Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kemisk modifiering av tryptofanresterna i en rekombinant Ca2+-ATPase N-domän för studier av tryptofan-ANS FRET

Published: October 9, 2021 doi: 10.3791/62770
Automatic Translation
1, 1
1Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

Summary

ANS binder till ca2+-ATPase rekombinant N-domän. Fluorescensspektra visar ett FRET-liknande mönster vid excitation vid en våglängd på 295 nm. NBS-medierad kemisk modifiering av Trp släcker N-domänens fluorescens, vilket leder till avsaknad av energiöverföring (FRET) mellan Trp-resterna och ANS.

Abstract

Sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) är en P-typ ATPase som har kristalliserats i olika konformationer. Detaljerad funktionell information kan dock erhållas från isolerade rekombinanta domäner. Den konstruerade (Trp552Leu och Tyr587Trp) rekombinanta nukleotidbindningsdomänen (N-domän) visar fluorescenssläckande på ligandbindning. En extrinsisk fluorofor, nämligen 8-anilino-1-naftalensulfonat (ANS), binder till nukleotidbindningsstället via elektrostatiska och hydrofobiska interaktioner med resterna Arg, His, Ala, Leu och Phe. ANS-bindning framgår av ökningen av fluorescensintensiteten när den är upphetsad vid en våglängd (λ) på 370 nm. Men när upphetsad på λ av 295 nm, ökningen av fluorescens intensitet verkar vara kopplade till släckning av N-domänen inneboende fluorescens. Fluorescensspektra visar ett Föster resonansenergiöverföringsmönster (FRET)-liknande mönster, vilket tyder på närvaron av ett Trp-ANS FRET-par, som verkar stödjas av det korta avståndet (~ 20 Å) mellan Tyr587Trp och ANS. Denna studie beskriver en analys av Trp-ANS FRET par av Trp kemisk modifiering (och fluorescenssläckande) som förmedlas av N-bromosuccinimide (NBS). I den kemiskt modifierade N-domänen ökade ANS fluorescens när upphetsad på en λ på 295 nm, liknande när upphetsad på en λ på 370 nm. Den NBS-medierade kemiska modifieringen av Trp-resterna kan därför användas för att undersöka frånvaron av fret mellan Trp och ANS. I avsaknad av Trp fluorescens bör man inte observera en ökning av ANS fluorescens. Den kemiska modifieringen av Trp-rester i proteiner från NBS kan vara användbar för att undersöka FRET mellan Trp-rester som ligger nära det bundna ans. Denna analys kommer sannolikt också att vara användbar vid användning av andra fluorforer.

Introduction

Föster resonans energiöverföring (FRET) har blivit en standardteknik för att bestämma avståndet mellan molekylära strukturer efter bindning eller interaktion i proteinstruktur ochfunktionsstudier 1,2,3,4. I ATPases av P-typ har FRET använts för att undersöka strukturen och funktionen hos sarko-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA)2,5,6,7,8 ,t.ex.strukturella fluktuationer under katalytisk cykel har analyserats i hela proteinet av FRET7.

FRET-givare är olika och sträcker sig från små fluorescerande (extrinsiska) molekyler till fluorescerandeproteiner 9,10. Tryptofanrester (Trp) (på grund av deras fluorescens) är användbara för att identifiera strukturella förändringar i proteinaminosyrasekvenser11,12. Trps fluorescensintensitet beror i hög grad på polariteten i dess omgivande miljö13,14. Ligandbindning genererar vanligtvis strukturella omorganiseringar i proteiner /enzymer 15,16. Om Trp förekommer på eller befinner sig nära proteinbindningsstället påverkar strukturella fluktuationer ofta graden av Trp-exponering för vattenhaltiga medier13,14. Således resulterar förändringen i polaritet i släckning av Trp fluorescensintensitet13,14. Därför är Trps fluorescerande egenskap användbar för att utföra ligand bindande studier för enzymer. Andra fysiska fenomen kan också leda till Trp fluorescenssläckande17,18,19,20, t.ex. FRET och förändringar i medelpolaritet. Energiöverföring från Trps upphetsade tillstånd till en fluorfor har också potentiella tillämpningar, t.ex. affinitetsbestämning av små ligands iproteiner 21. Faktum är att Trp främst har använts som fluorescensdonator i FRET-studier påproteiner 22,23,24,t.ex. i terbium (Tb3 +) FRET-studier, en Trp-rest används ofta som en antenn för energiöverföring till Tb3+25,26,27. Trp uppvisar olika fördelar jämfört med andra FRET-givare på grund av dess inneboende konstituerande karaktär i proteinstrukturen, vilket eliminerar behovet av förberedande processer som kan påverka funktionen/strukturen hos det studeradeproteinet 24. Således är identifieringen av radiativa sönderfall (energiöverföring och förändringar i den medelpolaritet som induceras av proteinstrukturiska omorganiseringar) viktig för att dra exakta slutsatser om ligandbindning i proteinstrukturstudier13,14,19,28.

