Summary
Um método para a extração do cofato F420 de culturas puras foi otimizado para a separação e análise cromatográfica líquida do comprimento da cauda F420 em cultura pura e amostras ambientais.
Abstract
O cofator F420 desempenha um papel central como portador de hidreto no metabolismo primário e secundário de muitas taxas bacterianas e arqueais. O cofator é mais conhecido por seu papel na methanogênese, onde facilita reações termodinamicamente difíceis. Como a cauda de poliglutamate varia de comprimento entre diferentes organismos, as análises de perfil de comprimento podem ser uma ferramenta poderosa para distinguir e caracterizar diferentes grupos e caminhos em vários habitats. Aqui, o protocolo descreve a extração e otimização da detecção do cofato F420 aplicando extração em fase sólida combinada com análise de cromatografia líquida de alto desempenho independente de abordagens biológicas culturais ou moleculares. O método foi aplicado para obter informações adicionais sobre a expressão do cofator F420 de comunidades microbianas em solos, lodo anaeróbico e culturas puras e foi avaliado por experimentos de espiadura. Assim, o estudo conseguiu gerar diferentes perfis de comprimento da cauda F420 para methanogênios hidroeotróficos e acetoclásticos em culturas puras metogênicas controladas, bem como de amostras ambientais, como lodo digestor anaeróbico e solos.
Introduction
F420 é um cofator generalizado, mas muitas vezes negligenciado, que funciona como um portador obrigatório de hidreto de dois elétrons em processos metabólicos primários e secundários tanto da Archaea quanto das Bactérias1,2. F420 é um 5-deazaflavin e estruturalmente semelhante aos flavins, pelo qual suas propriedades químicas e biológicas são mais comparáveis com as de NAD+ ou NADP+. Devido à substituição de nitrogênio por carbono na posição 5 do anel isoalloxazine, é um forte redutivo, apresentando assim um baixo potencial de redox padrão de -340 mV1,3. F420 compreende um anel 5-deazaflavin e um linker 2-fospho-L-lactato (F420-0). Uma cauda oligoglutamate contendo monômeros de glutamato n+1 pode ser anexada à molécula (F420-n+1)4.
Por muito tempo, o cofator F420 tem sido associado exclusivamente com Archaea e Actinobacteria. Isso foi em grande parte anulado. Análises recentes revelaram que o F420 está distribuído entre diversos organismos anaeróbicos e aeróbicos da filo Proteobacteria, Cloroflexi, e potencialmente firmicutes que habitam uma miríade de habitats como solos, lagos e intestino humano1,5. Em 2019, Braga et al.6, mostraram que o proteobacterium Paraburkholderia rizoxinica produz um derivado F420 único, contendo um 3-fosfoglicerate em vez de uma cauda de 2 fosfolactato, que pode ser difundida em vários habitats. Dentro do domínio Archaea, f420 foi encontrado em várias linhagenias, incluindo methanogenic7, methanotrófico8,9, e ordens redutoras de sulfato10, e deve ser produzido em Thaumarchaeota11. F420 é mais conhecido como uma coenzima redox essencial em methanogênese metilotrófica e metilotrófica. A forma reduzida de F420 (F420H2) funciona como um doador de elétrons para a redução de metilenotetrahidromedromedetina (metileno-H4MPT, Mer) e mehenyl-H4MPT12,13. Também pode ser usado como um porta-elétrons em vias de transporte de elétrons independentes de H2 de methanogênios contendo citocromes12,14. Além disso, a forma oxidada de F420 tem uma fluorescência azul-esverdeada característica após a excitação a 420 nm, o que facilita a detecção de methanogênios microscopicamente (Figura 1). Devido ao seu baixo potencial de redox, f420 facilita (i) a redução exógena de um amplo espectro de compostos orgânicos recalcitrantes ou tóxicos, (ii) síntese de antibióticos tetracítricos e lincosamidas ou fitotoxinas em estreptomices (filo Actinobacteria), e (iii) resistência ao estresse oxidativo ou nitrosativo ou outras condições desfavoráveis em micobactérias (filo Actinobacteria)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Consequentemente, os oxidoreductases dependentes de F420 são biocatalysts promissores para fins industriais e farmacêuticos, bem como para a bioremediação de ambientes contaminados1,23. Apesar dessas descobertas recentes, os papéis exatos do cofator F420 ainda são marginalmente conhecidos em Actinobacteria ou outras bactérias.
Há pelo menos três caminhos para a biosíntese F4202,6,24. No início, a via da biossíntese é dividida em uma biosíntese de 5 deazaflavinas e um ramo metabolismo de 2 fosfolactato. A parte reativa da molécula F420 é sintetizada via FO-synthase usando os substratos tyrosine e 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinadiona. O resultado é o nível de riboflavina cromohore FO. Dentro do ramo de metabolismo de lactato atualmente aceito, o L-lactato é fosfoilado a 2-phospho-L-lactato por um L-lactato kinase (CofB); 2-phospho-L-lactato, por sua vez, é guanylated para L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine por 2-phospho-L-lactate guanylyltransferase (CofC). No próximo passo, L-lactil-2-diphospho-5'-guanosine é ligado à FO por um 2-phospho-L-lactato transferase (CofD) para formar F420-02. Finalmente, a enzima F420-0:ɣ-glutamyl liga os monômeros glutamato para F420-0, formando o cofator final6 em números variados23,25. Diferentes organismos apresentam padrões diferentes no número de resíduos de glutamato anexados, com caudas mais curtas encontradas para methanogênios do que em micobactérias2,25,26. Geralmente, os metanogens mostram comprimentos de cauda de dois a três, com até cinco no metanogena actolástico, methanosarcina sp., enquanto os comprimentos da cauda encontrados em Mycobacterium sp. variaram de cinco a sete resíduos de glutamato2,25,26,27. No entanto, descobertas recentes mostraram que a F420 de cadeia longa se liga a oxidoreductases dependentes da F420 com uma afinidade maior do que a F420 de cadeia curta; além disso, o F420 de cadeia longa ligado aumenta a afinidade do substrato, mas diminui a taxa de rotatividade das respectivas enzimas23.
A detecção do cofato F420 é frequentemente baseada em sua fluorescência. Assim, seus derivados de glutamato oligo foram separados por meio de fase inversa (RP)-HPLC27,28. Recentemente, Ney et al. usaram hidróxido de tetrabutylammonium como um reagente de emparelhamento de íons para a cauda de glutamato carregada negativamente para melhorar a separação em RP-HLPC com sucesso5. Aqui, apresentamos um método para a preparação de amostras, posteriormente, extração, purificação, separação e quantificação do cofato F420 não apenas de culturas puras, mas também de diferentes amostras ambientais (ou seja, solos e lodo digestor).
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Protocol
NOTA: A extração e análise do cofato F420 é um processo de três etapas, incluindo lise amostral, pré-purificação de cofato por extração em fase sólida (SPE) e detecção de cofatores através de RP-HPLC (IP-RP-HPLC) com detecção de fluorescência. Antes de iniciar, prepare os materiais e reagentes conforme indicado na Tabela 1.
1. Lise amostral
- Adicione até 5 g de amostra aos tubos apropriados (por exemplo, tubos cônicos de 50 mL).
- Adicione 5 mL do tampão de lise (solução de estoque 2x, Tabela 1) às amostras.
- Leve a um volume final de 10 mL com água destilada para atingir uma concentração final de 0,5 g·mL-1.
- Vórtice as amostras diluídas para 20 s.
- Autoclave por 30 min a 121 °C.
- Para amostras secas como solo florestal, traga para um volume final de 20 mL com água destilada após autoclaving e vórtice a amostra diluída.
ATENÇÃO: O aumento da temperatura durante a autoclavagem pode causar a explosão dos tubos.
2. Pré-purificação do cofator F 420 através de extração em fase sólida (SPE)
NOTA: Todas as etapas da SPE são conduzidas à temperatura ambiente
- Esfrie as amostras em temperatura ambiente.
- Centrifugar as amostras autoclavadas por 5 min a 11.000 x g.
- Prepare 5 mL SPE colunas preenchidas com 100 mg de sorbent polimérico de modo misto de ânion fraco.
- Condiciona o trocador de ânion com 3 mL de metanol (solução de condição, Tabela 1).
- Equilibre o trocador de ânion com 3 mL de água destilada (solução de equilíbrio, Tabela 1).
- Carregue até 9,0 mL do supernascido do lysate centrifuso na coluna SPE.
- Lave as impurezas com 5 mL de acetato de amônio de 25 mM (solução de lavagem spe 1, Tabela 1).
- Lave as impurezas com 5 mL de metanol (solução de lavagem spe 2, Tabela 1).
- Elute o cofator F420 em 1,0 mL de tampão de eluição (Tabela 1).
NOTA: Prepare o tampão de eluição fresco. Devido ao vácuo aplicado e à alta pressão de vapor do tampão de elução, os volumes de eluição podem diferir de amostra para amostra. Para garantir o mesmo volume final em todas as amostras, recomenda-se pesar os vasos de coleta antes e depois da eluição e calcular o volume de eluição eficaz. Equilibre as diferenças com a adição de tampão de elução.
3. Detecção do cofator F420
- Coloque o forno a 40 °C e detector de fluorescência a 420 nm de comprimento de onda de extinção e comprimento de onda de emissão de 470 nm. Obter separação via modo gradiente utilizando as fases móveis A e B (Tabela 1): 0-3 min: 26% B; 3-24 min: 26%-50% B; 24-25 min: 50% B; 25-27 min: 50%-26% B; 27-35 min: 26% B a uma vazão de 0,75 mL·min-1.
NOTA: Garantia de equilíbrio das condições da coluna antes da injeção de amostras, lavando a coluna pelo menos com volumes de 3 colunas de 74% de fase móvel A e 26% de fase B móvel (Tabela 1).- Filtre as amostras elucidadas da SPE em frascos HPLC usando um filtro PTFE com um tamanho de poro de 0,22 μm.
NOTA: Recomenda-se os filtros PTFE com um tamanho de poros de 0,22 μm. - Injete 50 μL da amostra elucida no sistema HPLC para analisar a composição e concentração do cofato F420 .
NOTA: Como nenhum padrão quantitativo é usado neste protocolo, amostras e variantes devem ser comparadas por área de pico.
- Filtre as amostras elucidadas da SPE em frascos HPLC usando um filtro PTFE com um tamanho de poro de 0,22 μm.
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Representative Results
Culturas puras de termófila de metanosarcina e termofílico de Metanoculleus, ambos termofílicos methanogênicos Archaea, foram cultivadas em mídia adequada, como descrito anteriormente29,30. Para a termófila de metanoosacina, o metanol foi usado como fonte de energia, enquanto o termofílico de Metanoculleus foi cultivado em H2/CO2. O crescimento foi verificado pela avaliação microscópica, enquanto a atividade foi examinada por meio da medição do metano (CH4) por cromatografia gasosa, conforme descrito anteriormente31. Culturas puras foram utilizadas para a extração do cofato F420 de acordo com o protocolo apresentado. Além disso, amostras ambientais incluindo amostras de um sludge de reator de biogás mesofílico (Estação de tratamento de águas residuais, Zirl, Áustria; para detalhes sobre parâmetros de lodo, por favor, consulte 32), um prado usado agrícolamente (Innsbruck, Áustria) e solo florestal (Lans, Áustria) foram levados no outono de 2020 para a extração e análise do cofactor F420.
O crescimento das culturas puras tem sido verificado por microscopia (Figura 1), com o CH4 produzido analisado via cromatografia gasosa durante 14 dias de incubação (dados não apresentados). A eficiência da extração do cofactor F420 a partir de culturas puras foi testada aplicando diferentes estratégias de desintegração: batidas de batida usando batidas cerâmicos de 0,5-1,0 mm, tratamento ultrassônico e desintegração da temperatura de pressão usando pressão de 121°C e 1,2 barras (autoclaving). A eficiência máxima de extração tornou-se aparente usando o tratamento de pressão-temperatura aplicando um buffer como descrito na seção de protocolo e, assim, foi ainda mais aplicada para todos os experimentos subsequentes (Figura 2). Os testes de eficiência de extração foram realizados por meio da adição padrão de diferentes volumes de uma cultura termofílico de Methanoculleus em crescimento. Além disso, a comparação de diferentes amostras e variantes foi baseada na área de pico a partir de cromatógrafos.
Posteriormente, os extratos celulares foram submetidos a um procedimento de extração em fase sólida (SPE). Para isso, diferentes trocadores de íons foram testados. Descobriu-se que um sorbent polimérico de modo misto de ânion fraco rendeu a maior quantidade de cofato F420 após a eluição. Além disso, diferentes tampões de elução e soluções de lavagem foram testados e mostraram os melhores resultados para acetato de amônio de 25 mM como tampão de lavagem e uma mistura de NH3 em metanol como tampão de eluição. O metanol da etapa de eluição pode ser trocado após a eluição com água através de um tratamento de temperatura de vácuo.
A análise HPLC do cofactor F420 foi testada com diferentes colunas C18 com os melhores resultados para a configuração do sistema alcançado durante o estudo apresentado com uma coluna NX C18. Foi utilizado um padrão contendo uma distribuição conhecida de derivados F420 com comprimento variado da cauda de glutamato para fins de referência. Este padrão foi gentilmente fornecido pelo Prof. Colin Jackson da Universidade Nacional Australiana. A análise do comprimento da cauda do glutamato revelou diferenças na concentração geral do cofator F420 e na distribuição do comprimento da cauda F420 de culturas puras e amostras ambientais (Figura 3).
| Buffer | Composição |
| Tampão de lise (solução de estoque 2x) | Fosfato de dihidro de potássio de 200 mM (KH2PO4) 50 mM ácido ethylenodiaminatotraacético (EDTA) 1% (w/v) polisorbato 80 (Interpolação 80) ajustado para pH 7.0 com solução de hidróxido de sódio de 5 M |
| Solução de condicionamento de SPE | Metanol (grau HPLC) |
| Solução de equilíbrio da SPE | Água destilada 0,2 μm filtrada |
| Solução de lavagem SPE 1 | Acetato de amônio de 25 mM |
| Solução de lavagem SPE 2 | Metanol (grau HPLC) |
| Tampão de eluição SPE | 2% (v/v) amônia em metanol diluindo solução de amônia aquosa de 20%-25% em metanol |
| Fase móvel HPLC A | Hidróxido de tetrabutylammonium de 10 mM (TBAH) Fosfato de hidrogênio di-amônio de 20 mM ((NH4)2HPO4) ajustado para pH 7.0 com ácido fosfórico de 85% |
| Fase móvel HPLC B | Acetonitrila (grau HPLC) |
Tabela 1: Composição de fase tampão e móvel para extração em fase sólida (SPE) e análise HPLC.
Figura 1: Cultura pura metogênica fluorescente. Visualização da termófila de metanoossarcina via (A) microscopia de contraste de fase e via (B) microscopia de fluorescência quando o cofactor F420 está animado com luz UV (excitação em 395-440 nm e emissão em 475-495 nm). Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Adição padrão. Área de pico do cofato recuperado F420 após SPE de 1,0 g de matriz cravada com diferentes volumes de culturas de M. termofílico . Matrix foi alterada com 0 μL, 250 μL, 500 μL, 750 μL e 1000 μL de cultura e submetida a diferentes estratégias de desintegração: beat-beating, tratamento ultrassônico e desintegração de pressão-temperatura (autoclaving). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Distribuição do comprimento da cauda do glutamato. Cofactor F420 distribuição de comprimento da cauda de culturas puras e amostras ambientais. De cima para baixo: prado usado agrícolamente (solo), floresta (solo), reator de biogás mesofílico, cultura pura de M. termophilus, e cultura pura de M. termophila. A absorvância relativa foi calculada pela normalização no pico mais alto dentro do cromatograma mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Para a avaliação do cofator F420 a partir de culturas puras metogênicas, pode-se realizar uma avaliação microscópica para visualizar o crescimento e a atividade (microscopia de fluorescência) dos microrganismos envolvidos (Figura 1). Para amostras derivadas de ambientes naturais, o uso de microscopia para detectar ou quantificar f420 é limitado devido a interferências com outros microrganismos fluorescentes, partículas orgânicas e inorgânicas. Neste contexto, a extração de F420 e a análise fluorométrica subsequente usando HPLC, como descrito anteriormente5, podem não apenas fornecer informações sobre a concentração global do cofato F420 , mas também sobre a distribuição do comprimento da cauda do poligutama.
Para a extração do cofator F420, um tratamento de pressão-temperatura mostrou-se altamente eficaz (Figura 2) e está de acordo com os achados anteriores5,27,33. Através deste método e a aplicação de um sistema de lise tampão fosfato, incluindo EDTA e polisorbato, as maiores concentrações do cofato F420 foram obtidas a partir de culturas puras methanogênicas contendo altas concentrações do fator. Além disso (e em comparação com os outros métodos de interrupção celular testados), o tratamento de pressão-temperatura é facilmente aplicável e que economiza material.
A SPE foi realizada para permitir uma análise de HPLC a jusante visando a determinação da distribuição do comprimento da cauda de poliglutama do cofato F420 dentro de uma amostra. Entre vários trocadores de íons, um sorbent polimérico de modo misto de ânion fraco mostrou o melhor desempenho e permite a vinculação efetiva do cofator F420 à matriz para fins de lavagem, bem como sua subsequente remoção da matriz de extração após lavar subejáveis sub-produtos. Para isso, o metanol básico provou ser o melhor.
Através do método apresentado, várias culturas puras e amostras ambientais puderam ser analisadas de forma reprodutivelmente em relação ao cofato F420 (Figura 3). Mesmo amostras como solos ou lodo contendo altas proporções de subprodutos indesejados poderiam ser analisadas pelo procedimento apresentado. Portanto, a análise a jusante via HPLC foi implementada com sucesso para analisar a concentração total de F420 e a distribuição de comprimento das caudas poliglutamas de derivados F420 . A detecção de altos níveis de F420 no solo e outras amostras suporta Ney et el.5, que propôs que o cofator seja difundido em bactérias do solo aeróbico com base na análise genômica e metagenômica.
Resumindo, este é o primeiro protocolo que visa extrair e analisar o cofator F420 não apenas a partir de culturas puras, mas também de amostras ambientais como solo ou lodo. O passo mais crítico na extração de F420 a partir de amostras ambientais é a SPE necessária para a pré-limpeza de lises para análises subsequentes do HPLC. O protocolo apresentado será útil para projetos futuros revelarem o papel do F420 em diversos ambientes e bioprocessos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Prof. Colin Jackson pelo apoio com o cofactor F420 purificado. Esta pesquisa foi apoiada pelo Tyrolean Science Fund (TWF) e pela Universität Innsbruck (Publikationsfonds). Reconhecemos muito o suporte de GPS, HK, SB, GG e HB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | |||
| Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector | Shimadzu | HPLC system | |
| Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes | |||
| HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm | Phenomenex | HPLC column | |
| PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis | |||
| Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent | Phenomenex | weak anion mixed-mode polymeric sorbent | |
| Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes | SPE equipment | ||
| Vortex mixer |
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