Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

שינוי כימי של שאריות טריפטופן ב- Ca רקומביננטיCa 2 +-ATPase N-דומיין לחקר טריפטופן-ANS FRET

Published: October 9, 2021 doi: 10.3791/62770
Automatic Translation
1, 1
1Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

Summary

ANS נקשר לתחום N רקומביננטי של Ca2+ATPase. ספקטרום פלואורסצנטי מציג תבנית דמוית FRET עם עירור באורך גל של 295 ננומטר. שינוי כימי בתיווך NBS של Trp מרווה את הפלואורסצנטיות של N-domain, מה שמוביל להיעדר העברת אנרגיה (FRET) בין שאריות Trp ו- ANS.

Abstract

הסרקו/אנדופלסמי רטיקולום Ca2+-ATPase (SERCA) הוא ATPase מסוג P שהתגבש בקונפורמציות שונות. מידע פונקציונלי מפורט ניתן בכל זאת לקבל מתחומים רקומביננטיים מבודדים. הדומיין המהונדס (Trp552Leu ו- Tyr587Trp) רקומביננטי נוקלאוטיד מחייב תחום (N-domain) מציג פלואורסצנטיות מרווה על כריכת ליגנד. פלואורופור חיצוני, כלומר, 8-אנילינו-1-נפטלין סולפונט (ANS), נקשר לאתר כריכת הנוקלאוטידים באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות והידרופוביות עם שאריות ארג, שלו, עלא, לאו ו-Phe. כריכת ANS מעידה על העלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות כאשר נרגשים באורך גל (λ) של 370 ננומטר. עם זאת, כאשר נרגשים ב λ של 295 ננומטר, העלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות נראה מצמיד את מרווה של פלואורסצנטיות מהותית N-תחום. ספקטרום פלואורסצנטי מציג תבנית דמוית העברת אנרגיית תהודה של Föster (FRET), ובכך מרמז על נוכחות של זוג Trp-ANS FRET, שנראה נתמך על ידי המרחק הקצר (~ 20 Å) בין Tyr587Trp ו- ANS. מחקר זה מתאר ניתוח של זוג Trp-ANS FRET על ידי שינוי כימי Trp (ומרווה פלואורסצנטיות) המתווך על ידי N-bromosuccinimide (NBS). בתחום N שונה כימית, פלואורסצנטיות ANS גדל כאשר נרגש ב λ של 295 ננומטר, בדומה כאשר נרגש ב λ של 370 ננומטר. לפיכך, שינוי כימי בתיווך NBS של שאריות Trp יכול לשמש כדי לחקור את היעדר FRET בין Trp ו ANS. בהיעדר פלואורסצנטיות Trp, אין לראות עלייה בפלואורסצנטיות ANS. השינוי הכימי של שאריות Trp בחלבונים על ידי NBS עשוי להיות שימושי לבדיקת FRET בין שאריות Trp שקרובות ל- ANS הכבול. סביר להניח כי ניתן יהיה להשתמש ב- Assay זה גם בעת שימוש בפלואורופורים אחרים.

Introduction

העברת אנרגיית התהודה של Föster (FRET) הפכה לטכניקה סטנדרטית לקביעת המרחק בין מבנים מולקולריים לאחר כריכה או אינטראקציה במבנה החלבון ובמחקריפונקציות 1,2,3,4. ב- ATPases מסוג P, FRET שימש כדי לחקור את המבנה והתפקוד של רטיקולום סרקו-אנדופלסמי Ca2 +- ATPase (SERCA)2,5,6,7,8, למשל, תנודות מבניות במהלך המחזור הקטליטי נותחו בחלבון כולו על ידי FRET7.

תורמי FRET הם מגוונים, והם נעים בין מולקולות פלואורסצנטיות קטנות (קיצוניות) לחלבונים פלואורסצנטיים9,10. שאריות טריפטופן (Trp) (בשל הפלואורסצנטיות שלהם) שימושיות לזיהוי שינויים מבניים ברצפי חומצות אמינו חלבוניות11,12. עוצמת הפלואורסצנטיות של Trp תלויה באופן משמעותי בקוטביות שלסביבתו 13,14. כריכת ליגנד מייצרת בדרך כלל סידורים מבניים בחלבונים/אנזימים15,16. אם Trp קיים או ממוקם קרוב לאתר כריכת החלבון, תנודות מבניות משפיעות לעתים קרובות על מידת החשיפה ל- Trp למדיה מימית13,14; לכן, השינוי בקוטביות גורם להרוות את עוצמת הפלואורסצנטיות של Trp13,14. לפיכך, המאפיין הפלואורסצנטי של Trp שימושי לביצוע מחקרי כריכת ליגנד עבור אנזימים. תופעות פיזיות אחרות עלולות גם להוביל לפלואורסצנטיות של Trp המשתוות17,18,19,20, למשל, FRET ושינויים בקוטביות בינונית. העברת אנרגיה מהמצב הנרגש של Trp לפלורופור יש גם יישומים פוטנציאליים, למשל, קביעת זיקה של ליגנדים קטנים בחלבונים21. ואכן, Trp שימש בעיקר כתורם פלואורסצנטי במחקרי FRET בחלבונים22,23,24, למשל, במחקרי טרביום (Tb3+) FRET, שאריות Trp משמש לעתים קרובות כאנטנה להעברת אנרגיה ל- Tb3 +25,26,27. Trp מציג יתרונות שונים על פני תורמי FRET אחרים בשל אופיו המכונן המובנה במבנה החלבון, אשר מבטל את הצורך בתהליכי הכנה שעשויים להשפיע על התפקוד / המבנה של החלבון הנחקר24. לכן, זיהוי של ריקבון קרינה (העברת אנרגיה ושינויים בקוטביות הבינונית הנגרמים על ידי סידורים מבניים של חלבון) חשוב להסיק מסקנות מדויקות לגבי כריכת ליגנד במחקרים מבניים חלבונים13,14,19,28.

