Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

בדיקה מהירה של עמידות של עץ להתכלות על ידי סרטנים מעץ ימי משעמם

Published: January 29, 2022 doi: 10.3791/62776
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 1
1University of Portsmouth, 2Microbiology Department, University of Massachusetts

Summary

פרוטוקול זה מציג שיטה להערכת קצב ההאכלה של הסרטן משעמם העץ, לימנוריה, על ידי מדידת ייצור כדורי צואה. שיטה זו מיועדת לשימוש במעבדות שאינן מומחיות ויש לה פוטנציאל להשתלב בפרוטוקולי בדיקה סטנדרטיים, כדי להעריך עמידות עץ משופרת בתנאים ימיים.

Abstract

חסרי חוליות משעממים מעץ הורסים במהירות עצים ימיים ותשתיות חוף מעץ, וגורמים לנזק של מיליארדי דולרים ברחבי העולם מדי שנה. כמו טיפולים של עץ עם biocides ספקטרום רחב, כגון creosote ו כרומטי נחושת arsenate (CCA), מוגבלים כעת בשימוש ימי על ידי חקיקה, מינים עץ עמיד באופן טבעי ושיטות שימור חדשניות של עץ נדרשים. שיטות אלה עוברות בדיקות על מנת לעמוד בסטנדרטים רגולטוריים, כגון התקן האירופי לבדיקת חומרים משמרים מעץ נגד בורי ים, EN 275. חקירה ראשונית של מינים של עצים עמידים או טיפולים משמרים מעץ ניתן להשיג במהירות ובזול באמצעות בדיקות מעבדה, אשר מציע יתרונות רבים על פני ניסויי שדה ימי כי הם בדרך כלל יקר, משתדלים לטווח ארוך. מינים רבים של לימנוריה (גריבל) הם סרטנים משעממים מעץ ימי. לימנוריה אידיאלית לשימוש בבדיקות מעבדה של מתכלים של עץ על ידי בורי עץ ימיים, בשל המעשיות של גידולם באקוואריה וקלות מדידת שיעורי ההאכלה שלהם על עץ. להלן, אנו מתארים בדיקת מעבדה סטנדרטית להערכת מתכלה מעץ באמצעות גריבל.

Introduction

בורי עץ עלולים לגרום נזק נרחב למבני עץ ימיים, כגון הגנות ימיות, מזחים ומבני חקלאות ימית; החלפה או שיקום של אשר עולה מיליארדי דולרים לשנה ברחבי העולם1,2,3. על מנת להגן על מבנים אלה, עץ מטופל לעתים קרובות כדי להפחית את ההתכלות. עם זאת, בשל הגבלת השימוש בביוצידים רחבי טווח באוסטרליה, האיחוד האירופי, בריטניה וארה"ב, בסביבה הימית, טכניקות שינוי חדשות ומינים של עץ העמידים באופן טבעי עבור borers מבוקשים על 4,5,6,7. טכניקות חדשניות לשימור עץ בסביבה הימית דורשות בדיקה יסודית על מנת לעמוד בסטנדרטים הרגולטוריים ולהגביל את ההשפעות הסביבתיות מפני מפגעים כגון שטיפה של כל חומר משמר כימי. לדוגמה, התקן האירופי, EN 275, שהוא התקן האירופי הנוכחי משנת 1992, משמש להערכת טיפולים לשימור עץ נגד נזקי עץ ימיים8,9. תקן זה, יחד עם חקיקה אחרת נגד השימוש בתרכובות ביו-דידל, כגון CCA4,5,6,7 ו- creosote10, מחייב שיטות בנות קיימא ולא רעילות להגנה על עץ ושימוש במינים של עצים עמידים באופן טבעי כדי להחליף טיפולים ביוצידליים11,12 . ניסויים ימיים, כגון אלה שצוינו ב- EN 275, דורשים תקופות חשיפה ארוכות ולכן הם יקרים ואיטיים כדי להניב תוצאות משמעותיות. בדיקות מעבדה, לעומת זאת, מספקות חלופה מהירה בהרבה לבדיקת שיטות לשימור מוצרי עץ מפני התקפת עץ ימית, ומאפשרות הערכה מהירה של התאמות ללוחות הזמנים של הטיפול13. תוצאות מניסוי מעבדה מהיר זה נועדו ליידע תהליכי שינוי חדשניים של עץ ולזהות מינים של עצים עם עמידות טבעית לנזקי בורי. שיעור הזנה נמוך וחיוניות יכולים להצביע על התנגדות מוגברת במוצרים פוטנציאליים ואז ניתן יהיה להזין מידע זה בחזרה לשותפים בתעשייה כדי לאפשר להם לשפר את העיצובים. השיטה שלנו מאפשרת תגובה זריזה ומהירה, כי הוא רצוי בתעשייה, ולאחר מוצרים מבטיחים זוהו, ניתן להשלים את התוצאות עם אלה מניסויים ימיים.

גריבלים (Limnoria) הם סוג של סרטני איזופוד במשפחה לימנורידה. ישנם מעל 60 מינים של לימנוריה ברחבי העולם13,14,15, עם שלושה מינים נפוצים שנמצאו בבריטניה, לימנוריה ליגנורום, לימנוריה טריפונקטה ולימינוריה quadripunctata16. הם נשאו מנהרות על פני העץ השקוע במי ים, ולעתים קרובות גרמו לנזק כלכלי משמעותי. Gribbles הם בשפע רב במים בבריטניה החוף וקל לתחזוקה בתנאי מעבדה, מה שהופך אותם אורגניזמים אידיאליים לחקר מתכלים עץ על ידי חסרי חוליות עץ ימי משעמם. הערכת שיעורי ההאכלה והחיוניות של נבלים על מינים שונים של עצים ושיטות שימור עץ יכולה לקבוע את יעילות ההתנגדות שלהם להתכלות. הפרוטוקול הבא קובע שיטה סטנדרטית למדידת שיעורי האכלה סחוס, שפותחה מזו המתוארת על ידי בורחס ועמיתיו12,17, בנוסף לייעול כניסת ניתוח תמונה כדי להפוך את התהליך להפעלה במעבדות שאינן מומחים. ניתוח תמונה משמש גם כדי להפחית את המגבלות המעשיות של ספירה ידנית של מספר גדול של דוגמאות. עמידות במבחנים ימיים ארוכי טווח, על פי התקן הבריטי EN350-1:1994, מדורגים בהתייחס לפינוס סילבסטריס סאפווד18. בבדיקות המעבדה לטווח קצר המוצגות כאן, אנו משתמשים באורן הסקוטי (Pinus sylvestris L) סאפווד כפקד לבדיקת עץ הלב של המין אקקי (לופירה אלאטה בנקס לשעבר C.F Gaertn), אשור (Fagus sylvatica L), ערמון מתוק (קסטנה סאטיבה מיל) וטרפנטין (סינקרנפיה גלמוליפרה (Sm.) ניד). ייצור כדורים צואה ממוצע וחיוניות בקרב שמונה שכפולים לכל מינים עץ שימש כאינדיקטור לעמידות. אנו מספקים נתונים להמחשה שנאספו מהערכה טיפוסית, באמצעות מינים גריבל Limnoria quadripunctata ומגוון של מינים עץ עמידים באופן טבעי. Limnoria quadripunctata, שזוהתה על ידי המפתחות שסופקו על ידי מנזיס (1951), נבחרה כמין האופטימלי לניסויים בהתכלות בשל העובדה שהוא החבר הנחקר ביותר במשפחה והוא מבוסס היטב כמין מודל לשימוש בניסויים מתכלים. פרוטוקול זה ישים גם לבדיקת יערות של טיפולים שונים למרות הבקרה בשימוש צריך להיות שכפולים מטופלים של אותו מין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מקלות בדיקה

  1. לאחר השלמת כל תהליכי הטיפול, חותכים עץ יבש למקלות בדיקה לגודל 2 מ"מ x 4 מ"מ x 20 מ"מ (איור 1). יובש באוויר נדבק למשקל קבוע, בתנאי מעבדה. השתמש לפחות 5 שכפולים של כל עץ נבדק.

Figure 1
איור 1: מקלות בדיקה המשמשים בבדיקות מעבדה לטווח קצר להערכת שיעורי האכלת גריבל.  מקלות עץ בדיקה בגודל 2 מ"מ x 4 מ"מ x 20 מ"מ. משמאל לימין: אקי, טרפנטין, ערמון מתוק ועץ לב אשור ואורן סאפווד סקוטי. סרגל קנה מידה 4 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. חדירת ואקום
    1. לאחר הכנת עץ (כלומר, חיתוך וטיפול, אם ישים), מניחים מקלות מתחת לרשת במיכל פלסטיק בטוח למזון, בתוך חיטוי הוואקום ומחליפים את המכסה ומבטיחים שיש חותם הדוק, המתאפשר על ידי ציפוי של שומן ואקום (איור 2).
    2. חברו שסתום משולש בין הצינור המחבר בין התסדן למשאבה, עם צינור שלישי המוביל לאוויר הפתוח (איור 2). ודא כי שסתום משולש סגור לאוויר ולהפעיל את המשאבה כדי להשיג ואקום של -0.75-1.0 בר בתוך חיטוי ואקום להחזיק את הוואקום הזה במשך 45 דקות - 1 שעה.
    3. שקוע בקצה הפתוח של הצינור השלישי לתוך מיכל של מי ים. לכבות את המשאבה ולסגור את השסתום המוביל למשאבה, ולאחר מכן לאט לפתוח את השסתום עד מי הים נמשך על ידי הוואקום לתוך התבשר. אפשר למים לזרום עד שהוא ממלא את מיכל הפלסטיק, מעל לרמת הרשת.
    4. לאחר מכן הסיג את הצינור ממי הים במיכל, ומאפשר לאוויר להיכנס, עד שהמתשן יחזור ללחץ אטמוספרי. שומרים את המקלות שקועים מתחת לרשת עד שהם שוקעים לתחתית מיכל הפלסטיק.

Figure 2
איור 2: ציוד המשמש לשאוב מקלות עץ מפזרים במי ים, כהכנה להאכלה לגריבלים במהלך בדיקת מעבדה.  A) חיטוי ואקום; ב) משאבה; ג) מד לחץ עבור חיטוי ואקום; ד) השסתום המשולש המוביל לחיטוי ואקום, משאבה ולאוויר הפתוח או מי ים (צינור כתום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. עץ שטיפה
    1. שקועים במקלות בדיקה רוויים במי ים במי ים הכלולים בצינורות 50 מ"ל (איור 3). החלף מים באופן קבוע לתקופה של 20 יום.
      הערה: תהליך השטיפה חל על כל עץ ניסיוני בבדיקה, כולל יער מטופל או טבעי.

Figure 3
איור 3: שטיפה ממקלות עץ להכנה להאכלה לגריבלים במהלך מעבדה.  עץ שהיה שקוע לחלוטין במי ים הכלולים בצינור פלקון 50 מ"ל, עם החלפת מים רגילה (1-3 ימים), המיוצר ליטוש בצבעים מובהקים. משמאל לימין שטיפה מעץ הלב של; ערמון מתוק, טרפנטין, אקי, ואשור ואורן ספוטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. חילוץ גריבל

  1. לחלץ דגימות בודדות של גריבל מבלוק עץ שורץ. השתמש בזוג מלקחיים עדינים ובמברשת צבע דקה (בגודל 000/0.4 מ"מ או קטנה יותר). בזהירות לקלף בחזרה כל עץ שמכסה את מחילה gribble עם המלקחיים
    הערה: מחילות נמצאות על פני העץ וניתן לזהותן באמצעות חורים קטנים (איור 4).
  2. לאחר חשיפת הגריבל, השתמשו במכחול כדי לאסוף בעדינות אנשים מלמטה ולהפקיד בצלחת פטרי מלאה במי ים. בדוק גריבל תחת מיקרוסקופ כדי לזהות מינים כדי לוודא שלא נגרם נזק בעת החילוץ.
    הערה: להכות pleopods הם סימן של חיוניות.
    1. יש להשליך את כל הנקבות המהורהרות ביצים כמו נקבות gravid יש יכולת האכלה מופחתת.

Figure 4
איור 4: תמונה של מחילה עם שני חורי אוורור טיפוסיים. ל. קוואדריפונקטה מחפרת על מקל עץ אורן רדיה, בגודל 2 מ"מ x 4 מ"מ x 20 מ"מ. שני חורי אוורור קטנים יותר ניתן לראות ליד הכניסה המחילה. סרגל קנה מידה 2 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.  

  1. זיהוי לימנוריה קוואדריפונקטה
    1. זהה את לימנוריה קוואדריפונקטה מתחת לסטריאומיקוסקופ על ידי ארבעת הצינורות הייחודיים, המסודרים בתבנית מרובעת, על הפלוטלסון של החיה בנוסף לקרינה בצורת X בפלוניט החמישי19 (איור 5).

Figure 5
איור 5: תכונות זיהוי קוואדריפונקטה של לימנוריה .  תמונה של משטח הגב לימנוריה quadripunctata, נלקח על סטריאומיקוסקופ בהגדלה x20. זיהוי תכונות המוצגות על ידי חץ אדום - מציין את קרינה בצורת X וחץ כחול - מציין ארבעה צינורות על pleotelson. סרגל קנה מידה 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

3. הכנת צלחות היטב

  1. בלוחות מרובי בארות בקוטר 20 מ"מ, הניחו מקל בדיקה אחד ו-5 מ"ל של מי ים לא מסוננים, בין 32-35 PSU, לבאר (איור 6).
  2. מניחים טיפולים / מינים של עץ באופן שיטתי לאורך צלחת הבאר, כך שכל סוג של עץ מיוצג לפחות פעם אחת לכל צלחת. הוסף גריבל אחד לכל באר.
    הערה: הטמפרטורה צריכה להישמר יציבה באינקובטור ב 20 °C (50 °F) ± 2 °C (50 °F) עבור המין L. quadripunctata, מינים אחרים של לימנוריה ניתן להשתמש עם התאמות לטמפרטורה שנעשו כדי להתאים את המינים הספציפיים.
  3. שמור צלחות בתנאים כהים קבועים כמו photoperiod אין השפעה על שיעור האכלת גריבל15.

Figure 6
איור 6: מערך ניסיוני לבדיקת האכלה.  דוגמה ל-12 לוחות רב-באריים המשמשים בבדיקות המעבדה של שיעור האכלת הגריבל. כל באר מכילה 5 מ"ל מי ים ומקל בדיקה אחד (20 מ"מ x 4 מ"מ x 2 מ"מ) של מינים שונים של עץ; סקוטי פיין סאפווד ואקי, אשור, ערמון מתוק, ועץ לב טרפנטין. סרגל קנה מידה 20 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. איסוף וספירת כדורי צואה והערכה של חיוניות.

  1. פעמיים בשבוע, להסיר את מקל הבדיקה וכל gribble (אחד לכל באר) מן צלחת הבאר ומניחים לתוך צלחת טובה מוכן מראש טרי (המכיל 5 מ"ל של מי ים לבאר [32-35 PSU, 18-22 °C (5 °F).
  2. השתמש במכחול כדי לצחצח בעדינות את כל כדורי צואה מהמקל לפני ההעברה ולשמור על כדורי צואה בתוך הבאר המקורית.
    הערה: לפני העברת הגריבל לצלחת באר טרייה, ניתן להעריך חיוניות בסולם של 1-5; 1= מת, 2 = פסיבי, לא על העץ, 3 = שוחה באופן פעיל או מכה pleopods, לא על העץ, 4 = זוחל על פני השטח של העץ, 5 = התחפר לתוך העץ.
  3. עיבוד תמונה
    1. השתמש במכחול עדין כדי להפריד בין כל גושים, כך גלולים בודדים נראים ומבריש כדורי הרחק מן הקצוות מאוד של הבאר. צלמו תמונה מפורטת תחת מיקרוסקופ סטריאו, בהגדלת x4 והעלו למחשב (איור 7).
      הערה: ודא שהכדורים נמצאים בפוקוס והרקע אחיד, ללא צללים או השתקפויות אור על פני המים.

Figure 7
איור 7: תמונה של כדורי צואה. ל. כדורי צואה quadripunctata (כדורים קטנים, גליליים, חומים) מהאכלה על עץ אורן רדיה בבאר אחת של צלחת רבת באר. צולם בהגדלת x4. תמונות לפני מניפולציה לניתוח תמונה (ראו איור 7). A) דוגמה לתמונה מתאימה לשימוש לספירה אוטומטית ב- ImageJ. כדוריות מפוזרות מספיק החוצה והרחק משולי הבאר. הבאר מרוכזת ואין מכשולים או השתקפויות. ב) דוגמה לתמונה שאינה מתאימה לניתוח תמונה. הבאר היא מחוץ למרכז, חיתוך החצי התחתון. עיגול כחול (מנוקד) מראה השתקפות אור מפני המים. עיגול כתום (מוצק) מראה כדורי מגובאות קרוב מדי זו לזו וקרובות מדי לקצה הבאר. עיגול אדום (מקווקו) מציג שבב עץ שלא הוסר. סרגל קנה מידה 10 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.  

  1. תהליך ליצירת ספירת כדורי צואה באמצעות ImageJ.
    1. הורד את ImageJ (הגירסה העדכנית ביותר נכון ל- 03/08/21, 1.8.0_172) https://imagej.nih.gov/ij/download.html או הפעלה מדפדפן המחשב.
    2. העלה ערימת תמונות על-ידי גרירה ושחרור או על-ידי בחירת קובץ | יבא | | רצף תמונות עיון. אל תשנה פרמטרים ולאחר מכן בחר אישור.
    3. לאחר מכן, השתמש בכלי העיגול כדי לבחור את החלק התחתון של הבאר המכילה את כדורי הצואה. הסר את קצות הבאר, בחר ערוך | תפנה בחוץ. הפוך את התמונה לבינארית ובחר תהליך | הפוך בינארי.
    4. כייל על-ידי בחירת ניתוח | קבע קנה מידה ובחר את מספר הפיקסלים למילימטר עבור התמונה (לדוגמה 10 פיקסלים = 1 מ"מ). ספרו את הכדורים, בחרו 'ניתוח | ניתח חלקיקים.
    5. בתיבה לצד גודל (יחידה2), בחר סף נמוך יותר זהה לכדור בגודל הקטן ביותר, באמצעות סולם היחידה שהוגדר קודם לכן (לדוגמה, אם 10 פיקסלים = 1 מ"מ והכדור הקטן ביותר הוא 0.5 מ"מ, בחר 5 אינסוף).
    6. בתיבה הנפתחת הצג , בחר קווי מתאר ולאחר מכן סמן סיכום ולחץ על אישור (איור 8).
      הערה: מידע נוסף ניתן למצוא https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/index.html

Figure 8

Figure 8.1
איור 8: דיאגרמת זרימה של התהליך המשמש ב- ImageJ לספירת כדורי צואה.  A) ייבוא רצף תמונות בכרטיסיה 'קובץ' של ImageJ. ב) לחצן העיון בתיבת הדו-שיח 'ייבוא רצף תמונות' כדי לייבא רצף תמונות מהתקן מקומי. ג) שימוש בכלי העיגול לבחירת אזור המכיל כדורי צואה D) נקה את הלחצן החיצוני באזור כרטיסיית העריכה כדי להסירו מחוץ לאזור שנבחר. ה) הפוך לחצן בינארי בכרטיסיית התהליך. ו) הגדר לחצן קנה מידה בכרטיסיה ניתוח. המרחק בפיקסלים שווה למספר הפיקסלים ליחידת מידה אחת (מ"מ). ז) לחצן ניתוח חלקיקים בכרטיסיה ניתוח. גודל (יחידה^2) מוגדר לסף התחתון של גודל גלולה צואה, בפיקסלים, לאינסוף. האפשרות 'חלוקה לרמות' ו'סיכום' נבחרו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. ניתוח נתונים
    1. להמיר ספירת גלולה לכדורים ליום, אשר נותן מידה עקיפה של קצב האכלה. יש למחוק נתונים מכל אדם נוצץ בימים שבהם אירעה ההשתמטות (איור 9).
      הערה: Moulting מתרחשת מעל 1-3 ימים וניתן לזהות כאשר moult מלא של השד החיצוני ניתן לראות.

Figure 9
איור 9: דוגמה לגריבל מול.  גריבל (L. quadripunctata) moulting, על מקל מבחן עץ אורן רדיה בגודל 20 מ"מ x 4 מ"מ x 2 מ"מ. מולים מסומנים על ידי עיגולים אדומים. סרגל קנה מידה 2 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניסוי האכלה של ל. quadripunctata נערך במשך 20 ימים, תוך שימוש בחמישה סוגי עץ שונים (פינוס סילבסטריס L) סאפאווד, ועץ לב של אשור (Fagus sylvatica L), אקקי (לופירה אלטה בנקס לשעבר C. F Gaertn), ערמון מתוק (Castanea sativa Mil), וטרפנטין (סינקרנפיה גלמוליפרה (Sm.) Neid)) (ראה שולחן חומרים), בנובמבר 2020. שמונה מקלות שכפול שימשו לכל מין עץ ודגימה אחת של לימנוריה quadripunctata הוזן לכל מקל. כל הגריבל נרכשו ממניות המתוחזקות באקוואריה במכון למדעי הים, אוניברסיטת פורטסמות ', בריטניה. המלאי מתווסף באופן קבוע עם אוספים פראיים מהחוף הדרומי של אנגליה. בעלי החיים מתייצבים היטב לתנאי התרבות היציבים והעקביים לפני הניסוי. מקלות עץ (20 מ"מ x 4 מ"מ x 2 מ"מ) היו שטיפה במי ים במשך שבועיים לפני ניסוי ההאכלה. גריבל אחד, מקל בדיקה אחד ו 5 מ"ל של מי ים הונחו לבאר בצלחת של 12 בארות ונשמרו באינקובטור בתנאים יציבים של 20 מעלות צלזיוס (± 0.2 מעלות צלזיוס) ובתנאים כהים קבועים. כדורי צואה נספרו ונאספו כל יומיים עד חמישה ימים, עם שינויי מים מלאים בכל אוסף. שמונה העתקים של כל מיני עץ שימשו, נותן בסך הכל ארבעים מקלות עם גריבל בודד אחד כל אחד. מי ים ששימשו לשטיפה של עצים ושימשו לאורך כל הניסוי הושגו ישירות מהאקווריום ששימש לגידול דגימות. תנאי מי הים יציבים באקווריום ויציבים באינקובטור. אידוי מנפח המים הקטן המשמש לבאר ממוזער על ידי עיצוב המכסה של לוחות הבאר ושינויי מים מלאים המתרחשים כל 2-5 ימים.

כדוריות נספרו באופן אוטומטי באמצעות תמונה J (גירסה 1.8.0_112).

גריבל האכלה על עץ סאפווד אורן סקוטי כמו שליטה, ייצר את כדורי הצואה ביותר ליום בעקביות, מלבד ביום 20 שבו ייצור גלולה היה עקף על ידי אשור. אקקי ייצר את כדורי הצואה הנמוכים ביותר ביום מכל מיני העץ שנבדקו. ייצור כדורי הצואה השני בגובהו נצפה על אשור, ואחריו ערמון מתוק וטרפנטין. חלה עלייה בייצור כדורי צואה בכל המינים מיום 5 עד יום 7. ייצור הכדורים צנח בכל המינים, מלבד אקקי, בין יום 7 ליום 12, אולי בשל הזמן המוגבר בין שינויי המים. לאחר מכן, ייצור כדורי צואה נשאר עקבי למדי בין כל אחד ממיני העץ. מהיום ה-14 חלה ירידה בייצור כדורי הצואה היומי, ואילו אשור גדל (איור 10).

Figure 10
איור 10: מספר כדורי הצואה ליום (n=40) (ממוצע ± SE) המיוצרים על ידי L. quadripunctata באמצעות מינים שונים של עץ, במשך 20 יום. טרפנטין, ערמון מתוק, אשור ועץ לב אקקי נבדקו, עם עץ אורן סקוטי המשמש כשליטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

החיוניות הגבוהה ביותר של ציון (5) נראתה אצל רוב האנשים הניזונים מעץ אורן סקוטי, מלבד האדם המת אחד. 5 מציין בעלי חיים שהתחפרו בעץ וזה נראה רק על עץ אורן סקוטי ועץ לב אשור. ביום ה -12 עבור אורן סקוטי ויום 20 לאשור, כל האנשים החיים התחפרו לתוך העץ. ערמון מתוק היה האחוז הגבוה ביותר תמותה אבל לא גדל עם הזמן. שאר האנשים החיים נשארו בחיוניות של 4 (זוחלים על פני העץ), מלבד ביום ה -14 שבו שני אנשים היו מחוץ ליער (חיוניות של 3). אקי וטרפנטין היו גם רוב האנשים בחיוניות של 4 לאורך כל הניסוי, מלבד ביום 14 ויום 5 עבור טרפנטין. התמותה לא הראתה עלייה לאורך זמן על פני כל מיני העץ. רק התחפרות נראתה כמתגברת על אורן ואשור סקוטים, בעוד ששלושת מיני העץ האחרים נותרו ברובם בחיוניות של 4 (איור 11).

Figure 11
איור 11: חיוניותם של יחידים לאורך זמן, כאחוז מהשכפולים, ניזונים ממיני עץ שונים.  טרפנטין, ערמון מתוק, אשור ועץ לב אקקי נבדקו, עם עץ אורן סקוטי המשמש כשליטה. מתוך שמונה שכפולים למינים של עץ, האחוז בחיוניות שונה זומם במהלך תקופת הניסוי בת 20 הימים. כחול כהה מייצג חיוניות של 5 (מחילה), כחול בהיר חיוניות של 4 (על עץ), אפור חיוניות של 3 (מחוץ לעץ אך פעיל), סגול חיוניות של 2 (מחוץ לעץ פסיבי) ושחור מראה חיוניות של 1 או אנשים מתים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות משיטת בדיקה זו יכולות לשמש לזיהוי סוגי עץ או טיפולים בעלי עמידות מוגברת לנזקי עץ ימי. לאחר מכן, ניסויי שדה ימיים, כמתואר בתקן האירופי EN 275, ניתן לערוך ועמידות ניתן לדרג (0 = "אין התקפה", 1 = "התקפה קלה", 2 = "התקפה מתונה", 3 = "התקפה חמורה", 4 ='failure'20) בנוסף להשוואה לעץ בקרה שאינו עמיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לפני בחירת דגימות גריבל לשימוש בניסוי האכלה, אנשים צריכים להיות מוקרנים כדי להעריך את התאמתם. יכולה להיות שונות מסוימת בשיעור ההאכלה בין אנשים בשל הבדלים בגודל, ולכן יש לבחור רק דגימות בוגרות בוגרות. אין הבדל משמעותי בין שיעור האכלה של אנשים בין 1.5 מ"מ ו 3 מ"מ אורך זוהה על ידי בורחס ואח ', 200917. נקבות לימנוריה מהורהרות בביצים שלהן, שבמהלכה יש שיעור האכלה מופחת. לכן, כל נקבות מהורהרת יש לבדוק ולהשליך בעת בחירת דגימות. באופן דומה, אנשים moulting יהיה גם שיעור האכלה מופחת21. לכן, כדורי צואה סופר בימים שבהם אנשים הם moulting צריך להיות מושלך17. כמו moulting מתרחשת במשך יותר מיום, moults נספרים כאשר moult שלד חיצוני מלא ניתן לראות בימי איסוף גלולה. לימנוריה, בעת יצירת המחילות שלהם, יש ייצור גלולה צואה מוגברת וגם לייצר יותר frass (פסולת עץ בסדר שאינו משולב כדורי צואה). רמות גבוהות של frass יכול להפריע זיהוי של כדורי צואה אבל ניתן להסיר בזהירות תחת תצפית סטריאומיקרוסקופ, באמצעות פיפטה או מברשת צבע בסדר, לפני לכידת תמונה לספירה אוטומטית. לחלופין, כדורים ניתן לספור באופן ידני.

התוכנה ImageJ דורשת איכות, תמונות ממוקדות לעיבוד תמונה. כדי לכך, יש ללכוד תמונות שבהן כדורי צואה אינם חסומים על ידי קירות הבאר ויש להשתמש במכחול להפרדת כדורי צואה בודדים. הרקע של התמונה חייב להיות אחיד ללא אזורי אור או צל, מה שיפריע כאשר התמונה הופכת לקובץ בינארי לעיבוד ב- ImageJ. אין צורך להתאים ניגודיות או אור לפני עיבוד התמונה. בעת ייבוא ערימת תמונות, יש לצלם את כל התמונות באותו מישור כך שלא יתרחשו שגיאות בעת העיבוד.

ואקום ספוג עץ עם מי ים גורם לעץ לשקוע ולהיות נגיש בקלות לגריבל. שטיפה של עץ לפני חשיפתו לגריבלים תסיר כל חילוץ מסיס במים שעלול להשפיע על קצב ההאכלה שלהם או לגרום לתמותה12. התמותה כתוצאה מתמציות במים אינה מייצגת תמותה הצפויה בים, שם התמציות יתחלקו במהירות. ובכן לוחות צריך להישמר בטמפרטורה קבועה כי הוא האופטימלי עבור מינים gribble נבדק. המין הבריטי הדרומי המשותף, ל. quadripunctata, מאכיל היטב בין 15 ל 25 °C (70 °F) ויש לו קצב האכלה אופטימלי ב 20 °C (70 °F) כך צלחות היטב ניתן לשמור בנוחות בחממה קבוע 20 °C (5 °F) ± 0 °C (5 °F).

הערכת החיוניות של גריבל האכלה מזהה השפעות sublethal או טרום קטלני של טיפולים בעץ או עצים עמידים באופן טבעי. חיוניות גבוהה של 5 מצביעה על כך שהגריבל מדגים התנהגות טבעית על ידי התחפרות בעץ ואינו סובל מהשפעה שלילית ממגע איתו. חיוניות של 4 מראה כי בעוד לא התחפר לתוך העץ, הגריבל עדיין נוח לזחול על פני השטח שלה. ציון של 3 ניתן לגריב שאינם על העץ, אלא לשחות באופן פעיל במים או הם נייחים אך עם רגליים פועמות במהירות ופליאופודים. חיוניות נמוכה של 2 פירושה שהגריבל חשוף ו/או שיש לו מעט אנרגיה. זה יכול לבוא מתקופה ממושכת של שיעור האכלה נמוך או מן החילוץ או שטיפה לתוך המים או להיות נגיש במהלך האכלה. אם ניתן לראות תמותה גבוהה לאחר 7-8 שבועות, ייתכן שהסיבה לכך היא רעב, שכן נבלים מורעבים (שנשמרו בבארות עם 5 מ"ל בלבד של מי ים וללא עץ) יכולים לשרוד במשך זמן כה רב (התבוננות אישית).

היתרונות של שימוש בבדיקת מעבדה לטווח קצר בניגוד לניסויי שדה ימיים ארוכי טווח, הם שניתן לבדוק במהירות טיפולים חדשניים ומוצרי עץ כדי לזהות את הפוטנציאל שלהם לשימוש מסחרי. יתר על כן, בדיקות כאלה יכולות להקל על אופטימיזציה מהירה של תהליכי טיפול. אם ייצור גלולה צואה נמוכה משמעותית נראה בהשוואה עץ בקרה, אז בדיקות ניתן להשלים על ידי ניסויים ימיים. Slevin et al., 201523 ו Westin et al., 201624 להפגין מתאם טוב בין מעבדה והערכות שדה באמצעות בדיקת אותו עץ בשתי הגדרות שונות, המציין יכולת חיזוי מסוגל של הראשון. ניתן לנהל מעשייה לטווח קצר במשך מספר שבועות. נבלים מורעבים יכולים לשרוד במשך 7-8 שבועות כאשר הם נשמרים במים מאווררים היטב ללא עץ (תצפית אישית) אשר עשוי לספק השוואה נוספת אם חוקרים את תגובת התמותה לסוגים שונים של יערות. עם זאת, באמצעות תצפיות אחרונות, שלא פורסמו לאחרונה, אין תנודה משמעותית בייצור כדורי צואה על פני פרק זמן ארוך יותר מ -20 יום, מלבד כאשר התמותה מתחילה להתרחש. בנוסף, שיטות קודמות, כגון אלה המשמשות את בורחס ואח ', 2008 ו 2009, פועל במשך 15 ימים. לכן, 20 ימים הם מספיק זמן לבדיקה מבוססת מעבדה מהירה כדי לספק אינדיקציה לעמידות עץ.

בעוד שיטה זו מתאימה לניסויים קצרי טווח, יש להשלים את הממצאים על ידי ניסויי שדה ימיים ארוכי טווח. תנאי המעבדה אינם יכולים לשכפל את מגוון הגורמים הביוטיים והאביוטיים שעשויים להשפיע על העץ בסביבה הימית. אורגניזמים מנפחים ביולוגית, יחד עם מינים אחרים של בוורי עץ ימיים (כגון תולעי ספינות) עדיין עשויים להיות נוכחים ולגרום נזק לעץ25,26. בנוסף, שחיקה מצחפות או חול שנזרקו על ידי גלים יכולה להתיש עץ, אשר לאחר מכן עשוי להיות נגיש עבור gribbles27. עם זאת, שיטת מעבדה סטנדרטית יכולה לספק סינון ראשוני של מוצרים חדשים המציגים הבטחה ליישומים ימיים. על ידי הערכת ייצור כדורי צואה וחיוניות, יערות טובים יותר בהפחתת שיעור האכלת גריבל ניתן לזהות.

בשל התקנות וההגבלות של חומרים משמרים מעץ, כגון CCA וקרוסטו, חשוב למצוא מוצרים חדשניים שיחליפו טיפולים אלה. עץ כפוף לרמות גבוהות של מתכלה בסביבה הימית, אך הוא עדיין אחד מחומרי הבנייה המתחדשים ביותר הזמינים ושומר היטב על כוחו ומבנהו במי הים27,28. לא רק עץ עמיד בפני biodegradation להפחית עלויות, אלא גם יהיה ידידותי יותר לסביבה מאשר באמצעות חומרים חלופיים כגון בטון או פלדה, אשר דורשים קלט אנרגיה גבוהה במהלך ייצור29,30, או חומרים משמרים ביו-סיד רחב טווח שעשויים לשחל ולהשפיע על המערכת האקולוגית שמסביב31,32,33,34,35,36, 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים הקשורים למחקר זה.

Acknowledgments

תודה למועצת המחקר של נורבגיה (הקרן האזורית של אוסלו, אלצ'ופור rffofjor 269707) ואוניברסיטת פורטסמות ' (הפקולטה למדע דוקטורט bursary) על מתן מימון ללימודים של לוסי מרטין. כמו כן, לג'רווייס ס. סוייר שסיפק את העץ ששימש להפקת התוצאות הייצוגיות. טורפנטין סופק על ידי פרופ' פיליפ אוונס מאוניברסיטת קולומביה הבריטית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well cell culture plates ThermoFisher Scientific 150200
50ml Falcon tubes Fisher Scientific 14-432-22
Adjustable volume pipette Fisher Scientific FBE10000 1-10 ml
Beech G. Sawyer (consultant in timber technology) Fagus sylvatica Taxonomic authority: L
Ekki G. Sawyer (consultant in timber technology) Lophira alata Taxonomic authority: Banks ex C. F. Gaertn.
Forceps Fisher Scientific 10098140
Incubator LMS LTD INC5009
Microporous specimen capsules Electron Microscopy Sciences 70187-20
Petri dish Fisher Scientific FB0875713
Scots Pine G. Sawyer (consultant in timber technology) Pinus sylvestris Taxonomic authority: L.
Size 00000 paintbrush Hobby Craft 5674331001 Size 000 or 0000 also acceptable
Sweet Chestnut G. Sawyer (consultant in timber technology) Castanea sativa Taxonomic authority: Mill
Turpentine P. Evans (Professor, Dept. Wood Science, University of British Columbia) Syncarpia glomulifera Taxonomic authority: (Sm.) Nied.
Vacuum desiccator Fisher Scientific 15544635

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morrell, J. J. Protection of wood-based materials. Handbook of environmental degradation of materials, 3rd ed. Kutz, M. , Elsevier Science and Technology Books. Oxford. 343-368 (2018).
  2. Distel, D. L. The biology of marine wood boring bivalves and their bacterial endosymbionts. Wood deterioration and preservation. Goodell, B., Nicholas, D., Schultz, T. , American Chemical Society. Washington, D.C. 253-271 (2003).
  3. Buslov, V., Scola, P. Inspection and structural evaluation of timber pier: case study. Journal of Structural Engineering. 117 (9), 2725-2741 (1991).
  4. US EPA. Registration Eligibility Decision for Chromated Arsenicals. List A, Case No. 0132. US EPA - Office of prevention, pesticides and toxic substances. , Available from: https://swap.stanford.edu/20110202084/http://www.epa.gov/oppsrrd1/reregistration/REDs/cca_red.pdf 800-807 (2008).
  5. Arsenic timber treatments (CCA and arsenic trioxide) review scope document, Review series 03.1. ISSN number 1443. Australian pesticides and veterinary medicines authority. , Available from: https://apvma.gov.au/sites/default/files/publication/14296-arsenic-timber-review-scope.pdf (2003).
  6. Commission directive 2003/2/EC of 6 January 2003 relating to restrictions on the marketing and use of arsenic (tenth adaptation to technical progress to Council Deretive 76/769/EEC). Official Journal of the European Communities. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/eudr/2003/2/adopted (2003).
  7. The Hazardous Waste (England and Wales) Regulations 2005 No.894. Environmental Protection England and Wales. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/uksi/2005/894/contents/made (2005).
  8. Palanti, S., Cragg, S. M., Plarre, R. Resistance against marine borers: About the revision of EN 275 and the attempt for a new laboratory standard for Limnoria. International Research Group on Wood Preservation, Document No. IRG/WP 20-20669. , (2020).
  9. The European Commission for Standardization. EN 275:1992. Wood preservatives- Determination of the protective effectiveness against marine wood borers. The European Commission for Standardization (CEN). , (1992).
  10. European Commission. Directive 98/8/EC concerning the placing of biocidal products on the market. Communication and Information Resource Centre for Administrations, Businesses and Citizens. , (2010).
  11. Mantanis, G. I. Chemical modification of wood by acetylation or furfurylation: A review of the present scaled-up technologies. BioResources. 12 (2), 4478-4489 (2017).
  12. Borges, L. M. S., Cragg, S. M., Bergot, J., Williams, J. R., Shayler, B., Sawyer, G. S. Laboratory screening of tropical hardwoods for natural resistance to the marine borer Limnoria quadripunctata: The role of leachable and non-leachable factors. Holzforschung. 62 (1), 99-111 (2008).
  13. Cragg, S. M., Pitman, A., Henderson, S. Developments in the understanding of the biology of marine wood boring crustaceans and in methods of controlling them. International Biodeterioration & Biodegradation. 43 (4), 197-205 (1999).
  14. Cookson, L. J., Vic, M. D. C. Additions to the taxonomy of the Limnoriidae. Memoirs of the Museum of Victoria. 56 (1), 129-143 (1997).
  15. Cookson, L. Australasian species of Limnoriidae (Crustacea: Isopoda). Memoirs of the Museum of Victoria. 52 (2), 137 (1991).
  16. Jones, L. T. The geographical and vertical distribution of British Limnoria [Crustacea: Isopoda]. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 43 (3), 589-603 (1963).
  17. Borges, L. M. S., Cragg, S. M., Busch, S. A laboratory assay for measuring feeding and mortality of the marine wood borer Limnoria under forced feeding conditions: A basis for a standard test method. International Biodeterioration & Biodegradation. 63 (3), 289-296 (2009).
  18. BSI Standards Publication. BS EN 350:2016. Durability of wood and wood-based products - Testing and classification of the durability to biological agents of wood and wood-based materials. BSI Standards Publication. , (2016).
  19. Menzies, R. The phylogeny, systematics, distribution, and natural history of limnoria. , University of Southern California. Dosctoal dissertation 196-208 (1951).
  20. Palanti, S., Feci, E., Anichini, M. Comparison between four tropical wood species for their resistance to marine borers (Teredo spp and Limnoria spp) in the Strait of Messina. International Biodeterioration & Biodegradation. 104, 472-476 (2015).
  21. Delgery, C. C., Cragg, S. M., Busch, S., Morgan, E. Effects of the epibiotic heterotrich ciliate Mirofolliculina limnoriae and moulting on the faecal pellet production by the wood-boring isopods Limnoria tripunctata and Limnoria quadripunctata. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 334 (2), 165-173 (2006).
  22. Morrell, J. J., Helsing, G. G., Graham, R. D. Marine wood maintenance manual: a guide for proper use of Douglas-fir in marine exposures. Forest Research Laboratory. , Oregon State University. Corvallis. Research Bulletin 48 (1984).
  23. Slevin, C. R., Westin, M., Lande, S., Cragg, S. Laboratory and marine trials of resistance of furfurylated wood to marine borers. Eighth European Conference on Wood Modification. , Aalto University. 464-471 (2015).
  24. Westin, M., et al. Marine borer resistance of acetylated and furfurylated wood - results from up to 16 years of field exposure. International Research Group on Wood Preservation. , Document No. IRG/WP 16-40756 (2016).
  25. Westin, M., Rapp, A., Field Nilsson, T. Field test of resistance of modified wood to marine borers. Wood Material Science and Engineering. 1 (1), 34-38 (2006).
  26. Borges, L. M. S. Biodegradation of wood exposed in the marine environment: Evaluation of the hazard posed by marine wood-borers in fifteen European sites. International Biodeterioration & Biodegradation. 96 (1), 97-104 (2014).
  27. Treu, A., et al. Durability and protection of timber structures in marine environments in Europe: An overview. BioResources. 14 (4), 10161-10184 (2019).
  28. Williams, J. R., Sawyer, G. S., Cragg, S. M., Simm, J. A questionnaire survey to establish the perceptions of UK specifiers concerning the key material attributes of timber for use in marine and freshwater engineering. Journal of the Institute of Wood Science. 17 (1), 41-50 (2005).
  29. Purnell, P. The carbon footprint of reinforced concrete. Advances in Cement Research. 25 (6), 362-368 (2013).
  30. Hill, C. A. S. The environmental consequences concerning the use of timber in the built environment. Frontiers in Built Environment. 5, 129 (2019).
  31. Mercer, T. G., Frostick, L. E. Leaching characteristics of CCA-treated wood waste: a UK study. Science of the Total Environment. 427, 165-174 (2012).
  32. Brown, C. J., Eaton, R. A., Thorp, C. H. Effects of chromated copper arsenate (CCA) wood preservative on early fouling community formation. Marine Pollution Bulletin. 42 (11), 1103-1113 (2001).
  33. Brown, C. J., Eaton, R. A. Toxicity of chromated copper arsenate (CCA)-treated wood to non-target marine fouling communities in Langstone Harbour, Portsmouth, UK. Marine Pollution Bulletin. 42 (4), 310-318 (2001).
  34. Brown, C. J., Albuquerque, R. M., Cragg, S. M., Eaton, R. A. Effects of CCA (copper-chrome-arsenic) preservative treatment of wood on the settlement and recruitment of wood of barnacles and tube building polychaete worms. Biofouling. 15 (1-3), 151-164 (2000).
  35. Lebow, S. T., Foster, D. O., Lebow, P. K. Release of copper, chromium and arsenic from treated southern pine exposed in seawater and freshwater. Forest Products Journal. 49 (7), 80-89 (1999).
  36. Smith, P. T. Risk to human health and estuarine posed by pulling out creosote-treated timber on oyster farms. Aquatic Toxicology. 86 (2), 287-298 (2008).
  37. Brown, C. J., et al. Assessment of Effects of Chromated Copper Arsenate (CCA)-Treated Timber on Nontarget Epibiota by Investigation of Fouling Community Development at Seven European Sites. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 45 (1), 0037-0047 (2003).

Tags

מדעי הסביבה גיליון 179 לימנוריה גריבל כדורי צואה קצב האכלה שימור עץ EN275 מתכלה ימית
בדיקה מהירה של עמידות של עץ להתכלות על ידי סרטנים מעץ ימי משעמם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martin, L. S., Shipway, J. R.,… More

Martin, L. S., Shipway, J. R., Martin, M. A., Malyon, G. P., Akter, M., Cragg, S. M. Rapid Testing of Resistance of Timber to Biodegradation by Marine Wood-Boring Crustaceans. J. Vis. Exp. (179), e62776, doi:10.3791/62776 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter