Summary
Detta protokoll presenterar en metod för att bedöma utfodringshastigheten för träuppborrningskräftan, Limnoria, genom att mäta fekal pelletsproduktion. Denna metod är utformad för användning i icke-specialiserade laboratorier och har potential att införlivas i standardtestprotokoll, för att utvärdera förbättrad träbeständighet under marina förhållanden.
Abstract
Träuppborrningslösa ryggradslösa djur förstör snabbt marint timmer och kustinfrastruktur i trä, vilket orsakar skador för miljarder dollar runt om i världen varje år. Eftersom behandlingar av trä med bredspektrumbiocider, såsom kreosot och kromaterat koppararsenat (CCA), nu begränsas i marin användning enligt lagstiftning krävs naturligt hållbara träslag och nya konserveringsmetoder för trä. Dessa metoder testas för att uppfylla lagstadgade standarder, såsom den europeiska standarden för testning av träskyddsmedel mot marina borrare, EN 275. Inledande undersökning av hållbara träslag eller träskyddsbehandlingar kan uppnås snabbt och billigt genom laboratorietester, vilket erbjuder många fördelar jämfört med marina fältförsök som vanligtvis är kostsamma, långsiktiga ansträngningar. Många arter av Limnoria (gribble) är marina träuppborrningsdjur. Limnoria är idealiska för användning i laboratorietester av biologisk nedbrytning av trä av marina träborrare, på grund av det praktiska i att föda upp dem i akvarier och hur lätt det är att mäta deras utfodringshastigheter på trä. Häri beskriver vi ett standardiserat laboratorietest för bedömning av biologisk nedbrytning av trä med hjälp av gribble.
Introduction
Träborrar kan orsaka omfattande skador på marina träkonstruktioner, såsom havsförsvar, bryggor och vattenbruksstrukturer. ersättning eller restaurering av vilken kostar miljarder dollar per år över hela världen1,2,3. För att skydda dessa konstruktioner behandlas timmer ofta för att minska biologisk nedbrytning. På grund av begränsningen av användningen av bredspektrumbiocider i Australien, EU, Storbritannien och USA, i den marina miljön, är nya modifieringstekniker och träslag som är naturligt hållbara för borers eftertraktade4,5,6,7. Nya tekniker för att bevara trä i den marina miljön kräver noggranna tester för att uppfylla lagstadgade standarder och begränsa miljöpåverkan från faror som utlakning av alla kemiska konserveringsmedel. Till exempel används den europeiska standarden EN 275, som är den nuvarande europeiska standarden från 1992, för att utvärdera träbevarande behandlingar mot skador på marina träborrar8,9. Denna standard, tillsammans med annan lagstiftning mot användning av biocidföreningar, såsom CCA4,5,6,7 och kreosot10, kräver hållbara, giftfria metoder för träskydd och användning av naturligt hållbara träslag för att ersätta biocidbehandlingar11,12 . Marina försök, såsom de som anges i EN 275, kräver långa exponeringsperioder och är därför dyra och långsamma för att ge meningsfulla resultat. Laboratorietester är dock ett mycket snabbare alternativ till testmetoder för att bevara trävaror mot angrepp av marina träborrar, vilket möjliggör en snabb utvärdering av justeringar av behandlingsscheman13. Resultaten från detta snabba laboratorieexperiment är utformade för att informera nya modifieringsprocesser av trä och för att identifiera träslag med naturlig hållbarhet för borrskador. En låg matningshastighet och vitalitet kan indikera ökat motstånd i potentiella produkter och denna information kan sedan matas tillbaka till branschpartners så att de kan förbättra designen. Vår metod möjliggör en smidig och snabb respons, vilket är önskvärt inom industrin, och när lovande produkter har identifierats kan resultaten kompletteras med resultaten från marina försök.