I proteinstrukturstudier har en extrinsisk fluorfor, nämligen 8-anilino-1-naftalensulfonat (ANS), främst använts i experiment relaterade till proteinveckning/utfällning28,29. ANS binder till proteiner/enzymer i infödda tillstånd, vanligtvis i de bindande platserna för substrat31,32,33; en ökning av ANS fluorescens kvantutbyte (ΦF) (nämligen en ökning av fluorescensintensiteten) induceras av spännande proteinet vid λ = 370 nm när lämpliga interaktioner mellan ANS med Arg och hans rester i hydrofobiska fickorförekommer 34,35,36,37. I olika studier har förekomsten av FRET (när det är spännande vid λ inom 280-295 nm) mellan Trp-rester (givare) och ANS (acceptor) rapporterats, vilket baseras på följande: 1) överlappning av fluorescensutsläppsspektrumet av Trp och excitationsspektrum av ANS, 2) identifiering av ett lämpligt avstånd mellan en eller flera Trp-rester och ANS för energiöverföring, 3) hög ANS-kvantutbyte när det är bundet i proteinfickor och 4) karakteristiskt FRET-mönster i proteinspektrat fluorescensspektra i närvaro av ANS3,17,27,37,38.

Nyligen har ligandbindning till nukleotidbindningsdomänen (N-domän) i SERCA och andra ATPas av P-typ undersökts med hjälp av konstruerade rekombinanta N-domäner40,41,42,43,44,45,46. Molekylär teknik för SERCA N-domänen har använts för att flytta de enda Trp-resterna (Trp552Leu) till en mer dynamisk struktur (Tyr587Trp) som ligger nära nukleotidbindningsstället, där fluorescensvariationer (släckning) kan användas för att övervaka strukturella förändringar vidligandbindning 34. Experimentella resultat har visat att ANS binder (som ATP) till nukleotidbindningsstället i det renade rekombinanta SERCA N-domänen34. Intressant nog ökar ANS fluorescens vid bindning till N-domänen vid excitation vid en λ på 295 nm, medan den inneboende fluorescensen hos N-domänen minskar34, vilket producerar ett FRET-mönster som föreslår bildandet av ett Trp-ANS FRET-par.

Användningen av NBS har föreslagits för att bestämma halten av Trp-rester iproteiner 47 genom absorbansanalys av modifierade proteiner. NBS modifierar den mycket absorberande indolgruppen Trp till den mindre absorberande oxindolen47,48. Detta resulterar i förlust (släckning) av Trp fluorescerande egenskap40. Därför kan NBS-medierad kemisk modifiering av Trp-rester användas som en analys för att definiera Trps (som givare) roll när FRET hypoteseras.

Detta protokoll beskriver den kemiska modifieringen av de enda Trp resterna av NBS i den konstruerade rekombinanta N-domänen för SERCA som en proteinmodell. Experimentella resultat visar att ANS fluorescensintensitet fortfarande ökar i den kemiskt NBS-modifierade N-domänen34, som saknar inneboende fluorescens. Därför är analysen användbar för att visa frånvaron av FRET mellan Trp-resterna och ANS när den är bunden till N-domänen34,40,49. Därför är denna analys (NBS kemisk modifiering av Trp) användbar för att bevisa närvaron av Trp-ANS FRET-paret i proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bestämning (i silico) av ANS- och SERCA N-domäninteraktion

  1. Generera en tredimensionell (3D) struktur av proteinet (SERCA N-domän) genom molekylär modellering med hjälp av den föredragna proteinmodelleringsprogramvaran50.
  2. Identifiera de aminosyrarester som utgör nukleotidbindningsstället med hjälp av den föredragnamolekylära strukturprogramvaran 51och bestäm förekomsten av Arg- och Lysrester35; Dessa krävs för ANS-bindning och för att öka fluorescensintensiteten (kvantutbyte).
  3. Utför molekylär dockning (med hjälp av den föredragna dockningsprogramvaran)52,53,54 för att bestämma interaktionerna mellan ATP, fluorescein isothiocyanate (FITC) (som bildar en kovalentbindningsställe med Lys515 som märker nukleotidbindningsstället) och ANS med aminosyror rester i nukleotidbindningsstället ( figur1).
  4. Beräkna det molekylära avståndet (Å) mellan Trp rester och bundet ANS med hjälp av mätverktyget i den föredragna programvaran.
  5. Utför molekylär dynamiksimulering av ANS-N-domänkomplex för att bestämma stabiliteten iinteraktionen 52,54. Utför sedan in vitro-experimenten när komplexens stabilitet har bekräftats.

2. Uttryck och rening av den rekombinanta N-domänen

  1. Syntetisera genkodningen för N-domän40.
  2. Designa och konstruera plasmiden som innehåller den syntetiska genen som kodar för N-domänen40.
  3. Uttryck och rena genom affinitetskromatografi (Ni-NTA), den konstruerade rekombinanta N-domänen. Utför en SDS-SIDA av det renade proteinet för att bestämma renheten (figur 2)40.
  4. Bestäm proteinkoncentrationen genom att studera absorbansen vid λ av 280 nm med N-domänens utrotningskoefficient (ε= 11 960 M-1·cm-1)40.

3. Övervaka bildandet av ANS-N-domänkomplexet baserat på FÖRÄNDRINGAR av ANS- och N-domänfluorescensintensitet.