במחקרים מבניים חלבון, פלואורופור חיצוני, כלומר, 8-אנילינו-1-נפטלין סולפונט (ANS), שימש בעיקר בניסויים הקשורים קיפול חלבון / התגלגלות28,29. ANS נקשר חלבונים / אנזימים במדינת האם, בדרך כלל באתרים מחייבים שלמצעים 31,32,33; עלייה בתפוקה קוונטית פלואורסצנטית ANS (ΦF) (כלומר, עלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות) מושרה על ידי מרגש את החלבון ב λ = 370 ננומטר כאשר אינטראקציות מתאימות של ANS עם ארג ושאריות שלו בכיסים הידרופוביים להתרחש34,35,36,37. במחקרים שונים, דווח על התרחשותו של FRET (כאשר מרגש ב λ בתוך 280-295 ננומטר) בין שאריות Trp (תורמים) ו- ANS (מקבל), אשר מבוסס על הדברים הבאים: 1) חפיפה של ספקטרום פליטת פלואורסצנטיות של Trp ו ספקטרום עירור של ANS, 2) זיהוי של מרחק מתאים בין שאריות Trp אחד או יותר (ים) ו- ANS להעברת אנרגיה, 3) תשואה קוונטית ANS גבוהה כאשר כבול בכיסי חלבון, ו 4) דפוס FRET אופייני בספקטרום הפלואורסצנטיות של החלבון בנוכחות ANS3,17,27,37,38.

לאחרונה, איגוד ליגנד לתחום איגוד הנוקלאוטידים (N-domain) ב- SERCA ו- ATPases אחרים מסוג P נחקרו באמצעות N-domains רקומביננטי מהונדס40,41,42,43,44,45,46. הנדסה מולקולרית של SERCA N-domain שימשה להעברת שאריות Trp הבלעדיות (Trp552Leu) למבנה דינמי יותר (Tyr587Trp) הקרוב לאתר כריכת הנוקלאוטידים, שבו ניתן להשתמש בווריאציות פלואורסצנטיות (מרווה) לניטור שינויים מבניים על כריכת ליגנד34. תוצאות הניסוי הוכיחו כי ANS נקשר (כ- ATP) לאתר כריכת הנוקלאוטידים ב- SERCA N-domainהמטוהר 34. מעניין, פלואורסצנטיות ANS גדל על כריכה לתחום N על עירור ב λ של 295 ננומטר, בעוד הפלואורסצנטיות המהותית של N-דומיין פוחתת34, ובכך לייצר דפוס FRET המציע היווצרות של זוג Trp-ANS FRET.

השימוש ב- NBS הוצע כדי לקבוע את התוכן של שאריות Trp בחלבונים47 על ידי בדיקת ספיגה של חלבונים מותאמים. NBS משנה את קבוצת האינדולה הסופגת ביותר של Trp לאוקסינדול פחות סופג47,48. התוצאה היא אובדן (מרווה) של מאפיין פלואורסצנטי Trp40. לפיכך, שינוי כימי בתיווך NBS של שאריות Trp עשוי לשמש בדיקה כדי להגדיר את התפקיד של Trp (כתורם) כאשר FRET הוא שיער.

פרוטוקול זה מתאר את השינוי הכימי של שאריות Trp הבלעדיות על ידי NBS בתחום N רקומביננטי מהונדס של SERCA כמודל חלבון. תוצאות הניסוי מראות כי עוצמת הפלואורסצנטיות של ANS עדיין עולה ב- N-domain34שעבר שינוי כימי NBS , חסר פלואורסצנטיות מהותית. לכן, הניסיון שימושי להדגמת היעדר FRET בין שאריות Trp ו- ANS כאשר הוא קשור ל- N-domain34,40,49. לפיכך, בדיקה זו (שינוי כימי NBS של Trp) שימושית בהוכחת נוכחותם של זוג Trp-ANS FRET בחלבונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. נחישות (בסיליקו) של אינטראקציית ה- ANS ו- SERCA N-domain

  1. צור מבנה תלת מימדי (3D) של החלבון (SERCA N-domain) על ידי מידול מולקולרי באמצעות תוכנת מידול החלבון המועדפת50.
  2. זהה את שאריות חומצת האמינו היוצרות את אתר כריכת הנוקלאוטיד באמצעות תוכנת המבנה המולקולרי המועדפת51, ולקבוע את נוכחותם של שאריות ארג וליס35; אלה נדרשים עבור איגוד ANS ולהגדיל את עוצמת הפלואורסצנטיות (תשואה קוונטית).
  3. בצע עגינה מולקולרית (באמצעות תוכנת העגינה המועדפת)52,53,54 כדי לקבוע את האינטראקציות של ATP, פלואורסצין איזוטיוצינט (FITC) (אשר יוצר קשר קוולנטי עם Lys515 תיוג האתר כריכת נוקלאוטיד), ו ANS עם שאריות חומצות אמינו באתר כריכת נוקלאוטידים ( איור1).
  4. חשב את המרחק המולקולרי (Å) בין שאריות Trp ו- ANS קשור באמצעות כלי המדידה בתוכנה המועדפת.
  5. בצע סימולציה דינמית מולקולרית של קומפלקס ANS-N-תחום כדי לקבוע את היציבות של האינטראקציה52,54. לאחר מכן, לבצע את הניסויים במבחנה כאשר היציבות של המתחם אושרה.

2. ביטוי וטיהור של N-תחום רקומביננטי

  1. לסנתז את קידוד הגן עבור N-תחום40.
  2. לעצב ולבנות את plasmid המכיל את הגן הסינתטי כי קודים עבור N-תחום40.
  3. לבטא ולטהר על ידי כרומטוגרפיה זיקה (Ni-NTA), N-תחום רקומביננטי מהונדס. בצע SDS-PAGE של החלבון המטוהר כדי לקבוע את הטוהר (איור 2)40.
  4. לקבוע את ריכוז החלבון על ידי לימוד הספיגה ב λ של 280 ננומטר עם מקדם ההכחדה N-תחום (ε = 11,960 M-1·ס"מ-1)40.

