Summary
Dit protocol presenteert een methode voor het beoordelen van de voedingssnelheid van het houtborende schaaldier Limnoria door de productie van fecale pellets te meten. Deze methode is ontworpen voor gebruik in niet-gespecialiseerde laboratoria en heeft potentieel voor opname in standaard testprotocollen, om verbeterde houtduurzaamheid onder maritieme omstandigheden te evalueren.
Abstract
Houtborende ongewervelde dieren vernietigen snel zeehout en houten kustinfrastructuur en veroorzaken elk jaar miljarden dollars aan schade over de hele wereld. Aangezien behandelingen van hout met breedspectrum biociden, zoals creosoot en gechromateerd koperarsenaat (CCA), nu door wetgeving worden beperkt in gebruik in de zee, zijn natuurlijk duurzame houtsoorten en nieuwe conserveringsmethoden van hout vereist. Deze methoden worden getest om te voldoen aan wettelijke normen, zoals de Europese norm voor het testen van houtconserveringsmiddelen tegen scheepsboorders, EN 275. Het eerste onderzoek naar duurzame houtsoorten of houtconserveringsbehandelingen kan snel en goedkoop worden bereikt door middel van laboratoriumtests, wat veel voordelen biedt ten opzichte van mariene veldproeven die doorgaans kostbare, langdurige inspanningen zijn. Veel soorten Limnoria (gribble) zijn mariene houtborende schaaldieren. Limnoria zijn ideaal voor gebruik in laboratoriumtests van de biologische afbraak van hout door mariene houtboorders, vanwege de praktische bruikbaarheid van het fokken in aquaria en het gemak van het meten van hun voedingssnelheden op hout. Hierin schetsen we een standaardiseerbare laboratoriumtest voor het beoordelen van de biologische afbraak van hout met behulp van gribble.
Introduction
Houtboorders kunnen uitgebreide schade toebrengen aan mariene houten structuren, zoals zeewering, pieren en aquacultuurstructuren; waarvan de vervanging of restauratie wereldwijd miljarden dollars per jaar kost1,2,3. Om deze structuren te beschermen, wordt hout vaak behandeld om de biologische afbraak te verminderen. Vanwege de beperking van het gebruik van breedspectrum biociden in Australië, de EU, het VK en de VS, in het mariene milieu, zijn echter nieuwe modificatietechnieken en houtsoorten die van nature duurzaam zijn voor boren gewild4,5,6,7. Nieuwe technieken voor het behoud van hout in het mariene milieu vereisen grondige tests om te voldoen aan wettelijke normen en de milieueffecten van gevaren zoals uitloging van chemische conserveermiddelen te beperken. Zo wordt de Europese norm EN 275, de huidige Europese norm uit 1992, gebruikt om houtconserveringsbehandelingen te evalueren tegen schade aan houtboorders in zee8,9. Deze norm, samen met andere wetgevingen tegen het gebruik van biocideverbindingen, zoals CCA4,5,6,7 en creosoot10, vereist duurzame, niet-toxische methoden voor houtbescherming en het gebruik van van nature duurzame houtsoorten ter vervanging van biocidebehandelingen11,12 . Mariene proeven, zoals die gespecificeerd in EN 275, vereisen lange blootstellingsperioden en zijn dus duur en traag om zinvolle resultaten op te leveren. Laboratoriumtests bieden echter een veel sneller alternatief voor testmethoden voor het conserveren van houtproducten tegen aanvallen van houtboorders in zee, waardoor snelle evaluatie van aanpassingen in behandelingsschema's mogelijk is13. De resultaten van dit snelle laboratoriumexperiment zijn ontworpen om nieuwe modificatieprocessen van hout te informeren en om houtsoorten te identificeren met natuurlijke duurzaamheid voor boorschade. Een lage voedingssnelheid en vitaliteit kunnen wijzen op een verhoogde weerstand in potentiële producten en deze informatie kan vervolgens worden teruggekoppeld naar industriële partners om hen in staat te stellen ontwerpen te verbeteren. Onze methode maakt een wendbare en snelle reactie mogelijk, die wenselijk is in de industrie, en zodra veelbelovende producten zijn geïdentificeerd, kunnen de resultaten worden aangevuld met die van mariene proeven.
