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Testes rápidos de resistência da madeira à biodegradação por crustáceos chatos da madeira marinha

Published: January 29, 2022 doi: 10.3791/62776
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 1
1University of Portsmouth, 2Microbiology Department, University of Massachusetts

Summary

Este protocolo apresenta um método para avaliar a taxa de alimentação do crustáceo chato de madeira, Limnoria, medindo a produção de pelotas fecais. Este método foi projetado para uso em laboratórios não especializados e tem potencial para incorporação em protocolos de teste padrão, para avaliar a maior durabilidade da madeira em condições marinhas.

Abstract

Invertebrados chatos de madeira destroem rapidamente madeiras marinhas e infraestrutura costeira de madeira, causando bilhões de dólares de danos em todo o mundo todos os anos. Como os tratamentos de madeira com biocidas de amplo espectro, como creosote e arsênio de cobre cromado (CCA), são agora restritos no uso marinho pela legislação, espécies de madeira naturalmente duráveis e novos métodos de preservação da madeira são necessários. Esses métodos passam por testes para atender às normas regulamentares, como o padrão europeu para testar conservantes de madeira contra borers marinhos, EN 275. A investigação inicial de espécies de madeira duráveis ou tratamentos de conservantes de madeira pode ser realizada de forma rápida e barata através de testes laboratoriais, o que oferece muitas vantagens sobre ensaios de campo marinho que são tipicamente caros, esforços de longo prazo. Muitas espécies de Limnoria (gribble) são crustáceos chatos de madeira marinha. A limnoria é ideal para uso em testes laboratoriais de biodegradação de madeira por borers de madeira marinha, devido à praticidade de criá-los em aquário e à facilidade de medir suas taxas de alimentação em madeira. Aqui, descrevemos um teste laboratorial padronizado para avaliar a biodegradação de madeira usando gribble.

Introduction

Os borers de madeira podem causar danos extensivos às estruturas de madeira marinha, como defesas marítimas, píeres e estruturas de aquicultura; a substituição ou restauração da qual custa bilhões de dólares por ano em todo o mundo1,2,3. Para proteger essas estruturas, a madeira é frequentemente tratada para reduzir a biodegradação. No entanto, devido à restrição do uso de biocidas de amplo espectro na Austrália, UE, Reino Unido e EUA, no ambiente marinho, novas técnicas de modificação e espécies de madeira que são naturalmente duráveis aos borers são procuradas 4,5,6,7. Novas técnicas para a preservação da madeira no ambiente marinho exigem testes minuciosos para atender às normas regulamentares e limitar os impactos ambientais de riscos como o lixiviação de qualquer conservante químico. Por exemplo, o padrão europeu, EN 275, que é o padrão europeu atual a partir de 1992, é usado para avaliar tratamentos de preservação da madeira contra danos de madeira marinha 8,9. Essa norma, juntamente com outras legislações contra o uso de compostos biocidas, como CCA4,5,6,7 e creosote10, necessita de métodos sustentáveis e não tóxicos de proteção da madeira e uso de espécies de madeira naturalmente duráveis para substituir tratamentos biocidas11,12 . Ensaios marinhos, como os especificados na EN 275, exigem longos períodos de exposição e, portanto, são caros e lentos para produzir resultados significativos. Os testes laboratoriais, no entanto, fornecem uma alternativa muito mais rápida para testar métodos de preservação de produtos madeireiros contra ataque de madeira marinha, permitindo uma avaliação rápida dos ajustes nos horários de tratamento13. Os resultados deste rápido experimento laboratorial são projetados para informar novos processos de modificação da madeira e identificar espécies de madeira com durabilidade natural para danos de borer. Uma baixa taxa de alimentação e vitalidade podem indicar maior resistência em produtos potenciais e essas informações podem então ser devolvidas aos parceiros do setor para permitir que eles melhorem os projetos. Nosso método permite uma resposta ágil e rápida, que é desejável na indústria, e uma vez que produtos promissores foram identificados, os resultados podem ser complementados com os de ensaios marinhos.

Gribbles (Limnoria) é um gênero de crustáceo isópode na família Limnoriidae. Existem mais de 60 espécies de Limnoria em todo o mundo13,14,15, com três espécies comuns encontradas no Reino Unido, Limnoria lignorum, Limnoria tripunctata e Limnoria quadripunctata16. Eles carregavam túneis na superfície da madeira que está submersa na água do mar, muitas vezes causando danos economicamente significativos. Os gribbles são altamente abundantes em águas costeiras do Reino Unido e são fáceis de manter em condições laboratoriais, tornando-os organismos ideais para o estudo da biodegradação de madeira por invertebrados chatos à madeira marinha. Avaliar as taxas de alimentação e vitalidade dos gribbles em diferentes espécies de madeira e métodos de preservação da madeira pode determinar a eficácia de sua resistência à biodegradação. O protocolo a seguir estabelece um método padrão para medir as taxas de alimentação de gribble, desenvolvido a partir do descrito por Borges e seus colegas12,17, além de agilizar a introdução da análise de imagem para tornar o processo operável em laboratórios não especializados. A análise de imagem também é usada para reduzir as limitações práticas de contagem manual de grandes amostras. A durabilidade nos testes marítimos de longo prazo, de acordo com o Padrão Britânico EN350-1:1994, são classificados em referência a Pinus sylvestris sapwood18. Nos testes laboratoriais de curto prazo apresentados aqui, usamos o pinheiro escocês (Pinus sylvestris L) como controle para testar a madeira da espécie ekki (Lophira alata Banks ex C.F Gaertn), faia (Fagus sylvatica L), castanha doce (Castanea sativa Mill) e terpentina (Syncarpia glomulifera (Sm.) Nied). A produção média de pelotas fecais e a vitalidade entre oito réplicas por espécie de madeira foram utilizadas como indicador de durabilidade. Fornecemos dados ilustrativos coletados de uma avaliação típica, usando as espécies de gribble Limnoria quadripunctata e uma gama de espécies de madeira naturalmente duráveis. Limnoria quadripunctata, identificada pelas chaves fornecidas por Menzies (1951), foi selecionada como a espécie ideal para ensaios de biodegradação devido ao fato de ser o membro mais bem estudado da família e é bem estabelecida como uma espécie modelo para uso em ensaios de biodegradação. Este protocolo também é aplicável para testar madeiras de diferentes tratamentos, embora o controle utilizado deva ser replicações não tratadas da mesma espécie.

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Protocol

1. Preparando varas de teste

  1. Depois que todos os processos de tratamento estiverem concluídos, corte a madeira seca em varas de teste para tamanho 2 mm x 4 mm x 20 mm (Figura 1). O ar seco gruda em um peso constante, em condições laboratoriais. Use pelo menos 5 réplicas de cada madeira que está sendo testada.

Figure 1
Figura 1: Varas de teste usadas em testes laboratoriais de curto prazo para avaliar as taxas de alimentação de gribble.  Teste varas de madeira tamanho 2 mm x 4 mm x 20 mm. Da esquerda para a direita: ekki, terebintina, castanha doce e madeira de faia e madeira de pinheiro escocês. Barra de escala 4 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Impregnação de vácuo
    1. Pós-preparação da madeira (ou seja, corte e tratamento, se aplicável), coloque as varas sob uma malha em um recipiente plástico seguro para alimentos, dentro do dessecador de vácuo e substitua a tampa garantindo que haja uma vedação apertada, facilitada por um revestimento de graxa de vácuo (Figura 2).
    2. Conecte uma válvula de três vias entre a tubulação que liga o dessecador e a bomba, com um terceiro tubo que leva ao ar livre (Figura 2). Certifique-se de que a válvula de três vias esteja fechada ao ar e execute a bomba para obter um vácuo entre -0,75 a -1,0 barra dentro do desiccador de vácuo e segure este vácuo por 45 minutos - 1 hora.
    3. Submergir a extremidade aberta do terceiro tubo em um recipiente de água do mar. Desligue a bomba e feche a válvula que leva à bomba e abra lentamente a válvula até que a água do mar seja puxada pelo vácuo para dentro do desiccador. Deixe a água fluir até encher o recipiente plástico, acima do nível da malha.
    4. Em seguida, retire o tubo da água do mar no recipiente, permitindo a entrada de ar, até que o desiccador retorne à pressão atmosférica. Mantenha as varas submersas sob a malha até afundarem no fundo do recipiente de plástico.

Figure 2
Figura 2: Equipamento usado para aspirar varas de madeira impregnadas com água do mar, em preparação para alimentação para gribbles durante um ensaio de alimentação laboratorial.  A) Desiccator a vácuo; B) Bomba; C) Medidor de pressão para o desiccador de vácuo; D) A válvula de três vias que leva ao desiccador de vácuo, bomba e a ar livre ou água do mar (tubo laranja). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Leaching Wood
    1. Submerse as varas de teste saturadas da água do mar na água do mar contidas em tubos de 50 mL (Figura 3). Substitua a água regularmente por um período de 20 dias.
      NOTA: O processo de lixiviação se aplica a qualquer madeira experimental em teste, incluindo madeiras tratadas ou naturais.

Figure 3
Figura 3: Leachate de varas de madeira para preparação para alimentação a gribbles durante um ensaio de alimentação laboratorial.  Madeira totalmente submersa na água do mar contida em um tubo Falcon de 50 ml, com mudança de água regular (1-3 dias), produziu lixachate claramente colorido. Da esquerda para a direita leachate de heartwood de; castanha doce, terebintina, ekki, e faia e pinheiro escocês sapwood. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Extraindo gribble

  1. Extrair espécimes individuais de gribble de um bloco de madeira infestado. Use um par de fórceps finos e um pincel fino (tamanho 000/0,4 mm ou menor). Retire cuidadosamente qualquer madeira que está cobrindo a toca de gribble com as fórceps
    NOTA: As tocas são encontradas na superfície da madeira e podem ser identificadas por pequenos orifícios (Figura 4).
  2. Uma vez que gribble tenha sido exposto, use um pincel para pegar gentilmente indivíduos de baixo e depositar em uma placa de petri cheia de água do mar. Verifique o gribble sob um microscópio para identificar espécies e para garantir que nenhum dano tenha sido causado durante a extração.
    NOTA: Vencer pleópodes é sinal de vitalidade.
    1. Descarte qualquer fêmea que pense em ovos, pois as fêmeas gravid têm uma capacidade de alimentação reduzida.

Figure 4
Figura 4: Imagem de uma toca de gribble com dois orifícios típicos de ventilação. L. quadripunctata burrow em uma vara de madeira de pinheiro Radiata, tamanho 2 mm x 4 mm x 20 mm. Dois orifícios de ventilação menores podem ser vistos ao lado da entrada da toca. Barra de escala 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.  

  1. Identificação de Limnoria quadripunctata
    1. Identifique limnoria quadripunctata sob um estereomicroscópio pelos quatro tubérculos distintos, dispostos em um padrão quadrado, no pleotelson do animal, além de uma carina em forma de X no quinto pleonite19 (Figura 5).

Figure 5
Figura 5: Limnoria quadripunctata identificando características.  Imagem da superfície dorsal Limnoria quadripunctata, tirada em um estereómico na ampliação x20. A identificação de características mostradas por seta vermelha - indica a carina em forma de X e seta azul - indica quatro tubercles em pleotelson. Barra de escala 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Preparando placas de poço

  1. Em placas multi-poços com poços de diâmetro de 20 mm, coloque uma vara de teste e 5 mL de água do mar não filtrada, entre 32-35 PSU, por poço (Figura 6).
  2. Coloque tratamentos/espécies de madeira sistematicamente em toda a placa do poço para que cada tipo de madeira seja representada pelo menos uma vez por placa. Adicione um gribble por bem.
    NOTA: A temperatura deve ser mantida estável em uma incubadora a 20 °C ± 2 °C para a espécie L. quadripunctata, outras espécies de Limnoria podem ser usadas com ajustes na temperatura feita para se adequar às espécies específicas.
  3. Mantenha as placas em condições escuras constantes, pois o fotoperóudo não tem efeito na taxa de alimentação de gribble15.

Figure 6
Figura 6: Configuração experimental para ensaio de alimentação de gribble.  Um exemplo de uma placa de 12 multi-poços usada nos testes laboratoriais da taxa de alimentação de gribble. Cada poço contém 5 ml de água do mar e um bastão de teste (20 mm x 4 mm x 2 mm) de diferentes espécies de madeira; Scots Pine sapwood e ekki, faia, castanha doce, e madeira de coração de terpentina. Barra de escala 20 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Coleta e Contagem de Pelotas Fecais e Avaliação da Vitalidade.

  1. Duas vezes por semana, remova o bastão de ensaio e cada gribble (um por poço) da placa do poço e coloque em uma placa de poço recém-preparada (contendo 5 mL de água do mar por poço [32-35 PSU, 18-22 °C]).
  2. Use um pincel para escovar suavemente as pelotas fecais da vara antes de transferir e reter as pelotas fecais dentro do poço original.
    NOTA: Antes de transferir o gribble para uma placa de poço fresco, a vitalidade pode ser avaliada em uma escala de 1-5; 1= morto, 2 = passivo, não na madeira, 3 = ativamente nadando ou batendo pleópodes, não na madeira, 4 = rastejando na superfície da madeira, 5 = escavado na madeira.
  3. Processamento de imagens
    1. Use um pincel fino para separar qualquer aglomerado para que as pelotas individuais sejam visíveis e escove as pelotas longe das bordas do poço. Tire uma fotografia detalhada sob um microscópio estéreo, na ampliação x4 e faça upload para um computador (Figura 7).
      NOTA: Certifique-se de que as pelotas estão em foco e o fundo é uniforme, sem sombras ou reflexos de luz na superfície da água.

Figure 7
Figura 7: Imagem de balas fecais gribble. L. pelotas fecais quadripunctata (pequenas, cilíndricas, pelotas marrons) de se alimentar em madeira de pinheiro Radiata em um poço de uma placa multi-bem. Tomada na ampliação x4. Imagens anteriores à manipulação para análise de imagem (ver Figura 7). A) Exemplo de uma imagem adequada a ser usada para contagem automatizada no ImageJ. As pelotas estão suficientemente espalhadas para fora e longe das bordas do poço. O poço está centrado e não há obstruções ou reflexos. B) Um exemplo de uma imagem inadequada para análise de imagem. O poço está fora do centro, cortando a metade inferior. O círculo azul (pontilhado) mostra reflexo de luz fora da superfície da água. O círculo laranja (sólido) mostra pelotas que são agrupadas muito de perto e muito perto da borda do poço. O círculo vermelho (tracejado) mostra um chip de madeira que não foi removido. Barra de escala 10 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.  

  1. Processo para gerar contagem de pelotas fecais usando imageJ.
    1. Baixe ImageJ (versão mais recente em 21/03/08, 1.8.0_172) de https://imagej.nih.gov/ij/download.html ou executado a partir do navegador do computador.
    2. Carregue uma pilha de imagens arrastando e soltando ou selecionando arquivo | | de importação sequência de imagens | Navegue. Não altere nenhum parâmetro e selecione Ok.
    3. Em seguida, use a ferramenta de círculo para selecionar a seção inferior do poço que contém as pelotas fecais. Remova as bordas do poço, selecione Editar | Claro lá fora. Torne a imagem binária, selecione Processe | Faça binário.
    4. Calibrar selecionando análise | Defina escala e escolha o número de pixels por milímetro para a imagem (por exemplo 10 pixels = 1 mm). Conte as pelotas, selecione Analisar | Analise partículas.
    5. Na caixa ao lado do Tamanho (unidade2), selecione um limiar inferior que seja o mesmo que a menor pelota de tamanho, usando a escala da unidade definida anteriormente (por exemplo, se 10 pixels = 1 mm e a menor pelota for de 0,5 mm, escolha 5-infinito).
    6. Na caixa de soltar show, selecione Contornos e, em seguida, marque Resumo e pressione Okay (Figura 8).
      NOTA: Mais informações podem ser encontradas em https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/index.html

Figure 8

Figure 8.1
Figura 8: Um diagrama de fluxo do processo utilizado no ImageJ para contar pelotas fecais.  A) Importar uma sequência de imagem na guia Arquivo da ImageJ. B) O botão de navegação na caixa de diálogo 'Import Image Sequence' para importar uma sequência de imagens de um dispositivo local. C) Utilização da ferramenta de círculo para selecionar área que contenha pelotas fecais D) Limpe o botão externo na área da guia de edição para remover fora da área selecionada. E) Faça o botão binário na guia do processo. F) Defina o botão de escala na guia Analisar. A distância em pixels equivale ao número de pixels a uma unidade de medição (mm). G) Analisar o botão de partículas na guia Analisar. Tamanho (unidade^2) definido para o limiar inferior do tamanho da pelota fecal, em pixels, para o infinito. Mostrar 'contornos' e 'resumir' são selecionados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Análise de dados
    1. Converter pelotas conta em pelotas por dia, o que dá e medida indireta da taxa de alimentação. Descartar dados de qualquer indivíduo moulting nos dias em que ocorreu a moldagem (Figura 9).
      NOTA: A moldagem ocorre ao longo de 1-3 dias e pode ser identificada quando um molde completo do exoesqueleto pode ser visto.

Figure 9
Figura 9: Exemplo de um molde de gribble.  Gribble (L. quadripunctata) moldagem, em um bastão de teste de madeira de pinheiro Radiata tamanho 20 mm x 4 mm x 2 mm. Os moldes são indicados por círculos vermelhos. Barra de escala 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Representative Results

Um experimento de alimentação de L. quadripunctata foi realizado ao longo de 20 dias, usando cinco tipos diferentes de madeira (pinheiro escocês (Pinus sylvestris L) madeira de safira, e madeira de bepênula (Fagus sylvatica L), ekki (Lophira alata Banks ex C. F Gaertn), castanha doce (Castanea sativa Mil) e terebintina (Syncarpia glomulifera (Sm.) Neid)) (Ver Tabela de Materiais), em novembro de 2020. Oito bastões de réplica foram usados por espécie de madeira e um espécime de Limnoria quadripunctata foi alimentado por vara. Todos os gribbles foram adquiridos de ações que são mantidas em aquário no Instituto de Ciências Marinhas da Universidade de Portsmouth, Reino Unido. As ações são regularmente complementadas com coleções selvagens da costa sul da Inglaterra. Os animais estão bem aclimatados às condições culturais estáveis e consistentes antes do experimento. As varas de madeira (20 mm x 4 mm x 2 mm) foram lixiviadas na água do mar por duas semanas antes do ensaio de alimentação. Um gribble, um bastão de teste e 5 mL de água do mar foram colocados por poço em uma placa de 12 multi-poços e mantidos em uma incubadora em condições estáveis de 20 °C (± 0,2 °C) e em condições escuras constantes. Pelotas fecais foram contadas e coletadas a cada 2 a 5 dias, com trocas de água completas em cada coleta. Foram utilizadas oito réplicas de cada espécie de madeira, dando um total de quarenta paus com um gribble individual cada. A água do mar usada para lixiviação de madeira e utilizada durante todo o experimento foi obtida diretamente do aquário usado para criar espécimes. As condições da água do mar são estáveis no aquário e estáveis na incubadora. A evaporação do pequeno volume de água usado por poço é minimizada pelo desenho da tampa das placas do poço e mudanças completas de água que ocorrem a cada 2-5 dias.

As pelotas foram contadas automaticamente usando a Imagem J (versão 1.8.0_112).

Gribble alimentando-se de madeira de pinheiro escocês como controle, produziu as pelotas mais fecais por dia de forma consistente, além do dia 20, onde a produção de pelotas foi ultrapassada pela faia. Ekki produziu as pelotas fecais mais baixas por dia de todas as espécies de madeira testadas. A segunda maior produção de pelotas fecais foi vista na faia, seguida por castanha doce e terebintina. Houve aumento na produção de pelotas fecais em todas as espécies do dia 5 ao dia 7. A produção de pelotas caiu em todas as espécies, além de Ekki, entre o dia 7 e o dia 12, possivelmente devido ao aumento do tempo entre as mudanças de água. Depois disso, a produção de pelotas fecais permaneceu bastante consistente entre cada uma das espécies de madeira. A partir do dia 14, o pinheiro escocês diminuiu na produção diária de pelotas fecais, enquanto a faia aumentou (Figura 10).

Figure 10
Figura 10: Número de pelotas fecais por dia (n=40) (média ± SE) produzidas por L. quadripunctata utilizando diferentes espécies de madeira, ao longo de 20 dias. Turpentina, castanha doce, faia e ekki heartwood testados, com madeira de pinheiro escocesa usada como controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A maior vitalidade de pontuação (5) foi observada na maioria dos indivíduos que se alimentam de madeira de pinheiro escocesa, além do indivíduo morto. 5 indica animais que se infiltraram na madeira e isso foi visto apenas em madeira de pinheiro escocês e madeira de faia. No dia 12 para os escoceses pinheiro e dia 20 para faia, todos os indivíduos vivos tinham escavado na madeira. A castanha doce teve a maior porcentagem de mortalidade, mas não aumentou com o tempo. O restante dos indivíduos vivos permaneceu em uma vitalidade de 4 (rastejando na superfície da madeira), exceto no dia 14, onde dois indivíduos estavam fora da madeira (vitalidade de 3). Ekki e terpentina também tiveram a maioria dos indivíduos em uma vitalidade de 4 durante a duração do experimento, além do dia 14 e dia 5 para terebintina. A mortalidade não mostrou aumento ao longo do tempo em nenhuma das espécies de madeira. Apenas a escavação foi vista para aumentar no pinheiro e faia escocesa, enquanto as outras três espécies de madeira permaneceram principalmente em uma vitalidade de 4 (Figura 11).

Figure 11
Figura 11: Vitalidade dos indivíduos ao longo do tempo, como porcentagem de réplicas, alimentando-se de diferentes espécies de madeira.  Turpentina, castanha doce, faia e ekki heartwood testados, com madeira de pinheiro escocesa usada como controle. Das oito réplicas por espécie de madeira, a porcentagem em diferentes vitalidades foi traçada ao longo do período experimental de 20 dias. O azul escuro representa uma vitalidade de 5 (escavação), azul claro uma vitalidade de 4 (na madeira), cinza uma vitalidade de 3 (fora da madeira, mas ativo), roxo uma vitalidade de 2 (fora de madeira e passiva) e preto mostra uma vitalidade de 1 ou indivíduos mortos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os resultados deste método de teste podem ser usados para identificar tipos de madeira ou tratamentos que tenham uma maior resistência a danos marinhos de borer de madeira. Em seguida, os ensaios de campo marinho, conforme descrito no Padrão Europeu EN 275, podem ser realizados e a durabilidade pode ser classificada (0= 'sem ataque', 1= 'ataque leve', 2= 'ataque moderado', 3= 'ataque severo', 4='falha'20) além de comparação com madeira de controle não durável.

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Discussion

Antes de selecionar espécimes de gribble para serem usados no experimento de alimentação, os indivíduos devem ser examinados para avaliar sua adequação. Pode haver alguma variação na taxa de alimentação entre os indivíduos devido a diferenças de tamanho, por isso apenas espécimes adultos adultos totalmente crescidos devem ser selecionados. Não foi detectada diferença significativa entre a taxa de alimentação dos indivíduos entre 1,5 mm e 3 mm de comprimento por Borges et al., 200917. Limnoria fêmea ninhada seus ovos, durante o qual o tempo tem uma taxa de alimentação reduzida. Portanto, qualquer fêmea de ninhada deve ser verificada e descartada durante a seleção de espécimes. Da mesma forma, os indivíduos moldantes também terão uma taxa de alimentação reduzida21. Portanto, a pelota fecal conta com dias em que os indivíduos estão moldando devem ser descartados17. Como a moldagem ocorre por mais de um dia, os moults são contados quando um múpulo exoesqueleto completo pode ser visto em dias de coleta de pelotas. Limnoria, ao criar suas tocas, tem uma produção de pelota fecal aumentada e também produzirá mais frass (resíduos de madeira fina que não são incorporados nas pelotas fecais). Os altos níveis de frass podem interferir na identificação de pelotas fecais, mas podem ser cuidadosamente removidos sob observação estereomicroscópio, usando uma pipeta ou pincel fino, antes da captura de imagem para contagem automática. Alternativamente, as pelotas podem ser contadas manualmente.

O software ImageJ requer imagens de qualidade e foco para processamento de imagens. Para isso, devem ser capturadas imagens nas quais as pelotas fecais não são obstruídas pelas paredes do poço e um pincel deve ser usado para separar pelotas fecais individuais. O fundo da imagem deve ser uniforme sem áreas de luz ou sombra, o que interferiria quando a imagem é transformada em binária para processamento no ImageJ. Não há necessidade de ajustar contraste ou luz antes do processamento da imagem. Ao importar uma pilha de imagens, todas as fotografias devem ser tiradas no mesmo plano para que não ocorram erros durante o processamento.

A vácuo impregnando madeira com água do mar faz com que a madeira afunde e se torne facilmente acessível ao gribble. A leaching de madeira antes de expô-la a gribbles removerá quaisquer extrativistas solúveis em água que possam afetar sua taxa de alimentação ou causar mortalidade12. A mortalidade por extrativos na água não representa a mortalidade esperada no mar, onde os extrativizadores serão rapidamente diluídos. Bem, as placas devem ser mantidas a uma temperatura constante que é a ideal para as espécies de gribble que estão sendo testadas. A espécie comum do sul britânico, L. quadripunctata, alimenta-se bem entre 15 e 25 °C e tem uma ótima taxa de alimentação a 20 °C17 para que as placas de poço possam ser convenientemente mantidas em uma incubadora a uma constante de 20 °C ± 0,5 °C.

Avaliar a vitalidade do gribble alimentar detecta efeitos subletais ou pré-letais de tratamentos de madeira ou madeiras naturalmente duráveis. Uma alta vitalidade de 5 indica que o gribble está demonstrando comportamento natural cavando na madeira e não sofre nenhum efeito adverso do contato com ele. Uma vitalidade de 4 mostra que, embora não tenha escavado na madeira, o gribble ainda é confortável para rastejar ao longo de sua superfície. Uma pontuação de 3 é dada a gribble que não estão na madeira, mas em vez de nadar ativamente na água ou estão estacionários, mas com pernas e pleópodes batendo rapidamente. Uma baixa vitalidade de 2 significa que o gribble está exposto e/ou tem pouca energia. Isso pode vir de um período prolongado de baixa taxa de alimentação ou de extrativos, seja lixiviando na água ou se tornando acessível durante a alimentação. Se a alta mortalidade for vista após 7-8 semanas, isso pode ser devido à fome, já que gribbles famintos (mantidos em poços com apenas 5 ml de água do mar e sem madeira) podem sobreviver por tanto tempo (observação pessoal).

Os benefícios do uso de um ensaio laboratorial de curto prazo em oposição a testes de campo marinho de longo prazo, é que novos tratamentos e produtos de madeira podem ser rapidamente testados para identificar seu potencial de ser usado comercialmente. Além disso, tais ensaios podem facilitar a rápida otimização dos processos de tratamento. Se uma produção de pelota fecal significativamente menor for vista em comparação com uma madeira de controle, então os testes podem ser complementados por ensaios marinhos. Slevin et al., 201523 e Westin et al., 201624 demonstram uma boa correlação entre avaliações laboratoriais e de campo através de testes da mesma madeira em dois cenários diferentes, indicando uma capacidade preditiva capaz do primeiro. Um ensaio de curto prazo pode ser executado por várias semanas. Gribbles famintos podem sobreviver por 7-8 semanas quando mantidos em água bem arejada sem madeira (observação pessoal) que podem fornecer comparação adicional se investigar a resposta de mortalidade a diferentes tipos de madeira. No entanto, por meio de observações recentes e inéditas, não há flutuação significativa na produção de pelotas fecais por um período superior a 20 dias, além de quando a mortalidade começa a ocorrer. Além disso, métodos anteriores, como o utilizado por Borges et al., 2008 e 2009, duram 15 dias. Portanto, 20 dias é tempo suficiente para um teste rápido baseado em laboratório para fornecer indicação de durabilidade da madeira.

Embora este método seja adequado para ensaios de curto prazo, os achados devem ser complementados por experimentos de campo marinho de longo prazo. As condições laboratoriais não podem replicar a variedade de fatores bióticos e abióticos que podem afetar a madeira no ambiente marinho. Organismos de biofouling, juntamente com outras espécies de borers de madeira marinha (como vermes) ainda podem estar presentes e causar danos à madeira25,26. Além disso, a abrasão da telha lançada por ondas ou areia pode desgastar a madeira para baixo, que pode então se tornar acessível para gribbles27. No entanto, um método de laboratório padrão pode fornecer uma triagem inicial de novos produtos que mostram promessa para aplicações marinhas. Ao avaliar a produção fecal de pelotas e vitalidade, podem ser identificadas madeiras melhores na redução da taxa de alimentação de gribble.

Devido às regulamentações e restrições de conservantes de madeira, como CCA e creosoto, é importante encontrar novos produtos para substituir esses tratamentos. A madeira está sujeita a altos níveis de biodegradação no ambiente marinho, mas ainda é um dos materiais de construção mais renováveis disponíveis e mantém sua força e estrutura bem na água do mar27,28. Não só a madeira resistente à biodegradação reduzirá custos, mas também será mais ecológica do que usar materiais alternativos como concreto ou aço, que requerem alto insumo energético durante a fabricação29,30, ou conservantes de biocida de amplo espectro que podem lixiviar e afetar o ecossistema circundante31,32,33,34,35,36, 37 anos.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse relacionados ao presente estudo.

Acknowledgments

Obrigado ao Conselho de Pesquisa da Noruega (Fundo Regional de Oslo, Alcofur rffofjor 269707) e à Universidade de Portsmouth (Faculdade de Ciências de Pesquisa em Pesquisa) por fornecer financiamento para os estudos de Lucy Martin. Além disso, para Gervais S. Sawyer que forneceu a madeira usada para gerar os resultados representativos. A terpentina foi fornecida pelo Prof. Philip Evans da Universidade da Colúmbia Britânica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well cell culture plates ThermoFisher Scientific 150200
50ml Falcon tubes Fisher Scientific 14-432-22
Adjustable volume pipette Fisher Scientific FBE10000 1-10 ml
Beech G. Sawyer (consultant in timber technology) Fagus sylvatica Taxonomic authority: L
Ekki G. Sawyer (consultant in timber technology) Lophira alata Taxonomic authority: Banks ex C. F. Gaertn.
Forceps Fisher Scientific 10098140
Incubator LMS LTD INC5009
Microporous specimen capsules Electron Microscopy Sciences 70187-20
Petri dish Fisher Scientific FB0875713
Scots Pine G. Sawyer (consultant in timber technology) Pinus sylvestris Taxonomic authority: L.
Size 00000 paintbrush Hobby Craft 5674331001 Size 000 or 0000 also acceptable
Sweet Chestnut G. Sawyer (consultant in timber technology) Castanea sativa Taxonomic authority: Mill
Turpentine P. Evans (Professor, Dept. Wood Science, University of British Columbia) Syncarpia glomulifera Taxonomic authority: (Sm.) Nied.
Vacuum desiccator Fisher Scientific 15544635

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Martin, L. S., Shipway, J. R., Martin, M. A., Malyon, G. P., Akter, M., Cragg, S. M. Rapid Testing of Resistance of Timber to Biodegradation by Marine Wood-Boring Crustaceans. J. Vis. Exp. (179), e62776, doi:10.3791/62776 (2022).

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