  1. Förbered en ANS-stamlösning i N,N-dimetylformamid.
    1. Väg en liten mängd (1-5 mg) ANS och lös upp den i 1 ml av den slutliga volymen N,N-dimetylformamid, t.ex. 3,2 mg (10,69 mM slutlig koncentration).
    2. Förbered en 100 μM ANS vattenhaltig stamlösning med ANS-lösningen i N,N-dimetylformamid, t.ex.
    3. Blanda lösningarna genom att virvla 3 - 5 gånger i 15 s.
      OBS: Använd endast ANS vattenhaltiga stamlösning i följande experiment. Förbered ans vattenhaltiga lagerlösningen innan experimenten påbörjas.
  2. Förbered NBS-stamlösningen i N,N-dimetylformamid.
    1. Väg en liten mängd (1-5 mg) NBS och lös upp den i 1 ml N,N-dimetylformamid, t.ex. 5,3 mg i 1 ml (29,78 mM slutlig koncentration).
    2. Förbered en 1 mM NBS vattenhaltig stamlösning med NBS-lösningen i N,N-dimetylformamid, t.ex.
    3. Blanda lösningarna genom att virvla 3 - 5 gånger i 15 s.
      OBS: Förbered NBS vattenhaltiga lagerlösning ny innan du påbörjar experimenten.
  3. Titrera N-domänen med ANS och registrera fluorescensspektra genom excitation vid λ=295 nm vid 25 °C.
    1. Få fluorescensspektrumets baslinje.
      1. Placera 1 ml 50 mM fosfatbuffert med pH 8,0 i en 1 mL fluorescenskvarts cuvette.
      2. Placera cellen i den termostaterade cellkammaren (25 °C) på spektrofluorometern och ställ in excitationen λ på 295 nm.
      3. Spela in fluorescensspektrumet (305 - 550 nm).
        OBS: Fluorescensspektrumet hos 50 mM fosfatbufferten med pH 8.0, som fungerar som blindprov, subtraheras från alla erhållna fluorescensspektra.
    2. Få det inneboende fluorescensspektrumet i N-domänen.
      1. Placera 900 μL 50 mM fosfatbuffert med pH 8,0 i en fluorescenskvarts cuvette.
      2. Tillsätt 100 μL N-domän (10 μM) suspension för att erhålla en slutlig koncentration på 1 μM N-domän i en slutlig volym på 1 ml.
      3. Homogenisera försiktigt med en mikropipett 20 gånger för att säkerställa lösningens homogenitet.
        OBS: Proteinet ska renas nyrenad för att erhålla högkvalitativt inneboende fluorescensspektra, t.ex.
      4. Placera cellen i den termostaterade cellkammaren (25 °C) på spektrofluorometern och ställ in excitationen λ på 295 nm.
      5. Registrera N-domänens inneboende fluorescensspektrum (305-550 nm).
    3. Tillsätt ANS och få fluorescensspektrumet genom excitation vid λ=295 nm.
      1. Tillsätt en 2 μL alikvot på 100 μM ANS vattenhaltig stamlösning till den suspenderade N-domänen (1 μM) för att erhålla en slutlig koncentration på 0,2 μM ANS.
      2. Homogenisera försiktigt med en mikropipett 20 gånger för att säkerställa lösningens homogenitet.
      3. Placera cellen i den termostabila cellkammaren (25 °C) på spektrofluorometern och ställ in excitationen λ på 295 nm.
      4. Spela in fluorescensspektrumet (305-550 nm).
      5. Upprepa ANS tillägg och fluorescens spektra inspelning över 1:1 molar relation ANS:N-domän.
      6. Subtrahera det tomma spektrumet från varje spektrum med lämplig programvara.
      7. Rita alla spektra i ett enda diagram.
      8. Bestäm om spektra bildar ett FRET-liknande mönster. ANS-N-domänen fluorescensspektra bildar ett FRET-liknande mönster (figur 3A).

4. N-domän inneboende fluorescens titrering av Trp kemisk modifiering med NBS.

  1. Upprepa steg 3.3.1 och 3.3.2.
  2. Tillsätt en 1 μL alikvot på 1 mM NBS vattenhaltig stamlösning till den upphängda N-domänen (1 μM) för att erhålla en slutlig koncentration på 1 μM NBS.
  3. Homogenisera försiktigt genom att använda en mikropipett 20 gånger för att säkerställa lösningens homogenitet.
  4. Placera cellen i den termostabila cellkammaren (25 °C) på spektrofluorometern och ställ in excitationen λ på 295 nm.
  5. Registrera fluorescensspektrumet (305-550 nm) (Figur 3B).
  6. Upprepa NBS tillägg och fluorescens spektra inspelning tills minimal N-domän inneboende fluorescens släckning observeras40. I N-domänen sker detta vanligtvis vid ett molarförhållande på 5-6 NBS/N-domän40.
    OBS: NBS släcker snabbt (<5 s) N-domänens inneboende fluorescens; en minskning av fluorescensintensiteten observeras. Fortsätt omedelbart till nästa steg, eftersom NBS också kan reagera med andra aminosyrarester47.
  7. Subtrahera det tomma spektrumet från varje spektrum med lämplig programvara.
  8. Rita alla spektra i ett enda diagram (figur 3B).

5. Titrera den NBS-modifierade N-domänen med ANS genom att registrera fluorescensspektra vid 25 °C.

  1. Utför steg 3.3.3 med den NBS-modifierade N-domänen som genererades i steg 4.
  2. Subtrahera det tomma spektrumet från varje spektrum med lämplig programvara.
  3. Rita alla spektra i ett enda diagram (figur 3C).
  4. Det genererade fluorescensspektrat (figur 3C) stöder eller motbevisar förekomsten av FRET, dvs.

6. Bevis på ANS som är bindande för den kemiskt modifierade N-domänen genom excitation vid λ=370 nm.

  1. Utför steg 3.3.3 med den NBS-modifierade N-domänen som genererades i steg 4 men som ändrar excitation λ till 370 nm.
  2. Subtrahera det tomma spektrumet från varje spektrum med lämplig programvara.
  3. Rita alla spektra i ett enda diagram (figur 3D).
  4. Bekräfta ANS-bindning till N-domänen genom att observera ökningen av ANS fluorescensintensitet. ANS-bindning till N-domänen visar en fluorescensökning när den är upphetsad över λ =370 nm (Figur 3D). Som en kontroll erhölls fluorescensspektrumet av ANS (ensam) i 50 mM fosfatbuffert med pH 8,0 spännande vid λ på 295 och 370 nm (Figur 4, visas inte i video).
    OBS: Det stoichiometriska förhållandet mellan NBS:Trp som krävs för kemisk modifiering beror på graden av nedgrävning av Trp-resterna i proteinet under studie46,47,55,56. Därför rekommenderas att bestämma förhållandet NBS:protein/(Trp) molar, i förväg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Molekylär dockning visar bindning av ANS till N-domänens nukleotidbindningsställe via elektrostatiska såväl som hydrofobiska interaktioner (figur 1). Molekylärt avstånd (20 Å) mellan Trpresterna och ANS (bundet till nukleotidbindningsstället) stöder förekomsten av FRET (figur 1). Den konstruerade (konstruerade) rekombinanta N-domänen erhölls med hög renhet genom affinitetskromatografi (figur 2) och var lämplig för fluorescensexperiment. Fluorescensspektra i ANS-N-domänkomplexet visade ett FRET-liknande mönster vid excitation vid λ=295 nm (Figur 3A). Den kemiska modifieringen av Trpresterna genom NBS ledde till att N-domänens inneboende fluorescens släcktes (figur 3B). Inom det kemiskt NBS-modifierade N-området visar försöksresultaten att ANS-fluorescensen ökade vid excitation vid λ=295 nm (figur 3C), liknande den som observerats i det icke-modifierade N-området (figur 3A). Därför ger direkt excitation av ANS vid λ=295 nm mest energi för ANS fluorescens (figur 3C), som tidigareföreslagits 28. ANS-bindning till det kemiskt modifierade N-området framgår av en ökning av dess fluorescens när den är upphetsad över λ =370 nm (figur 3D). Därför uppstår inte FRET mellan Trp-resterna och ANS som är bundna till nukleotidbindningsstället.

Figure 1
Bild 1:Molekylär dockning av ANS till nukleotidbindningsplatsen för N-domänen Ca2+-ATPase. ANS molekylär dockning utfördes med AutoDock Vina programvara (http://vina.scripps.edu/) och en genererad 3D-modell av N-domän40. Den konstruerade N-domänen innehåller mutationerna Trp552Leu och Tyr587Trp (visas i blått). Aminosyrarester som bildar nukleotidbindningsstället representeras som bollar och pinnar och markeras i orange. Denna siffra har ändrats med tillstånd från Springer Nature: Springer, Journal of Fluorescence. Upphovsrätt (2020)34. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Bild 2: SDS−PAGE för den konstruerade rekombinanta Ca2+-ATPase N-domänen. N-domänen utsattes för affinitet rening med hjälp av en kromatografisk kolumn. Fraktioner som motsvarade absorption (vid λ=280 nm) toppar utsattes för SDS−PAGE och visualiserades av Coomassie blå färgning. Den ~30 kDa His-taggade N-domänen bildas av 27 kDa av N-domän Ca2 +-ATPase och 3 kDa poly-His tag. Ca2+-ATPase N-domänrenhet bestämdes vara ≥95% av densitometri med Hjälp av ImageJ-programvaran (https://imagej.nih.gov/ij/download.html). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3:NBS-medierad kemisk modifiering av Trp-resterna i N-domänen motbevisar fret mellan Trp och ANS som är bundet till nukleotidbindningsstället. A. FRET mönster av ANS-N-domän komplexet vid excitation vid λ=295 nm. ANS tillsattes (slutlig koncentration i μM: Spektra a, 0; b, 0,2; c, 0,4; d, 0,6; e, 0,8; f, 1,0; g, 1,2; och h, 1,4) till den suspenderade N-domänen (1 μM). B. Jag är inte så bra på Fluorescenssläckning av N-domänen med NBS (NBS-koncentration i μM: a, 0; b, 1; c, 2; d, 3; e, 4; och f, 6). NBS förmedlar kemisk modifiering av Trp-resterna. N-domän inneboende fluorescens observerades vid excitation vid λ=295 nm. C. Fluorescensspektra av ANS som är bundet till den kemiskt modifierade N-domänen vid excitation vid λ=295 nm. De experimentella förhållandena är som i A. Figurerna A, B och C har modifierats med tillstånd från Springer Nature: Springer, Journal of Fluorescence. Upphovsrätt (2020)34. D. Jag är inte så bra på Fluorescensspektra av ANS som är bundet till den kemiskt modifierade N-domänen vid excitation vid λ=370 nm. N-domänen avbröts i 1 ml 50 mM fosfatbuffert (pH 8, 0) och alikvoter av NBS, och ANS lades till i enlighet därmed, enligt beskrivningen i A (ANS) och B (NBS). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: ANS fluorescensspektra. ANS (1,4 μM) i 50 mM fosfatbuffert med pH 8,0 var upphetsad vid λ på 295 och 370 nm; spektra presenteras i svart respektive blått. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fluorescensspektra i ANS-N-domänkomplexet visar ett FRET-liknande mönster när det är upphetsad på en λ på 295 nm, medan det molekylära avståndet (20 Å) mellan Trp-resterna och ANS verkar stödja förekomsten av FRET (Figur 1). Trp kemisk modifiering av NBS resulterar i en mindre fluorescerande N-domän(figur 3B,Spektrum f); Därför är energiöverföring inte möjlig. ANS fluorescensspektra liknar den för den icke-förmodifierade N-domänen när den är upphetsad över en λ på 295 nm (figur 3A och C).

Därför är direkt excitation av ANS vid en λ på 295 nm den främsta källan till ANS-fluorescens när den är bunden till ATP-bindningsstället (figur 3C), vilket är i överenskommelsen med den mekanism som föreslogs av andra författare28. Därför förekommer inte FRET från Trp-resterna till bundet ANS i N-domän-ANS-komplexet. Icke desto mindre stöder NBS-medierad kemisk modifiering av Trp-rester i andra proteiner FRET mellan Trp och ANS, t.ex. i enzymerna xylose reduktas från Neurospora crassa49, α-underenheten F1-ATPase från jäst mitokondrier58, och termolysin59.

Analysen skulle fungera bra i proteiner/enzymer med hydrofobiska fickor (bindningsställen) som innehåller hans och Arg rester, eftersom dessa bidrar till stabiliseringen av ANS-interaktionen. Dessutom bör sådana proteiner helst innehålla en enda Trp-rest som ligger vid proteinytan, nämligen tillgänglig för snabb reaktion med NBS40,41,49.

Alternativt, för att analysera Trp-ANS FRET-paret i proteiner, kan kemisk modifiering av hans rester genom acetylering och konnylering användas för att hämma ANS-interaktionen i proteinet / enzymbindningsstället60. Borttagning av Trp rester genom mutation är en annan strategi för att analysera FRET. Detta kan dock vara tidskrävande, och konstruktionerna kan uppvisa strukturella skillnader, vilket påverkar ligandbindning61. På samma sätt kan mutationen av Arg och hans rester på ligand-bindande platsen generera oförutsedda strukturella förändringar, vilket gör det muterade proteinet olämpligt för experiment62.

När det gäller Trp-resterna skulle prestandan hos NBS-kemikaliemodifieringsanalysen begränsas i följande fall: 1) om Trp-resterna är djupt begravda i kärnan av ett välvikt och kompakt protein; eftersom NBS-moiety inte skulle kunna komma åt Trp-resterna på grund av frånvaron av storahålrum 41,48,63, 2) om Trp-rester ligger i en membraninbäddad struktur (trans α-helix), eftersom NBS vattenkaraktär kommer att förhindra att det kommer in i det hydrofobamediet 32,56,64, 3) om proteinstrukturen innehåller flera Trp-rester; eftersom variationerna i tillgänglighet och fysikalisk miljö kan vara stora, vilket gör det svårt att tillsätta en fluorescenssignaländring till en Trp-rest32,41,56, 4) om ANS-bindning till proteiner främst beror på hydrofobisk interaktion, eftersom ANS fluorescensökning främst beror på elektrostatiska interaktioner32,65,66,67och e) om statisk släckning av Trp sker, t.ex. i närvaro av syre68.

NBS-medierad kemisk modifiering av Trp-rester verkar vara en snabb och enkel analys för att studera FRET mellan Trp och ANS som är bunden till proteiner/enzymer. Andra Trp-modifierande reagenser får användas i stället för NBS, t.ex. hydroxy-5-nitrobenzylbromid (HNB)69,70. Slutligen kan analysen tillämpas på detektion av föreslagna FRET-par av Trp med andra fluroforer21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades delvis av FAI-UASLP-bidragsnummer C19-FAI-05-89.89 och CONACYT-bidragsnummer 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021). Författarna tackar den tekniska hjälpen av Julian E. Mata-Morales i videoutgåva.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylamide Bio-Rad 1610107 SDS-PAGE
Ammonium persulfate Bio-Rad 1610700 SDS-PAGE
8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid Sigma-Aldrich A1028 Fluorophore
Bis-acrylamide Bio-Rad 1610125 SDS-PAGE
N-Bromosuccinimide Sigma-Aldrich B81255 Chemical modification
N,N-dimethylformamide J.T. Baker 9213-12 Stock solution preparation
Fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich F7250 Chemical fluorescence label
Fluorescence cuvette Hellma Z801291 Fluorescence assay
Fluorescence Spectrofluorometer Shimadzu RF 5301PC Fluorescence assay
HisTrap™ FF GE Healtcare 11-0004-59 Protein purification
IPTG, Dioxane free American Bionalytical AB00841-00010 Protein expression
Imidazole Sigma-Aldrich I5513-25G Protein purification
LB media Fisher Scientific 10000713 Cell culture
Pipetman L P10L Gilson FA10002M Fluorescence assay
Pipetman L P100L Gilson FA10004M Fluorescence assay
Pipetman L P200L Gilson FA10005M Fluorescence assay
Pipetman L P1000L Gilson FA10006M Fluorescence assay
Pipetman L P5000L Gilson FA10007 Fluorescence assay
Precision plus std Bio-Rad 1610374 SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphate Bio-Rad 1610302 SDS-PAGE
Sodium phosphate dibasic J.T. Baker 3828-19 Buffer preparation
Sodium phosphate monobasic J.T. Baker 3818-01 Buffer preparation
Syringe filter 0.2 um Millipore GVWP04700 Solution filtration
Temed Bio-Rad 1610801 SDS-PAGE
Tris Bio-Rad 1610719 SDS-PAGE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munishkina, L. A., Fink, A. L. Fluorescence as a method to reveal structures and membrane-interactions of amyloidogenic proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1768 (8), 1862-1885 (2007).
  2. Dong, X., Thomas, D. D. Time-resolved FRET reveals the structural mechanism of SERCA-PLB regulation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 449 (2), 196-201 (2014).
  3. Szilvay, G. R., Blenner, M. A., Shur, O., Cropek, D. M., Banta, S. A FRET-based method for probing the conformational behavior of an intrinsically disordered repeat domain from Bordetella pertussis adenylate cyclase. Biochemistry. 48 (47), 11273-11282 (2009).
  4. Sun, Y., Wallrabe, H., Booker, C. F., Day, R. N., Periasamy, A. Three-color spectral FRET microscopy localizes three interacting proteins in living cells. Biophysical Journal. 99 (4), 1274-1283 (2010).
  5. Cornea, R. L., et al. High-throughput FRET assay yields allosteric SERCA activators. Journal of Biomolecular Screening. 18 (1), 97-107 (2013).
  6. Gruber, S. J., et al. Discovery of enzyme modulators via high-throughput time-resolved FRET in living cells. Journal of Biomolecular Screening. 19 (2), 215-222 (2014).
  7. Dyla, M., et al. Dynamics of P-type ATPase transport revealed by single-molecule FRET. Nature. 551 (7680), 346-351 (2017).
  8. Corradi, G. R., Adamo, H. P. Intramolecular fluorescence resonance energy transfer between fused autofluorescent proteins reveals rearrangements of the N- and C-terminal segments of the plasma membrane Ca2+ pump involved in the activation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (49), 35440-35448 (2007).
  9. Piston, D. W., Kremers, G. -J. Fluorescent protein FRET: The good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
  10. Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
  11. Chen, Y., Barkley, M. D. Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins. Biochemistry. 37 (28), 9976-9982 (1998).
  12. Zelent, B., et al. Tryptophan fluorescence yields and lifetimes as a probe of conformational changes in human glucokinase. Journal of Fluorescence. 27 (5), 1621-1631 (2017).
  13. Callis, P. R. Binding phenomena and fluorescence quenching. I: Descriptive quantum principles of fluorescence quenching using a supermolecule approach. Journal of Molecular Structure. 1077, 14-21 (2014).
  14. Callis, P. R. Binding phenomena and fluorescence quenching. II: Photophysics of aromatic residues and dependence of fluorescence spectra on protein conformation. Journal of Molecular Structure. 1077, 22-29 (2014).
  15. Agarwal, P. K., Geist, A., Gorin, A. Protein dynamics and enzymatic catalysis: Investigating the peptidyl-prolyl cis-trans isomerization activity of cyclophilin A. Biochemistry. 43 (33), 10605-10618 (2004).
  16. Deng, H., Zhadin, N., Callender, R. Dynamics of protein ligand binding on multiple time scales: NADH binding to lactate dehydrogenase. Biochemistry. 40 (13), 3767-3773 (2001).
  17. van de Weert, M. Fluorescence quenching to study protein-ligand binding: common errors. Journal of fluorescence. 20 (2), 625-629 (2010).
  18. van de Weert, M., Stella, L. Fluorescence quenching and ligand binding: A critical discussion of a popular methodology. Journal of Molecular Structure. 998 (1-3), 144-150 (2011).
  19. Stella, L., van de Weert, M., Burrows, H. D., Fausto, R. Fluorescence spectroscopy and binding: Getting it right. Journal of Molecular Structure. 1077, 1-3 (2014).