3. נטר את היווצרותו של קומפלקס התחום ANS-N המבוסס על שינויי עוצמת הפלורסצנטיות של ANS ו- N-domain.

  1. הכן פתרון מלאי ANS ב N,N-דימתילפורמיד.
    1. שקול כמות קטנה (1-5 מ"ג) של ANS, ולהמיס אותו ב 1 מ"ל של הנפח הסופי של N,N-דימתילפורמיד, למשל, 3.2 מ"ג (10.69 mM ריכוז סופי).
    2. הכן פתרון מלאי מימי 100μM ANS באמצעות פתרון ANS ב N,N-דימתילפורמיד, למשל, להוסיף 9.4 μL של פתרון ANS 10.69 mM ל 990.6 μL של 50 mM חוצץ פוספט עם pH 8.0 כדי להשיג נפח סופי של 1 מ"ל.
    3. מערבבים את הפתרונות על ידי מערבולת 3 - 5 פעמים עבור 15 s.
      הערה: בניסוי הבא, השתמש רק בפתרון המניה המ מימי ANS. הכן טרי את פתרון המניה הממית ANS לפני תחילת הניסויים.
  2. הכן את פתרון המניות של NBS ב- N,N-דימתילפורמיד.
    1. שקול כמות קטנה (1-5 מ"ג) של NBS, ולהמיס אותו 1 מ"ל של N,N-דימתילפורמיד, למשל, 5.3 מ"ג ב 1 מ"ל (29.78 mM ריכוז סופי).
    2. הכן פתרון מלאי מימי 1 mM NBS באמצעות פתרון NBS ב N,N-דימתילפורמיד, למשל, להוסיף 3.36 μL של פתרון NBS 29.78 mM ל 96.64 μL של 50 mM חוצץ פוספט עם pH 8.0 כדי להשיג נפח סופי 0.1 מ"ל.
    3. מערבבים את הפתרונות על ידי מערבולת 3 - 5 פעמים עבור 15 s.
      הערה: הכן טרי את פתרון המלאי המומי של NBS לפני תחילת הניסויים.
  3. לתמצת את N-הדומיין עם ANS, ולתעד את ספקטרום פלואורסצנטיות על ידי עירור ב λ = 295 ננומטר ב 25 °C (70 °F).
    1. להשיג את בסיס ספקטרום הפלואורסצנטיות.
      1. מקם 1 מ"ל של 50 mM חוצץ פוספט עם pH 8.0 ב 1 מ"ל פלואורסצנטי קוורץ cuvette.
      2. מקם את התא בתא התא המוצהר התרמו -state (25 °C) של ספקטרופלואורומטר והגדר את העירור λ ל 295 ננומטר.
      3. להקליט את ספקטרום הפלואורסצנטיות (305 - 550 ננומטר).
        הערה: ספקטרום הפלואורסצנטיות של חיץ הפוספט של 50 מ"מ עם pH 8.0, המשמש כדגימה ריקה, מופחת מכל ספקטרום הפלואורסצנטי שהושג.
    2. להשיג את ספקטרום הפלואורסצנטיות המהותי של N-תחום.
      1. מניחים 900 μL של 50 mM חוצץ פוספט עם pH 8.0 ב cuvette קוורץ פלואורסצנטי.
      2. הוסף 100 μL של השעיית N-domain (10 μM) כדי לקבל ריכוז סופי N-domain 1 בנפח סופי של 1 מ"ל.
      3. הומוגניזציה בעדינות באמצעות מיקרופיפט 20 פעמים כדי להבטיח את ההומוגניות של הפתרון.
        הערה: החלבון צריך להיות מטוהר טרי כדי לקבל ספקטרום פלואורסצנטיות מהותית באיכות גבוהה, למשל, N-domain רקומביננטי מטוהר ניתן להשתמש רק במשך שבוע לאחר הטיהור.
      4. מקם את התא בתא התא המוצהר התרמו -state (25 °C) של ספקטרופלואורומטר והגדר את העירור λ ל 295 ננומטר.
      5. הקלט את ספקטרום הפלואורסצנטיות המהותית של N-domain (305-550 ננומטר).
    3. הוסף ANS, ולקבל את ספקטרום הפלואורסצנטיות על ידי עירור ב λ = 295 ננומטר.
      1. הוסף 2 μL aliquot של 100 μM ANS פתרון מלאי מימית N-domain מושעה (1 μM) כדי לקבל ריכוז סופי ANS 0.2 μM.
      2. הומוגניזציה בעדינות באמצעות מיקרופיפט 20 פעמים כדי להבטיח את ההומוגניות של הפתרון.
      3. מקם את התא בתא התא התרמו-יציב (25 °C) של ספקטרופלואורומטר והגדר את העירור λ ל 295 ננומטר.
      4. להקליט את ספקטרום הפלואורסצנטיות (305-550 ננומטר).
      5. חזור על תוספות ANS וספקטרום פלואורסצנטיות הקלטה מעל 1:1 קשר טוחן ANS:N-domain.
      6. הפחת את הספקטרום הריק מכל ספקטרום באמצעות תוכנה מתאימה.
      7. התווה את כל הספקטרום בגרף יחיד.
      8. קבעו אם הספקטרום יוצר תבנית דמוית FRET. ספקטרום הפלואורסצנטיות של ANS-N-domain יוצר תבנית דמוית FRET(איור 3A).

4. Titration פלואורסצנטיות מהותית של N-domain על ידי שינוי כימי Trp עם NBS.

  1. חזור על שלבים 3.3.1 ו- 3.3.2.
  2. הוסף 1 μL aliquot של 1 mM NBS פתרון מלאי מימי ל- N-domain מושעה (1 μM) כדי להשיג ריכוז סופי של 1 μM NBS.
  3. הומוגני בעדינות באמצעות מיקרופיפט 20 פעמים כדי להבטיח את ההומוגניות של הפתרון.
  4. מקם את התא בתא התא התרמו-יציב (25 °C) של ספקטרופלואורומטר והגדר את העירור λ ל 295 ננומטר.
  5. תעד את ספקטרום הפלואורסצנטיות (305-550 ננומטר)(איור 3B).
  6. חזור על הקלטת ספקטרום התוספת והפלואורסצנטיות של NBS עד שנצפו40מרווה פלואורסצנטיות מהותית מינימלית של N-domain . ב- N-domain, פעולה זו מתרחשת בדרך כלל ביחס טחון של 5-6 NBS / N-domain40.
    הערה: NBS מרווה במהירות (<5 s) את הפלואורסצנטיות המהותית של ה- N-domain; נצפתה ירידה בעוצמת הפלואורסצנטיות. המשך מיד לשלב הבא, כמו NBS עשוי גם להגיב עם שאריות חומצת אמינו אחרות47.
  7. הפחת את הספקטרום הריק מכל ספקטרום באמצעות תוכנה מתאימה.
  8. התווה את כל הספקטרום בגרף יחיד (איור 3B).

5. טיטרט N-דומיין שונה NBS עם ANS על ידי הקלטת ספקטרום פלואורסצנטי ב 25 °C (70 °F).

  1. בצע את שלב 3.3.3 באמצעות N-domain שהשתנה על-ידי NBS שנוצר בשלב 4.
  2. הפחת את הספקטרום הריק מכל ספקטרום באמצעות תוכנה מתאימה.
  3. התווה את כל הספקטרום בגרף יחיד (איור 3C).
  4. ספקטרום הפלואורסצנטיות שנוצר (איור 3C) תומך או מפריך את המופע של FRET, כלומר, כאשר FRET מתרחש, פלואורסצנטיות ANS אינה גדלה ולהיפך.

6. ראיות של ANS מחייב לתחום N שונה כימית על ידי עירור ב λ = 370 ננומטר.

  1. בצע את שלב 3.3.3 באמצעות N-domain שהשתנה על-ידי NBS שנוצר בשלב 4 אך שינה את העירור ל- 370 ננומטר.
  2. הפחת את הספקטרום הריק מכל ספקטרום באמצעות תוכנה מתאימה.
  3. התווה את כל הספקטרום בגרף יחיד (איור 3D).
  4. אשר איגוד ANS לתחום N על-ידי התבוננות בעלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות של ANS. איגוד ANS לתחום N מראה עלייה פלואורסצנטית כאשר נרגשים ב- λ = 370 ננומטר (איור 3D). כפקד, ספקטרום הפלואורסצנטיות של ANS (לבד) במאגר פוספט של 50 מ"מ עם pH 8.0 הושג מרגש ב λ של 295 ו 370 ננומטר(איור 4,לא מוצג בסרטון).
    הערה: היחסים הסטויצ'יומטריים של NBS:Trp הנדרש לשינוי כימי תלוי במידת הקבורה של שאריות Trp בחלבון על פי מחקר46,47,55,56. לכן, מומלץ לקבוע את יחס הטוחנת NBS:חלבון/(Trp), מראש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עגינה מולקולרית מציגה את הכריכה של ANS לאתר כריכת הנוקלאוטידים של ה- N-domain באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות והידרופוביות (איור 1). המרחק המולקולרי (20 Å) בין שאריות Trp ל- ANS (מאוגד לאתר כריכת הנוקלאוטיד) תומך במופע של FRET (איור 1). תחום ה-N המתוכננת (המהונדסת) התקבל בטוהר גבוה על ידי כרומטוגרפיה שלזיקה (איור 2)והתאים לניסויי פלואורסצנטיות. ספקטרום פלואורסצנטיות של קומפלקס התחום ANS-N הציג דפוס דמוי FRET על עירור ב λ = 295 ננומטר (איור 3A). שינוי כימי של שאריות Trp על ידי NBS הוביל להרוות את הפלואורסצנטיות המהותית של N-domain (איור 3B). בתחום N-domain שעבר שינוי כימי ב- NBS, תוצאות הניסוי מראות כי פלואורסצנטיות ANS גדלה עם עירור ב- λ = 295 ננומטר (איור 3C), בדומה לזה שנצפה בתחום N-in(איור 3A). לכן, עירור ישיר של ANS ב λ = 295 ננומטר מספק את האנרגיה ביותר עבור פלואורסצנטיות ANS (איור 3C), כפי שהוצע בעבר28. קשירת ANS לתחום N-domain שעבר שינוי כימי מעידה על עלייה בפלואורסצנטיות שלו כאשר היא מתרגשת ב- λ = 370 ננומטר (איור 3D). לכן, FRET אינו מתרחש בין שאריות Trp ו- ANS המאוגד לאתר איגוד הנוקלאוטידים.

Figure 1
איור 1: עגינה מולקולרית של ANS לאתר כריכת הנוקלאוטידים של התחום Ca2+-ATPase N. עגינה מולקולרית ANS בוצעה באמצעות תוכנת AutoDock Vina (http://vina.scripps.edu/) ודגם תלת-ממדי שנוצר של N-domain40. ה- N-domain המהונדס מכיל מוטציות Trp552Leu ו- Tyr587Trp (מוצג בכחול). שאריות חומצת אמינו היוצרות את אתר כריכת הנוקלאוטידים מיוצגים כדורים ומקלות ומודגשים בכתום. נתון זה שונה באישור של ספרינגר טבע: ספרינגר, כתב העת של פלואורסצנטיות. זכויות יוצרים (2020)34. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: SDS−PAGE של ה- Ca המהונדס רקומביננטי Ca2 +-ATPase N-domain. ה- N-domain היה נתון לטיהור זיקה באמצעות עמודה כרומטוגרפית. שברים התואמים לספיגה (ב λ = 280 ננומטר) פסגות היו נתונים SDS−PAGE ודמיינו על ידי כתמים כחולים קומאסי. ~ 30 kDa שלו מתויג N-דומיין נוצר על ידי 27 kDa של N-תחום Ca2 +-ATPase ו 3 kDa של תג פולי-שלו. טוהר התחום Ca2+-ATPase N נקבע ≥95% על ידי צפיפות באמצעות תוכנת ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/download.html). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: שינוי כימי בתיווך NBS של שאריות Trp בתחום N מפריך FRET בין Trp ל- ANS הקשור לאתר כריכת הנוקלאוטיד. א. תבנית FRET של מתחם התחום ANS-N-עם עירור ב λ = 295 ננומטר. ANS נוסף (ריכוז סופי ב- μM: ספקטרה א', 0; b, 0.2; ג, 0.4; ד, 0.6; e, 0.8; f, 1.0; g, 1.2; ו- h, 1.4) לתחום N המושעה (1 מיקרומטר). ב. מרווה פלואורסצנטיות של N-domain על ידי NBS (ריכוז NBS ב- μM: a, 0; b, 1; c, 2; d, 3; e, 4; ו- f, 6). NBS מתווך שינוי כימי של שאריות Trp. פלואורסצנטיות מהותית N-תחום נצפתה על עירור ב λ = 295 ננומטר. ג. ספקטרום פלואורסצנטיות של ANS כי הוא מחויב N-תחום שונה כימית על עירור ב λ = 295 ננומטר. התנאים הניסיוניים הם כמו A. איורים א', ב' ו-ג' שונו באישור ספרינגר טבע: ספרינגר, כתב העת לפלורסצנטיות. זכויות יוצרים (2020)34. ד. ספקטרום פלואורסצנטיות של ANS כי הוא מחויב N-תחום שונה כימית על עירור ב λ = 370 ננומטר. N-הדומיין הושעה 1 מ"ל של 50 mM חוצץ פוספט (pH 8.0) ו aliquots של NBS, ו ANS נוספה בהתאם, כמתואר A (ANS) ו- B (NBS). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ספקטרום פלואורסצנטי ANS. ANS (1.4 מיקרומטר) ב 50 mM חוצץ פוספט עם pH 8.0 היה נרגש ב λ של 295 ו 370 ננומטר; הספקטרום מוצג בשחור וכחול, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ספקטרום פלואורסצנטיות של קומפלקס ה- ANS-N-domain מציג תבנית דמוית FRET כאשר נרגשים במהירות של 295 ננומטר, בעוד שהמרחק המולקולרי (20 Å) בין שאריות הטרפ ל- ANS נראה תומך בהתרחשות של FRET (איור 1). שינוי כימי Trp על ידי NBS תוצאות פחות פלואורסצנטי N-תחום (איור 3B, ספקטרום f); לפיכך, העברת אנרגיה אינה אפשרית. ספקטרום הפלואורסצנטיות של ANS דומה לזה של N-דומיין לא משתנה כאשר נרגשים ב- λ של 295 ננומטר(איור 3A ו- C).

לכן, עירור ישיר של ANS ב λ של 295 ננומטר הוא המקור העיקרי של פלואורסצנטיות ANS כאשר הוא מחויב לאתר מחייב ATP (איור 3C),אשר עולה בקנה אחד עם המנגנון שהוצע על ידי מחברים אחרים28. לכן, FRET משאריות Trp ל- ANS מאוגד אינו מתרחש במתחם N-domain-ANS. עם זאת, שינוי כימי בתיווך NBS של שאריות Trp בחלבונים אחרים תומך FRET בין Trp ו- ANS, למשל, באנזימים קסילוז רדוקטאז מ Neurospora crassa49, α-subunit של F1-ATPase מן המיטוכונדריה שמרים58, ותרמוליסין59.

ההסתערות תבוצע היטב בחלבונים/אנזימים עם כיסים הידרופוביים (אתרי כריכה) המכילים שאריות שלו וארג, שכן אלה תורמים לייצוב האינטראקציה עם ANS. בנוסף, חלבונים כאלה צריכים להכיל באופן אידיאלי שאריות Trp יחיד הממוקם על פני השטח של החלבון, כלומר, נגיש לתגובה מהירה עם NBS40,41,49.

לחלופין, כדי לנתח את זוג Trp-ANS FRET בחלבונים, שינוי כימי של שאריות שלו על ידי אצטילציה ותמצית עשוי לשמש כדי לעכב את אינטראקציית ANS באתר כריכת חלבון /אנזים 60. מחיקת שאריות Trp על ידי מוטציה היא אסטרטגיה נוספת לניתוח FRET. עם זאת, זה עשוי להיות זמן רב, ואת המבנים עשויים להפגין הבדלים מבניים, ובכך להשפיע על מחייב ליגנד61. באופן דומה, מוטציה של ארג ושאריות שלו באתר מחייב ליגנד עשוי ליצור שינויים מבניים בלתי צפויים, ובכך להפוך את החלבון המוטציה לא מתאים לניסויים62.

לגבי שאריות Trp, הביצועים של בדיקת השינוי הכימי NBS יהיה מוגבל במקרים הבאים: 1) אם שאריות Trp קבור עמוק בליבה של חלבון מקופל היטב וקומפקטי; מאז moiety NBS לא יוכל לגשת שאריות Trp בשל היעדר חללים גדולים41,48,63, 2) אם שאריות Trp ממוקם במבנים מוטבעים קרום (transmembrane α סליל), כמו האופי מימי של NBS ימנע ממנו להיכנס למדיום הידרופובי32,56,64, 3) אם מבנה החלבון מכיל שאריות TRP מרובות; כמו וריאציות הנגישות והסביבה הפיזיקוכימית עשוי להיות גדול, ובכך קשה להקנות את המשימה של שינוי אות פלואורסצנטי לשאריות Trp32,41,56, 4) אם ANS מחייב חלבונים נובע בעיקר אינטראקציה הידרופובית, כמו עליית פלואורסצנטי ANS נובע בעיקר אינטראקציות אלקטרוסטטיות32,65,66,67, ו- e) אם סטטי מרווה של Trp מתרחשת, למשל, בנוכחות חמצן68.

