos de un reactor de biogás mesófilo (planta de tratamiento de aguas residuales, Zirl, Austria; para obtener detalles sobre los parámetros de los lodos, consulte 32), una pradera utilizada agrícolamente (Innsbruck, Austria) y suelo forestal (Lans, Austria) para la extracción y el análisis del cofactor F420.
El crecimiento de cultivos puros ha sido verificado por microscopía (Figura 1), con el CH4 producido analizado mediante cromatografía de gases durante 14 días de incubación (datos no mostrados). La eficiencia de la extracción del cofactor F420 de cultivos puros se probó mediante la aplicación de diferentes estrategias de desintegración: batido con latidos cerámicos de 0,5-1,0 mm, tratamiento ultrasónico y desintegración presión-temperatura utilizando 121 ° C y presión de 1,2 bar (autoclave). La máxima eficiencia de extracción se hizo evidente mediante el tratamiento de presión-temperatura aplicando un tampón como se describe en la sección de protocolo y, por lo tanto, se aplicó para todos los experimentos posteriores (Figura 2). Las pruebas de eficiencia de extracción se realizaron mediante la adición estándar de diferentes volúmenes de un cultivo de Methanoculleus thermophilus de buen crecimiento. Además, la comparación de diferentes muestras y variantes se basó en el área de pico de los cromatogramas.
Posteriormente, los extractos celulares se sometieron a un procedimiento de extracción en fase sólida (SPE). Para este propósito, se probaron diferentes intercambiadores de iones. Resultó que un sorbente polimérico de modo mixto de aniones débil produjo la mayor cantidad de cofactor F420 después de la elución. Además, se probaron diferentes tampones de elución y soluciones de lavado que mostraron los mejores resultados para acetato de amonio de 25 mM como tampón de lavado y una mezcla de NH3 en metanol como tampón de elución. El metanol de la etapa de elución podría intercambiarse después de la elución con agua a través de un tratamiento a temperatura de vacío.
El análisis HPLC del cofactor F420 se probó con diferentes columnas C18 con los mejores resultados para la configuración del sistema logrados durante el estudio presentado con una columna NX C18. Se utilizó un estándar que contenía una distribución conocida de derivados F420 con longitud variable de la cola de glutamato para fines de referencia. Este estándar fue amablemente proporcionado por el Prof. Colin Jackson de la Universidad Nacional de Australia. El análisis de la longitud de la cola de glutamato reveló diferencias en la concentración global del cofactor F420 y la distribución de la longitud de la cola F420 de cultivos puros metanogénicos y muestras ambientales (Figura 3).
| Búfer | Composición |
| Tampón de lisis (solución madre 2x) | 200 mM de fosfato de dihidrógeno potásico (KH2PO4) 50 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 1% (p/v) polisorbato 80 (Tween 80) ajustado a pH 7.0 con solución de hidróxido de sodio de 5 M |
| Solución de acondicionamiento SPE | Metanol (grado HPLC) |
| Solución de equilibrio SPE | Agua destilada 0,2 μm filtrada |
| Solución de lavado SPE 1 | 25 mM de acetato de amonio |
| Solución de lavado SPE 2 | Metanol (grado HPLC) |
| Búfer de elución SPE | 2% (v/v) de amoníaco en metanol diluyendo la solución acuosa de amoníaco al 20%-25% en metanol |
| HPLC móvil fase A | Hidróxido de tetrabutilamonio (TBAH) de 10 mM 20 mM de fosfato de hidrógeno di-amonio ((NH4)2HPO4) ajustado a pH 7.0 con 85% de ácido fosfórico |
| HPLC móvil fase B | Acetonitrilo (grado HPLC) |
Tabla 1: Composición de fases móviles y tampón para extracción en fase sólida (SPE) y análisis hpLC.
