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Biochemistry

重组卡2 +- 研究色氨酸 - ANS FRET 的色氨酸残留物的化学修饰 - ATPase N 域

Published: October 9, 2021 doi: 10.3791/62770
Automatic Translation
1, 1
1Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

Summary

ANS 与 Ca2+- ATPase 重组 N 域绑定。荧光光谱在激发时以 295 nm 的波长显示类似 FRET 的图案。NBS 调解的 Trp 化学修饰抑制了 N 域的荧光，这导致 Trp 残留物和 ANS 之间没有能量转移 （FRET）。

Abstract

沙科/内质 Ca2+-ATPase （SERCA） 是一种 P 型 ATPase，在各种构象中结晶。尽管如此，仍可从孤立的重组域获取详细的功能信息。工程 （Trp552Leu 和 Tyr587Trp） 重组核苷酸绑定域 （N 域） 显示配体绑定后荧光淬火。一种外在的氟磷，即8-阿尼利诺-1-纳布他烯硫酸盐（ANS），通过静电和疏水性与阿格、赫斯、阿拉、卢和菲残留物的相互作用，与核苷酸结合。当兴奋的波长（+）为370纳米时，荧光强度的增加就证明了ANS的结合。然而，当兴奋在 \295 nm 时，荧光强度的增加似乎与 N 域内在荧光的淬火相伴而生。荧光光谱显示一个类似Föster共振能量转移（FRET）的模式，从而暗示了Trp-ANS FRET对的存在，这似乎由Tyr587Trp和ANS之间的短距离（+20+）支撑。本研究描述了由 N-溴素酰胺 （NBS）调解的 Trp-ANS FRET 对的 Trp 化学修饰（和荧光淬火）分析。在化学改性 N 域中，ANS 荧光在 295 nm 的兴奋时增加，类似于在 370 nm 时兴奋时增加。因此，NBS 调解的 Trp 残留物的化学修饰可用于探索 Trp 和 ANS 之间缺乏 FRET。在没有TRP荧光的情况下，不应观察ANS荧光的增加。NBS 对蛋白质中的 Trp 残留物进行化学修饰可能有助于检查接近绑定 ANS 的 Trp 残留物之间的 FRET。这种检测在使用其他氟化物时可能也很有用。

Introduction

Füster共振能量转移（FRET）已成为确定分子结构之间的距离后，结合或相互作用的蛋白质结构和功能研究1，2，3，4的标准技术。在P型ATPases中，FRET被用来研究SARCO内质视网膜Ca 2+-ATPase（SERCA）2、5、6、7、8的结构波动，例如，FRET7对整个蛋白质的结构波动进行了分析。

FRET捐赠者是多种多样的，从小荧光（外在）分子到荧光蛋白9，10。色氨酸（Trp）残留物（由于其荧光）有助于识别蛋白质氨基酸序列11，12的结构变化。Trp的荧光强度在很大程度上取决于其周围环境的极性。利甘结合通常产生蛋白质/酶15，16的结构重新排列。如果Trp位于或位于蛋白质结合部位附近，结构波动通常会影响Trp暴露在13、14等水平：因此，极性的变化导致Trp荧光强度13，14的淬火。因此，Trp 的荧光特性对于对酶进行配体结合研究很有用。其他物理现象也可能导致Trp荧光淬火17，18，19，20，例如，FRET和中等极性的变化。能量从兴奋状态的Trp转移到氟也具有潜在的应用，例如，在蛋白质21中小配体的亲和力测定。事实上，Trp在FRET研究中主要用作22、23、24等蛋白质的荧光捐献者，例如，在terbium（Tb3+）FRET研究中，Trp残留物经常被用作能量转移到Tb 3+25、26、27的天线。Trp由于其在蛋白质结构中固有的构成特性，与其他FRET捐赠者相比具有各种优势，从而消除了可能影响所研究蛋白质24的功能/结构的预制过程的需要。因此，在蛋白质结构研究13、14、19、28中，对辐射衰变（由蛋白质结构重组引起的能量转移和中等极性变化）的识别对于得出关于配体结合的准确结论非常重要。

在蛋白质结构研究中，一种外在的氟磷，即8-阿尼利诺-1-纳布他烯硫酸盐（ANS），主要用于与蛋白质折叠/展开有关的实验。ANS与原生状态的蛋白质/酶结合，通常在基板31、32、33的结合部位：ANS荧光量子产量（+F）的增加（即荧光强度的增加）是由刺激蛋白质在\370纳米时，ANS与Arg的适当相互作用和他的残留物在疏水口袋发生34，35，36，37。在各种研究中， 已报告TRP残留物（捐赠者）和ANS（接受者）之间的FRAT（当在280-295纳米内激动人心时）的发生，其依据如下：1） Trp 的荧光发射光谱和 ANS 的激发光谱重叠，2） 确定一个或多个 Trp 残留物与 ANS 之间的适当距离用于能量转移， 3） 高ANS量子产量时，结合在蛋白质口袋，和4）特征FRET模式在蛋白质的荧光光谱中存在ANS 3，17，27，37，38。

最近，使用工程重组N域40、41、42、43、44、45、46等对SERCA和其他P型ATPass的核苷酸结合域（N域）进行了配体结合。SERCA N域的分子工程已用于将唯一的Trp残留物（Trp552Leu）移动到一个更动态的结构（Tyr587Trp），该结构靠近核苷酸结合部位，其中荧光变异（淬火）可用于监测配体结合34时的结构变化。实验结果表明，ANS与纯重组剂SERCA N-domain34中的核苷酸结合部位（作为ATP）结合。有趣的是，ANS 荧光在激发时以 295 nm 的激发度与 N 域结合时增加，而 N 域的内在荧光减少34，从而产生一个 FRET 模式，表明 Trp-ANS FRET 对的形成。

已建议使用 NBS 通过对改性蛋白质的吸收分析来确定蛋白质 47中的 Trp 残留物含量。NBS将Trp高度吸收的内陆组修改为吸收性较小的奥辛多莱47，48。这导致Trp荧光财产损失（淬火）40。因此，NBS 调解的Trp残留物的化学修饰可以用作在FRET假设时定义Trp（作为供体）的作用的测定。

本协议将国家统计局在 SERCA 工程重组 N 域中唯一 Trp 残留物的化学修改描述为蛋白质模型。实验结果表明，在化学NBS改性N-domain34中，ANS荧光强度仍在增加，缺乏内在荧光。因此，当与 N 域34、40、49绑定时，该检测有助于证明 Trp 残留物和 ANS 之间没有 FRET。因此，这种检测（Trp的NBS化学修饰）有助于证明Trp-ANS FRET对在蛋白质中的存在。

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Protocol

1. 确定（在西里科）的ANS和SERCAN域互动

  1. 使用首选的蛋白质建模软件50进行分子建模，生成蛋白质（SERCA N-Domain）的三维（3D）结构。
  2. 使用首选分子结构软件51识别形成核苷酸结合位点的氨基酸残留物，确定Arg和Lys残留物的存在：这些是ANS结合和增加荧光强度（量子产量）所必需的。
  3. 执行分子对接（使用首选对接软件）52，53，54，以确定ATP，荧光素异氰酸酯（FITC）（与Lys515标记核苷酸结合站点）和ANS与氨基酸残留物在核苷酸结合场（图1）的相互作用。
  4. 使用首选软件中的测量工具计算 Trp 残留物和绑定 ANS 之间的分子距离 （+） 。
  5. 对ANS-N域复合物进行分子动力学模拟，以确定相互作用的稳定性52，54。然后，在确认复合物的稳定性时进行体外实验。

2. 重组N域的表达和纯化

  1. 合成N域40的基因编码。
  2. 设计和构建含有N域40编码的合成基因的质粒。
  3. 通过亲和色谱 （Ni-NTA） 快速和净化，这是工程重组的 N 域。执行纯化蛋白的SDS-PAGE，以确定纯度（图2）40。
  4. 通过研究 N 域灭绝系数 （ε= 11，960 M-1+cm-1）40的 280 nm 的吸收量确定蛋白质浓度。

3. 根据 ANS 和 N 域荧光强度变化监测 ANS-N 域复合体的形成。

  1. 在N，N二甲基甲酰胺中准备 ANS 库存解决方案。
    1. 称量小（1-5毫克）的ANS，并溶解在N，N-二甲基甲酰胺的最后体积的1mL，例如，3.2毫克（10.69 mM最终浓度）。
    2. 使用N、二甲基甲酰胺 N 的 ANS 溶液准备 100 μM ANS As 库存解决方案，例如，将 10.69 mM ANS 溶液的 9.4 μL 添加到 990.6 μL 的 50 mM 磷酸盐缓冲器，pH 8.0 获得 1 mL 的最终体积。
    3. 通过漩涡 3 - 5 次 15s 混合解决方案。
      注：在以下实验中，仅使用 ANS Aqueous 股票解决方案。在开始实验之前，应重新准备 ANS 水性库存解决方案。
  2. 准备 N， N二甲基甲酰胺的NBS股票解决方案。
    1. 称量小（1-5毫克）的NBS，并溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺，例如，5.3毫克在1 mL（29.78 mM最终浓度）。
    2. 使用 N（N-二甲基甲酰胺）中的 NBS 溶液准备 1 mMNBS排量库存解决方案，例如，将 29.78 mM NBS 溶液的 3.36 μL 添加到 96.64 μL 的 50 mm 磷酸盐缓冲器，pH 8.0 获得最终体积 0.1 mL。
    3. 通过漩涡 3 - 5 次 15s 混合解决方案。
      注：在开始实验之前，请重新准备 NBS 水性股票解决方案。
  3. 用 ANS 对 N 域进行定点，并在 25 °C 下以 +295 nm 的激发度记录荧光光谱。
    1. 获取荧光谱基线。
      1. 将 1 mL 的 50 mM 磷酸盐缓冲器与 pH 8.0 放在 1 mL 荧光石英中。
      2. 将电池放置在光谱仪的热介质细胞室 （25 °C）中，并将激发 =设置为 295 nm。
      3. 记录荧光谱 （305 - 550 nm）。
        注：pH 8.0的50mM磷酸盐缓冲器的荧光谱作为空白样品，从所有获得的荧光光谱中减去。
    2. 获取 N 域的内在荧光谱。
      1. 将 900 μL 的 50 mM 磷酸盐缓冲器与 pH 8.0 放在荧光石英库维特中。
      2. 添加 100 μL 的 N 域 （10 μM） 悬架，以在 1 mL 最终卷中获得 1 μM N 域最终浓度。
      3. 使用微管轻轻地同质化 20 次，以确保溶液的均匀性。
        注：蛋白质应新鲜纯化，以获得高品质的内在荧光光谱，例如，纯化重组N-Domain在纯化后只能使用一周。
      4. 将电池放置在光谱仪的热介质细胞室 （25 °C）中，并将激发 =设置为 295 nm。
      5. 记录 N 域内在荧光谱 （305-550 nm）。
    3. 添加 ANS，以 +295 nm 的激发获得荧光谱。
      1. 在悬浮的 N 域 （1 μM） 中添加 2 μL 100 μM ANS Aques 股票解决方案，以获得 0.2 μM ANS 最终浓度。
      2. 使用微管轻轻地同质化 20 次，以确保溶液的均匀性。
      3. 将电池放置在光谱流光计的热稳定细胞室 （25 °C）中，并将激发 =设置为 295 nm。
      4. 记录荧光谱（305-550 nm）。
      5. 重复 ANS 添加和荧光光谱记录高于 1：1 摩尔关系 ANS：N 域。
      6. 使用合适的软件从每个频谱中减去空白频谱。
      7. 在单个图形中绘制所有光谱。
      8. 确定光谱是否形成类似 FRET 的模式。ANS-N域荧光光谱形成类似FRET的图案（图3A）。

4. N 域内荧光点子由 Trp 化学修饰与 Nbs 。

  1. 重复步骤 3.3.1 和 3.3.2。
  2. 在悬浮的 N 域 （1 μM） 中添加 1 μL 1 mM NBS 的排泄性库存解决方案，以获得 1 μM NBS 的最终浓度。
  3. 使用微管 20 次，确保溶液的均质，从而轻轻地实现均质。
  4. 将电池放置在光谱流光计的热稳定细胞室 （25 °C）中，并将激发 =设置为 295 nm。
  5. 记录荧光谱（305-550纳米）（图3B）。
  6. 重复 NBS 添加和荧光光谱记录，直到观察到最小的 N 域内荧光淬火40。在 N 域中，这通常发生在 5-6 NBS/N 域40的摩尔比。
    注：国家统计局快速淬火（<5s）N域的内在荧光：荧光强度下降。立即进入下一步，因为国家统计局也可能与其他氨基酸残留物47反应。
  7. 使用合适的软件从每个频谱中减去空白频谱。
  8. 在单个图形（图 3B）中绘制所有光谱。

5. 通过在 25 °C 下记录荧光光谱，用 ANS 对 NBS 修改的 N 域进行点缀。

  1. 使用第 4 步生成的 NBS 修改的 N 域执行步骤 3.3.3。
  2. 使用合适的软件从每个频谱中减去空白频谱。
  3. 在单个图形（图 3C）中绘制所有光谱。
  4. 生成的荧光光谱 （图 3C）支持或反驳 FRET 的发生，即当 FRET 发生时，ANS 荧光不会增加，反之亦然。

6. ANS 以 +370 nm 的激发与化学改性 N 域结合的证据。

  1. 使用 NBS 修改后的 N 域执行步骤 3.3.3，该域在第 4 步生成，但将激励 = 更改为 370 nm。
  2. 使用合适的软件从每个频谱中减去空白频谱。
  3. 在单个图形（图 3D）中绘制所有光谱。
  4. 通过观察 ANS 荧光强度的增加，确认 ANS 与 N 域结合。与 N 域结合的 ANS 显示在 +370 nm （图 3D）时兴奋时荧光增加。作为对照，ANS（单独）在50mM磷酸盐缓冲器中（pH 8.0）的荧光光谱在295和370纳米（图4，不显示在视频中）获得令人兴奋。
    注：NBS：化学改性所需的口腔测量关系取决于所研究的蛋白质46、47、55、56中Trp残留物的埋藏程度。因此，建议事先确定国家统计局：蛋白质/（Trp）摩尔比。

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Representative Results

分子对接显示ANS通过静电和疏水相互作用与N域核苷酸结合部位的结合（图1）。Trp 残留物和 ANS（与核苷酸结合部位）之间的分子距离 （20+） 支持 FRET 的发生（图1）。设计（工程）重组N域通过亲和色谱仪（图2）获得高纯度，适合荧光实验。ANS-N 域复合物的荧光光谱在激发时显示类似 FRET 的图案，频率为 ±295 nm（图 3A）。国家统计局对Trp残留物的化学改造导致N域内在荧光的淬火（图3B）。在化学NBS改性N域中，实验结果表明，ANS荧光在=295 nm（图3C）的激发下增加，类似于在非修改N域（图3A）中观察到的荧光。因此，ANS 在 ±295 nm 的直接激发为 ANS 荧光 （图 3C）提供了最大的能量，如前所述28。与化学改性 N 域结合的 ANS 在 +370 nm （图 3D）时荧光增加就证明了这一点。因此，FRET 不会发生在与核苷酸结合站点相连的 Trp 残留物和 ANS 之间。

Figure 1
图1：ANS与Ca2+-ATPaseN域核苷酸结合位点的分子对接。 ANS分子对接是使用Autautdock Vina软件（http://vina.scripps.edu/）和N域40生成的3D模型进行的。工程 N 域包含突变 Trp552Leu 和 Tyr587Trp（以蓝色显示）。形成核苷酸结合位点的氨基酸残留物被表示为球和棒，并突出显示为橙色。这个数字已经修改了从斯普林格自然的许可：斯普林格，荧光杂志。 版权所有 （2020）34. 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2： 工程重组卡2+-ATPase N域的SDS+PAGE。N 域使用色谱柱进行亲和纯化。与吸收相对应的分数（在 ±280 nm）峰值下，受 SDS+PAGE 的约束，并由库马西蓝色染色可视化。+30 kDa 他标记的 N 域由 N 域 Ca 2+ -ATPase 的27kDa 和多他的标签的 3 kDa 组成。Ca2+-ATPase N-域的纯度通过使用 ImageJ 软件（https://imagej.nih.gov/ij/download.html）进行密度测量确定为 ≥95%。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3：NBS介质的Trp残留物在N域中的化学修改反驳了Trp和ANS之间的FRET，这与核苷酸结合部位有关。 A. ANS-N 域复合物的 FRET 模式在 =295 nm 激发时。向暂停的 N 域 （1 μM） 添加了 ANS（最终浓度为 μM：Spectra a， 0; b， 0.2; c， 0.4; d， 0.6; e， 0.8; f， 1.0; g， 1.2; h， 1.4） 。 B. NBS（NBS 浓度在 μM 中：a、0;b、1;c、2;d、3;e、4 和 f，6）对 NBS 的 N 域进行荧光淬火，以调解 Trp 残留物的化学修饰。N 域内在荧光在 =295 nm 的激发下观察到。 C. 在 =295 nm 的激发下，与化学改性 N 域结合的 ANS 荧光光谱。实验条件与 A一样。图A、B和C经斯普林格自然：斯普林格，荧光杂志许可修改。版权所有 （2020）34. D. 在 =370 nm 的激发下，与化学改性 N 域结合的 ANS 荧光光谱。N 域被暂停在 1 毫升 50 mM 磷酸盐缓冲 （pH 8.0） 和 NBS 的碱性报价中，并相应地添加 ANS，如 A （ANS） 和 B （NBS） 中所述。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4： ANS荧光光谱。 ANS （1.4 μM） 在 50 mM 磷酸盐缓冲与 pH 8.0 兴奋在 + 295 和 370 nm;光谱分别以黑色和蓝色呈现。 请单击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

ANS-N 域复合物的荧光光谱在 295 nm 的兴奋时显示类似 FRET 的模式，而 Trp 残留物和 ANS 之间的分子距离 （20 +） 似乎支持 FRET 的发生（图1）。NBS 的 Trp 化学修饰导致荧光 N 域变小（图 3B，频谱 f）：因此，能量转移是不可能的。ANS 荧光光谱与未修改的 N 域相似，当兴奋在 295 nm （图 3A 和 C）时。

因此，在 295 nm 的 295 nm 下直接激发 ANS 是 ANS 荧光的主要来源，当它与 ATP 绑定站点 （图 3C）绑定时，该站点与其他作者28建议的机制一致。因此，从 Trp 残留到绑定 ANS 的 FRET 不会在 N 域-ANS 复合体中发生。尽管如此，NBS在其他蛋白质中对Trp残留物进行化学修饰，支持Trp和ANS之间的FRET，例如，在神经孢子cras49酶中，F1-ATPase从酵母线粒体58和热解压素59中α子。

检测在含有他和阿格残留物的疏水口袋（结合部位）的蛋白质/酶中表现良好，因为这些有助于稳定ANS相互作用。此外，这种蛋白质最好含有位于蛋白质表面的唯一Trp残留物，即可与NBS40、41、49快速反应。

或者，为了分析蛋白质中的TRP-ANS FRET对，通过乙酰化和精洁化来化学改造他的残留物，可以用来阻碍蛋白质/酶结合部位60中的ANS相互作用。通过突变删除Trp残留物是分析FRET的另一种策略。然而，这可能是耗时的，结构可能会表现出结构差异，从而影响配体绑定61。同样，Arg和他的残留物在配体结合部位的突变可能会产生不可预见的结构变化，从而使变异的蛋白质不适合实验62。

关于Trp残留物，NBS-化学修饰检测的性能在以下情况下将受到限制：1） 如果Trp残留物深埋在折叠良好且紧凑的蛋白质的核心：因为如果Trp残渣位于膜嵌入结构（转置）中，则由于没有大腔41、48、63、2）而无法进入Trp残渣 如果蛋白质结构中含有多个Trp残留物，则mbrane α-helix），因为国家统计局的水性特征将阻止它进入疏水介质32、56、64、3）：由于无障碍环境和物理化学环境的变化可能很大， 因此，如果ANS与蛋白质结合主要是由于疏水相互作用，荧光信号的分配将很难更改为Trp残留物32、41、56、4），因为ANS荧光增加主要是由于静电相互作用32、65、66、67和e）如果是静态的 Trp的淬火发生，例如，在氧气68的存在。

NBS调解的Trp残留物的化学修饰似乎是研究Trp和ANS之间的FRET的快速和容易的检测，这与蛋白质/酶有关。其他Trp修改试剂可以代替国家统计局，例如羟基-5-硝基溴化物（HNB）69，70。最后，检测可能适用于检测建议的FRET对Trp与其他荧光21。

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Disclosures

作者宣称他们没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

这项工作部分由FAI-UASLP赠款编号C19-FAI-05-89.89和CONACYT赠款编号316463（阿波约斯前 拉：福塔莱西门托和曼特尼门托基础设施研究公司，乌索科门和卡帕西塔奇-恩特克尼卡2021年）。作者感谢朱利安·马塔-莫拉莱斯在视频版中的技术帮助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylamide Bio-Rad 1610107 SDS-PAGE
Ammonium persulfate Bio-Rad 1610700 SDS-PAGE
8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid Sigma-Aldrich A1028 Fluorophore
Bis-acrylamide Bio-Rad 1610125 SDS-PAGE
N-Bromosuccinimide Sigma-Aldrich B81255 Chemical modification
N,N-dimethylformamide J.T. Baker 9213-12 Stock solution preparation
Fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich F7250 Chemical fluorescence label
Fluorescence cuvette Hellma Z801291 Fluorescence assay
Fluorescence Spectrofluorometer Shimadzu RF 5301PC Fluorescence assay
HisTrap™ FF GE Healtcare 11-0004-59 Protein purification
IPTG, Dioxane free American Bionalytical AB00841-00010 Protein expression
Imidazole Sigma-Aldrich I5513-25G Protein purification
LB media Fisher Scientific 10000713 Cell culture
Pipetman L P10L Gilson FA10002M Fluorescence assay
Pipetman L P100L Gilson FA10004M Fluorescence assay
Pipetman L P200L Gilson FA10005M Fluorescence assay
Pipetman L P1000L Gilson FA10006M Fluorescence assay
Pipetman L P5000L Gilson FA10007 Fluorescence assay
Precision plus std Bio-Rad 1610374 SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphate Bio-Rad 1610302 SDS-PAGE
Sodium phosphate dibasic J.T. Baker 3828-19 Buffer preparation
Sodium phosphate monobasic J.T. Baker 3818-01 Buffer preparation
Syringe filter 0.2 um Millipore GVWP04700 Solution filtration
Temed Bio-Rad 1610801 SDS-PAGE
Tris Bio-Rad 1610719 SDS-PAGE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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生物化学，第176期，
重组卡<sup>2 +</sup>- 研究色氨酸 - ANS FRET 的色氨酸残留物的化学修饰 - ATPase N 域
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Sampedro, J. G., Cataño, Y.… More

Sampedro, J. G., Cataño, Y. Chemical Modification of the Tryptophan Residue in a Recombinant Ca2+-ATPase N-domain for Studying Tryptophan-ANS FRET. J. Vis. Exp. (176), e62770, doi:10.3791/62770 (2021).

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