NBS תיווך שינוי כימי של שאריות Trp נראה בדיקה מהירה וקלה לחקר FRET בין Trp ו ANS כי הוא קשור חלבונים / אנזימים. ריאגנטים אחרים לשינוי Trp עשויים לשמש במקום NBS, למשל, הידרוקסי-5-ניטרבנזיל ברומיד (HNB)69,70. לבסוף, ההסרה עשויה להיות ישימה לגילוי זוגות FRET מוצעים של Trp עם פלורופורים אחרים21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה חלקית על ידי FAI-UASLP grant number C19-FAI-05-89.89 and CONACYT grant number 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021). המחברים מודים לסיוע הטכני של ג'וליאן א. מאטה-מוראלס במהדורת וידאו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylamide Bio-Rad 1610107 SDS-PAGE
Ammonium persulfate Bio-Rad 1610700 SDS-PAGE
8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid Sigma-Aldrich A1028 Fluorophore
Bis-acrylamide Bio-Rad 1610125 SDS-PAGE
N-Bromosuccinimide Sigma-Aldrich B81255 Chemical modification
N,N-dimethylformamide J.T. Baker 9213-12 Stock solution preparation
Fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich F7250 Chemical fluorescence label
Fluorescence cuvette Hellma Z801291 Fluorescence assay
Fluorescence Spectrofluorometer Shimadzu RF 5301PC Fluorescence assay
HisTrap™ FF GE Healtcare 11-0004-59 Protein purification
IPTG, Dioxane free American Bionalytical AB00841-00010 Protein expression
Imidazole Sigma-Aldrich I5513-25G Protein purification
LB media Fisher Scientific 10000713 Cell culture
Pipetman L P10L Gilson FA10002M Fluorescence assay
Pipetman L P100L Gilson FA10004M Fluorescence assay
Pipetman L P200L Gilson FA10005M Fluorescence assay
Pipetman L P1000L Gilson FA10006M Fluorescence assay
Pipetman L P5000L Gilson FA10007 Fluorescence assay
Precision plus std Bio-Rad 1610374 SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphate Bio-Rad 1610302 SDS-PAGE
Sodium phosphate dibasic J.T. Baker 3828-19 Buffer preparation
Sodium phosphate monobasic J.T. Baker 3818-01 Buffer preparation
Syringe filter 0.2 um Millipore GVWP04700 Solution filtration
Temed Bio-Rad 1610801 SDS-PAGE
Tris Bio-Rad 1610719 SDS-PAGE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munishkina, L. A., Fink, A. L. Fluorescence as a method to reveal structures and membrane-interactions of amyloidogenic proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1768 (8), 1862-1885 (2007).
  2. Dong, X., Thomas, D. D. Time-resolved FRET reveals the structural mechanism of SERCA-PLB regulation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 449 (2), 196-201 (2014).
  3. Szilvay, G. R., Blenner, M. A., Shur, O., Cropek, D. M., Banta, S. A FRET-based method for probing the conformational behavior of an intrinsically disordered repeat domain from Bordetella pertussis adenylate cyclase. Biochemistry. 48 (47), 11273-11282 (2009).
  4. Sun, Y., Wallrabe, H., Booker, C. F., Day, R. N., Periasamy, A. Three-color spectral FRET microscopy localizes three interacting proteins in living cells. Biophysical Journal. 99 (4), 1274-1283 (2010).
  5. Cornea, R. L., et al. High-throughput FRET assay yields allosteric SERCA activators. Journal of Biomolecular Screening. 18 (1), 97-107 (2013).
  6. Gruber, S. J., et al. Discovery of enzyme modulators via high-throughput time-resolved FRET in living cells. Journal of Biomolecular Screening. 19 (2), 215-222 (2014).
  7. Dyla, M., et al. Dynamics of P-type ATPase transport revealed by single-molecule FRET. Nature. 551 (7680), 346-351 (2017).
  8. Corradi, G. R., Adamo, H. P. Intramolecular fluorescence resonance energy transfer between fused autofluorescent proteins reveals rearrangements of the N- and C-terminal segments of the plasma membrane Ca2+ pump involved in the activation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (49), 35440-35448 (2007).
  9. Piston, D. W., Kremers, G. -J. Fluorescent protein FRET: The good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
  10. Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
  11. Chen, Y., Barkley, M. D. Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins. Biochemistry. 37 (28), 9976-9982 (1998).
  12. Zelent, B., et al. Tryptophan fluorescence yields and lifetimes as a probe of conformational changes in human glucokinase. Journal of Fluorescence. 27 (5), 1621-1631 (2017).
  13. Callis, P. R. Binding phenomena and fluorescence quenching. I: Descriptive quantum principles of fluorescence quenching using a supermolecule approach. Journal of Molecular Structure. 1077, 14-21 (2014).
  14. Callis, P. R. Binding phenomena and fluorescence quenching. II: Photophysics of aromatic residues and dependence of fluorescence spectra on protein conformation. Journal of Molecular Structure. 1077, 22-29 (2014).
  15. Agarwal, P. K., Geist, A., Gorin, A. Protein dynamics and enzymatic catalysis: Investigating the peptidyl-prolyl cis-trans isomerization activity of cyclophilin A. Biochemistry. 43 (33), 10605-10618 (2004).
  16. Deng, H., Zhadin, N., Callender, R. Dynamics of protein ligand binding on multiple time scales: NADH binding to lactate dehydrogenase. Biochemistry. 40 (13), 3767-3773 (2001).
  17. van de Weert, M. Fluorescence quenching to study protein-ligand binding: common errors. Journal of fluorescence. 20 (2), 625-629 (2010).
  18. van de Weert, M., Stella, L. Fluorescence quenching and ligand binding: A critical discussion of a popular methodology. Journal of Molecular Structure. 998 (1-3), 144-150 (2011).
  19. Stella, L., van de Weert, M., Burrows, H. D., Fausto, R. Fluorescence spectroscopy and binding: Getting it right. Journal of Molecular Structure. 1077, 1-3 (2014).
  20. Credi, A., Prodi, L. Inner filter effects and other traps in quantitative spectrofluorimetric measurements: Origins and methods of correction. Journal of Molecular Structure. 1077, 30-39 (2014).
  21. Lee, M. M., Peterson, B. R. Quantification of small molecule-protein interactions using FRET between tryptophan and the pacific blue fluorophore. ACS Omega. 1 (6), 1266-1276 (2016).
  22. Zhang, Y., et al. Comparison of FÖrster-resonance-energy-transfer acceptors for tryptophan and tyrosine residues in native proteins as donors. Journal of Fluorescence. 23 (1), 147-157 (2013).
  23. Xie, Y., Maxson, T., Tor, Y. Fluorescent ribonucleoside as a FRET acceptor for tryptophan in native proteins. Journal of the American Chemical Society. 132 (34), 11896-11897 (2010).
  24. Ghisaidoobe, A. B. T. T., Chung, S. J. Intrinsic tryptophan fluorescence in the detection and analysis of proteins: A focus on Förster resonance energy transfer techniques. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 22518-22538 (2014).
  25. Goryashchenko, A. S., et al. Genetically encoded FRET-sensor based on terbium chelate and red fluorescent protein for detection of caspase-3 activity. International Journal of Molecular Sciences. 16 (7), 16642-16654 (2015).
  26. Arslanbaeva, L. R., et al. Induction-resonance energy transfer between the terbium-binding peptide and the red fluorescent proteins DsRed2 and TagRFP. Biophysics. 56 (3), 381-386 (2011).
  27. Di Gennaro, A. K., Gurevich, L., Skovsen, E., Overgaard, M. T., Fojan, P. Study of the tryptophan-terbium FRET pair coupled to silver nanoprisms for biosensing applications. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (22), 8838-8844 (2013).
  28. Hawe, A., Poole, R., Jiskoot, W. Misconceptions over Förster resonance energy transfer between proteins and ANS/bis-ANS: Direct excitation dominates dye fluorescence. Analytical Biochemistry. 401 (1), 99-106 (2010).
  29. Ghosh, U., Das, M., Dasgupta, D. Association of fluorescent probes 1-anilinonaphthalene-8-sulfonate and 4,4´-dianilino-1,1´-binaphthyl-5,5´-disulfonic acid with T7 RNA polymerase. Biopolymers. 72 (4), 249-255 (2003).
  30. Vreuls, C., et al. Guanidinium chloride denaturation of the dimeric Bacillus licheniformis BlaI repressor highlights an independent domain unfolding pathway. The Biochemical Journal. 384, 179-190 (2004).
  31. Möller, M., Denicola, A. Study of protein-ligand binding by fluorescence. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (5), 309-312 (2002).
  32. Chang, L., Wen, E., Hung, J., Chang, C. Energy transfer from tryptophan residues of proteins to 8-anilinonaphthalene-1-sulfonate. Journal of Protein Chemistry. 13 (7), 635-640 (1994).
  33. Togashi, D. M., Ryder, A. G. A fluorescence analysis of ANS bound to bovine serum albumin: Binding properties revisited by using energy transfer. Journal of Fluorescence. 18 (2), 519-526 (2008).
  34. Dela Cruz-Torres, V., Cataño, Y., Olivo-Rodríguez, M., Sampedro, J. G. ANS interacts with the Ca2+-ATPase nucleotide binding site. Journal of Fluorescence. 30 (3), 483-496 (2020).
  35. Gasymov, O. K., Glasgow, B. J. ANS fluorescence: Potential to augment the identification of the external binding sites of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1774 (3), 403-411 (2007).
  36. Matulis, D., Lovrien, R. 1-anilino-8-naphthalene sulfonate anion-protein binding depends primarily on ion pair formation. Biophysical Journal. 74 (1), 422-429 (1998).
  37. Samukange, V., Yasukawa, K., Inouye, K. Interaction of 8-anilinonaphthalene 1-sulphonate (ANS) and human matrix metalloproteinase 7 (MMP-7) as examined by MMP-7 activity and ANS fluorescence. Journal of Biochemistry. 151 (5), 533-540 (2012).
  38. Qin, J., et al. Selective and sensitive homogenous assay of serum albumin with 1-anilinonaphthalene-8-sulphonate as a biosensor. Analytica Chimica Acta. 829, 60-67 (2014).
  39. Malik, A., Kundu, J., Karmakar, S., Lai, S., Chowdhury, P. K. Interaction of ANS with human serum albumin under confinement: Important insights and relevance. Journal of Luminescence. 167, 316-326 (2015).
  40. Páez-Pérez, E. D., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. G. Nucleotide binding in an engineered recombinant Ca2+-ATPase N-domain. Biochemistry. 55 (49), 6751-6765 (2016).
  41. Sampedro, J. G., Nájera, H., Uribe-Carvajal, S., Ruiz-Granados, Y. G. Mapping the ATP binding site in the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Journal of fluorescence. 24 (6), 1849-1859 (2014).
  42. Abu-Abed, M., Millet, O., MacLennan, D. H., Ikura, M. Probing nucleotide-binding effects on backbone dynamics and folding of the nucleotide-binding domain of the sarcoplasmic/endoplasmic-reticulum Ca2+-ATPase. The Biochemical Journal. 379, Pt 2 235-242 (2004).
  43. Abu-Abed, M., Mal, T. K., Kainosho, M., MacLennan, D. H., Ikura, M. Characterization of the ATP-binding domain of the sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase: probing nucleotide binding by multidimensional NMR. Biochemistry. 41 (4), 1156-1164 (2002).
  44. Sazinsky, M. H., Mandal, A. K., Argüello, J. M., Rosenzweig, A. C. Structure of the ATP binding domain from the Archaeoglobus fulgidus Cu+-ATPase. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11161-11166 (2006).
  45. Liu, L., et al. Crystallization and preliminary X-ray studies of the N-domain of the Wilson disease associated protein. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 65 (6), 621-624 (2009).
  46. Banci, L., et al. The binding mode of ATP revealed by the solution structure of the N-domain of human ATP7A. Journal of Biological Chemistry. 285 (4), 2537-2544 (2010).
  47. Spande, T. F., Witkop, B. Determination of the tryptophan content of proteins with N-bromosuccinimide. Methods in Enzymology. 11, 498-506 (1967).
  48. Spande, T. F., Green, N. M., Witkop, B. The Reactivity toward N-bromosuccinimide of tryptophan in enzymes, zymogens, and inhibited enzymes. Biochemistry. 5 (6), 1926-1933 (1966).
  49. Rawat, U. B., Rao, M. B. Purification, kinetic characterization and involvement of tryptophan residue at the NADPH binding site of xylose reductase from Neurospora crassa. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1293 (2), 222-230 (1996).
  50. Zaki, M. J., Bystroff, C. Protein Structure Prediction. , Humana Press. Totowa, NJ. (2008).
  51. Wang, Z., et al. Comprehensive evaluation of ten docking programs on a diverse set of protein-ligand complexes: The prediction accuracy of sampling power and scoring power. Physical Chemistry Chemical Physics. 18 (18), 12964-12975 (2016).
  52. Pagadala, N. S., Syed, K., Tuszynski, J. Software for molecular docking: A review. Biophysical Reviews. , 91-102 (2017).
  53. Dolatkhah, Z., Javanshir, S., Sadr, A. S., Hosseini, J., Sardari, S. Synthesis, Molecular Docking, Molecular Dynamics Studies, and Biological Evaluation of 4 H -Chromone-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylate Derivatives as Potential Antileukemic Agents. Journal of Chemical Information and Modeling. 57 (6), 1246-1257 (2017).
  54. Forli, S., et al. Computational protein-ligand docking and virtual drug screening with the AutoDock suite. Nature Protocols. 11 (5), 905-919 (2016).
  55. Lindahl, E. R. Molecular dynamics simulations. Molecular Modeling of Proteins. Methods in Molecular Biology. 443, 3-23 (2008).
  56. Turk, T., Maček, P., Gubenšek, F. The role of tryptophan in structural and functional properties of equinatoxin II. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Protein Structure and Molecular. 1119 (1), 1-4 (1992).
  57. Peterman, B. F., Laidler, K. J. Study of reactivity of tryptophan residues in serum albumins and lysozyme by N-bromosuccinamide fluorescence quenching. Archives of Biochemistry and Biophysics. 199 (1), 158-164 (1980).
  58. Divita, G., Goody, R. S., Gautheron, D. C., Di Pietro, A. Structural mapping of catalytic site with respect to α-subunit and noncatalytic site in yeast mitochondrial F1-ATPase using fluorescence resonance energy transfer. Journal of Biological Chemistry. 268 (18), 13178-13186 (1993).
  59. Horrocks, W. D., Holmquist, B., Vallee, B. L. Energy transfer between terbium (III) and cobalt (II) in thermolysin: a new class of metal-metal distance probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 4764-4768 (1975).
  60. Chakraborty, J., Das, N., Halder, U. C. Unfolding diminishes fluorescence resonance energy transfer (FRET) of lysine modified β-lactoglobulin: Relevance towards anti-HIV binding. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 102 (1), 1-10 (2011).
  61. Sirangelo, I., Malmo, C., Casillo, M., Irace, G. Resolution of Tryptophan-ANS Fluorescence Energy Transfer in Apomyoglobin by Site-directed Mutagenesis. Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 381-384 (2007).
  62. Ribeiro, A. J. M., Tyzack, J. D., Borkakoti, N., Holliday, G. L., Thornton, J. M. A global analysis of function and conservation of catalytic residues in enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 314-324 (2020).
  63. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Exposure of tryptophanyl residues in proteins. Quantitative determination by fluorescence quenching studies. Biochemistry. 15 (3), 672-680 (1976).
  64. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Fluorescence quenching of indole and model micelle systems. The Journal of Physical Chemistry. 80 (5), 486-493 (1976).
  65. Kinsley, N., Sayed, Y., Mosebi, S., Armstrong, R. N., Dirr, H. W. Characterization of the binding of 8-anilinonaphthalene sulfonate to rat class Mu GST M1-1. Biophysical Chemistry. 137 (2-3), 100-104 (2008).
  66. Mohsenifar, A., et al. A study of the oxidation-induced conformational and functional changes in neuroserpin. Iranian Biomedical Journal. 11 (1), 41-46 (2007).
  67. Gonzalez, W. G., Miksovska, J. Application of ANS fluorescent probes to identify hydrophobic sites on the surface of DREAM. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (9), 1472-1480 (2014).
  68. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Fluorescence quenching studies with proteins. Analytical Biochemistry. 114 (2), 199-227 (1981).
  69. Poulos, T. L., Price, P. A. The identification of a tryptophan residue essential to the catalytic activity of bovine pancreatic deoxyribonuclease. The Journal of biological chemistry. 246 (12), 4041-4045 (1971).
  70. Hu, J. -J., He, P. -Y., Li, Y. -M. Chemical modifications of tryptophan residues in peptides and proteins. Journal of Peptide Science An Official Publication of the European Peptide Society. 27 (1), 3286 (2021).

Tags

ביוכימיה גיליון 176
שינוי כימי של שאריות טריפטופן ב- Ca רקומביננטי<sup>Ca 2 +</sup>-ATPase N-דומיין לחקר טריפטופן-ANS FRET
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sampedro, J. G., Cataño, Y.… More

Sampedro, J. G., Cataño, Y. Chemical Modification of the Tryptophan Residue in a Recombinant Ca2+-ATPase N-domain for Studying Tryptophan-ANS FRET. J. Vis. Exp. (176), e62770, doi:10.3791/62770 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter