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Biochemistry

ट्रिप्टोफान-एएनएस FRET का अध्ययन करने के लिए एक रिकॉम्बिनेंट सीए2 +-ATPase N-डोमेन में ट्रिप्टोफान अवशेषों का रासायनिक संशोधन

Published: October 9, 2021 doi: 10.3791/62770
Automatic Translation
1, 1
1Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

Summary

ANS सीए2 +-ATPase recombinant N-डोमेन के लिए बांधता है। फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा 295 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर उत्तेजन पर एक FRET की तरह पैटर्न प्रदर्शित करता है। टीआरपी का एनबीएस-मध्यस्थता रासायनिक संशोधन एन-डोमेन के फ्लोरेसेंस को quenches करता है, जिससे टीआरपी अवशेषों और एएनएस के बीच ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) की अनुपस्थिति होती है।

Abstract

सारको/एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम सीए2+-एटीपीएसई (एसईआरसीए) एक पी-प्रकार की एटीपीई है जिसे विभिन्न अनुरूपता में सघन किया गया है। विस्तृत कार्यात्मक जानकारी फिर भी अलग-अलग पुनर्संयोजन डोमेन से प्राप्त की जा सकती है। इंजीनियर (Trp552Leu और Tyr587Trp) पुनः संयोजन न्यूक्लियोटाइड-बाध्यकारी डोमेन (एन-डोमेन) लिगामेंट बाइंडिंग पर बुझाने फ्लोरेसेंस प्रदर्शित करता है। एक बाह्य फ्लोरोफोर, अर्थात्, 8-अनिलिनो-1-नेफ्थालीन सल्फोनेट (एएनएस), एर्ग, हि, अला, एलू और पीएचई अवशेषों के साथ इलेक्ट्रोस्टैटिक और हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन के माध्यम से न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग साइट से बांधता है। ANS बाध्यकारी फ्लोरेसेंस तीव्रता में वृद्धि का सबूत है जब 370 एनएम की एक तरंग दैर्ध्य (λ) पर उत्साहित है। हालांकि, जब 295 एनएम के λ उत्साहित, फ्लोरेसेंस तीव्रता में वृद्धि एन-डोमेन आंतरिक फ्लोरेसेंस के शमन के साथ मिलकर प्रतीत होती है। फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा एक फॉस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) की तरह पैटर्न प्रदर्शित करता है, जिससे टीआरपी-एंस FRET जोड़ी की उपस्थिति का सुझाव दिया जाता है, जो Tyr587Trp और एंस के बीच कम दूरी (~ 20 Å) द्वारा समर्थित प्रतीत होता है। इस अध्ययन में टीआरपीरासायनिक संशोधन (और फ्लोरेसेंस शमन) द्वारा टीआरपी-एएनएस FRET जोड़ी के विश्लेषण का वर्णन किया गया है जो एन-ब्रोमोस्यूसिनिमाइड (एनबीएस) द्वारा मध्यस्थता की जाती है। रासायनिक रूप से संशोधित एन-डोमेन में, एएनएस फ्लोरेसेंस 295 एनएम के λ पर उत्साहित होने पर बढ़ गया, जो 370 एनएम के λ पर उत्साहित होता है। इसलिए टीआरपी अवशेषों के एनबीएस-मध्यस्थता वाले रासायनिक संशोधन का इस्तेमाल टीआरपी और एएनएस के बीच FRET की अनुपस्थिति की जांच के लिए किया जा सकता है । टीआरपी फ्लोरेसेंस के अभाव में, किसी को एन्स फ्लोरेसेंस में वृद्धि का पालन नहीं करना चाहिए। एनबीएस द्वारा प्रोटीन में टीआरपी अवशेषों का रासायनिक संशोधन टीआरपी अवशेषों के बीच FRET की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है जो बाध्य ANS के करीब हैं। अन्य फ्लोरोफोरस का उपयोग करते समय यह परख भी उपयोगी होगी।

Introduction

फॉस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफईआरटी) प्रोटीन संरचना और कार्य अध्ययन 1 ,2,3,4में बाध्यकारी या बातचीत के बाद आणविकसंरचनाओंके बीच की दूरी निर्धारित करने के लिए एक मानक तकनीक बन गया है। पी-प्रकार के एटीपीएएसईएस में, जेआरटी का उपयोग सरको-एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम सीए 2 + -एटीपीएस (एसईआरसीए)2,5,6,7,8,जैसे, उत्प्रेरक चक्र के दौरान संरचनात्मक उतार-चढ़ाव की संरचना और कार्य की जांच करने के लिए किया गयाहै।

FRET दाताओं विविध हैं, और छोटे फ्लोरोसेंट (बाह्य) अणुओं से फ्लोरोसेंट प्रोटीन9,10के लिए सीमा । ट्राइप्टोफन (टीआरपी) अवशेष (उनके फ्लोरेसेंस के कारण) प्रोटीन अमीनो एसिड दृश्यों में संरचनात्मक परिवर्तनों की पहचान करने के लिए उपयोगी हैं11,12। टीआरपी की फ्लोरेसेस तीव्रता इसके आसपास के वातावरण13,14की ध्रुवता पर काफी हद तक निर्भर करती है . लिगांड बाइंडिंग आमतौर पर प्रोटीन/एंजाइम15,16में संरचनात्मक पुनर्व्यवस्था उत्पन्न करती है । यदि टीआरपी प्रोटीन बाध्यकारी साइट के करीब मौजूद है या स्थित है, तो संरचनात्मक उतार-चढ़ाव अक्सर जलीय मीडिया13,14के लिए टीआरपी एक्सपोजर की डिग्री को प्रभावित करते हैं। इस प्रकार, ध्रुवता में परिवर्तन टीआरपी फ्लोरेसेंस तीव्रता13,14की शमन में परिणाम . इसलिए, टीआरपी की फ्लोरोसेंट संपत्ति एंजाइमों के लिए लिगांड बाध्यकारी अध्ययन करने के लिए उपयोगी है। अन्य भौतिक घटनाओं से टीआरपी फ्लोरेसेंस शमन17,18,19,20,जैसे, FRET और मध्यम ध्रुवीयता में परिवर्तन हो सकता है। टीआरपी की उत्तेजित स्थिति से फ्लोरोफोर में ऊर्जा हस्तांतरण में संभावित अनुप्रयोग भी होते हैं, उदाहरण के लिए, प्रोटीन21में छोटे लिगामेंट्स का आत्मीयता निर्धारण। दरअसल, टीआरपी का उपयोग मुख्य रूप से प्रोटीन22, 23, 24, 24,जैसे, टेर्बियम (टीबी3 +)FRET अध्ययनों में FRET अध्ययनों में फ्लोरेसेंस डोनर के रूप में किया जाता है, टीआरपी अवशेषों का उपयोग टीबी3 +25, 26,27में ऊर्जा हस्तांतरण के लिए एंटीना के रूप में अक्सर किया जाता है। टीआरपी प्रोटीन संरचना में अपने अंतर्निहित संविलियन चरित्र के कारण अन्य FRET दानदाताओं पर विभिन्न लाभ प्रदर्शित करता है, जो प्रेटिव प्रक्रियाओं की आवश्यकता को समाप्त करता है जो अध्ययन किए गए प्रोटीन24के कार्य/संरचना को प्रभावित कर सकते हैं। इस प्रकार , प्रोटीन संरचनात्मक पुनर्व्यवस्थाओं से प्रेरित मध्यम ध्रुवता में ऊर्जा अंतरण और परिवर्तन की पहचान प्रोटीन संरचनात्मक अध्ययन13 , 14,19,28में लिगांड बाध्यकारी के बारे में सटीक निष्कर्ष निकालने के लिए महत्वपूर्ण है ।

प्रोटीन संरचनात्मक अध्ययनों में, एक बाह्य फ्लोरोफोर, अर्थात्, 8-अनिलिनो-1-नेफ्थालीन सल्फोनेट (एएनएस), मुख्य रूप से प्रोटीनतह से संबंधित प्रयोगों में इस्तेमाल किया गयाहै/ ANS मूल राज्य में प्रोटीन/एंजाइमों के लिए बांधता है, आमतौर पर सब्सट्रेट्स31,32, 33के बाध्यकारी स्थलों में; एएनएस फ्लोरेसेंस क्वांटम यील्ड (ΦF) (अर्थात्, फ्लोरेसेंस तीव्रता में वृद्धि) में वृद्धि λ = 370 एनएम पर प्रोटीन को रोमांचक द्वारा प्रेरित करती है जब एआरजी के साथ एएनएस की उपयुक्त बातचीत और हाइड्रोफोबिक जेब में उनके अवशेष34,35,36, 37होते हैं। विभिन्न अध्ययनों में, टीआरपी अवशेषों (दानदाताओं) और एएनएस (स्वीकार्य) के बीच 280-295 एनएम के भीतर Λ में रोमांचक होने की घटना की सूचना दी गई है, जो निम्नलिखित पर आधारित है: 1) टीआरपी के फ्लोरेसेंस उत्सर्जन स्पेक्ट्रम का ओवरलैप और एएनएस, 2 का उत्तेजन स्पेक्ट्रम) एक या एक से अधिक टीआरपी अवशेषों (एस) और ऊर्जा हस्तांतरण के लिए एएनएस के एक उपयुक्त दूरी की पहचान 3) प्रोटीन की जेब में बंधे होने पर उच्च एएनएस क्वांटम यील्ड , और 4) एएनएस 3 , 17 ,27,37,37,38की उपस्थिति में प्रोटीन के फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा में विशेषता FRET पैटर्न।

हाल ही में, एसईआरसीए और अन्य पी-प्रकार के एटीपीएएस में न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग डोमेन (एन-डोमेन) के लिए बाध्यकारी लिगांड की जांच इंजीनियर रिकॉम्बिनेंटएन-डोमेन40, 41,42,43,44,45, 46का उपयोग करके की गई है। एसईआरसीए एन-डोमेन की आणविक इंजीनियरिंग का उपयोग एकमात्र टीआरपी अवशेष (Trp552Leu) को अधिक गतिशील संरचना (Tyr587Trp) में स्थानांतरित करने के लिए किया गया है जो न्यूक्लियोटाइड-बाध्यकारी साइट के करीब है, जहां फ्लोरेसेंस विविधताओं (शमन) का उपयोग लिगांड बाध्यकारी34पर संरचनात्मक परिवर्तनों की निगरानी के लिए किया जा सकता है। प्रायोगिक परिणामों से पता चला है कि एएनएस शुद्ध पुनः संयोजन SERCA एन-डोमेन34में न्यूक्लियोटाइड-बाध्यकारी साइट को (एटीपी के रूप में) बांधता है। दिलचस्प बात यह है कि 295 एनएम के λ में उत्तेजन पर एन-डोमेन के लिए बाध्यकारी होने पर एएनएस फ्लोरेसेंस बढ़ जाता है, जबकि एन-डोमेन का आंतरिक फ्लोरेसेंस34कम हो जाता है, जिससे एक FRET पैटर्न का उत्पादन होता है जो टीआरपी-एएनएस FRET जोड़ी के गठन का सुझाव देता है।

एनबीएस के उपयोग को संशोधित प्रोटीन की परख को अवशोषित करके प्रोटीन47 में टीआरपी अवशेषों की सामग्री का निर्धारण करने का प्रस्ताव किया गया है। एनबीएस टीआरपी के अत्यधिक अवशोषित इंडोल समूह को कम शोषक ऑक्सइंडोल47,48मेंसंशोधितकरता है । इसके परिणामस्वरूप टीआरपी फ्लोरोसेंट संपत्ति40के नुकसान (शमन) होता है। इसलिए, टीआरपी अवशेषों के एनबीएस-मध्यस्थता रासायनिक संशोधन का उपयोग टीआरपी (दाता के रूप में) की भूमिका को परिभाषित करने के लिए एक परख के रूप में किया जा सकता है जब FRET परिकल्पना की जाती है।

यह प्रोटोकॉल एक प्रोटीन मॉडल के रूप में एसईआरसीए के इंजीनियर पुनर्संयोजन एन-डोमेन में एनबीएस द्वारा एकमात्र टीआरपी अवशेषों के रासायनिक संशोधन का वर्णन करता है। प्रायोगिक परिणाम दर्शाते हैं कि रासायनिक एनबीएस-संशोधित एन-डोमेन34में एन एस फ्लोरेसेंस तीव्रता अभी भी बढ़ जाती है, जिसमें आंतरिक फ्लोरेसेंस का अभाव है। इसलिए, परख टीआरपी अवशेषों और एएनएस के बीच FRET की अनुपस्थिति का प्रदर्शन करने के लिए उपयोगी है जब एन-डोमेन34,40,49से बंधे हैं। इसलिए, यह परख (टीआरपी का एनबीएस रासायनिक संशोधन) प्रोटीन में टीआरपी-एएनएस FRET जोड़ी की उपस्थिति साबित करने में उपयोगी है।

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Protocol

1. ANS और SERCA N-डोमेन बातचीत के(सिलिको में)दृढ़ संकल्प

  1. पसंदीदा प्रोटीन मॉडलिंग सॉफ्टवेयर 50 का उपयोग करके आणविक मॉडलिंग द्वारा प्रोटीन (एसईआरसीए एन-डोमेन) की त्रि-आयामी(3डी) संरचना उत्पन्न करें।
  2. अमीनो एसिड अवशेषों की पहचान करें जो पसंदीदा आणविक संरचना सॉफ्टवेयर51का उपयोग करके न्यूक्लियोटाइड-बाध्यकारी साइट बनाते हैं, और एआरजी और Lys अवशेषों की उपस्थिति निर्धारित करते हैं35; ये एएनएस बाध्यकारी के लिए आवश्यक हैं और फ्लोरेसेंस तीव्रता (क्वांटम उपज) को बढ़ाने के लिए।
  3. आणविक डॉकिंग (पसंदीदा डॉकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके)52,53,54 एटीपी, फ्लोरोसीन आइसोथियोसायनेट (फिटसी) (जो न्यूक्लियोटाइड-बाध्यकारी साइट लेबलिंग Lys515 के साथ एक सहसंयोजक बांड बनाता है) और न्यूक्लियोटाइड-बाध्यकारी साइट(चित्रा 1)में अमीनो एसिड अवशेषों के साथ एएनएस।
  4. पसंदीदा सॉफ्टवेयर में माप उपकरण का उपयोग कर टीआरपी अवशेषों और बाध्य एएनएस के बीच आणविक दूरी (Å) की गणना करें।
  5. बातचीत52,54की स्थिरता निर्धारित करने के लिए ANS-N-डोमेन परिसर के आणविक गतिशीलता सिमुलेशन प्रदर्शन करते हैं। फिर, इन विट्रो प्रयोगों को करें जब परिसर की स्थिरता की पुष्टि हो गई हो।

2. पुनर्संयोजन एन-डोमेन की अभिव्यक्ति और शुद्धि

  1. एन-डोमेन40के लिए जीन कोडिंग को संश्लेषित करें।
  2. प्लाज्मिड का डिजाइन और निर्माण जिसमें सिंथेटिक जीन होता है जो एन-डोमेन40के लिए कोड करता है।
  3. एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी (नी-एनटीए), इंजीनियर रिकॉम्बिनेंट एन-डोमेन द्वारा एक्सप्रेस और शुद्ध करें। शुद्धता(चित्रा 2)40निर्धारित करने के लिए शुद्ध प्रोटीन का एक एसडीएस-पेज करें।
  4. एन-डोमेन विलुप्त होने के गुणांक (ε = 11,960 एम -1-सेमी-1)40केसाथ 280 एनएम के λ अवशोषण का अध्ययन करके प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करें।

3. ANS और N-डोमेन फ्लोरेसेंस तीव्रता परिवर्तन के आधार पर ANS-N-डोमेन परिसर के गठन की निगरानी करें।

  1. एन,एन-डाइमेथाइलफार्मेमाइड में एक एएनएस स्टॉक समाधान तैयार करें।
    1. एएनएस की एक छोटी राशि (1-5 मिलीग्राम) का वजन करें, और इसे एन,एन-डाइमेथाइलफॉर्मेमाइड, जैसे, 3.2 मिलीग्राम (10.69 mm अंतिम एकाग्रता) की अंतिम मात्रा के 1 मिलील में भंग करें।
    2. एन,एन-डाइमेथाइलफार्मेमाइड में एएनएस समाधान काउपयोग करके 100 μM ANS जलीय स्टॉक समाधान तैयार करें, उदाहरण के लिए, 10.69 m AM ANS समाधान के 9.4 μL को 50 m फॉस्फेट बफर के साथ 50 m फॉस्फेट बफर में जोड़ें।
    3. 15 एस के लिए 3 - 5 बार भंवर से समाधान मिलाएं।
      नोट: निम्नलिखित प्रयोग में, केवल ANS जलीय स्टॉक समाधान का उपयोग करें। प्रयोग शुरू करने से पहले एंस जलीय स्टॉक समाधान को ताजा तैयार करें।
  2. एन,एन-डाइमेथाइलफार्मेमाइड में एनबीएस स्टॉक समाधान तैयार करें।
    1. एनबीएस की एक छोटी राशि (1-5 मिलीग्राम) का वजन करें, और इसे एनके 1 मिलीलन, एन-डाइमेथाइलफार्मेमाइड, जैसे, 1 मिलीएल (29.78 m m अंतिम एकाग्रता) में 5.3 मिलीग्राम में भंग करें।
    2. एन,एन-डाइमेथाइलफार्मेमाइड, जैसे में एनबीएस समाधान का उपयोग करके 1 एमएमएम एनबीएस जलीय स्टॉक समाधान तैयार करें, अंतिम वॉल्यूम 0.1 एमएल प्राप्त करने के लिए 50 एमएम फॉस्फेट बफर के 96.64 μL में 29.78 m NBS समाधान के 3.36 μL जोड़ें।
    3. 15 एस के लिए 3 - 5 बार भंवर से समाधान मिलाएं।
      नोट: प्रयोग शुरू करने से पहले एनबीएस जलीय स्टॉक समाधान को तैयार करें।
  3. एन-डोमेन को एएनएस के साथ टिट्रेट करें, और 25 डिग्री सेल्सियस पर λ = 295 एनएम पर उत्तेजन द्वारा फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड करें।
    1. फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम बेसलाइन प्राप्त करें।
      1. 1 एमएल फ्लोरेसेंस क्वार्ट्ज क्वेट में पीएच 8.0 के साथ 50 एमएम फॉस्फेट बफर के 1 एमएल रखें।
      2. स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर के थर्मो-सैथ सेल चैंबर (25 डिग्री सेल्सियस) में सेल की स्थिति और 295 एनएम के लिए λ उत्साह सेट करें।
      3. फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम (305 - 550 एनएम) रिकॉर्ड करें।
        नोट: पीएच 8.0 के साथ 50 m M फॉस्फेट बफर का फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम, जो खाली नमूने के रूप में कार्य करता है, सभी प्राप्त फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा से घटाया जाता है।
    2. एन-डोमेन के आंतरिक फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम प्राप्त करें।
      1. फ्लोरेसेंस क्वार्ट्ज क्वेट में पीएच 8.0 के साथ 50 एमएम फॉस्फेट बफर के 900 माइक्रोन रखें।
      2. 1 मिलियन अंतिम मात्रा में 1 μM N-डोमेन अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एन-डोमेन (10 माइक्रोन) निलंबन के 100μL जोड़ें।
      3. धीरे-धीरे समाधान की एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए 20 बार माइक्रोपिपेट का उपयोग करके समरूपता।
        नोट: प्रोटीन को उच्च गुणवत्ता वाले आंतरिक फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए हौसले से शुद्ध किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, शुद्ध पुनर्संयोजन एन-डोमेन का उपयोग शुद्ध होने के बाद केवल एक सप्ताह के लिए किया जा सकता है।
      4. स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर के थर्मो-सैथ सेल चैंबर (25 डिग्री सेल्सियस) में सेल की स्थिति और 295 एनएम के लिए λ उत्साह सेट करें।
      5. एन-डोमेन आंतरिक फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम (305-550 एनएम) रिकॉर्ड करें।
    3. एएनएस जोड़ें, और λ = 295 एनएम पर उत्तेजन द्वारा फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम प्राप्त करें।
      1. 0.2 माइक्रोन एएनएस अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए निलंबित एन-डोमेन (1 माइक्रोन) में 100 माइक्रोन एएनएस जलीय स्टॉक समाधान का 2 μL aliquot जोड़ें।
      2. धीरे-धीरे समाधान की एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए 20 बार माइक्रोपिपेट का उपयोग करके समरूपता।
      3. स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर के थर्मो-स्थिर सेल चैंबर (25 डिग्री सेल्सियस) में कोशिका की स्थिति और 295 एनएम के लिए λ उत्साह सेट करें।
      4. फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम (305-550 एनएम) रिकॉर्ड करें।
      5. 1:1 मोलर रिलेशनशिप एएनएस: एन-डोमेन के ऊपर एएनएस एडिक्शन और फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा रिकॉर्डिंग दोहराएं।
      6. उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक स्पेक्ट्रम से खाली स्पेक्ट्रम घटाना।
      7. एक ही ग्राफ में सभी स्पेक्ट्रा प्लॉट।
      8. निर्धारित करें कि स्पेक्ट्रा एक FRET की तरह पैटर्न के रूप में । एएनएस-एन-डोमेन फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा एक FRET-जैसे पैटर्न(चित्रा 3 ए)बनाते हैं।

4. एनबीएस के साथ टीआरपी रासायनिक संशोधन द्वारा एन-डोमेन आंतरिक फ्लोरेसेंस टिटरेशन।

  1. चरण 3.3.1 और 3.3.2 दोहराएं।
  2. 1 μM एनबीएस की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए निलंबित एन-डोमेन (1 माइक्रोन) में 1 एमएमएम एनबीएस जलीय स्टॉक समाधान का 1 μL aliquot जोड़ें।
  3. समाधान की एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए 20 बार माइक्रोपिपेट का उपयोग करके धीरे-धीरे समरूपता।
  4. स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर के थर्मो-स्थिर सेल चैंबर (25 डिग्री सेल्सियस) में कोशिका की स्थिति और 295 एनएम के लिए λ उत्साह सेट करें।
  5. फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम (305-550 एनएम)(चित्रा 3B)रिकॉर्ड करें।
  6. एनबीएस जोड़ और फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा रिकॉर्डिंग को तब तक दोहराएं जब तक कि न्यूनतम एन-डोमेन आंतरिक फ्लोरेसेंस शमन40नहीं हो जाता। एन-डोमेन में, यह आमतौर पर 5-6 एनबीएस/एन-डोमेन40के मोलर अनुपात में होता है।
    नोट: एनबीएस तेजी से एन-डोमेन के आंतरिक फ्लोरेसेंस (<5 एस) को quenches (<5 एस) फ्लोरेसेंस तीव्रता में कमी देखी जाती है। अगले चरण के लिए तुरंत आगे बढ़ें, क्योंकि एनबीएस अन्य अमीनो एसिड अवशेषों47के साथ भी प्रतिक्रिया दे सकता है।
  7. उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक स्पेक्ट्रम से खाली स्पेक्ट्रम घटाना।
  8. एक ही ग्राफ(चित्रा 3B)में सभी स्पेक्ट्रा प्लॉट ।

5. 25 डिग्री सेल्सियस पर फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड करके एएनएस के साथ एनबीएस-संशोधित एन-डोमेन को टिट्रेट करें।

  1. चरण 4 में उत्पन्न एनबीएस संशोधित एन-डोमेन का उपयोग करके चरण 3.3.3 करें।
  2. उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक स्पेक्ट्रम से खाली स्पेक्ट्रम घटाना।
  3. एक ही ग्राफ(चित्रा 3C)में सभी स्पेक्ट्रा प्लॉट ।
  4. उत्पन्न फ्लोरेसेंसस्पेक्ट्रा (चित्रा 3सी)का समर्थन या वीआरटी की घटना का खंडन करता है, यानी, जब FRET होता है, तो एएनएस फ्लोरेसेंस में वृद्धि नहीं होती है और इसके विपरीत।

6. λ = 370 एनएम पर उत्तेजन द्वारा रासायनिक रूप से संशोधित एन-डोमेन के लिए बाध्यकारी एएनएस के सबूत।

  1. चरण 4 में उत्पन्न एनबीएस संशोधित एन-डोमेन का उपयोग करके चरण 3.3.3 करें, लेकिन λ उत्तेजन को 370 एनएम तक बदल दें।
  2. उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक स्पेक्ट्रम से खाली स्पेक्ट्रम घटाना।
  3. एक ही ग्राफ(चित्रा 3 डी)में सभी स्पेक्ट्रा प्लॉट करें।
  4. ANS फ्लोरेसेंस तीव्रता में वृद्धि देख कर एन-डोमेन के लिए बाध्यकारी ANS की पुष्टि करें। एन-डोमेन के लिए बाध्यकारी ANS λ = 370 एनएम(चित्रा 3 डी)पर उत्साहित होने पर फ्लोरेसेंस वृद्धि दिखाता है। नियंत्रण के रूप में, पीएच 8.0 के साथ 50 मीटर फॉस्फेट बफर में एएनएस (अकेले) का फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम 295 और 370 एनएम(चित्रा 4,वीडियो में नहीं दिखाया गया) के λ रोमांचक प्राप्त किया गया था।
    नोट: एनबीएस का स्टोइकिओमेट्रिक संबंध: रासायनिक संशोधन के लिए आवश्यक टीआरपी अध्ययन46, 47, 55, 56के तहत प्रोटीन में टीआरपी अवशेषों(एस)को दफनाने की डिग्री पर निर्भर करता है। इसलिए, एनबीएस: प्रोटीन/(टीआरपी) मोलर अनुपात, पहले से निर्धारित करने की सिफारिश की जाती है।

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Representative Results

आणविक डॉकिंग इलेक्ट्रोस्टैटिक के साथ-साथ हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन(चित्रा 1)के माध्यम से एन-डोमेन की न्यूक्लियोटाइड-बाध्यकारी साइट के लिए एएनएस के बाध्यकारी से पता चलता है। टीआरपी अवशेषों और एएनएस (न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग साइट से बंधे) के बीच आणविक दूरी (20 Å) FRET(चित्रा 1)की घटना का समर्थन करती है। डिजाइन (इंजीनियर) पुनः संयोजन एन-डोमेन एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी(चित्रा 2)द्वारा उच्च शुद्धता पर प्राप्त किया गया था और फ्लोरेसेंस प्रयोगों के लिए उपयुक्त था। एएनएस-एन-डोमेन कॉम्प्लेक्स के फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा ने λ = 295 एनएम(चित्रा 3 ए)पर उत्तेजन पर एक FRET-जैसे पैटर्न प्रदर्शित किए। एनबीएस द्वारा टीआरपी अवशेषों के रासायनिक संशोधन के कारण एन-डोमेन(चित्रा 3बी)के आंतरिक फ्लोरेसेंस का शमन हुआ। रासायनिक एनबीएस-संशोधित एन-डोमेन में, प्रायोगिक परिणाम यह प्रदर्शित करते हैं कि एएनएस फ्लोरेसेंस ने λ = 295 एनएम(चित्रा 3 सी)पर उत्तेजन पर वृद्धि की, जो गैर-संशोधित एन-डोमेन(चित्रा 3 ए)में मनाया गया था। इसलिए , λ = 295 एनएम पर एएनएस की सीधी उमंग एएनएस फ्लोरेसेंस(चित्रा 3सी)के लिए सबसे अधिक ऊर्जा प्रदान करती है, जैसा कि पहले28सुझाव दिया गया था । रासायनिक रूप से संशोधित एन-डोमेन के लिए बाध्यकारी ANS λ = 370 एनएम(चित्रा 3 डी)पर उत्साहित होने पर इसकी फ्लोरेसेंस में वृद्धि का सबूत है। इसलिए, टीआरपी अवशेषों और एएनएस के बीच FRET नहीं होता है जो न्यूक्लियोटाइड-बाध्यकारी साइट से बंधा हुआ है।

Figure 1
चित्रा 1:सीए 2 + -ATPase N-डोमेन की न्यूक्लियोटाइड-बाध्यकारी साइट पर एएनएस की आणविकडॉकिंग। एएनएस आणविक डॉकिंग ऑटोडॉक विना सॉफ्टवेयर (http://vina.scripps.edu/) और एन-डोमेन40के एक उत्पन्न 3डी मॉडल का उपयोग करके किया गया था। इंजीनियर एन-डोमेन में म्यूटेशन Trp552Leu और Tyr587Trp (नीले रंग में दिखाया गया है) शामिल हैं। न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग साइट बनाने वाले अमीनो एसिड अवशेषों को गेंदों और छड़ें के रूप में दर्शाया जाता है और नारंगी रंग में हाइलाइट किया जाता है। इस आंकड़े को स्प्रिंगर नेचर से अनुमति के साथ संशोधित किया गयाहै: स्प्रिंगर, फ्लोरेसेंस जर्नल । कॉपीराइट (2020)34. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:इंजीनियर रिकॉम्बिनेंट सीए2 +-ATPase N-डोमेन का SDS−पेज। एन-डोमेन को क्रोमेग्राफिक कॉलम का उपयोग करके आत्मीयता शुद्धि के अधीन किया गया था। अवशोषण (λ = 280 एनएम) चोटियों से मेल खाते हैं जो एसडीएस − पेज के अधीन थे और कूमासी ब्लू स्टेनिंग द्वारा कल्पना की गई थी। ~ 30 केडीए उनके टैग वाले एन-डोमेन का गठन एन-डोमेन सीए 2 + -ATPase के27केडीए और पॉली-हिस टैग के 3 केडीए द्वारा किया गया है। सीए2 +-ATPase N-डोमेन शुद्धता ImageJ सॉफ्टवेयर (https://imagej.nih.gov/ij/download.html) का उपयोग करके घनत्व द्वारा ≥95% होने की ठान ली थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:एन-डोमेन में टीआरपी अवशेषों का एनबीएस-मध्यस्थता रासायनिक संशोधन टीआरपी और एएनएस के बीच FRET को गलत साबित करता है जो न्यूक्लियोटाइड-बाध्यकारी साइट से बंधा हुआ है। ए= 295 एनएम पर उत्तेजन पर एएनएस-एन-डोमेन परिसर λ का FRET पैटर्न। एएनएस जोड़ा गया था (μM में अंतिम एकाग्रता: स्पेक्ट्रा ए, 0; बी, 0.2; सी, 0.4; डी, 0.6; ई, 0.8; एफ, 1.0; जी, 1.2; और एच, 1.4) निलंबित एन-डोमेन (1 μ) में। B. एनबीएस द्वारा एन-डोमेन का फ्लोरेसेंस शमन (एनबीएसएफ एकाग्रता माइक्रोन में: ए, 0; बी, 1; सी, 2; डी, 3; ई, 4; और एफ, 6) एनबीएस टीआरपी अवशेषों के रासायनिक संशोधन की मध्यस्थता करता है । λ = 295 एनएम पर उत्तेजन पर एन-डोमेन आंतरिक फ्लोरेसेंस देखा गया था। सी. एएनएस का फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा जो λ = 295 एनएम पर उत्तेजन पर रासायनिक रूप से संशोधित एन-डोमेन से बंधा हुआ है। प्रायोगिक स्थितियां एमें हैं । आंकड़े ए, बी, और सी स्प्रिंगर प्रकृति से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है: स्प्रिंगर, फ्लोरेसेंस के जर्नल । कॉपीराइट (2020)34. डी. एएनएस का फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा जो λ = 370 एनएम पर उत्तेजित होने पर रासायनिक रूप से संशोधित एन-डोमेन से बंधा हुआ है। एन-डोमेन को 50 m m फॉस्फेट बफर (पीएच 8.0) और एनबीएस के एलिकोट्स के 1 मिलीलीटर में निलंबित कर दिया गया था, और एएनएस को तदनुसार जोड़ा गया था, जैसा कि ए (एएनएस) और बी (एनबीएस) में वर्णित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:ANS फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा। पीएच 8.0 के साथ 50 m m फॉस्फेट बफर में ANS (1.4 माइक्रोन) 295 और 370 एनएम के λ उत्साहित था; स्पेक्ट्रा क्रमशः काले और नीले रंग में प्रस्तुत किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

एएनएस-एन-डोमेन कॉम्प्लेक्स का फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा 295 एनएम के λ में उत्साहित होने पर एक FRET-जैसा पैटर्न प्रदर्शित करता है, जबकि टीआरपी अवशेषों और एएनएस के बीच आणविक दूरी (20 Å) FRET(चित्रा 1)की घटना का समर्थन करने लगता है। एनबीएस द्वारा टीआरपी रासायनिक संशोधन के परिणामस्वरूप कम फ्लोरोसेंट एन-डोमेन(चित्रा 3B,स्पेक्ट्रम एफ); इसलिए, ऊर्जा हस्तांतरण संभव नहीं है। 295 एनएम(चित्रा 3 ए और सी)के λ पर उत्साहित होने पर एएनएस फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा गैर-संशोधित एन-डोमेन के समान हैं।

इसलिए , 295 एनएम के λ में एएनएस का प्रत्यक्ष उत्तेजन एएनएस फ्लोरेसेंस का मुख्य स्रोत है जब यह एटीपी बाध्यकारी साइट(चित्रा 3 सी)से बंधा होता है , जो अन्यलेखकोंद्वारा प्रस्तावित तंत्र से सहमत है । इसलिए टीआरपी अवशेषों से बंधे एएनएस तक की FRET एन-डोमेन-एएनएस कॉम्प्लेक्स में नहीं होती है। फिर भी, एनबीएस-मध्यस्थता अन्य प्रोटीन में टीआरपी अवशेषों का रासायनिक संशोधन टीआरपी और एएनएस के बीच FRET का समर्थन करता है, उदाहरण के लिए, न्यूरोस्पोरा क्रैसा49से एंजाइमों जाइलोस रिडक्शन में, खमीर माइटोकॉन्ड्रिया58से एफ 1-एटीपीई की α-सबयूनिट, और थर्मोलिसिन59।

परख हाइड्रोफोबिक जेब (बाध्यकारी साइटों) है कि उनके और Arg अवशेषों को होते है के साथ प्रोटीन/एंजाइमों में अच्छा प्रदर्शन करेंगे, के रूप में इन ANS बातचीत के स्थिरीकरण में योगदान करते हैं । इसके अतिरिक्त, ऐसे प्रोटीन में आदर्श रूप से एकमात्र टीआरपी अवशेष होना चाहिए जो प्रोटीन की सतह पर स्थित है, अर्थात्, एनबीएस40,41, 49के साथ तेजी से प्रतिक्रिया के लिए सुलभ।

वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन में टीआरपी-एएनएस FRET जोड़ी का विश्लेषण करने के लिए, एसिटिलेशन और succinylation द्वारा अपने अवशेषों के रासायनिक संशोधन प्रोटीन/एंजाइम बाध्यकारी साइट६०में ANS बातचीत में बाधा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उत्परिवर्तन द्वारा टीआरपी अवशेषों को हटाना FRET का विश्लेषण करने के लिए एक और रणनीति है। हालांकि, यह समय लेने वाला हो सकता है, और निर्माण संरचनात्मक मतभेदों को प्रदर्शित कर सकते हैं, जिससे लिगांड बाध्यकारी61प्रभावित हो सकता है। इसी प्रकार, लिगांड-बाइंडिंग साइट पर एआरजी और उनके अवशेषों के उत्परिवर्तन से अप्रत्याशित संरचनात्मक परिवर्तन उत्पन्न हो सकते हैं, जिससे उत्परिवर्तित प्रोटीन62प्रयोगों के लिए अनुपयुक्त हो सकता है।

टीआरपी अवशेषों के संबंध में, एनबीएस-रासायनिक संशोधन परख का प्रदर्शन निम्नलिखित मामलों में सीमित होगा: 1) यदि टीआरपी अवशेषों को अच्छी तरह से मुड़ा हुआ और कॉम्पैक्ट प्रोटीन के मूल में गहराई से दफनाया जाता है; चूंकि एनबीएस मोसिटी बड़ेगुहाओं 41, 48,63,2 की अनुपस्थिति के कारण टीआरपी अवशेषों तक पहुंचने में असमर्थ होगी, यदि टीआरपी अवशेष झिल्ली-एम्बेडेड संरचनाओं (ट्रांसमेम्ब) में स्थित हैं एनबीएस के जलीय चरित्र के रूप में α-हेलिक्स)इसे हाइड्रोफोबिक माध्यम32,56,64, 3)में प्रवेश करने से रोकदेगा यदि प्रोटीन संरचना में कई टीआरपी अवशेष होते हैं; पहुंच और भौतिक रसायन वातावरण में भिन्नता बड़े हो सकते हैं, जिससे एकटीआरपी अवशेष32,41,56,4 में फ्लोरेसेंस सिग्नल चेंज करने में मुश्किल हो जाती है, यदि प्रोटीन के लिए बाध्यकारी एएनएस मुख्य रूप से हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन के कारण होता है, क्योंकि एएनएस फ्लोरेसेंस वृद्धि मुख्य रूप सेइलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन32,65,66,67और ई के कारण होती है यदि स्थिर टीआरपी की शमन होती है, उदाहरण के लिए, ऑक्सीजन68की उपस्थिति में ।

एनबीएस ने टीआरपी अवशेषों के रासायनिक संशोधन की मध्यस्थता की, जो टीआरपी और एएनएस के बीच FRET का अध्ययन करने के लिए एक तेजी से और आसान परख प्रतीत होता है जो प्रोटीन/एंजाइमों के लिए बाध्य है । अन्य टीआरपी-संशोधित अभिकर्मकों का उपयोग एनबीएस के बजाय किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, हाइड्रोक्सी-5-नाइट्रोबेन्जिल ब्रोमाइड (एचएनबी)69,70। अंत में, परख अन्य फ्लोरोफोरस21के साथ टीआरपी के प्रस्तावित FRET जोड़े का पता लगाने के लिए लागू हो सकता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम को आंशिक रूप से एफएआई-यूएएसएलपी ग्रांट नंबर C19-FAI-05-89.89 और CONACYT अनुदान संख्या 316463 (एपोयोस ए ला सिएंसिया डी फ्रंटेरा: फोर्टालेसिमेंटो वाई मैंटेनिमिएटो डी इन्फ्रास्ट्रक्चरस डी इन्वेस्टिगासिओन डी यूएसओ कोमुन वाई कैपेसिcióनटीसी लेखक वीडियो संस्करण में जूलियन ई. माता-मोरालेस की तकनीकी सहायता का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylamide Bio-Rad 1610107 SDS-PAGE
Ammonium persulfate Bio-Rad 1610700 SDS-PAGE
8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid Sigma-Aldrich A1028 Fluorophore
Bis-acrylamide Bio-Rad 1610125 SDS-PAGE
N-Bromosuccinimide Sigma-Aldrich B81255 Chemical modification
N,N-dimethylformamide J.T. Baker 9213-12 Stock solution preparation
Fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich F7250 Chemical fluorescence label
Fluorescence cuvette Hellma Z801291 Fluorescence assay
Fluorescence Spectrofluorometer Shimadzu RF 5301PC Fluorescence assay
HisTrap™ FF GE Healtcare 11-0004-59 Protein purification
IPTG, Dioxane free American Bionalytical AB00841-00010 Protein expression
Imidazole Sigma-Aldrich I5513-25G Protein purification
LB media Fisher Scientific 10000713 Cell culture
Pipetman L P10L Gilson FA10002M Fluorescence assay
Pipetman L P100L Gilson FA10004M Fluorescence assay
Pipetman L P200L Gilson FA10005M Fluorescence assay
Pipetman L P1000L Gilson FA10006M Fluorescence assay
Pipetman L P5000L Gilson FA10007 Fluorescence assay
Precision plus std Bio-Rad 1610374 SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphate Bio-Rad 1610302 SDS-PAGE
Sodium phosphate dibasic J.T. Baker 3828-19 Buffer preparation
Sodium phosphate monobasic J.T. Baker 3818-01 Buffer preparation
Syringe filter 0.2 um Millipore GVWP04700 Solution filtration
Temed Bio-Rad 1610801 SDS-PAGE
Tris Bio-Rad 1610719 SDS-PAGE

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बायोकेमिस्ट्री अंक 176
ट्रिप्टोफान-एएनएस FRET का अध्ययन करने के लिए एक रिकॉम्बिनेंट सीए<sup>2 +</sup>-ATPase N-डोमेन में ट्रिप्टोफान अवशेषों का रासायनिक संशोधन
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Sampedro, J. G., Cataño, Y.… More

Sampedro, J. G., Cataño, Y. Chemical Modification of the Tryptophan Residue in a Recombinant Ca2+-ATPase N-domain for Studying Tryptophan-ANS FRET. J. Vis. Exp. (176), e62770, doi:10.3791/62770 (2021).

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