Gribbles (Limnoria) is een geslacht van kreeftachtigen uit de familie Limnoriidae. Er zijn wereldwijd meer dan 60 soorten Limnoria13,14,15, met drie veel voorkomende soorten in het Verenigd Koninkrijk, Limnoria lignorum, Limnoria tripunctata en Limnoria quadripunctata16. Ze boren tunnels op het oppervlak van hout dat wordt ondergedompeld in zeewater, vaak met economisch aanzienlijke schade tot gevolg. Gribbles zijn zeer overvloedig aanwezig in de britse kustwateren en zijn gemakkelijk te onderhouden onder laboratoriumomstandigheden, waardoor ze ideale organismen zijn voor de studie van de biologische afbraak van hout door ongewervelde zeedieren. Het evalueren van de voedingssnelheden en vitaliteit van gribbles op verschillende houtsoorten en houtconserveringsmethoden kan de effectiviteit van hun weerstand tegen biologische afbraak bepalen. Het volgende protocol beschrijft een standaardmethode voor het meten van gribblevoedingssnelheden, ontwikkeld op basis van de door Borges en collega's beschreven 12,17, naast het stroomlijnen van de introductie van beeldanalyse om het proces bedienbaar te maken in niet-gespecialiseerde laboratoria. Beeldanalyse wordt ook gebruikt om de praktische beperkingen van het handmatig tellen van een groot aantal monsters te verminderen. Duurzaamheid bij langdurige mariene tests, volgens de Britse norm EN350-1:1994, worden beoordeeld in verwijzing naar Pinus sylvestris spinthout18. In de hier gepresenteerde laboratoriumtests op korte termijn gebruiken we grove den (Pinus sylvestris L) spinthout als controle voor het testen van kernhout van de soorten ekki (Lophira alata Banks ex C.F Gaertn), beuk (Fagus sylvatica L), tamme kastanje (Castanea sativa Mill) en terpentijn (Syncarpia glomulifera (Sm.) Nied). De gemiddelde productie en vitaliteit van fecale pellets tussen acht replicaties per houtsoort werd gebruikt als indicator voor duurzaamheid. We bieden illustratieve gegevens verzameld uit een typische evaluatie, met behulp van de gribble-soort Limnoria quadripunctata en een reeks natuurlijk duurzame houtsoorten. Limnoria quadripunctata, geïdentificeerd door de sleutels van Menzies (1951), werd geselecteerd als de optimale soort voor biologische afbraakproeven vanwege het feit dat het het meest bestudeerde lid van de familie is en goed ingeburgerd is als een modelsoort voor gebruik in biologische afbraakproeven. Dit protocol is ook van toepassing op het testen van bossen met verschillende behandelingen, hoewel de gebruikte controle onbehandelde replicaties van dezelfde soort moet zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Teststicks voorbereiden
- Nadat alle behandelingsprocessen zijn voltooid, snijdt u droog hout in teststokken tot de grootte 2 mm x 4 mm x 20 mm (figuur 1). Luchtdrogen blijft aan een constant gewicht, onder laboratoriumomstandigheden. Gebruik ten minste 5 replica's van elk hout dat wordt getest.
Figuur 1: Teststicks die worden gebruikt in kortdurende laboratoriumtests om de voersnelheid van gribbels te beoordelen. Testhouten sticks van 2 mm x 4 mm x 20 mm. Van links naar rechts: ekki, terpentijn, tamme kastanje en beukenhout en grove dennen spinthout. Schaalbalk 4 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Vacuüm impregneren
- Plaats na de houtbereiding (d.w.z. snijden en behandelen, indien van toepassing), de sticks onder een gaas in een voedselveilige plastic container, in de vacuümsiccator en vervang het deksel zodat er een strakke afdichting is, vergemakkelijkt door een coating van vacuümvet (figuur 2).
- Bevestig een driewegklep tussen de buis die de exsiccator en de pomp verbindt, met een derde buis die naar open lucht leidt (figuur 2). Zorg ervoor dat de driewegklep is afgesloten voor de lucht en laat de pomp draaien om een vacuüm van -0,75 tot -1,0 bar in de vacuümsiccator te bereiken en houd dit vacuüm 45 minuten - 1 uur vast.
- Dompel het open uiteinde van de derde buis onder in een container met zeewater. Schakel de pomp uit en sluit de klep die naar de pomp leidt en open vervolgens langzaam de klep totdat zeewater door het vacuüm in de exsiccator wordt getrokken. Laat het water stromen totdat het de plastic container vult, boven het niveau van het gaas.
- Trek vervolgens de buis terug uit het zeewater in de container en laat lucht binnen, totdat de exsiccator terugkeert naar de atmosferische druk. Houd de stokjes onder het gaas totdat ze naar de bodem van de plastic container zinken.
Figuur 2: Apparatuur die wordt gebruikt om houtstokken met zeewater te zuigen, ter voorbereiding op het voeren aan gribbles tijdens een laboratoriumvoedingstest. A) Vacuüm exsiccator; B) Pomp; C) Manometer voor de vacuümsiccator; D) De driewegklep die leidt naar de vacuümsiccator, pomp en naar open lucht of zeewater (oranje buis). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Uitlogend hout
- Dompel met zeewater verzadigde teststicks onder in zeewater in buizen van 50 ml (figuur 3). Vervang water regelmatig gedurende een periode van 20 dagen.
OPMERKING: Het uitlogingsproces is van toepassing op elk experimenteel hout dat wordt getest, inclusief behandeld of natuurlijk hout.
- Dompel met zeewater verzadigde teststicks onder in zeewater in buizen van 50 ml (figuur 3). Vervang water regelmatig gedurende een periode van 20 dagen.
Figuur 3: Percolaat uit houten stokken voor bereiding voor het voeren aan gribbles tijdens een laboratoriumvoedingstest. Hout dat volledig werd ondergedompeld in zeewater in een Falcon-buis van 50 ml, met regelmatige waterverversing (1-3 dagen), produceerde duidelijk gekleurd percolaat. Van links naar rechts percolaat uit kernhout van; tamme kastanje, terpentijn, ekki en beuken en grove dennen spinthout. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Gribble extraheren
- Haal individuele exemplaren van gribble uit een aangetast houtblok. Gebruik een fijne tang en een dunne (maat 000/0,4 mm of kleiner) kwast. Pel voorzichtig al het hout dat het gribblehol bedekt met de tang
OPMERKING: Holen bevinden zich op het oppervlak van hout en zijn te herkennen aan kleine gaatjes (figuur 4). - Zodra gribble is blootgesteld, gebruik je een penseel om voorzichtig individuen van onderaf op te pakken en af te zetten in een petrischaal gevuld met zeewater. Controleer gribble onder een microscoop om soorten te identificeren en om er zeker van te zijn dat er geen schade is veroorzaakt tijdens het extraheren.
OPMERKING: Het verslaan van pleopoden is een teken van vitaliteit.- Gooi alle vrouwtjes die eieren broeden weg, omdat gravid vrouwtjes een verminderde voedingscapaciteit hebben.
Figuur 4: Afbeelding van een gribblehol met twee typische ventilatiegaten. L. quadripunctata hol op een stok van Radiata dennenhout, afmeting 2 mm x 4 mm x 20 mm. Naast de ingang van het hol zijn twee kleinere ventilatiegaten te zien. Schaalbalk 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Limnoria quadripunctata identificeren
- Identificeer Limnoria quadripunctata onder een stereomicroscoop door de vier verschillende knobbeltjes, gerangschikt in een vierkant patroon, op het pleotelson van het dier, naast een X-vormige carina op het vijfde pleoniet19 (figuur 5).
Figuur 5: Limnoria quadripunctata identificerende kenmerken. Afbeelding van dorsaal oppervlak Limnoria quadripunctata, genomen op een stereomicroscoop bij x20 vergroting. Identificerende kenmerken weergegeven door rode pijl - geeft de X-vormige carina en blauwe pijl aan - duidt op vier knobbeltjes op pleotelson. Schaalbalk 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Putplaten bereiden
- Plaats in meerputplaten met putten met een diameter van 20 mm één teststick en 5 ml ongefilterd zeewater, tussen 32-35 PSU, per put (figuur 6).
- Plaats behandelingen/houtsoorten systematisch door de putplaat, zodat elke houtsoort minstens één keer per plaat wordt weergegeven. Voeg één gribbel per put toe.
OPMERKING: De temperatuur moet in een incubator stabiel worden gehouden bij 20 °C ± 2 °C voor de soort L. quadripunctata, andere soorten Limnoria kunnen worden gebruikt met aanpassingen aan de temperatuur die zijn aangepast aan de specifieke soort. - Houd platen in constante donkere omstandigheden, omdat de fotoperiode geen effect heeft op de voersnelheid van de gribble15.
Figuur 6: Experimentele opstelling voor gribble feeding assay. Een voorbeeld van een 12 multi-well plaat die wordt gebruikt in het laboratorium testen van de voersnelheid van gribble. Elke put bevat 5 ml zeewater en één teststick (20 mm x 4 mm x 2 mm) van verschillende houtsoorten; Grove dennen spinthout en ekki, beuk, tamme kastanje en terpentijn kernhout. Schaalbalk 20 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Fecale pellets verzamelen en tellen en vitaliteit beoordelen.
- Verwijder tweemaal per week de teststick en elke gribble (één per put) van de putplaat en plaats deze in een vers voorbereide putplaat (met 5 ml zeewater per put [32-35 PSU, 18-22 °C]).
- Gebruik een verfkwast om eventuele fecale pellets voorzichtig van de stok af te borstelen voordat u ze overbrengt en bewaar de fecale pellets in de oorspronkelijke put.
OPMERKING: Voordat de gribble naar een verse putplaat wordt overgebracht, kan de vitaliteit worden beoordeeld op een schaal van 1-5; 1= dood, 2 = passief, niet op het hout, 3 = actief zwemmen of pleopoden slaan, niet op het hout, 4 = kruipen op het oppervlak van het hout, 5 = ingegraven in het hout. - Beeldverwerking
- Gebruik een fijne verfkwast om eventuele klonten te scheiden, zodat individuele pellets zichtbaar zijn en borstel pellets weg van de randen van de put. Maak een gedetailleerde foto onder een stereomicroscoop, bij vergroting x4 en upload naar een computer (figuur 7).
OPMERKING: Zorg ervoor dat de pellets scherp zijn en dat de achtergrond uniform is, zonder schaduwen of lichtreflecties op het wateroppervlak.
- Gebruik een fijne verfkwast om eventuele klonten te scheiden, zodat individuele pellets zichtbaar zijn en borstel pellets weg van de randen van de put. Maak een gedetailleerde foto onder een stereomicroscoop, bij vergroting x4 en upload naar een computer (figuur 7).
Figuur 7: Afbeelding van gribble fecale pellets. L. quadripunctata fecale pellets (kleine, cilindrische, bruine pellets) van het voeden met Radiata dennenhout in één put van een multi-well plaat. Genomen bij x4 vergroting. Beelden voorafgaand aan manipulatie voor beeldanalyse (zie figuur 7). A) Voorbeeld van een geschikte afbeelding die kan worden gebruikt voor geautomatiseerd tellen in ImageJ. Pellets zijn voldoende verspreid en weg van de randen van de put. De put is gecentreerd en er zijn geen obstakels of reflecties. B) Een voorbeeld van een afbeelding die niet geschikt is voor beeldanalyse. De put is uit het midden en snijdt de onderste helft af. Blauwe (gestippelde) cirkel toont lichtreflectie van het wateroppervlak. Oranje (vaste) cirkel toont pellets die te dicht op elkaar en te dicht bij de rand van de put zijn samengeklonterd. Rode (onderbroken) cirkel toont een houtsnipper die niet is verwijderd. Schaalbalk 10 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Proces om fecale pellettelling te genereren met behulp van ImageJ.
- Download ImageJ (nieuwste versie vanaf 03/08/21, 1.8.0_172) van https://imagej.nih.gov/ij/download.html of voer uit vanuit de browser van de computer.
- Upload een stapel afbeeldingen door te slepen en neer te zetten of door Bestand | | importeren | van de afbeeldingsreeks Bladeren. Wijzig geen parameters en selecteer oke.
- Gebruik vervolgens het cirkelgereedschap om het onderste gedeelte van de put met de fecale pellets te selecteren. Verwijder de randen van het putje en selecteer Bewerken | Helder buiten. Maak de afbeelding binair, selecteer Proces | Binair maken.
- Kalibreren door Analyse | te selecteren Stel schaal in en kies het aantal pixels per millimeter voor de afbeelding (bijvoorbeeld 10 pixels = 1 mm). Tel de pellets, selecteer Analyse | Analyseer deeltjes.
- Selecteer in het vak naast Grootte (eenheid2) een lagere drempel die gelijk is aan de kleinste maat pellet, met behulp van de eenheidsschaal die eerder is ingesteld (bijvoorbeeld als 10 pixels = 1 mm en de kleinste pellet 0,5 mm is, kiest u 5-oneindig).
- Selecteer in de vervolgkeuzelijst Weergeven de optie Contouren en schakel vervolgens Samenvatten in en druk op OK (figuur 8).
OPMERKING: Meer informatie is te vinden op https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/index.html
Figuur 8: Een stroomdiagram van het proces dat in ImageJ wordt gebruikt om fecale pellets te tellen. A) Een afbeeldingsreeks importeren op het tabblad Bestand van AfbeeldingJ. B) De bladerknop in het dialoogvenster 'Afbeeldingsreeks importeren' om een reeks afbeeldingen van een lokaal apparaat te importeren. C) Gebruik het cirkelgereedschap om een gebied met fecale pellets te selecteren D) Wis de knop Buitenkant in het tabblad Bewerken om buiten het geselecteerde gebied te verwijderen. E) Binaire knop maken op het procestabblad. F) Schaalknop instellen op het tabblad Analyseren. Afstand in pixels is gelijk aan het aantal pixels tot één maateenheid (mm). G) Knop Deeltjes analyseren op het tabblad Analyseren. Grootte (eenheid^2) ingesteld op de onderste drempel van fecale pelletgrootte, in pixels, tot oneindig. Toon 'contouren' en 'samenvatting' zijn geselecteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
-
Data-analyse
- Zet pellettellingen om in pellets per dag, wat een indirecte meting van de voedingssnelheid geeft. Gooi gegevens weg van ruiende personen op dagen dat de rui plaatsvond (figuur 9).
OPMERKING: Rui vindt plaats gedurende 1-3 dagen en kan worden geïdentificeerd wanneer een volledige rui van het exoskelet kan worden gezien.
- Zet pellettellingen om in pellets per dag, wat een indirecte meting van de voedingssnelheid geeft. Gooi gegevens weg van ruiende personen op dagen dat de rui plaatsvond (figuur 9).
Figuur 9: Voorbeeld van een gribble rui. Rui van gribble (L. quadripunctata), op een Radiata dennenhouten teststok van 20 mm x 4 mm x 2 mm. Ruien worden aangegeven door rode cirkels. Schaalbalk 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voedingsexperiment van L. quadripunctata werd gedurende 20 dagen uitgevoerd, met behulp van vijf verschillende houtsoorten (grove den (Pinus sylvestris L) spinthout en kernhout van beuken (Fagus sylvatica L), ekki (Lophira alata Banks ex C. F Gaertn), tamme kastanje (Castanea sativa Mil) en terpentijn (Syncarpia glomulifera (Sm.) Neid)) (zie materiaaltabel), in november 2020. Per houtsoort werden acht replicatiestokjes gebruikt en per stok werd één exemplaar limnoria quadripunctata gevoerd. Alle gribble werd verkregen uit voorraden die worden onderhouden in aquaria van het Institute of Marine Sciences, University of Portsmouth, VK. Voorraden worden regelmatig aangevuld met wilde collecties van de zuidkust van Engeland. Dieren zijn goed geacclimatiseerd aan de stabiele en consistente kweekomstandigheden voorafgaand aan het experiment. Houten stokjes (20 mm x 4 mm x 2 mm) werden gedurende twee weken voorafgaand aan de voedingsproef in zeewater uitgeloogd. Eén gribble, één teststick en 5 ml zeewater werden per put in een plaat met 12 multiputten geplaatst en in een incubator bewaard bij stabiele omstandigheden van 20 °C (± 0,2 °C) en in constante donkere omstandigheden. Fecale pellets werden geteld en verzameld om de 2 tot 5 dagen, met volledige waterverversingen bij elke verzameling. Van elke houtsoort werden acht replica's gebruikt, wat in totaal veertig stokken met elk één individuele gribble opleverde. Zeewater dat werd gebruikt voor het uitlogen van hout en tijdens het hele experiment werd gebruikt, werd rechtstreeks verkregen uit het aquarium dat werd gebruikt om exemplaren te achterhalen. Zeewatercondities zijn stabiel in het aquarium en stabiel in de incubator. Verdamping uit het kleine volume water dat per put wordt gebruikt, wordt geminimaliseerd door het dekselontwerp van de putplaten en volledige waterverversingen die elke 2-5 dagen plaatsvinden.
Pellets werden automatisch geteld met afbeelding J (versie 1.8.0_112).
Gribble die zich voedde met grove dennen spinthout als controle, produceerde consequent de meeste fecale pellets per dag, behalve op dag 20, waar de pelletproductie werd ingehaald door beuken. Ekki produceerde de laagste fecale pellets per dag van alle geteste houtsoorten. De op één na hoogste fecale pelletproductie werd gezien op beuken, gevolgd door tamme kastanje en terpentijn. Er was een toename van de productie van fecale pellets bij alle soorten van dag 5 tot dag 7. De pelletproductie daalde in alle soorten, behalve ekki, tussen dag 7 en dag 12, mogelijk als gevolg van de toegenomen tijd tussen waterveranderingen. Hierna bleef de productie van fecale pellets vrij constant bij elk van de houtsoorten. Vanaf dag 14 nam grove den af in de dagelijkse productie van fecale pellets, terwijl beuken toenamen (figuur 10).
Figuur 10: Aantal fecale pellets per dag (n=40) (gemiddelde ± SE) geproduceerd door L. quadripunctata met verschillende houtsoorten, gedurende 20 dagen. Terpentijn, tamme kastanje, beuken en ekki kernhout getest, met grove dennen spinthout gebruikt als controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De hoogste vitaliteit van score (5) werd gezien bij de meeste personen die zich voedden met grove dennenhout, behalve bij één dode persoon. 5 duidt op dieren die zich in het hout hebben ingegraven en dit werd alleen gezien op grove dennen spinthout en beuken kernhout. Op dag 12 voor grove dennen en dag 20 voor beuken hadden alle levende individuen zich in het bos ingegraven. Tamme kastanje had het hoogste percentage sterfte, maar nam in de loop van de tijd niet toe. De rest van de levende individuen bleef op een vitaliteit van 4 (kruipen op het houtoppervlak), behalve op dag 14 waar twee individuen van het hout waren (vitaliteit van 3). Ekki en terpentijn hadden ook de meerderheid van de individuen met een vitaliteit van 4 gedurende de duur van het experiment, behalve op dag 14 en dag 5 voor terpentijn. De sterfte vertoonde in de loop van de tijd geen toename bij een van de houtsoorten. Alleen het graven nam toe op grove dennen en beuken, terwijl de andere drie houtsoorten meestal op een vitaliteit van 4 bleven (figuur 11).
Figuur 11: Vitaliteit van individuen in de loop van de tijd, als een percentage van replicaties, die zich voeden met verschillende houtsoorten. Terpentijn, tamme kastanje, beuken en ekki kernhout getest, met grove dennen spinthout gebruikt als controle. Van acht replicaties per houtsoort werd het percentage bij verschillende vitaliteiten uitgezet over de experimentele periode van 20 dagen. Donkerblauw staat voor een vitaliteit van 5 (graven), lichtblauw een vitaliteit van 4 (op hout), grijs een vitaliteit van 3 (van hout maar actief), paars een vitaliteit van 2 (van hout en passief) en zwart toont een vitaliteit van 1 of dode individuen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De resultaten van deze testmethode kunnen worden gebruikt om houtsoorten of behandelingen te identificeren die een verhoogde weerstand hebben tegen schade aan houtboorders in zee. Vervolgens kunnen mariene veldproeven, zoals beschreven in de Europese norm EN 275, worden uitgevoerd en kan de duurzaamheid worden beoordeeld (0 = 'geen aanval', 1 = 'lichte aanval', 2 = 'matige aanval', 3 = 'ernstige aanval', 4 = 'falen'20) naast vergelijking met niet-duurzaam controlehout.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voordat gribblespecimens worden geselecteerd voor gebruik in het voedingsexperiment, moeten individuen worden gescreend om hun geschiktheid te beoordelen. Er kan enige variatie in voedingssnelheid tussen individuen zijn als gevolg van verschillen in grootte, dus alleen volgroeide volwassen exemplaren moeten worden geselecteerd. Borges et al., 200917, hebben geen significant verschil tussen de voedingssnelheid van individuen tussen 1,5 mm en 3 mm gedetecteerd. Vrouwelijke Limnoria broeden hun eieren, gedurende welke tijd een verminderde voedingssnelheid hebben. Daarom moeten broedende vrouwtjes worden gecontroleerd en weggegooid tijdens het selecteren van exemplaren. Evenzo zullen ruiende individuen ook een verminderde voedingssnelheid hebben21. Daarom moeten fecale pellettellingen op dagen dat individuen ruien worden weggegooid17. Omdat rui langer dan een dag plaatsvindt, worden ruien geteld wanneer een volledige exoskelet rui te zien is op pelletopvangdagen. Limnoria hebben bij het maken van hun holen een verhoogde fecale pelletproductie en zullen ook meer frass produceren (fijn houtafval dat niet in de fecale pellets is opgenomen). De hoge niveaus van frass kunnen de identificatie van fecale pellets verstoren, maar kunnen zorgvuldig worden verwijderd onder stereomicroscoopobservatie, met behulp van een pipet of fijne verfkwast, voorafgaand aan het vastleggen van afbeeldingen voor automatisch tellen. Als alternatief kunnen pellets handmatig worden geteld.
De software ImageJ vereist kwaliteit, in-focus beelden voor beeldverwerking. Hiertoe moeten beelden worden vastgelegd waarin fecale pellets niet worden belemmerd door de putwanden en moet een verfkwast worden gebruikt om individuele fecale pellets te scheiden. De achtergrond van de afbeelding moet uniform zijn zonder licht- of schaduwgebieden, wat zou interfereren wanneer de afbeelding wordt omgezet in binair voor verwerking in ImageJ. Het is niet nodig om contrast of licht aan te passen voorafgaand aan de beeldverwerking. Bij het importeren van een stapel afbeeldingen moeten alle foto's in hetzelfde vlak worden gemaakt, zodat er geen fouten optreden tijdens de verwerking.
Het vacuüm impregneren van hout met zeewater zorgt ervoor dat het hout zinkt en gemakkelijk toegankelijk wordt voor de gribble. Door hout uit te lekken voordat het wordt blootgesteld aan gribbles, worden in water oplosbare extractieven verwijderd die hun voedingssnelheid kunnen beïnvloeden of sterfte kunnen veroorzaken12. Sterfte als gevolg van extractieven in het water is niet representatief voor de sterfte die te verwachten is in de zee, waar extracten snel zullen verdunnen. Putplaten moeten op een constante temperatuur worden gehouden die optimaal is voor de gribble-soorten die worden getest. De gemeenschappelijke Zuid-Britse soort, L. quadripunctata, voedt goed tussen 15 en 25 °C en heeft een optimale voedingssnelheid bij 20 °C17 , zodat putplaten gemakkelijk in een incubator kunnen worden bewaard bij een constante 20 °C ± 0,5 °C.
Het beoordelen van de vitaliteit van de voedergribble detecteert subletale of pre-dodelijke effecten van houtbehandelingen of natuurlijk duurzaam hout. Een hoge vitaliteit van 5 geeft aan dat de gribble natuurlijk gedrag vertoont door zich in te graven in het hout en geen nadelig effect ondervindt van contact ermee. Een vitaliteit van 4 laat zien dat, hoewel hij zich niet in het hout heeft ingegraven, de gribble nog steeds comfortabel is om langs het oppervlak te kruipen. Een score van 3 wordt gegeven aan gribble die niet op het hout ligt, maar in plaats daarvan actief in het water zwemt of stilstaat maar met snel kloppende benen en pleopoden. Een lage vitaliteit van 2 betekent dat de gribble wordt blootgesteld en/of weinig energie heeft. Dit kan het gevolg zijn van een langdurige periode van lage voedingssnelheid of van extractieven die in het water uitlogen of toegankelijk worden tijdens het voeren. Als na 7-8 weken een hoge sterfte wordt gezien, kan dit te wijten zijn aan uithongering, omdat uitgehongerde gribbles (bewaard in putten met slechts 5 ml zeewater en geen hout) zo lang kunnen overleven (persoonlijke observatie).
De voordelen van het gebruik van een laboratoriumtest op korte termijn in tegenstelling tot langdurige mariene veldproeven, is dat nieuwe behandelingen en houtproducten snel kunnen worden getest om hun potentieel voor commercieel gebruik te identificeren. Bovendien kunnen dergelijke testen een snelle optimalisatie van behandelingsprocessen vergemakkelijken. Als een significant lagere fecale pelletproductie wordt gezien in vergelijking met een controlehout, kan het testen worden aangevuld met mariene proeven. Slevin et al., 201523 en Westin et al., 201624 tonen een goede correlatie aan tussen laboratorium- en veldbeoordelingen door hetzelfde hout in twee verschillende omgevingen te testen, wat wijst op een capabel voorspellend vermogen van de eerste. Een kortdurende test kan enkele weken worden uitgevoerd. Uitgehongerde gribbles kunnen 7-8 weken overleven wanneer ze in goed belucht water zonder hout worden bewaard (persoonlijke observatie), wat een extra vergelijking kan bieden bij het onderzoeken van de sterfterespons op verschillende soorten hout. Door recente, niet-gepubliceerde waarnemingen is er echter geen significante fluctuatie in de productie van fecale pellets over een periode langer dan 20 dagen, behalve wanneer sterfte begint op te treden. Bovendien lopen eerdere methoden, zoals die gebruikt door Borges et al., 2008 en 2009, 15 dagen. Daarom is 20 dagen voldoende tijd voor een snelle laboratoriumtest om de duurzaamheid van het hout aan te geven.
Hoewel deze methode geschikt is voor kortetermijnproeven, moeten de bevindingen worden aangevuld met langdurige mariene veldexperimenten. Laboratoriumomstandigheden kunnen de verscheidenheid aan biotische en abiotische factoren die hout in het mariene milieu kunnen beïnvloeden, niet repliceren. Biofouling organismen, samen met andere soorten mariene houtboorders (zoals scheepswormen) kunnen nog steeds aanwezig zijn en schade aan het hout veroorzaken25,26. Bovendien kan slijtage door golfgeworpen gordelroos of zand hout naar beneden slijten, dat dan toegankelijk kan worden voor gribbles27. Een standaard laboratoriummethode kan echter een eerste screening bieden van nieuwe producten die veelbelovend zijn voor maritieme toepassingen. Door de fecale pelletproductie en vitaliteit te beoordelen, kunnen bossen worden geïdentificeerd die beter zijn in het verminderen van de voersnelheid van gribble.
Vanwege de regelgeving en beperkingen van houtconserveringsmiddelen, zoals CCA en creosoot, is het belangrijk om nieuwe producten te vinden om deze behandelingen te vervangen. Hout is onderhevig aan hoge niveaus van biologische afbraak in het mariene milieu, maar is nog steeds een van de meest hernieuwbare bouwmaterialen die beschikbaar zijn en behoudt zijn sterkte en structuur goed in zeewater27,28. Hout dat bestand is tegen biologische afbraak zal niet alleen de kosten verlagen, maar zal ook milieuvriendelijker zijn dan het gebruik van alternatieve materialen zoals beton of staal, die een hoge energie-input vereisen tijdens de productie29,30, of breedspectrum biocideconserveringsmiddelen die kunnen uitlogen en het omliggende ecosysteem kunnen aantasten31,32,33,34,35,36, 37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten met betrekking tot deze studie.
Acknowledgments
Dank aan de Onderzoeksraad van Noorwegen (Oslo Regional Fund, Alcofur rffofjor 269707) en de Universiteit van Portsmouth (Faculty of Science PhD research bursary) voor het verstrekken van financiering voor de studies van Lucy Martin. Ook aan Gervais S. Sawyer die het hout leverde dat werd gebruikt om de representatieve resultaten te genereren. Terpentijn werd geleverd door Prof. Philip Evans van de Universiteit van British Columbia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 150200 | |
| 50ml Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Adjustable volume pipette | Fisher Scientific | FBE10000 | 1-10 ml |
| Beech | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Fagus sylvatica | Taxonomic authority: L |
| Ekki | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Lophira alata | Taxonomic authority: Banks ex C. F. Gaertn. |
| Forceps | Fisher Scientific | 10098140 | |
| Incubator | LMS LTD | INC5009 | |
| Microporous specimen capsules | Electron Microscopy Sciences | 70187-20 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Scots Pine | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Pinus sylvestris | Taxonomic authority: L. |
| Size 00000 paintbrush | Hobby Craft | 5674331001 | Size 000 or 0000 also acceptable |
| Sweet Chestnut | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Castanea sativa | Taxonomic authority: Mill |
| Turpentine | P. Evans (Professor, Dept. Wood Science, University of British Columbia) | Syncarpia glomulifera | Taxonomic authority: (Sm.) Nied. |
| Vacuum desiccator | Fisher Scientific | 15544635 |
References
- Morrell, J. J. Protection of wood-based materials. Handbook of environmental degradation of materials, 3rd ed. Kutz, M. , Elsevier Science and Technology Books. Oxford. 343-368 (2018).
- Distel, D. L. The biology of marine wood boring bivalves and their bacterial endosymbionts. Wood deterioration and preservation. Goodell, B., Nicholas, D., Schultz, T. , American Chemical Society. Washington, D.C. 253-271 (2003).
- Buslov, V., Scola, P. Inspection and structural evaluation of timber pier: case study. Journal of Structural Engineering. 117 (9), 2725-2741 (1991).
- US EPA. Registration Eligibility Decision for Chromated Arsenicals. List A, Case No. 0132. US EPA - Office of prevention, pesticides and toxic substances. , Available from: https://swap.stanford.edu/20110202084/http://www.epa.gov/oppsrrd1/reregistration/REDs/cca_red.pdf 800-807 (2008).
- Arsenic timber treatments (CCA and arsenic trioxide) review scope document, Review series 03.1. ISSN number 1443. Australian pesticides and veterinary medicines authority. , Available from: https://apvma.gov.au/sites/default/files/publication/14296-arsenic-timber-review-scope.pdf (2003).
- Commission directive 2003/2/EC of 6 January 2003 relating to restrictions on the marketing and use of arsenic (tenth adaptation to technical progress to Council Deretive 76/769/EEC). Official Journal of the European Communities. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/eudr/2003/2/adopted (2003).
- The Hazardous Waste (England and Wales) Regulations 2005 No.894. Environmental Protection England and Wales. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/uksi/2005/894/contents/made (2005).
- Palanti, S., Cragg, S. M., Plarre, R. Resistance against marine borers: About the revision of EN 275 and the attempt for a new laboratory standard for Limnoria. International Research Group on Wood Preservation, Document No. IRG/WP 20-20669. , (2020).
- The European Commission for Standardization. EN 275:1992. Wood preservatives- Determination of the protective effectiveness against marine wood borers. The European Commission for Standardization (CEN). , (1992).
- European Commission. Directive 98/8/EC concerning the placing of biocidal products on the market. Communication and Information Resource Centre for Administrations, Businesses and Citizens. , (2010).
- Mantanis, G. I. Chemical modification of wood by acetylation or furfurylation: A review of the present scaled-up technologies. BioResources. 12 (2), 4478-4489 (2017).
- Borges, L. M. S., Cragg, S. M., Bergot, J., Williams, J. R., Shayler, B., Sawyer, G. S. Laboratory screening of tropical hardwoods for natural resistance to the marine borer Limnoria quadripunctata: The role of leachable and non-leachable factors. Holzforschung. 62 (1), 99-111 (2008).
- Cragg, S. M., Pitman, A., Henderson, S. Developments in the understanding of the biology of marine wood boring crustaceans and in methods of controlling them. International Biodeterioration & Biodegradation. 43 (4), 197-205 (1999).
- Cookson, L. J., Vic, M. D. C.
- Cookson, L. Australasian species of Limnoriidae (Crustacea: Isopoda). Memoirs of the Museum of Victoria. 52 (2), 137 (1991).
- Jones, L. T. The geographical and vertical distribution of British Limnoria [Crustacea: Isopoda]. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 43 (3), 589-603 (1963).
- Borges, L. M. S., Cragg, S. M., Busch, S. A laboratory assay for measuring feeding and mortality of the marine wood borer Limnoria under forced feeding conditions: A basis for a standard test method. International Biodeterioration & Biodegradation. 63 (3), 289-296 (2009).
- BSI Standards Publication. BS EN 350:2016. Durability of wood and wood-based products - Testing and classification of the durability to biological agents of wood and wood-based materials. BSI Standards Publication. , (2016).
- Menzies, R. The phylogeny, systematics, distribution, and natural history of limnoria. , University of Southern California. Dosctoal dissertation 196-208 (1951).
- Palanti, S., Feci, E., Anichini, M. Comparison between four tropical wood species for their resistance to marine borers (Teredo spp and Limnoria spp) in the Strait of Messina. International Biodeterioration & Biodegradation. 104, 472-476 (2015).
- Delgery, C. C., Cragg, S. M., Busch, S., Morgan, E. Effects of the epibiotic heterotrich ciliate Mirofolliculina limnoriae and moulting on the faecal pellet production by the wood-boring isopods Limnoria tripunctata and Limnoria quadripunctata. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 334 (2), 165-173 (2006).
- Morrell, J. J., Helsing, G. G., Graham, R. D. Marine wood maintenance manual: a guide for proper use of Douglas-fir in marine exposures. Forest Research Laboratory. , Oregon State University. Corvallis. Research Bulletin 48 (1984).
- Slevin, C. R., Westin, M., Lande, S., Cragg, S. Laboratory and marine trials of resistance of furfurylated wood to marine borers. Eighth European Conference on Wood Modification. , Aalto University. 464-471 (2015).
- Westin, M., et al. Marine borer resistance of acetylated and furfurylated wood - results from up to 16 years of field exposure. International Research Group on Wood Preservation. , Document No. IRG/WP 16-40756 (2016).
- Westin, M., Rapp, A., Field Nilsson, T. Field test of resistance of modified wood to marine borers. Wood Material Science and Engineering. 1 (1), 34-38 (2006).
- Borges, L. M. S. Biodegradation of wood exposed in the marine environment: Evaluation of the hazard posed by marine wood-borers in fifteen European sites. International Biodeterioration & Biodegradation. 96 (1), 97-104 (2014).
- Treu, A., et al. Durability and protection of timber structures in marine environments in Europe: An overview. BioResources. 14 (4), 10161-10184 (2019).
- Williams, J. R., Sawyer, G. S., Cragg, S. M., Simm, J. A questionnaire survey to establish the perceptions of UK specifiers concerning the key material attributes of timber for use in marine and freshwater engineering. Journal of the Institute of Wood Science. 17 (1), 41-50 (2005).
- Purnell, P. The carbon footprint of reinforced concrete. Advances in Cement Research. 25 (6), 362-368 (2013).
- Hill, C. A. S. The environmental consequences concerning the use of timber in the built environment. Frontiers in Built Environment. 5, 129 (2019).
- Mercer, T. G., Frostick, L. E. Leaching characteristics of CCA-treated wood waste: a UK study. Science of the Total Environment. 427, 165-174 (2012).
- Brown, C. J., Eaton, R. A., Thorp, C. H. Effects of chromated copper arsenate (CCA) wood preservative on early fouling community formation. Marine Pollution Bulletin. 42 (11), 1103-1113 (2001).
- Brown, C. J., Eaton, R. A. Toxicity of chromated copper arsenate (CCA)-treated wood to non-target marine fouling communities in Langstone Harbour, Portsmouth, UK. Marine Pollution Bulletin. 42 (4), 310-318 (2001).
- Brown, C. J., Albuquerque, R. M., Cragg, S. M., Eaton, R. A. Effects of CCA (copper-chrome-arsenic) preservative treatment of wood on the settlement and recruitment of wood of barnacles and tube building polychaete worms. Biofouling. 15 (1-3), 151-164 (2000).
- Lebow, S. T., Foster, D. O., Lebow, P. K. Release of copper, chromium and arsenic from treated southern pine exposed in seawater and freshwater. Forest Products Journal. 49 (7), 80-89 (1999).
- Smith, P. T. Risk to human health and estuarine posed by pulling out creosote-treated timber on oyster farms. Aquatic Toxicology. 86 (2), 287-298 (2008).
- Brown, C. J., et al. Assessment of Effects of Chromated Copper Arsenate (CCA)-Treated Timber on Nontarget Epibiota by Investigation of Fouling Community Development at Seven European Sites. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 45 (1), 0037-0047 (2003).