  20. Credi, A., Prodi, L. Inner filter effects and other traps in quantitative spectrofluorimetric measurements: Origins and methods of correction. Journal of Molecular Structure. 1077, 30-39 (2014).
  21. Lee, M. M., Peterson, B. R. Quantification of small molecule-protein interactions using FRET between tryptophan and the pacific blue fluorophore. ACS Omega. 1 (6), 1266-1276 (2016).
  22. Zhang, Y., et al. Comparison of FÖrster-resonance-energy-transfer acceptors for tryptophan and tyrosine residues in native proteins as donors. Journal of Fluorescence. 23 (1), 147-157 (2013).
  23. Xie, Y., Maxson, T., Tor, Y. Fluorescent ribonucleoside as a FRET acceptor for tryptophan in native proteins. Journal of the American Chemical Society. 132 (34), 11896-11897 (2010).
  24. Ghisaidoobe, A. B. T. T., Chung, S. J. Intrinsic tryptophan fluorescence in the detection and analysis of proteins: A focus on Förster resonance energy transfer techniques. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 22518-22538 (2014).
  25. Goryashchenko, A. S., et al. Genetically encoded FRET-sensor based on terbium chelate and red fluorescent protein for detection of caspase-3 activity. International Journal of Molecular Sciences. 16 (7), 16642-16654 (2015).
  26. Arslanbaeva, L. R., et al. Induction-resonance energy transfer between the terbium-binding peptide and the red fluorescent proteins DsRed2 and TagRFP. Biophysics. 56 (3), 381-386 (2011).
  27. Di Gennaro, A. K., Gurevich, L., Skovsen, E., Overgaard, M. T., Fojan, P. Study of the tryptophan-terbium FRET pair coupled to silver nanoprisms for biosensing applications. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (22), 8838-8844 (2013).
  28. Hawe, A., Poole, R., Jiskoot, W. Misconceptions over Förster resonance energy transfer between proteins and ANS/bis-ANS: Direct excitation dominates dye fluorescence. Analytical Biochemistry. 401 (1), 99-106 (2010).
  29. Ghosh, U., Das, M., Dasgupta, D. Association of fluorescent probes 1-anilinonaphthalene-8-sulfonate and 4,4´-dianilino-1,1´-binaphthyl-5,5´-disulfonic acid with T7 RNA polymerase. Biopolymers. 72 (4), 249-255 (2003).
  30. Vreuls, C., et al. Guanidinium chloride denaturation of the dimeric Bacillus licheniformis BlaI repressor highlights an independent domain unfolding pathway. The Biochemical Journal. 384, 179-190 (2004).
  31. Möller, M., Denicola, A. Study of protein-ligand binding by fluorescence. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (5), 309-312 (2002).
  32. Chang, L., Wen, E., Hung, J., Chang, C. Energy transfer from tryptophan residues of proteins to 8-anilinonaphthalene-1-sulfonate. Journal of Protein Chemistry. 13 (7), 635-640 (1994).
  33. Togashi, D. M., Ryder, A. G. A fluorescence analysis of ANS bound to bovine serum albumin: Binding properties revisited by using energy transfer. Journal of Fluorescence. 18 (2), 519-526 (2008).
  34. Dela Cruz-Torres, V., Cataño, Y., Olivo-Rodríguez, M., Sampedro, J. G. ANS interacts with the Ca2+-ATPase nucleotide binding site. Journal of Fluorescence. 30 (3), 483-496 (2020).
  35. Gasymov, O. K., Glasgow, B. J. ANS fluorescence: Potential to augment the identification of the external binding sites of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1774 (3), 403-411 (2007).
  36. Matulis, D., Lovrien, R. 1-anilino-8-naphthalene sulfonate anion-protein binding depends primarily on ion pair formation. Biophysical Journal. 74 (1), 422-429 (1998).
  37. Samukange, V., Yasukawa, K., Inouye, K. Interaction of 8-anilinonaphthalene 1-sulphonate (ANS) and human matrix metalloproteinase 7 (MMP-7) as examined by MMP-7 activity and ANS fluorescence. Journal of Biochemistry. 151 (5), 533-540 (2012).
  38. Qin, J., et al. Selective and sensitive homogenous assay of serum albumin with 1-anilinonaphthalene-8-sulphonate as a biosensor. Analytica Chimica Acta. 829, 60-67 (2014).
  39. Malik, A., Kundu, J., Karmakar, S., Lai, S., Chowdhury, P. K. Interaction of ANS with human serum albumin under confinement: Important insights and relevance. Journal of Luminescence. 167, 316-326 (2015).
  40. Páez-Pérez, E. D., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. G. Nucleotide binding in an engineered recombinant Ca2+-ATPase N-domain. Biochemistry. 55 (49), 6751-6765 (2016).
  41. Sampedro, J. G., Nájera, H., Uribe-Carvajal, S., Ruiz-Granados, Y. G. Mapping the ATP binding site in the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Journal of fluorescence. 24 (6), 1849-1859 (2014).
  42. Abu-Abed, M., Millet, O., MacLennan, D. H., Ikura, M. Probing nucleotide-binding effects on backbone dynamics and folding of the nucleotide-binding domain of the sarcoplasmic/endoplasmic-reticulum Ca2+-ATPase. The Biochemical Journal. 379, Pt 2 235-242 (2004).
  43. Abu-Abed, M., Mal, T. K., Kainosho, M., MacLennan, D. H., Ikura, M. Characterization of the ATP-binding domain of the sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase: probing nucleotide binding by multidimensional NMR. Biochemistry. 41 (4), 1156-1164 (2002).
  44. Sazinsky, M. H., Mandal, A. K., Argüello, J. M., Rosenzweig, A. C. Structure of the ATP binding domain from the Archaeoglobus fulgidus Cu+-ATPase. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11161-11166 (2006).
  45. Liu, L., et al. Crystallization and preliminary X-ray studies of the N-domain of the Wilson disease associated protein. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 65 (6), 621-624 (2009).
  46. Banci, L., et al. The binding mode of ATP revealed by the solution structure of the N-domain of human ATP7A. Journal of Biological Chemistry. 285 (4), 2537-2544 (2010).
  47. Spande, T. F., Witkop, B. Determination of the tryptophan content of proteins with N-bromosuccinimide. Methods in Enzymology. 11, 498-506 (1967).
  48. Spande, T. F., Green, N. M., Witkop, B. The Reactivity toward N-bromosuccinimide of tryptophan in enzymes, zymogens, and inhibited enzymes. Biochemistry. 5 (6), 1926-1933 (1966).
  49. Rawat, U. B., Rao, M. B. Purification, kinetic characterization and involvement of tryptophan residue at the NADPH binding site of xylose reductase from Neurospora crassa. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1293 (2), 222-230 (1996).
  50. Zaki, M. J., Bystroff, C. Protein Structure Prediction. , Humana Press. Totowa, NJ. (2008).
  51. Wang, Z., et al. Comprehensive evaluation of ten docking programs on a diverse set of protein-ligand complexes: The prediction accuracy of sampling power and scoring power. Physical Chemistry Chemical Physics. 18 (18), 12964-12975 (2016).
  52. Pagadala, N. S., Syed, K., Tuszynski, J. Software for molecular docking: A review. Biophysical Reviews. , 91-102 (2017).
  53. Dolatkhah, Z., Javanshir, S., Sadr, A. S., Hosseini, J., Sardari, S. Synthesis, Molecular Docking, Molecular Dynamics Studies, and Biological Evaluation of 4 H -Chromone-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylate Derivatives as Potential Antileukemic Agents. Journal of Chemical Information and Modeling. 57 (6), 1246-1257 (2017).
  54. Forli, S., et al. Computational protein-ligand docking and virtual drug screening with the AutoDock suite. Nature Protocols. 11 (5), 905-919 (2016).
  55. Lindahl, E. R. Molecular dynamics simulations. Molecular Modeling of Proteins. Methods in Molecular Biology. 443, 3-23 (2008).
  56. Turk, T., Maček, P., Gubenšek, F. The role of tryptophan in structural and functional properties of equinatoxin II. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Protein Structure and Molecular. 1119 (1), 1-4 (1992).
  57. Peterman, B. F., Laidler, K. J. Study of reactivity of tryptophan residues in serum albumins and lysozyme by N-bromosuccinamide fluorescence quenching. Archives of Biochemistry and Biophysics. 199 (1), 158-164 (1980).
  58. Divita, G., Goody, R. S., Gautheron, D. C., Di Pietro, A. Structural mapping of catalytic site with respect to α-subunit and noncatalytic site in yeast mitochondrial F1-ATPase using fluorescence resonance energy transfer. Journal of Biological Chemistry. 268 (18), 13178-13186 (1993).
  59. Horrocks, W. D., Holmquist, B., Vallee, B. L. Energy transfer between terbium (III) and cobalt (II) in thermolysin: a new class of metal-metal distance probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 4764-4768 (1975).
  60. Chakraborty, J., Das, N., Halder, U. C. Unfolding diminishes fluorescence resonance energy transfer (FRET) of lysine modified β-lactoglobulin: Relevance towards anti-HIV binding. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 102 (1), 1-10 (2011).
  61. Sirangelo, I., Malmo, C., Casillo, M., Irace, G. Resolution of Tryptophan-ANS Fluorescence Energy Transfer in Apomyoglobin by Site-directed Mutagenesis. Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 381-384 (2007).
  62. Ribeiro, A. J. M., Tyzack, J. D., Borkakoti, N., Holliday, G. L., Thornton, J. M. A global analysis of function and conservation of catalytic residues in enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 314-324 (2020).
  63. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Exposure of tryptophanyl residues in proteins. Quantitative determination by fluorescence quenching studies. Biochemistry. 15 (3), 672-680 (1976).
  64. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Fluorescence quenching of indole and model micelle systems. The Journal of Physical Chemistry. 80 (5), 486-493 (1976).
  65. Kinsley, N., Sayed, Y., Mosebi, S., Armstrong, R. N., Dirr, H. W. Characterization of the binding of 8-anilinonaphthalene sulfonate to rat class Mu GST M1-1. Biophysical Chemistry. 137 (2-3), 100-104 (2008).
  66. Mohsenifar, A., et al. A study of the oxidation-induced conformational and functional changes in neuroserpin. Iranian Biomedical Journal. 11 (1), 41-46 (2007).
  67. Gonzalez, W. G., Miksovska, J. Application of ANS fluorescent probes to identify hydrophobic sites on the surface of DREAM. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (9), 1472-1480 (2014).
  68. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Fluorescence quenching studies with proteins. Analytical Biochemistry. 114 (2), 199-227 (1981).
  69. Poulos, T. L., Price, P. A. The identification of a tryptophan residue essential to the catalytic activity of bovine pancreatic deoxyribonuclease. The Journal of biological chemistry. 246 (12), 4041-4045 (1971).
  70. Hu, J. -J., He, P. -Y., Li, Y. -M. Chemical modifications of tryptophan residues in peptides and proteins. Journal of Peptide Science An Official Publication of the European Peptide Society. 27 (1), 3286 (2021).

Tags

Biokemi nummer 176
Kemisk modifiering av tryptofanresterna i en rekombinant Ca<sup>2+</sup>-ATPase N-domän för studier av tryptofan-ANS FRET
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sampedro, J. G., Cataño, Y.… More

Sampedro, J. G., Cataño, Y. Chemical Modification of the Tryptophan Residue in a Recombinant Ca2+-ATPase N-domain for Studying Tryptophan-ANS FRET. J. Vis. Exp. (176), e62770, doi:10.3791/62770 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter