Summary
ANS связывается с Ca2+-ATPase рекомбинантным N-доменом. Флуоресцентные спектры отображают FRET-подобную картину при возбуждении на длине волны 295 нм. NBS-опосредовавшая химическая модификация Trp гасят флуоресценцию N-домена, что приводит к отсутствию переноса энергии (FRET) между остатком Trp и ANS.
Abstract
Сарко/эндоплазматический щетикулум Ca2+-ATPase (SERCA) представляет собой АТФазу P-типа, которая кристаллизовалась в различных конформациях. Тем не менее, подробная функциональная информация может быть получена из изолированных рекомбинантных доменов. Спроектированный (Trp552Leu и Tyr587Trp) рекомбинантный нуклеотид-связывающий домен (N-домен) отображает флуоресцентное гашение при связывании лиганда. Внешний флуорофор, а именно 8-анилино-1-нафталинсульфонат (ANS), связывается с нуклеотид-связывающим сайтом посредством электростатических и гидрофобных взаимодействий с остатками Arg, His, Ala, Leu и Phe. Связывание ВНС свидетельствует увеличение интенсивности флуоресценции при возбуждении на длине волны (λ) 370 нм. Однако при возбуждении при λ 295 нм увеличение интенсивности флуоресценции, по-видимому, связано с гашением внутренней флуоресценции N-домена. Флуоресцентные спектры отображают резонансную картину переноса энергии Фёстера (FRET), тем самым предполагая наличие пары Trp-ANS FRET, которая, по-видимому, поддерживается коротким расстоянием (~ 20 Å) между Tyr587Trp и ANS. В этом исследовании описывается анализ пары Trp-ANS FRET методом химической модификации Trp (и флуоресцентного гашения), которая опосредована N-бромосукцинимидом (NBS). В химически модифицированном N-домене флуоресценция ANS увеличивалась при возбуждении при λ 295 нм, аналогично при возбуждении при λ 370 нм. Следовательно, опосредованные NBS химические модификации остатка Trp могут быть использованы для исследования отсутствия FRET между Trp и ANS. При отсутствии флуоресценции Trp не следует наблюдать увеличение флуоресценции ВСС. Химическая модификация остатков Trp в белках NBS может быть полезна для изучения FRET между остатками Trp, которые близки к связанным ANS. Этот анализ, вероятно, также будет полезен при использовании других флуорофоров.
Introduction
Резонансный перенос энергии Фёстера (FRET) стал стандартным методом определения расстояния между молекулярными структурами после связывания или взаимодействия в белковой структуре и функциональных исследованиях1,2,3,4. В АТФазах Р-типа FRET был использован для исследования структуры и функции сарко-эндоплазматического стикулума Ca2+-АТФазы (SERCA)2,5,6,7,8,например, структурные флуктуации во время каталитического цикла были проанализированы во всем белке с помощью FRET7.
Доноры FRET разнообразны и варьируются от небольших флуоресцентных (внешних) молекул до флуоресцентных белков9,10. Остатки триптофана (Trp) (из-за их флуоресценции) полезны для выявления структурных изменений в белковых аминокислотных последовательностях11,12. Интенсивность флуоресценции Trp существенно зависит от полярности окружающей его среды13,14. Связывание лигандов обычно порождает структурные перестройки в белках/ферментах15,16. Если Trp присутствует в месте связывания белка или расположен близко к нему, структурные колебания часто влияют на степень воздействия Trp на водные среды13,14; таким образом, изменение полярности приводит к гашению интенсивности флуоресценции Trp13,14. Следовательно, флуоресцентное свойство Trp полезно для проведения исследований связывания лигандов для ферментов. Другие физические явления могут также привести к закалке флуоресценции Trp17,18,19,20,например, FRET и изменениям средней полярности. Передача энергии из возбужденного состояния Trp во флуорофор также имеет потенциальное применение, например, определение аффинности малых лигандов в белках21. Действительно, Trp в основном использовался в качестве флуоресцентного донора в исследованиях FRET в белках22,23,24,например, в исследованиях TERBium (Tb3+)FRET, остаток Trp часто используется в качестве антенны для передачи энергии tb3 +25,26,27. Trp демонстрирует различные преимущества перед другими донорами FRET благодаря присущему ему конститутивному характеру в структуре белка, что исключает необходимость в препаративных процессах, которые могут влиять на функцию/структуру исследуемого белка24. Таким образом, идентификация радиационных распадов (перенос энергии и изменения полярности среды, которые индуцируются структурными перестройками белка) важна для получения точных выводов относительно связывания лигандов в структурных исследованиях белка13,14,19,28.
В исследованиях структуры белка внешний флуорофор, а именно 8-анилино-1-нафталинсульфонат (НС), в основном использовался в экспериментах, связанных со сворачиванием/развертыванием белка28,29. ВСС связывается с белками/ферментами в нативном состоянии, обычно в местах связывания субстратов31,32,33; увеличение квантового выхода флуоресценции ВНС (ΦF) (а именно увеличение интенсивности флуоресценции) индуцируется возбуждением белка при λ=370 нм, когда подходящие взаимодействия НС с Arg и его остатками в гидрофобных карманах происходят34,35,36,37. В различных исследованиях сообщалось о возникновении FRET (при возбуждении при λ в пределах 280-295 нм) между остатками Trp (донорами) и ANS (акцептором), что основано на следующем: 1) перекрытии спектра флуоресцентного излучения Trp и спектра возбуждения ANS, 2) идентификации подходящего расстояния между одним или несколькими остатками Trp и ANS для передачи энергии, 3) высокий квантовый выход ВСС при связывании в белковых карманах и 4) характерный паттерн FRET в спектрах флуоресценции белка в присутствииANS 3,17,27,37,38.
В последнее время связывание лигандов с нуклеотидсвязывающим доменом (N-доменом) в SERCA и других АТФазах P-типа было исследовано с использованием инженерных рекомбинантных N-доменов40,41,42,43,44,45,46. Молекулярная инженерия N-домена SERCA была использована для перемещения единственного остатка Trp (Trp552Leu) в более динамичную структуру (Tyr587Trp), которая близка к нуклеотид-связывающему сайту, где вариации флуоресценции (гашение) могут быть использованы для мониторинга структурных изменений при связывании лиганда34. Экспериментальные результаты показали, что ВНС связывается (как АТФ) с нуклеотид-связывающим сайтом в очищенном рекомбинантном N-домене SERCAN 34. Интересно, что флуоресценция ANS увеличивается при связывании с N-доменом при возбуждении при λ 295 нм, в то время как внутренняя флуоресценция N-домена уменьшаетсяна 34,тем самым создавая паттерн FRET, который предполагает образование пары Trp-ANS FRET.
Предложено использовать НБС для определения содержания остатков Trp в белках47 путем анализа абсорбции модифицированных белков. NBS модифицирует высокоабсорбировку индоловой группы Trp на менее абсорбирующий оксиндол47,48. Это приводит к потере (закалке) флуоресцентного свойства Trp40. Следовательно, Опосредованная NBS химическая модификация остатков Trp может быть использована в качестве анализа для определения роли Trp (как донора), когда freT выдвигается гипотеза.
Этот протокол описывает химическую модификацию единственного остатка Trp NBS в спроектированном рекомбинантном N-домене SERCA в качестве белковой модели. Экспериментальные результаты показывают, что интенсивность флуоресценции ANS все еще увеличивается в химически модифицированном NBS N-домене34,которому не хватает внутренней флуоресценции. Поэтому анализ полезен для демонстрации отсутствия FRET между остатком Trp и ANS при связывания с N-доменом34,40,49. Следовательно, этот анализ (NBS химическая модификация Trp) полезен для доказательства присутствия пары Trp-ANS FRET в белках.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Определение(in silico)взаимодействия ANS и SERCA N-домена
- Генерация трехмерной (3D) структуры белка (SERCA N-домен) путем молекулярного моделирования с использованием предпочтительного программного обеспечения для моделирования белка50.
- Идентифицировать аминокислотные остатки, образующие нуклеотид-связывающий сайт, используя предпочтительное программное обеспечение51молекулярной структуры, и определить наличие остатков Arg и Lys35; они необходимы для связывания ВНС и для увеличения интенсивности флуоресценции (квантового выхода).
- Выполняют молекулярную стыковку (с использованием предпочтительного программного обеспечения стыковки)52,53,54 для определения взаимодействий АТФ, фторэсцеина изотиоцианата (FITC) (который образует ковалентную связь с Lys515, маркируя нуклеотид-связывающий сайт) и ANS с аминокислотными остатками в нуклеотид-связывающем сайте(фиг.1).
- Рассчитайте молекулярное расстояние (Å) между остатком Trp и связанным ANS с помощью инструмента измерения в предпочтительном программном обеспечении.
- Выполнить молекулярно-динамическое моделирование комплекса ANS-N-домена для определения устойчивости взаимодействия52,54. Затем выполните эксперименты in vitro, когда стабильность комплекса будет подтверждена.
2. Экспрессия и очистка рекомбинантного N-домена
- Синтезируют ген, кодирующий N-домен40.
- Спроектируйте и постройте плазмиду, содержащую синтетический ген, кодируемый N-доменом40.
- Экспресс и очистка с помощью аффинной хроматографии (Ni-NTA), инженерного рекомбинантного N-домена. Выполните SDS-PAGE очищенного белка для определения чистоты(Рисунок 2)40.
- Определить концентрацию белка можно путем изучения абсорбации при λ 280 нм с коэффициентом вымирания N-домена (ε= 11,960М-1·см-1)40.
3. Мониторинг формирования ANS-N-доменного комплекса на основе изменений интенсивности флуоресценции ANS и N-домена.
- Готовят СТОКОВЫЙ раствор ВНС в N,N-диметилформамиде.
- Взвесили небольшое количество (1-5 мг) ВНС и растворили его в 1 мл конечного объема N,N-диметилформамида, например, 3,2 мг (конечная концентрация 10,69 мМ).
- Готовят водный раствор 100 мкМ ANS с использованием раствора ANS в N,N-диметилформамиде, например, добавляют 9,4 мкл раствора ANS 10,69 мМ к 990,6 мкл 50 мМ фосфатного буфера с рН 8,0 для получения конечного объема 1 мл.
- Перемешайте растворы путем вихря 3 - 5 раз в течение 15 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: В следующем эксперименте используйте только водный раствор ANS. Перед началом экспериментов приготовьте водный раствор ВС.
- Готовят раствор NBS в N,N-диметилформамиде.
- Взвесили небольшое количество (1-5 мг) НБС и растворили его в 1 мл N,N-диметилформамида, например, 5,3 мг в 1 мл (конечная концентрация 29,78 мМ).
- Готовят водный раствор NBS 1 мМ, используя раствор NBS в N,N-диметилформамиде, например, добавляют 3,36 мкл раствора NBS 29,78 мМ к 96,64 мкл 50 мМ фосфатного буфера с рН 8,0 для получения конечного объема 0,1 мл.
- Перемешайте растворы путем вихря 3 - 5 раз в течение 15 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом экспериментов своевременно приготовьте водный раствор NBS.
- Титруйте N-домен с ANS и запишите спектры флуоресценции возбуждением при λ=295 нм при 25 °C.
- Получение базового уровня флуоресцентного спектра.
- Поместите 1 мл 50 мМ фосфатного буфера с рН 8,0 в флуоресцентную кварцевую кювету 1 мл.
- Поместите ячейку в термостатированную ячейку ячейки (25 °C) спектрофлуорометра и установите возбуждение λ на 295 нм.
- Запись спектра флуоресценции (305 - 550 нм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Спектр флуоресценции 50 мМ фосфатного буфера с рН 8,0, который служит пустым образцом, вычитается из всех полученных спектров флуоресценции.
- Получение собственного спектра флуоресценции N-домена.
- Поместите 900 мкл 50 мМ фосфатного буфера с рН 8,0 в флуоресцентную кварцевую кювету.
- Добавьте 100 мкл N-доменной (10 мкМ) суспензии для получения конечной концентрации 1 мкМ N-домена в конечном объеме 1 мл.
- Аккуратно гомогенизируйте с помощью микропипетки 20 раз, чтобы обеспечить однородность раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Белок должен быть свежеочищен для получения высококачественных собственных флуоресцентных спектров, например, очищенный рекомбинантный N-домен может быть использован только в течение недели после очистки. - Поместите ячейку в термостатированную ячейку ячейки (25 °C) спектрофлуорометра и установите возбуждение λ на 295 нм.
- Запишите спектр внутренней флуоресценции N-домена (305-550 нм).
- Сложите ВС и получите спектр флуоресценции путем возбуждения при λ=295 нм.
- Добавьте 2 мкл аликвоты водного раствора ANS 100 мкМ в взвешенный N-домен (1 мкМ) для получения конечной концентрации 0,2 мкМ ANS.
- Аккуратно гомогенизируйте с помощью микропипетки 20 раз, чтобы обеспечить однородность раствора.
- Поместите ячейку в термостабильной камере ячейки (25 °C) спектрофлуорометра и установите возбуждение λ на 295 нм.
- Запись спектра флуоресценции (305-550 нм).
- Повторите сложения ANS и запись спектров флуоресценции выше молярного соотношения 1:1 ANS:N-домен.
- Вычтите пустой спектр из каждого спектра с помощью подходящего программного обеспечения.
- Построй все спектры в одном графике.
- Определите, образуют ли спектры FRET-подобный паттерн. Спектры флуоресценции ANS-N-домена образуют FRET-подобный паттерн(рисунок 3A).
- Получение базового уровня флуоресцентного спектра.
4. N-доменное титрование внутренней флуоресценции методом химической модификации Trp с NBS.
- Повторите шаги 3.3.1 и 3.3.2.
- Добавьте 1 мкл аликвоты 1 мМ водного раствора NBS к взвешенному N-домену (1 мкМ) для получения конечной концентрации 1 мкМ NBS.
- Мягко гомогенизируйте с помощью микропипетки 20 раз, чтобы обеспечить однородность раствора.
- Поместите ячейку в термостабильной камере ячейки (25 °C) спектрофлуорометра и установите возбуждение λ на 295 нм.
- Запись спектра флуоресценции (305-550 нм)(рисунок 3В).
- Повторяйте запись спектров сложения и флуоресценции NBS до тех пор, пока не будет наблюдаться минимальное закалка внутренней флуоресценции N-домена40. В N-домене это обычно происходит при молярном соотношении 5-6 NBS/N-домен40.
ПРИМЕЧАНИЕ: NBS быстро гасят (<5 с) внутреннюю флуоресценцию N-домена; наблюдается снижение интенсивности флуоресценции. Немедленно переходите к следующему этапу, так как НБС может также вступать в реакцию с другими аминокислотными остатками47. - Вычтите пустой спектр из каждого спектра с помощью подходящего программного обеспечения.
- Построй все спектры в одном графике(рисунок 3B).
5. Титруем N-модифицированный N-домен NBS с ANS путем регистрации флуоресцентных спектров при 25 °C.
- Выполните шаг 3.3.3, используя измененный N-домен NBS, созданный на шаге 4.
- Вычтите пустой спектр из каждого спектра с помощью подходящего программного обеспечения.
- Построй все спектры в одном графике(рисунок 3C).
- Генерируемые флуоресцентныеспектры (рисунок 3С)поддерживают или опровергают возникновение FRET, т.е. при возникновении FRET флуоресценция ANS не увеличивается и наоборот.
6. Доказательства связывания ВНС с химически модифицированным N-доменом возбуждением при λ=370 нм.
- Выполните шаг 3.3.3, используя модифицированный N-домен NBS, который был сгенерирован на шаге 4, но изменив возбуждение λ на 370 нм.
- Вычтите пустой спектр из каждого спектра с помощью подходящего программного обеспечения.
- Построй все спектры в одном графике(рисунок 3D).
- Подтвердите связывание ВНС с N-доменом, наблюдая за увеличением интенсивности флуоресценции ВНС. Связывание ANS с N-доменом показывает увеличение флуоресценции при возбуждении при λ=370 нм(рисунок 3D). В качестве контроля флуоресцентный спектр ВНС (один) в 50 мМ фосфатном буфере с рН 8,0 был получен возбуждающим при λ 295 и 370 нм(рисунок 4,не показанный на видео).
ПРИМЕЧАНИЕ: Стехиометрическая зависимость NBS:Trp, необходимая для химической модификации, зависит от степени закапывания остатка (остатков) Trp в исследуемом белке46,47,55,56. Поэтому рекомендуется заранее определить молярное соотношение NBS:белок/(Trp).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Молекулярная стыковка показывает связывание ВНС с нуклеотид-связывающим сайтом N-домена посредством электростатических, а также гидрофобных взаимодействий(рисунок 1). Молекулярное расстояние (20 Å) между остатком Trp и ANS (связанным с нуклеотид-связывающим сайтом) поддерживает возникновение FRET(фиг.1). Спроектированный (спроектированный) рекомбинантный N-домен был получен при высокой чистоте с помощью аффинной хроматографии(рис. 2)и пригоден для флуоресцентных экспериментов. Флуоресцентные спектры комплекса ANS-N-домена отображали FRET-подобную картину при возбуждении при λ=295 нм(рисунок 3A). Химическая модификация остатка Trp NBS привела к гашению внутренней флуоресценции N-домена(рисунок 3B). В химически модифицированном NBS N-домене экспериментальные результаты показывают, что флуоресценция ANS увеличивается при возбуждении при λ=295 нм(рисунок 3C),аналогичной той, которая наблюдается в немодифицированной N-домене(рисунок 3A). Поэтому прямое возбуждение ВНС при λ=295 нм обеспечивает наибольшую энергию для флуоресценции ВНС(рисунок 3С),как предлагалосьранее 28. Связывание НС с химически модифицированным N-доменом свидетельствует увеличение его флуоресценции при возбуждении при λ=370 нм(рисунок 3D). Таким образом, FRET не возникает между остатком Trp и ANS, который связан с сайтом связывания нуклеотидов.
Рисунок 1:Молекулярная стыковка ANS с нуклеотид-связывающим сайтом Ca2+-АТФазы N-домена. Молекулярная стыковка ANS выполнялась с использованием программного обеспечения AutoDock Vina (http://vina.scripps.edu/) и сгенерированной 3D-модели N-домена40. Спроектированный N-домен содержит мутации Trp552Leu и Tyr587Trp (показаны синим цветом). Аминокислотные остатки, образующие нуклеотидсвязывающий сайт, представлены в виде шариков и палочек и выделены оранжевым цветом. Эта цифра была изменена с разрешения Springer Nature: Springer, Journal ofFluorescence. Авторское право (2020)34. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:SDS−PAGE инженерного рекомбинантного Ca2+-ATPase N-домена. N-домен подвергали аффинной очистке с помощью хроматографической колонки. Фракции, которые соответствовали пикам поглощения (при λ=280 нм), подвергались воздействию SDS−PAGE и визуализировались синим окрашиванием Кумасси. ~30 кДа His-помеченный N-домен образован 27 кДа N-домена Ca2+-ATPase и 3 кДа поли-Его тега. Чистота N-домена Ca2+-ATPase была определена ≥95% с помощью денситометрии с помощью программного обеспечения ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/download.html). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:NBS-опосредоваемая химическая модификация остатка Trp в N-домене опровергает FRET между Trp и ANS, который связан с нуклеотид-связывающим сайтом. A. Паттерн FRET комплекса ANS-N-домена при возбуждении при λ=295 нм. К взвешенной N-домену (1 мкМ) добавляли НС (конечная концентрация в мкМ: спектры a, 0; b, 0,2; c, 0,4; d, 0,6; e, 0,8; f, 1,0; g, 1,2; и h, 1,4). В. Флуоресцентное гашение N-домена NBS (концентрация NBS в мкМ: a, 0; b, 1; c, 2; d, 3; e, 4; и f, 6). NBS опосредует химическую модификацию остатка Trp. N-доменная внутренняя флуоресценция наблюдалась при возбуждении при λ=295 нм. С. Флуоресцентные спектры ВНС, связанные с химически модифицированным N-доменом при возбуждении при λ=295 нм. Экспериментальные условия такие же, как в А. Рисунки A, B и C были изменены с разрешения Springer Nature: Springer, Journal of Fluorescence. Авторское право (2020)34. Д. Флуоресцентные спектры ВНС, связанные с химически модифицированным N-доменом при возбуждении при λ=370 нм. N-домен суспендировали в 1 мл 50 мМ фосфатного буфера (рН 8,0) и аликвот NBS, и ANS добавляли соответственно, как описано в A (ANS) и B (NBS). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Спектры флуоресценции ANS. ВНС (1,4 мкМ) в 50 мМ фосфатном буфере с рН 8,0 возбуждался при λ 295 и 370 нм; спектры представлены в черном и синем цветах соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Флуоресцентные спектры комплекса ANS-N-домена отображают FRET-подобную картину при возбуждении при λ 295 нм, в то время как молекулярное расстояние (20 Å) между остатком Trp и ANS, по-видимому, поддерживает возникновение FRET(рисунок 1). Химическая модификация Trp NBS приводит к менее флуоресцентной N-домену(рисунок 3B,спектр f); следовательно, передача энергии невозможна. Спектры флуоресценции ANS аналогичны спектрам немодифицированного N-домена при возбуждении при λ 295 нм(рис. 3A и C).
Поэтому прямое возбуждение ВНС при λ 295 нм является основным источником флуоресценции ВНС, когда она связана с сайтом связывания АТФ(рис. 3С),что согласуется с механизмом, предложенным другими авторами28. Таким образом, FRET от остатка Trp до связанного ANS не встречается в комплексе N-домен-ANS. Тем не менее, NBS-опосредоваемая химическая модификация остатков Trp в других белках поддерживает FRET между Trp и ANS, например, в ферментах ксилозредуктазе из Neurospora crassa49,α субъединицы F1-АТФазы из дрожжевых митохондрий58и термолизина59.
Анализ будет хорошо работать в белках / ферментах с гидрофобными карманами (сайтами связывания), которые содержат остатки His и Arg, поскольку они способствуют стабилизации взаимодействия ANS. Дополнительно такие белки в идеале должны содержать единственный остаток Trp, который расположен на поверхности белка, а именно доступен для быстрой реакции с NBS40,41,49.
Альтернативно, для анализа пары Trp-ANS FRET в белках химическая модификация его остатков путем ацетилирования и сукцинилирования может быть использована для затруднения взаимодействия ВСН в месте связывания белка/фермента60. Удаление остатка Trp путем мутации является еще одной стратегией анализа FRET. Однако это может занять много времени, и конструкции могут демонстрировать структурные различия, тем самым влияя на связывание лигандов61. Аналогичным образом, мутация Arg и его остатков в месте связывания лигандов может генерировать непредвиденные структурные изменения, тем самым делая мутированный белок непригодным для экспериментов62.
Что касается остатка Trp, то эффективность анализа химической модификации NBS будет ограничена в следующих случаях: 1) если остаток Trp глубоко погребен в ядре хорошо сложенного и компактного белка; поскольку часть NBS не сможет получить доступ к остатку Trp из-за отсутствия больших полостей41,48,63,2) если остатки Trp расположены в мембранно-внедренных структурах (трансмембранная α-спирали), так как водный характер NBS будет препятствовать его попаданию в гидрофобнуюсреду 32,56, 64,3), если белковая структура содержит множественные остатки Trp; поскольку различия в доступности и физико-химической среде могут быть большими, что затрудняет присвоение флуоресцентного сигнала изменению остатка Trp32,41,56,4), если связывание ANS с белками обусловлено главным образом гидрофобным взаимодействием, поскольку увеличение флуоресценции ANS обусловлено главным образом электростатическими взаимодействиями32,65,66,67и e), если статически закалка Trp происходит, например, в присутствии кислорода68.
Опосредованное NBS химическое изменение остатков Trp, по-видимому, является быстрым и простым анализом для изучения FRET между Trp и ANS, который связан с белками / ферментами. Вместо НБС могут использоваться другие Trp-модифицирующие реагенты, например, гидрокси-5-нитробензилбромид (HNB)69,70. Наконец, анализ может быть применим к обнаружению предлагаемых fret пар Trp с другими флурофорами21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была частично профинансирована грантом FAI-UASLP No C19-FAI-05-89.89 и грантом CONACYT No 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021). Авторы благодарят за техническую помощь Джулиана Э. Мата-Моралеса в видеоигровке.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acrylamide | Bio-Rad | 1610107 | SDS-PAGE |
Ammonium persulfate | Bio-Rad | 1610700 | SDS-PAGE |
8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid | Sigma-Aldrich | A1028 | Fluorophore |
Bis-acrylamide | Bio-Rad | 1610125 | SDS-PAGE |
N-Bromosuccinimide | Sigma-Aldrich | B81255 | Chemical modification |
N,N-dimethylformamide | J.T. Baker | 9213-12 | Stock solution preparation |
Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F7250 | Chemical fluorescence label |
Fluorescence cuvette | Hellma | Z801291 | Fluorescence assay |
Fluorescence Spectrofluorometer | Shimadzu | RF 5301PC | Fluorescence assay |
HisTrap™ FF | GE Healtcare | 11-0004-59 | Protein purification |
IPTG, Dioxane free | American Bionalytical | AB00841-00010 | Protein expression |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | Protein purification |
LB media | Fisher Scientific | 10000713 | Cell culture |
Pipetman L P10L | Gilson | FA10002M | Fluorescence assay |
Pipetman L P100L | Gilson | FA10004M | Fluorescence assay |
Pipetman L P200L | Gilson | FA10005M | Fluorescence assay |
Pipetman L P1000L | Gilson | FA10006M | Fluorescence assay |
Pipetman L P5000L | Gilson | FA10007 | Fluorescence assay |
Precision plus std | Bio-Rad | 1610374 | SDS-PAGE |
Sodium dodecyl sulphate | Bio-Rad | 1610302 | SDS-PAGE |
Sodium phosphate dibasic | J.T. Baker | 3828-19 | Buffer preparation |
Sodium phosphate monobasic | J.T. Baker | 3818-01 | Buffer preparation |
Syringe filter 0.2 um | Millipore | GVWP04700 | Solution filtration |
Temed | Bio-Rad | 1610801 | SDS-PAGE |
Tris | Bio-Rad | 1610719 | SDS-PAGE |
References
- Munishkina, L. A., Fink, A. L. Fluorescence as a method to reveal structures and membrane-interactions of amyloidogenic proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1768 (8), 1862-1885 (2007).
- Dong, X., Thomas, D. D. Time-resolved FRET reveals the structural mechanism of SERCA-PLB regulation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 449 (2), 196-201 (2014).
- Szilvay, G. R., Blenner, M. A., Shur, O., Cropek, D. M., Banta, S. A FRET-based method for probing the conformational behavior of an intrinsically disordered repeat domain from Bordetella pertussis adenylate cyclase. Biochemistry. 48 (47), 11273-11282 (2009).
- Sun, Y., Wallrabe, H., Booker, C. F., Day, R. N., Periasamy, A. Three-color spectral FRET microscopy localizes three interacting proteins in living cells. Biophysical Journal. 99 (4), 1274-1283 (2010).
- Cornea, R. L., et al. High-throughput FRET assay yields allosteric SERCA activators. Journal of Biomolecular Screening. 18 (1), 97-107 (2013).
- Gruber, S. J., et al. Discovery of enzyme modulators via high-throughput time-resolved FRET in living cells. Journal of Biomolecular Screening. 19 (2), 215-222 (2014).
- Dyla, M., et al. Dynamics of P-type ATPase transport revealed by single-molecule FRET. Nature. 551 (7680), 346-351 (2017).
- Corradi, G. R., Adamo, H. P. Intramolecular fluorescence resonance energy transfer between fused autofluorescent proteins reveals rearrangements of the N- and C-terminal segments of the plasma membrane Ca2+ pump involved in the activation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (49), 35440-35448 (2007).
- Piston, D. W., Kremers, G. -J. Fluorescent protein FRET: The good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
- Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
- Chen, Y., Barkley, M. D. Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins. Biochemistry. 37 (28), 9976-9982 (1998).
- Zelent, B., et al. Tryptophan fluorescence yields and lifetimes as a probe of conformational changes in human glucokinase. Journal of Fluorescence. 27 (5), 1621-1631 (2017).
- Callis, P. R. Binding phenomena and fluorescence quenching. I: Descriptive quantum principles of fluorescence quenching using a supermolecule approach. Journal of Molecular Structure. 1077, 14-21 (2014).
- Callis, P. R. Binding phenomena and fluorescence quenching. II: Photophysics of aromatic residues and dependence of fluorescence spectra on protein conformation. Journal of Molecular Structure. 1077, 22-29 (2014).
- Agarwal, P. K., Geist, A., Gorin, A. Protein dynamics and enzymatic catalysis: Investigating the peptidyl-prolyl cis-trans isomerization activity of cyclophilin A. Biochemistry. 43 (33), 10605-10618 (2004).
- Deng, H., Zhadin, N., Callender, R. Dynamics of protein ligand binding on multiple time scales: NADH binding to lactate dehydrogenase. Biochemistry. 40 (13), 3767-3773 (2001).
- van de Weert, M. Fluorescence quenching to study protein-ligand binding: common errors. Journal of fluorescence. 20 (2), 625-629 (2010).
- van de Weert, M., Stella, L. Fluorescence quenching and ligand binding: A critical discussion of a popular methodology. Journal of Molecular Structure. 998 (1-3), 144-150 (2011).
- Stella, L., van de Weert, M., Burrows, H. D., Fausto, R. Fluorescence spectroscopy and binding: Getting it right. Journal of Molecular Structure. 1077, 1-3 (2014).
- Credi, A., Prodi, L. Inner filter effects and other traps in quantitative spectrofluorimetric measurements: Origins and methods of correction. Journal of Molecular Structure. 1077, 30-39 (2014).
- Lee, M. M., Peterson, B. R. Quantification of small molecule-protein interactions using FRET between tryptophan and the pacific blue fluorophore. ACS Omega. 1 (6), 1266-1276 (2016).
- Zhang, Y., et al. Comparison of FÖrster-resonance-energy-transfer acceptors for tryptophan and tyrosine residues in native proteins as donors. Journal of Fluorescence. 23 (1), 147-157 (2013).
- Xie, Y., Maxson, T., Tor, Y. Fluorescent ribonucleoside as a FRET acceptor for tryptophan in native proteins. Journal of the American Chemical Society. 132 (34), 11896-11897 (2010).
- Ghisaidoobe, A. B. T. T., Chung, S. J. Intrinsic tryptophan fluorescence in the detection and analysis of proteins: A focus on Förster resonance energy transfer techniques. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 22518-22538 (2014).
- Goryashchenko, A. S., et al. Genetically encoded FRET-sensor based on terbium chelate and red fluorescent protein for detection of caspase-3 activity. International Journal of Molecular Sciences. 16 (7), 16642-16654 (2015).
- Arslanbaeva, L. R., et al. Induction-resonance energy transfer between the terbium-binding peptide and the red fluorescent proteins DsRed2 and TagRFP. Biophysics. 56 (3), 381-386 (2011).
- Di Gennaro, A. K., Gurevich, L., Skovsen, E., Overgaard, M. T., Fojan, P. Study of the tryptophan-terbium FRET pair coupled to silver nanoprisms for biosensing applications. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (22), 8838-8844 (2013).
- Hawe, A., Poole, R., Jiskoot, W. Misconceptions over Förster resonance energy transfer between proteins and ANS/bis-ANS: Direct excitation dominates dye fluorescence. Analytical Biochemistry. 401 (1), 99-106 (2010).
- Ghosh, U., Das, M., Dasgupta, D. Association of fluorescent probes 1-anilinonaphthalene-8-sulfonate and 4,4´-dianilino-1,1´-binaphthyl-5,5´-disulfonic acid with T7 RNA polymerase. Biopolymers. 72 (4), 249-255 (2003).
- Vreuls, C., et al. Guanidinium chloride denaturation of the dimeric Bacillus licheniformis BlaI repressor highlights an independent domain unfolding pathway. The Biochemical Journal. 384, 179-190 (2004).
- Möller, M., Denicola, A. Study of protein-ligand binding by fluorescence. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (5), 309-312 (2002).
- Chang, L., Wen, E., Hung, J., Chang, C. Energy transfer from tryptophan residues of proteins to 8-anilinonaphthalene-1-sulfonate. Journal of Protein Chemistry. 13 (7), 635-640 (1994).
- Togashi, D. M., Ryder, A. G. A fluorescence analysis of ANS bound to bovine serum albumin: Binding properties revisited by using energy transfer. Journal of Fluorescence. 18 (2), 519-526 (2008).
- Dela Cruz-Torres, V., Cataño, Y., Olivo-Rodríguez, M., Sampedro, J. G. ANS interacts with the Ca2+-ATPase nucleotide binding site. Journal of Fluorescence. 30 (3), 483-496 (2020).
- Gasymov, O. K., Glasgow, B. J. ANS fluorescence: Potential to augment the identification of the external binding sites of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1774 (3), 403-411 (2007).
- Matulis, D., Lovrien, R. 1-anilino-8-naphthalene sulfonate anion-protein binding depends primarily on ion pair formation. Biophysical Journal. 74 (1), 422-429 (1998).
- Samukange, V., Yasukawa, K., Inouye, K. Interaction of 8-anilinonaphthalene 1-sulphonate (ANS) and human matrix metalloproteinase 7 (MMP-7) as examined by MMP-7 activity and ANS fluorescence. Journal of Biochemistry. 151 (5), 533-540 (2012).
- Qin, J., et al. Selective and sensitive homogenous assay of serum albumin with 1-anilinonaphthalene-8-sulphonate as a biosensor. Analytica Chimica Acta. 829, 60-67 (2014).
- Malik, A., Kundu, J., Karmakar, S., Lai, S., Chowdhury, P. K. Interaction of ANS with human serum albumin under confinement: Important insights and relevance. Journal of Luminescence. 167, 316-326 (2015).
- Páez-Pérez, E. D., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. G. Nucleotide binding in an engineered recombinant Ca2+-ATPase N-domain. Biochemistry. 55 (49), 6751-6765 (2016).
- Sampedro, J. G., Nájera, H., Uribe-Carvajal, S., Ruiz-Granados, Y. G. Mapping the ATP binding site in the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Journal of fluorescence. 24 (6), 1849-1859 (2014).
- Abu-Abed, M., Millet, O., MacLennan, D. H., Ikura, M. Probing nucleotide-binding effects on backbone dynamics and folding of the nucleotide-binding domain of the sarcoplasmic/endoplasmic-reticulum Ca2+-ATPase. The Biochemical Journal. 379, Pt 2 235-242 (2004).
- Abu-Abed, M., Mal, T. K., Kainosho, M., MacLennan, D. H., Ikura, M. Characterization of the ATP-binding domain of the sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase: probing nucleotide binding by multidimensional NMR. Biochemistry. 41 (4), 1156-1164 (2002).
- Sazinsky, M. H., Mandal, A. K., Argüello, J. M., Rosenzweig, A. C. Structure of the ATP binding domain from the Archaeoglobus fulgidus Cu+-ATPase. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11161-11166 (2006).
- Liu, L., et al. Crystallization and preliminary X-ray studies of the N-domain of the Wilson disease associated protein. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 65 (6), 621-624 (2009).
- Banci, L., et al. The binding mode of ATP revealed by the solution structure of the N-domain of human ATP7A. Journal of Biological Chemistry. 285 (4), 2537-2544 (2010).
- Spande, T. F., Witkop, B. Determination of the tryptophan content of proteins with N-bromosuccinimide. Methods in Enzymology. 11, 498-506 (1967).
- Spande, T. F., Green, N. M., Witkop, B. The Reactivity toward N-bromosuccinimide of tryptophan in enzymes, zymogens, and inhibited enzymes. Biochemistry. 5 (6), 1926-1933 (1966).
- Rawat, U. B., Rao, M. B. Purification, kinetic characterization and involvement of tryptophan residue at the NADPH binding site of xylose reductase from Neurospora crassa. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1293 (2), 222-230 (1996).
- Zaki, M. J., Bystroff, C. Protein Structure Prediction. , Humana Press. Totowa, NJ. (2008).
- Wang, Z., et al. Comprehensive evaluation of ten docking programs on a diverse set of protein-ligand complexes: The prediction accuracy of sampling power and scoring power. Physical Chemistry Chemical Physics. 18 (18), 12964-12975 (2016).
- Pagadala, N. S., Syed, K., Tuszynski, J. Software for molecular docking: A review. Biophysical Reviews. , 91-102 (2017).
- Dolatkhah, Z., Javanshir, S., Sadr, A. S., Hosseini, J., Sardari, S. Synthesis, Molecular Docking, Molecular Dynamics Studies, and Biological Evaluation of 4 H -Chromone-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylate Derivatives as Potential Antileukemic Agents. Journal of Chemical Information and Modeling. 57 (6), 1246-1257 (2017).
- Forli, S., et al. Computational protein-ligand docking and virtual drug screening with the AutoDock suite. Nature Protocols. 11 (5), 905-919 (2016).
- Lindahl, E. R.
Molecular dynamics simulations. Molecular Modeling of Proteins. Methods in Molecular Biology. 443, 3-23 (2008). - Turk, T., Maček, P., Gubenšek, F. The role of tryptophan in structural and functional properties of equinatoxin II. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Protein Structure and Molecular. 1119 (1), 1-4 (1992).
- Peterman, B. F., Laidler, K. J. Study of reactivity of tryptophan residues in serum albumins and lysozyme by N-bromosuccinamide fluorescence quenching. Archives of Biochemistry and Biophysics. 199 (1), 158-164 (1980).
- Divita, G., Goody, R. S., Gautheron, D. C., Di Pietro, A. Structural mapping of catalytic site with respect to α-subunit and noncatalytic site in yeast mitochondrial F1-ATPase using fluorescence resonance energy transfer. Journal of Biological Chemistry. 268 (18), 13178-13186 (1993).
- Horrocks, W. D., Holmquist, B., Vallee, B. L. Energy transfer between terbium (III) and cobalt (II) in thermolysin: a new class of metal-metal distance probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 4764-4768 (1975).
- Chakraborty, J., Das, N., Halder, U. C. Unfolding diminishes fluorescence resonance energy transfer (FRET) of lysine modified β-lactoglobulin: Relevance towards anti-HIV binding. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 102 (1), 1-10 (2011).
- Sirangelo, I., Malmo, C., Casillo, M., Irace, G. Resolution of Tryptophan-ANS Fluorescence Energy Transfer in Apomyoglobin by Site-directed Mutagenesis. Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 381-384 (2007).
- Ribeiro, A. J. M., Tyzack, J. D., Borkakoti, N., Holliday, G. L., Thornton, J. M. A global analysis of function and conservation of catalytic residues in enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 314-324 (2020).
- Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Exposure of tryptophanyl residues in proteins. Quantitative determination by fluorescence quenching studies. Biochemistry. 15 (3), 672-680 (1976).
- Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Fluorescence quenching of indole and model micelle systems. The Journal of Physical Chemistry. 80 (5), 486-493 (1976).
- Kinsley, N., Sayed, Y., Mosebi, S., Armstrong, R. N., Dirr, H. W. Characterization of the binding of 8-anilinonaphthalene sulfonate to rat class Mu GST M1-1. Biophysical Chemistry. 137 (2-3), 100-104 (2008).
- Mohsenifar, A., et al. A study of the oxidation-induced conformational and functional changes in neuroserpin. Iranian Biomedical Journal. 11 (1), 41-46 (2007).
- Gonzalez, W. G., Miksovska, J. Application of ANS fluorescent probes to identify hydrophobic sites on the surface of DREAM. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (9), 1472-1480 (2014).
- Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Fluorescence quenching studies with proteins. Analytical Biochemistry. 114 (2), 199-227 (1981).
- Poulos, T. L., Price, P. A. The identification of a tryptophan residue essential to the catalytic activity of bovine pancreatic deoxyribonuclease. The Journal of biological chemistry. 246 (12), 4041-4045 (1971).
- Hu, J. -J., He, P. -Y., Li, Y. -M. Chemical modifications of tryptophan residues in peptides and proteins. Journal of Peptide Science An Official Publication of the European Peptide Society. 27 (1), 3286 (2021).