Gribbles (Limnoria) är ett släkte av isopod kräftdjur i familjen Limnoriidae. Det finns över 60 arter av Limnoria över hela världen13,14,15, med tre vanliga arter som finns i Storbritannien, Limnoria lignorum, Limnoria tripunctata och Limnoria quadripunctata16. De borrade tunnlar på ytan av trä som är nedsänkt i havsvatten, vilket ofta orsakar ekonomiskt betydande skador. Gribbles är mycket rikliga i brittiska kustvatten och är lätta att underhålla under laboratorieförhållanden, vilket gör dem till idealiska organismer för studier av tränedskränkning av marina träuppborrningsstörtverk. Utvärdering av utfodringshastigheter och vitalitet av gribbles på olika träslag och träbevarande metoder kan bestämma effektiviteten av deras motståndskraft mot biologisk nedbrytning. I följande protokoll fastställs en standardmetod för mätning av gribblematningshastigheter, utvecklad från den som beskrivs av Borges och kollegor12,17, förutom att effektivisera införandet av bildanalys för att göra processen fungerande i icke-specialiserade laboratorier. Bildanalys används också för att minska de praktiska begränsningarna för att manuellt räkna ett stort antal prover. Hållbarhet i långsiktiga marina tester, enligt den brittiska standarden EN350-1:1994, graderas med hänvisning till Pinus sylvestris sapwood18. I de kortsiktiga laboratorietester som presenteras här använder vi skotsk tall (Pinus sylvestris L) sapwood som en kontroll för att testa kärnved av arten ekki (Lophira alata Banks ex C.F Gaertn), bok (Fagus sylvatica L), söt kastanj (Castanea sativa Mill) och terpentin (Syncarpia glomulifera (Sm.) Nied). Genomsnittlig produktion och vitalitet av fekal pellet bland åtta replikat per träslag användes som en indikator på hållbarhet. Vi tillhandahåller illustrativa data som samlats in från en typisk utvärdering, med hjälp av gribblearten Limnoria quadripunctata och en rad naturligt hållbara träslag. Limnoria quadripunctata, som identifieras av de nycklar som Menzies (1951) tillhandahöll, valdes som den optimala arten för biologisk nedbrytningsförsök på grund av att det är den mest välstuderade medlemmen i familjen och är väletablerad som en modellart för användning i biologiska försök. Detta protokoll är också tillämpligt för att testa skogar av olika behandlingar även om den kontroll som används bör vara obehandlade replikationer av samma art.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbereda testpinnar
- När alla behandlingsprocesser är klara ska du skära torrt trä i testpinnar i storlek 2 mm x 4 mm x 20 mm (figur 1). Lufttorr håller fast vid en konstant vikt, under laboratorieförhållanden. Använd minst 5 replikat av varje trä som testas.
Figur 1: Testpinnar som används vid kortvarig laboratorietestning för att bedöma gribblematningshastigheter. Testa träpinnar i storlek 2 mm x 4 mm x 20 mm. Från vänster till höger: ekki, terpentin, söt kastanj och bokhjärtat och skotsk tallsawood. Skalstreck 4 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Vakuumimpregnering
- Efter beredning av trä (dvs. skärning och behandling, om tillämpligt), placera pinnarna under ett nät i en livsmedelssäker plastbehållare, inuti vakuumavsickatorn och byt ut locket så att det finns en tät tätning, underlättad av en beläggning av vakuumfett (figur 2).
- Fäst en trevägsventil mellan slangen som förbinder avsickatorn och pumpen, med ett tredje rör som leder till utomhusluften (figur 2). Se till att trevägsventilen är stängd för luften och kör pumpen för att uppnå ett vakuum på mellan -0,75 och -1,0 bar i vakuumavsickatorn och håll detta vakuum i 45 minuter - 1 timme.
- Doppa den öppna änden av det tredje röret i en behållare med havsvatten. Stäng av pumpen och stäng ventilen som leder till pumpen och öppna sedan ventilen långsamt tills havsvattnet dras av vakuumet in i avsöndrings- Låt vattnet flöda tills det fyller plastbehållaren, över masknivån.
- Dra sedan tillbaka röret från havsvattnet i behållaren, så att luft kan komma in, tills desiccatorn återgår till atmosfärstrycket. Håll pinnarna nedsänkta under nätet tills de sjunker till botten av plastbehållaren.
Figur 2: Utrustning som används för att dammsuga impregnerade träpinnar med havsvatten, som förberedelse för utfodring av gribbles under en laboratoriematningsanalys. A) Vakuumavsickare; B) Pump; C) Tryckmätare för vakuumavsickatorn. D) Trevägsventilen som leder till vakuumavsöndring, pump och till utomhusluft eller havsvatten (orange rör). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Utlakning av trä
- Dränk havsvattenmättade testpinnar i havsvatten i 50 ml rör (figur 3). Byt ut vatten regelbundet i 20 dagar.
OBS: Utlakningsprocessen gäller allt experimentellt trä som testas, inklusive behandlade eller naturliga träslag.
- Dränk havsvattenmättade testpinnar i havsvatten i 50 ml rör (figur 3). Byt ut vatten regelbundet i 20 dagar.
Figur 3: Lak utlakning från träpinnar för beredning för utfodring till gribbles under en laboratoriematningsanalys. Trä som var helt nedsänkt i havsvatten som fanns i ett 50 ml Falcon-rör, med regelbunden vattenförändring (1-3 dagar), producerade tydligt färgat lakvatten. Från vänster till höger lak ut från hjärtved av; söt kastanj, terpentin, ekki och bok och skotsk tallsawood. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
2. Extrahera Gribble
- Extrahera enskilda exemplar av gribble från ett infekterat träblock. Använd ett par fina tångar och en tunn (storlek 000/0,4 mm eller mindre) pensel. Skala försiktigt tillbaka allt trä som täcker gribblehålan med tångarna
OBS: Hålor finns på träytan och kan identifieras med små hål (figur 4). - När gribble har exponerats, använd en pensel för att försiktigt plocka upp individer underifrån och deponera i en petriskål fylld med havsvatten. Kontrollera gribble under ett mikroskop för att identifiera arter och för att säkerställa att inga skador orsakades under utsugning.
OBS: Att slå pleopoder är ett tecken på vitalitet.- Kassera alla honor som grubblar ägg eftersom gravida honor har en minskad utfodringskapacitet.
Bild 4: Bild av en gribble håla med två typiska ventilationshål. L. quadripunctata håla på en pinne radiata tallträ, storlek 2 mm x 4 mm x 20 mm. Två mindre ventilationshål kan ses bredvid hålingången. Skalstreck 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Identifiera Limnoria quadripunctata
- Identifiera Limnoria quadripunctata under ett stereomikroskop av de fyra distinkta tuberclesna, ordnade i ett kvadratiskt mönster, på djurets pleotelson förutom en X-formad carina på den femte pleonit19 (figur 5).
Bild 5: Limnoria quadripunctata identifierande funktioner. Bild av dorsal yta Limnoria quadripunctata, tagen på ett stereomicroscope vid x20 förstoring. Identifierande funktioner som visas av röd pil - indikerar den X-formade carina och blå pilen - indikerar fyra tubercles på pleotelson. Skalstreck 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Förbereda brunnsplattor
- Placera en teststicka och 5 ml ofiltrerat havsvatten, mellan 32–35 PSU, per brunn (figur 6) i flerbrunnstallerplattor med 32-35 PSU-brunnar (figur 6).
- Placera behandlingar/träslag systematiskt i hela brunnsplattan så att varje träslag representeras minst en gång per tallrik. Lägg till en gribble per brunn.
OBS: Temperaturen bör hållas stabil i en inkubator vid 20 °C ± 2 °C för arten L. quadripunctata, andra arter av Limnoria kan användas med justeringar av temperaturen som gjorts för att passa den specifika arten. - Håll plattorna i konstant mörka förhållanden eftersom fotoperioden inte påverkar gribblematningshastigheten15.
Figur 6: Experimentellt inrättat för gribblematningsanalys. Ett exempel på en 12 multi-well plate som används vid laboratorietestning av gribblematningshastighet. Varje brunn innehåller 5 ml havsvatten och en teststicka (20 mm x 4 mm x 2 mm) av olika träslag. Scots Pine sapwood och ekki, bok, söt kastanj och terpentinhjärtat. Skalstreck 20 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Samla in och räkna fekala pellets och bedöma vitalitet.
- Två gånger i veckan, ta bort teststickan och varje gribble (en per brunn) från brunnsplattan och placera i en nyberedd brunnsplatta (innehållande 5 ml havsvatten per brunn [32-35 PSU, 18-22 °C]).
- Använd en pensel för att försiktigt borsta bort avföringspellets från pinnen innan du överför och behåller fekalpelletsen i den ursprungliga brunnen.
OBS: Innan gribblen överförs till en ny brunnsplatta kan vitaliteten bedömas på en skala 1-5; 1= död, 2 = passiv, inte på träet, 3 = aktivt simma eller slå pleopoder, inte på träet, 4 = krypande på träets yta, 5 = grävt i träet. - Bildbehandling
- Använd en fin pensel för att separera eventuella klumpar så att enskilda pellets är synliga och borsta pellets bort från brunnens kanter. Ta ett detaljerat fotografi under ett stereomikroskop, vid förstoring x4 och ladda upp till en dator (bild 7).
OBS: Se till att pelletsen är i fokus och att bakgrunden är likformig, utan skuggor eller ljusreflektioner på vattenytan.
- Använd en fin pensel för att separera eventuella klumpar så att enskilda pellets är synliga och borsta pellets bort från brunnens kanter. Ta ett detaljerat fotografi under ett stereomikroskop, vid förstoring x4 och ladda upp till en dator (bild 7).
Bild 7: Bild av gribble fekala pellets. L. quadripunctata fekala pellets (små, cylindriska, bruna pellets) från utfodring på Radiata tallträ i en brunn av en multi-well plate. Tagen vid x4 förstoring. Bilder före manipulering för bildanalys (se figur 7). A) Exempel på en lämplig bild som ska användas för automatisk räkning i ImageJ. Pellets är tillräckligt utspridda och bort från brunnens kanter. Brunnen är centrerad och det finns inga hinder eller reflektioner. B) Ett exempel på en bild som är olämplig för bildanalys. Brunnen är off-center, skär av den nedre halvan. Blå (prickad) cirkel visar ljusreflektion från vattnets yta. Orange (fast) cirkel visar pellets som klumpas ihop för nära varandra och för nära brunnens kant. Röd (streckad) cirkel visar ett flis som inte togs bort. Skalstreck 10 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Process för att generera fekalt pelletantal med ImageJ.
- Ladda ned ImageJ (senaste versionen från 03/08/21, 1.8.0_172) från https://imagej.nih.gov/ij/download.html eller kör från datorns webbläsare.
- Ladda upp en hög med bilder genom att dra och släppa eller genom att välja Arkiv | Importera | Bildsekvens | Bläddra. Ändra inga parametrar och välj sedan Okej.
- Använd sedan cirkelverktyget för att välja den nedre delen av brunnen som innehåller fekala pellets. Ta bort brunnskanterna, välj Redigera | Rensa utanför. Gör bilden binär väljer du Process | Gör binär.
- Kalibrera genom att välja Analysera | Ange skala och välj antalet pixlar per millimeter för bilden (till exempel 10 pixlar = 1 mm). Räkna pelletsen, välj Analysera | Analysera partiklar.
- I rutan bredvid Storlek (enhet2) väljer du ett lägre tröskelvärde som är samma som den minsta pelleten, med hjälp av enhetsskalan som ställts in tidigare (till exempel om 10 pixlar = 1 mm och den minsta pelleten är 0,5 mm, välj 5-oändlighet).
- Välj Dispositioner i listrutan Visa och markera sedan Sammanfatta och tryck på Okej (bild 8).
OBS: Mer information finns på https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/index.html
Bild 8: Ett flödesdiagram över den process som används i ImageJ för att räkna fekala pellets. A) Importera en bildsekvens på fliken Arkiv i ImageJ. B) B) Bläddringsknappen i dialogrutan Importera bildsekvens för att importera en sekvens av bilder från en lokal enhet. C) Använd cirkelverktyget för att markera område som innehåller fekala pellets D) Avmarkera knappen Rensa utsida i området redigera flik för att ta bort utanför det markerade området. E) Gör binär knapp på processfliken F) Ange skalningsknappen på fliken Analysera. Avståndet i pixlar motsvarar antalet pixlar till en måttenhet (mm). G) Knappen Analysera partiklar på fliken Analys. Storlek (enhet^2) inställd på det lägre tröskelvärdet för fekal pelletsstorlek, i pixlar, till oändlighet. Visa "dispositioner" och "sammanfattning" väljs. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
-
Dataanalys
- Konvertera pelletsantal till pellets per dag, vilket ger och indirekt mått på utfodringshastigheten. Kassera data från alla mullrande individer de dagar som stönande inträffade (figur 9).
OBS: Moulting sker över 1-3 dagar och kan identifieras när en fullständig moult av exoskelettet kan ses.
- Konvertera pelletsantal till pellets per dag, vilket ger och indirekt mått på utfodringshastigheten. Kassera data från alla mullrande individer de dagar som stönande inträffade (figur 9).
Bild 9: Exempel på en gribble moult. Gribble (L. quadripunctata) moulting, på en Radiata tall trä teststicka storlek 20 mm x 4 mm x 2 mm. Moults indikeras av röda cirklar. Skalstreck 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett utfodringsexperiment av L. quadripunctata genomfördes under 20 dagar, med hjälp av fem olika trätyper (skotsk tall (Pinus sylvestris L) sapwood och kärnved av bok (Fagus sylvatica L), ekki (Lophira alata Banks ex C. F Gaertn), söt kastanj (Castanea sativa Mil) och terpentin (Syncarpia glomulifera (Sm.) Neid)) (Se tabell över material), i november 2020. Åtta replikatpinnar användes per träslag och ett exemplar av Limnoria quadripunctata matades per pinne. Alla gribble förvärvades från lager som underhålls i akvarier vid Institute of Marine Sciences, University of Portsmouth, Storbritannien. Bestånden kompletteras regelbundet med vilda samlingar från Englands sydkust. Djur acklimatiseras väl till de stabila och konsekventa odlingsförhållandena före experimentet. Träpinnar (20 mm x 4 mm x 2 mm) läckte ut i havsvatten i två veckor före utfodringsförsöket. En gribble, en teststicka och 5 ml havsvatten placerades per brunn i en 12 multibrunnplatta och hölls i en inkubator vid stabila förhållanden på 20 °C (± 0,2 °C) och i konstant mörka förhållanden. Fekala pellets räknades och samlades in var 2 till 5 dag, med fullständiga vattenförändringar vid varje samling. Åtta replikat av varje träart användes, vilket gav totalt fyrtio pinnar med en individuell gribble vardera. Havsvatten som används för utlakning av trä och användes under hela experimentet erhölls direkt från akvariet som används för att baka exemplar. Havsvattenförhållandena är stabila i akvariet och stabila i inkubatorn. Avdunstning från den lilla mängd vatten som används per brunn minimeras av brunnsplattornas lockkonstruktion och fulla vattenförändringar som inträffar var 2-5 dag.
Pellets räknades automatiskt med bild J (version 1.8.0_112).
Gribble matning på skotskt tallsavsavved som en kontroll, producerade de mest fekala pellets per dag konsekvent, bortsett från på dag 20 där pelletsproduktionen blev omkörd av bok. Ekki producerade de lägsta fekala pellets per dag av alla testade träslag. Den näst högsta fekala pelletsproduktionen sågs på bok, följt av söt kastanj och terpentin. Produktionen av fekal pellet i alla arter ökade från dag 5 till dag 7. Pelletsproduktionen minskade i alla arter, förutom ekki, mellan dag 7 och dag 12, möjligen på grund av den ökade tiden mellan vattenförändringar. Därefter förblev produktionen av fekal pellet ganska konsekvent bland var och en av träarterna. Från dag 14 minskade skotsk tall i daglig produktion av fekal pellet, medan bok ökade (figur 10).
Figur 10: Antal fekala pellets per dag (n=40) (medelvärde ± SE) som produceras av L. quadripunctata med hjälp av olika träslag under 20 dagar. Terpentin, söt kastanj, bok och ekki heartwood testas, med skotsk tallsav som kontroll. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Den högsta vitaliteten av poäng (5) sågs hos de flesta individer som matar på skotsk tallved, förutom den enda döda individen. 5 anger djur som har grävt sig in i träet och detta sågs endast på skotsk tallsavskog och bokhjärtat. På dag 12 för skotsk tall och dag 20 för bok hade alla levande individer grävt sig in i skogen. Söt kastanj hade den högsta procentuella dödligheten men ökade inte med tiden. Resten av levande individer stannade på en vitalitet av 4 (krypande på träytan), bortsett från på dag 14 där två individer var av träet (vitalitet 3). Ekki och terpentin hade också majoriteten av individer på en vitalitet av 4 under experimentets varaktighet, förutom vid dag 14 och dag 5 för terpentin. Dödligheten visade inte en ökning över tid över någon av träarterna. Endast rynkning sågs öka på skotsk tall och bok medan de andra tre träarterna mestadels förblev på en vitalitet på 4 (figur 11).
Figur 11: Individers vitalitet över tid, i procent av replikat, som livnär sig på olika träslag. Terpentin, söt kastanj, bok och ekki heartwood testas, med skotsk tallsav som kontroll. Av åtta replikat per träslag plottades andelen vid olika vitaliteter under den 20 dagar långa försöksperioden. Mörkblå representerar en vitalitet på 5 (grävande), ljusblå en vitalitet på 4 (på trä), grå en vitalitet på 3 (av trä men aktiv), lila en vitalitet på 2 (av trä och passiv) och svart visar en vitalitet på 1 eller döda individer. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Resultat från denna testmetod kan användas för att identifiera trätyper eller behandlingar som har en ökad motståndskraft mot marina träborrskador. Därefter kan marina fältförsök, som beskrivs i den europeiska standarden EN 275, genomföras och hållbarheten kan graderas (0= "ingen attack", 1= "lätt attack", 2= "måttlig attack", 3= "allvarlig attack", 4="misslyckande"20) utöver jämförelsen med icke-hållbart kontrollträ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Innan du väljer gribbleprover som ska användas i utfodringsexperimentet bör individer screenas för att bedöma deras lämplighet. Det kan finnas en viss variation i utfodringshastigheten mellan individer på grund av skillnader i storlek, så endast fullvuxna vuxna exemplar bör väljas. Ingen signifikant skillnad mellan utfodringshastigheten hos individer mellan 1,5 mm och 3 mm längd upptäcktes av Borges m.fl., 200917. Kvinnlig Limnoria grubblar sina ägg, under vilken tid har en minskad utfodringshastighet. Därför bör alla grubblande honor kontrolleras och kasseras när man väljer exemplar. På samma sätt kommer moulting individer också att ha en minskad utfodringshastighet21. Därför bör fekal pellet räknas på dagar då individer moulting kasseras17. Eftersom mullrande sker i mer än en dag räknas moults när en fullständig exoskelettmoult kan ses på pelletssamlingsdagar. Limnoria, när de skapar sina hålor, har en ökad fekal pelletsproduktion och kommer också att producera fler frass (fint träavfall som inte ingår i fekala pellets). De höga nivåerna av frass kan störa identifieringen av fekala pellets men kan försiktigt avlägsnas under stereomikroscope observation, med hjälp av en pipett eller fin pensel, före bildtagning för automatisk räkning. Alternativt kan pellets räknas manuellt.
Programvaran ImageJ kräver kvalitet, i fokus bilder för bildbehandling. För detta ändamål bör bilder tas där fekala pellets inte hindras av brunnsväggarna och en pensel bör användas för att separera enskilda fekala pellets. Bildens bakgrund måste vara enhetlig utan ljus- eller skuggområden, vilket skulle störa när bilden omvandlas till binär för bearbetning i ImageJ. Det finns inget behov av att justera kontrast eller ljus före bildbehandling. När du importerar en hög med bilder måste alla fotografier tas i samma plan så att inga fel uppstår under bearbetningen.
Vakuumimpregnering av trä med havsvatten gör att träet sjunker och blir lättillgängligt för gribble. Utlakning av trä innan det exponeras för gribbles kommer att ta bort alla vattenlösliga extraktiv som kan påverka deras utfodringshastighet eller orsaka dödlighet12. Dödlighet på grund av extraktiver i vattnet är inte representativ för den dödlighet som kan förväntas i havet, där extraktiverna snabbt kommer att spädas ut. Brunnsplattor bör hållas vid en konstant temperatur som är optimal för gribblearten som testas. Den vanliga sydstatsarter, L. quadripunctata, matar bra mellan 15 och 25 °C och har en optimal matningshastighet vid 20 °C17 så att brunnsplattor bekvämt kan hållas i en inkubator vid en konstant 20 °C ± 0,5 °C.
Bedömning av vitaliteten hos utfodringsgripen detekterar subletala eller pre-dödliga effekter av träbehandlingar eller naturligt hållbart timmer. En hög vitalitet på 5 indikerar att gribble visar naturligt beteende genom att gräva in i träet och inte lider någon negativ effekt av kontakt med det. En vitalitet på 4 visar att även om den inte har grävt in i träet, är gribble fortfarande bekväm att krypa längs dess yta. En poäng på 3 ges till gribble som inte är på träet, men istället aktivt simmar i vattnet eller är stationära men med snabbt slå ben och pleopods. En låg vitalitet på 2 innebär att gribble exponeras och / eller har lite energi. Detta kan bero på en längre period med låg utfodringshastighet eller från extraktiv som antingen läcker ut i vattnet eller blir tillgänglig under utfodring. Om hög dödlighet ses efter 7-8 veckor kan detta bero på svält, eftersom svältande gribbles (hålls i brunnar med bara 5 ml havsvatten och inget trä) kan överleva så länge (personlig observation).
Fördelarna med att använda en kortsiktig laboratorieanalys i motsats till långsiktiga marina fältförsök är att nya behandlingar och träprodukter snabbt kan testas för att identifiera deras potential att användas kommersiellt. Dessutom kan sådana analyser underlätta snabb optimering av behandlingsprocesser. Om en betydligt lägre fekal pelletsproduktion ses jämfört med ett kontrollträ, kan testning kompletteras med marina försök. Slevin et al., 201523 och Westin et al., 201624 visar ett gott samband mellan laboratorie- och fältbedömningar genom att testa samma trä i två olika miljöer, vilket indikerar en kapabel prediktiv förmåga hos den förra. En kortsiktig analys kan köras i flera veckor. Svälta gribbles kan överleva i 7-8 veckor när de hålls i väl luftat vatten utan trä (personlig observation) vilket kan ge ytterligare jämförelse om man undersöker dödlighetssvaret på olika typer av skogar. Genom nyligen opublicerade observationer finns det dock ingen signifikant fluktuation i fekal pelletsproduktion under en tidsperiod som är längre än 20 dagar, förutom när dödligheten börjar inträffa. Dessutom pågår tidigare metoder, som de som används av Borges et al., 2008 och 2009, i 15 dagar. Därför är 20 dagar en tillräckligt lång tid för ett snabbt laboratoriebaserat test för att ge indikation på trähållbarhet.
Även om denna metod är lämplig för kortsiktiga försök, bör resultaten kompletteras med långsiktiga marina fältexperiment. Laboratorieförhållandena kan inte återskapa de olika biotiska och abiotiska faktorer som kan påverka trä i den marina miljön. Biofouling organismer, tillsammans med andra arter av marina träborrar (såsom skeppsmaskar) kan fortfarande vara närvarande och orsaka skador på träet25,26. Dessutom kan nötning från vågkastad bältros eller sand slita ner trä, som sedan kan bli tillgängligt för gribbles27. En standardlaboratoriummetod kan dock ge en första screening av nya produkter som visar lovande för marina tillämpningar. Genom att bedöma fekal pelletsproduktion och vitalitet kan trä som är bättre på att minska gribblematningshastigheten identifieras.
På grund av reglerna och begränsningarna av träskyddsmedel, såsom CCA och kreosot, är det viktigt att hitta nya produkter som ersätter dessa behandlingar. Timmer är föremål för hög biologisk nedbrytbarhet i den marina miljön men är fortfarande ett av de mest förnybara byggmaterialen som finns och behåller sin styrka och struktur väl i havsvatten27,28. Timmer som är resistent mot biologisk nedbrytbarhet kommer inte bara att minska kostnaderna utan också vara mer miljövänligt än att använda alternativa material som betong eller stål, som kräver hög energitillförsel under tillverkningen29,30, eller biocidskyddsmedel med bredspektrum som kan läcka ut och påverka det omgivande ekosystemet31,32,33,34,35,36, 37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter relaterade till denna studie.
Acknowledgments
Tack till Norges forskningsråd (Oslo Regional Fund, Alcofur rffofjor 269707) och University of Portsmouth (Faculty of Science PhD research bursary) för att ha tillhandahållit finansiering för studierna av Lucy Martin. Dessutom till Gervais S. Sawyer som tillhandahöll träet som användes för att generera de representativa resultaten. Turpentin tillhandahölls av prof. Philip Evans vid University of British Columbia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 150200 | |
| 50ml Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Adjustable volume pipette | Fisher Scientific | FBE10000 | 1-10 ml |
| Beech | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Fagus sylvatica | Taxonomic authority: L |
| Ekki | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Lophira alata | Taxonomic authority: Banks ex C. F. Gaertn. |
| Forceps | Fisher Scientific | 10098140 | |
| Incubator | LMS LTD | INC5009 | |
| Microporous specimen capsules | Electron Microscopy Sciences | 70187-20 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Scots Pine | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Pinus sylvestris | Taxonomic authority: L. |
| Size 00000 paintbrush | Hobby Craft | 5674331001 | Size 000 or 0000 also acceptable |
| Sweet Chestnut | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Castanea sativa | Taxonomic authority: Mill |
| Turpentine | P. Evans (Professor, Dept. Wood Science, University of British Columbia) | Syncarpia glomulifera | Taxonomic authority: (Sm.) Nied. |
| Vacuum desiccator | Fisher Scientific | 15544635 |
References
- Morrell, J. J. Protection of wood-based materials. Handbook of environmental degradation of materials, 3rd ed. Kutz, M. , Elsevier Science and Technology Books. Oxford. 343-368 (2018).
- Distel, D. L. The biology of marine wood boring bivalves and their bacterial endosymbionts. Wood deterioration and preservation. Goodell, B., Nicholas, D., Schultz, T. , American Chemical Society. Washington, D.C. 253-271 (2003).
- Buslov, V., Scola, P. Inspection and structural evaluation of timber pier: case study. Journal of Structural Engineering. 117 (9), 2725-2741 (1991).
- US EPA. Registration Eligibility Decision for Chromated Arsenicals. List A, Case No. 0132. US EPA - Office of prevention, pesticides and toxic substances. , Available from: https://swap.stanford.edu/20110202084/http://www.epa.gov/oppsrrd1/reregistration/REDs/cca_red.pdf 800-807 (2008).
- Arsenic timber treatments (CCA and arsenic trioxide) review scope document, Review series 03.1. ISSN number 1443. Australian pesticides and veterinary medicines authority. , Available from: https://apvma.gov.au/sites/default/files/publication/14296-arsenic-timber-review-scope.pdf (2003).
- Commission directive 2003/2/EC of 6 January 2003 relating to restrictions on the marketing and use of arsenic (tenth adaptation to technical progress to Council Deretive 76/769/EEC). Official Journal of the European Communities. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/eudr/2003/2/adopted (2003).
- The Hazardous Waste (England and Wales) Regulations 2005 No.894. Environmental Protection England and Wales. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/uksi/2005/894/contents/made (2005).
- Palanti, S., Cragg, S. M., Plarre, R. Resistance against marine borers: About the revision of EN 275 and the attempt for a new laboratory standard for Limnoria. International Research Group on Wood Preservation, Document No. IRG/WP 20-20669. , (2020).
- The European Commission for Standardization. EN 275:1992. Wood preservatives- Determination of the protective effectiveness against marine wood borers. The European Commission for Standardization (CEN). , (1992).
- European Commission. Directive 98/8/EC concerning the placing of biocidal products on the market. Communication and Information Resource Centre for Administrations, Businesses and Citizens. , (2010).
- Mantanis, G. I. Chemical modification of wood by acetylation or furfurylation: A review of the present scaled-up technologies. BioResources. 12 (2), 4478-4489 (2017).
- Borges, L. M. S., Cragg, S. M., Bergot, J., Williams, J. R., Shayler, B., Sawyer, G. S. Laboratory screening of tropical hardwoods for natural resistance to the marine borer Limnoria quadripunctata: The role of leachable and non-leachable factors. Holzforschung. 62 (1), 99-111 (2008).
- Cragg, S. M., Pitman, A., Henderson, S. Developments in the understanding of the biology of marine wood boring crustaceans and in methods of controlling them. International Biodeterioration & Biodegradation. 43 (4), 197-205 (1999).
- Cookson, L. J., Vic, M. D. C.
- Cookson, L. Australasian species of Limnoriidae (Crustacea: Isopoda). Memoirs of the Museum of Victoria. 52 (2), 137 (1991).
- Jones, L. T. The geographical and vertical distribution of British Limnoria [Crustacea: Isopoda]. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 43 (3), 589-603 (1963).
- Borges, L. M. S., Cragg, S. M., Busch, S. A laboratory assay for measuring feeding and mortality of the marine wood borer Limnoria under forced feeding conditions: A basis for a standard test method. International Biodeterioration & Biodegradation. 63 (3), 289-296 (2009).
- BSI Standards Publication. BS EN 350:2016. Durability of wood and wood-based products - Testing and classification of the durability to biological agents of wood and wood-based materials. BSI Standards Publication. , (2016).
- Menzies, R. The phylogeny, systematics, distribution, and natural history of limnoria. , University of Southern California. Dosctoal dissertation 196-208 (1951).
- Palanti, S., Feci, E., Anichini, M. Comparison between four tropical wood species for their resistance to marine borers (Teredo spp and Limnoria spp) in the Strait of Messina. International Biodeterioration & Biodegradation. 104, 472-476 (2015).
- Delgery, C. C., Cragg, S. M., Busch, S., Morgan, E. Effects of the epibiotic heterotrich ciliate Mirofolliculina limnoriae and moulting on the faecal pellet production by the wood-boring isopods Limnoria tripunctata and Limnoria quadripunctata. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 334 (2), 165-173 (2006).
- Morrell, J. J., Helsing, G. G., Graham, R. D. Marine wood maintenance manual: a guide for proper use of Douglas-fir in marine exposures. Forest Research Laboratory. , Oregon State University. Corvallis. Research Bulletin 48 (1984).
- Slevin, C. R., Westin, M., Lande, S., Cragg, S. Laboratory and marine trials of resistance of furfurylated wood to marine borers. Eighth European Conference on Wood Modification. , Aalto University. 464-471 (2015).
- Westin, M., et al. Marine borer resistance of acetylated and furfurylated wood - results from up to 16 years of field exposure. International Research Group on Wood Preservation. , Document No. IRG/WP 16-40756 (2016).
- Westin, M., Rapp, A., Field Nilsson, T. Field test of resistance of modified wood to marine borers. Wood Material Science and Engineering. 1 (1), 34-38 (2006).
- Borges, L. M. S. Biodegradation of wood exposed in the marine environment: Evaluation of the hazard posed by marine wood-borers in fifteen European sites. International Biodeterioration & Biodegradation. 96 (1), 97-104 (2014).
- Treu, A., et al. Durability and protection of timber structures in marine environments in Europe: An overview. BioResources. 14 (4), 10161-10184 (2019).
- Williams, J. R., Sawyer, G. S., Cragg, S. M., Simm, J. A questionnaire survey to establish the perceptions of UK specifiers concerning the key material attributes of timber for use in marine and freshwater engineering. Journal of the Institute of Wood Science. 17 (1), 41-50 (2005).
- Purnell, P. The carbon footprint of reinforced concrete. Advances in Cement Research. 25 (6), 362-368 (2013).
- Hill, C. A. S. The environmental consequences concerning the use of timber in the built environment. Frontiers in Built Environment. 5, 129 (2019).
- Mercer, T. G., Frostick, L. E. Leaching characteristics of CCA-treated wood waste: a UK study. Science of the Total Environment. 427, 165-174 (2012).
- Brown, C. J., Eaton, R. A., Thorp, C. H. Effects of chromated copper arsenate (CCA) wood preservative on early fouling community formation. Marine Pollution Bulletin. 42 (11), 1103-1113 (2001).
- Brown, C. J., Eaton, R. A. Toxicity of chromated copper arsenate (CCA)-treated wood to non-target marine fouling communities in Langstone Harbour, Portsmouth, UK. Marine Pollution Bulletin. 42 (4), 310-318 (2001).
- Brown, C. J., Albuquerque, R. M., Cragg, S. M., Eaton, R. A. Effects of CCA (copper-chrome-arsenic) preservative treatment of wood on the settlement and recruitment of wood of barnacles and tube building polychaete worms. Biofouling. 15 (1-3), 151-164 (2000).
- Lebow, S. T., Foster, D. O., Lebow, P. K. Release of copper, chromium and arsenic from treated southern pine exposed in seawater and freshwater. Forest Products Journal. 49 (7), 80-89 (1999).
- Smith, P. T. Risk to human health and estuarine posed by pulling out creosote-treated timber on oyster farms. Aquatic Toxicology. 86 (2), 287-298 (2008).
- Brown, C. J., et al. Assessment of Effects of Chromated Copper Arsenate (CCA)-Treated Timber on Nontarget Epibiota by Investigation of Fouling Community Development at Seven European Sites. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 45 (1), 0037-0047 (2003).