Figura 1: Cultivo puro metanogénico fluorescente. Visualización de Methanosarcina thermophila mediante microscopía de contraste de fase (A) y microscopía de fluorescencia (B) cuando el cofactor F420 se excita con luz UV (excitación a 395-440 nm y emisión a 475-495 nm). Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Adición estándar. Área pico del cofactor F420 recuperado después de SPE de 1,0 g de matriz con diferentes volúmenes de cultivos de M. thermophilus . Matrix se modificó con 0 μL, 250 μL, 500 μL, 750 μL y 1000 μL de cultivo y se sometió a diferentes estrategias de desintegración: beat-beating, tratamiento ultrasónico y desintegración presión-temperatura (autoclave). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Distribución de la longitud de la cola de glutamato. Distribución de la longitud de la cola del cofactor F420 de cultivos puros y muestras ambientales. De arriba a abajo: prado (suelo) utilizado agrícolamente, bosque (suelo), reactor de biogás mesófilo, cultivo puro de M. thermophilus y cultivo puro de M. thermophila. La absorbancia relativa se calculó mediante normalización en el pico más alto dentro del cromatograma mostrado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Para la evaluación del cofactor F420 a partir de cultivos metanogénicos puros, se puede realizar una evaluación microscópica para visualizar el crecimiento y la actividad (microscopía de fluorescencia) de los microorganismos involucrados (Figura 1). Para muestras procedentes de entornos naturales, el uso de microscopía para detectar o cuantificar F420 es limitado debido a interferencias con otros microorganismos fluorescentes, partículas orgánicas e inorgánicas. En este contexto, la extracción de F420 y el posterior análisis fluorométrico utilizando HPLC, como se describió anteriormente5, no solo pueden proporcionar información sobre la concentración global del cofactor F420 , sino también sobre la distribución de la longitud de la cola del poligutamato.
Para la extracción del cofactor F420, un tratamiento presión-temperatura demostró ser altamente efectivo (Figura 2) y está de acuerdo con los hallazgos anteriores5,27,33. A través de este método y aplicando un sistema de lisis tampón de fosfato que incluye EDTA y polisorbato, se obtuvieron las concentraciones más altas de cofactor F420 a partir de cultivos puros metanogénicos que contenían altas concentraciones del factor. Además, y en comparación con los otros métodos de interrupción celular probados), el tratamiento de presión-temperatura es fácilmente aplicable y ahorra material.
SPE se realizó para permitir un análisis de HPLC aguas abajo con el objetivo de determinar la distribución de la longitud de la cola del poliglutamato F420 del cofactor F420 dentro de una muestra. Entre varios intercambiadores de iones, un sorbente polimérico de modo mixto de aniones débil mostró el mejor rendimiento y permite la unión efectiva del cofactor F420 a la matriz para fines de lavado, así como su posterior eliminación de la matriz de extracción después de lavar los subproductos no deseados. Para este propósito, el metanol básico resultó ser el mejor.
A través del método presentado, varios cultivos puros y muestras ambientales pudieron ser analizados de manera reproducible con respecto al cofactor F420 (Figura 3). Incluso muestras como suelos o lodos que contienen altas proporciones de subproductos no deseados podrían analizarse mediante el procedimiento presentado. Por lo tanto, el análisis aguas abajo a través de HPLC se implementó con éxito para analizar la concentración total de F420 y la distribución de longitud de las colas de poliglutamato de los derivados de F420 . La detección de altos niveles de F420 en suelo y otras muestras apoya a Ney et el.5, quienes propusieron que el cofactor está muy extendido en bacterias aeróbicas del suelo a partir de análisis genómicos y metagenómicos.
En resumen, este es el primer protocolo que tiene como objetivo extraer y analizar el cofactor F420 no solo de cultivos puros, sino también de muestras ambientales como suelo o lodos. El paso más crítico en la extracción de F420 de muestras ambientales es el SPE necesario para la limpieza previa de lisados para el posterior análisis de HPLC. El protocolo presentado será útil para futuros proyectos para revelar el papel de F420 en varios entornos y bioprocesos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Prof. Colin Jackson por el apoyo con el cofactor purificado F420. Esta investigación fue apoyada por el Fondo Científico Tirolesa (TWF) y la Universität Innsbruck (Publikationsfonds). Reconocemos enormemente el apoyo de GPS, HK, SB, GG y HB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | |||
| Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector | Shimadzu | HPLC system | |
| Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes | |||
| HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm | Phenomenex | HPLC column | |
| PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis | |||
| Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent | Phenomenex | weak anion mixed-mode polymeric sorbent | |
| Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes | SPE equipment | ||
| Vortex mixer |
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