Summary
Imaging-derived mean square displacement (iMSD) analyse wordt toegepast op macropinosomen om hun intrinsieke tijd-evoluerende aard in termen van structurele en dynamische eigenschappen te benadrukken. Macropinosomen worden vervolgens vergeleken met insulinesecretiekorrels (ISG's) als referentie voor subcellulaire structuren met tijdinvariante gemiddelde structurele/dynamische eigenschappen.
Abstract
Imaging-derived mean square displacement (iMSD) wordt gebruikt om de structurele en dynamische eigenschappen van subcellulaire nanostructuren aan te pakken, zoals blaasjes die betrokken zijn bij de endo/ exocytotische handel in opgeloste stoffen en biomoleculen. iMSD is gebaseerd op standaard time-lapse-beeldvorming, is compatibel met elke optische opstelling en hoeft niet stil te staan bij afzonderlijke objecten om trajecten te extraheren. Van elk iMSD-spoor wordt een uniek drietal van gemiddelde structurele en dynamische parameters (d.w.z. grootte, lokale diffusiviteit, abnormale coëfficiënt) berekend en gecombineerd om de "iMSD-handtekening" van de bestudeerde nanostructuur te bouwen.
De potentie van deze benadering wordt hier bewezen met het voorbeeldige geval van macropinosomen. Deze blaasjes evolueren in de loop van de tijd en veranderen hun gemiddelde grootte, aantal en dynamische eigenschappen van vroege naar late stadia van intracellulaire handel. Ter controle worden insulinesecretiekorrels (ISG's) gebruikt als referentie voor subcellulaire structuren die in een stationaire toestand leven waarin de gemiddelde structurele en dynamische eigenschappen van de hele populatie van objecten invariant zijn in de tijd. De iMSD-analyse benadrukt deze eigenaardige kenmerken kwantitatief en effent de weg naar vergelijkbare toepassingen op subcellulair niveau, zowel in de fysiologische als pathologische toestanden.
Introduction
Subcellulaire nanostructuren (bijv. endocytische/secretoire blaasjes, organellen) spelen een cruciale rol in de celsignaleringsregulatie1. Een goede afstemming van hun structurele (bijv. grootte) en/of dynamische (bijv. diffusiviteit) kenmerken bepaalt hoe de cel reageert op interne of externe stimuli 2,3,4. Op basis van dit bewijs is het niet verrassend dat veranderingen van deze kenmerken in veel pathologische omstandigheden worden gevonden. Voorbeelden omvatten de rol van verkeerd gereguleerde endocytose bij kanker 2,3, de structurele en dynamische veranderingen die worden gevonden op het niveau van ISG's in β-cellen die zijn blootgesteld aantype-2 diabetesomstandigheden 5, de misregulatie van lysosomale structurele en transporteigenschappen in globoïde-cel leukodystrofie of galactosylceramide lipidose6, en disfuncties in de endo-lysosomale route bij neurodegeneratieve aandoeningen (bijv. De ziekte van Alzheimer)7.
In deze context hebben onderzoekers onlangs bewezen dat de prestaties van standaard optische microscopiemethoden kunnen worden verbeterd door de ruimtelijke en temporele bemonsteringsresolutie goed af te stemmen8. Dit kan op zijn beurt meer inzicht geven in biologische processen van relevantie. In de praktijk wordt dit mogelijk gemaakt door een algoritme van spatiotemporale fluctuatieanalyse, dat tegelijkertijd de gemiddelde structurele en dynamische eigenschappen van diffuserende objecten rechtstreeks uit de standaardstapel van optische microscopiebeelden haalt zonder dat voorafgaande kennis over het biologische object van belang en extractie van trajecten met één object nodig is. Al deze informatie is ingesloten in een enkele uitvoer van de methode: een iMSD-spoor9 (details over de afleiding en analyse van iMSD-sporen worden gegeven in aanvullend bestand 1).
Het resulterende experimentele protocol bestaat uit een paar stappen. Ten eerste wordt beeldvorming van het gebied van belang uitgevoerd met een hoge temporele resolutie. Vervolgens worden gemiddelde ruimtelijk-temporele correlatiefuncties berekend uit de stapel afbeeldingen. Ten slotte wordt door Gaussiaanse aanpassing van de reeks correlatiefuncties de gemiddelde 'diffusiewet' rechtstreeks uit beeldvorming verkregen en geanalyseerd om de objectdiffusiemodus te herkennen. Het potentieel van de methode was al bewezen voor een verscheidenheid aan biologische objecten, variërend van moleculen tot nanodeeltjes en zelfs hele subcellulaire organellen / structuren 9,10,11,12,13,14,15.
Dit artikel rapporteert iMSD-toepassing op macropinosomen om hun intrinsieke, onomkeerbare tijdsveranderende aard te benadrukken in termen van hun gemiddelde (d.w.z. op het hele populatieniveau) structurele en dynamische eigenschappen. Verder worden deze endocytische blaasjes vergeleken met ISG's als referentie voor subcellulaire structuren in een 'stationaire toestand', d.w.z. een toestand waarin de gemiddelde structurele / dynamische eigenschappen van de hele populatie van korrels op elk moment constant blijven. Macropinocytose definieert een reeks gebeurtenissen geïnitieerd door de uitgebreide reorganisatie (of ruches) van het plasmamembraan om een externe macropinocytische structuur te vormen die vervolgens wordt geïnternaliseerd16. De gevormde macropinosomen in een vroeg stadium lijken sterk op fagosomen. Tegelijkertijd kunnen ze worden onderscheiden van andere vormen van endocytische blaasjes vanwege hun karakteristieke grote omvang, morfologische heterogeniteit en gebrek aan eiwitlaagstructuren.
Biochemische assays onthulden dat macropinosomen bij internalisatie geleidelijk worden verrijkt met eiwitmarkers van andere endocytische routes, wat suggereert dat hun identiteit voortdurend verandert tijdens de handel17. Met behulp van antilichamen tegen bekende markers van de endosomale route werd aangetoond dat macropinosomen geleidelijk klassieke endoconale kenmerken aannemen: ze nemen in omvang af, ontwikkelen zich tot late endocytische structuren (bijv. lysosomen) of verliezen uiteindelijk hun identiteit via membraangemedieerd ophalen van specifieke moleculaire markers (bijv. het sorteren van nexins)18,19 . Het algemene scenario is dat elk macropinosoom in de cel onomkeerbaar zijn structurele en dynamische (evenals moleculaire) identiteit verandert tijdens de handel van het plasmamembraan naar zijn uiteindelijke intracellulaire lot. Als gevolg hiervan veranderen ook de structurele/dynamische/moleculaire eigenschappen van de hele populatie van macropinosomen langs hetzelfde temporele pad. Omdat de iMSD-methode intrinsiek gevoelig is voor de gemiddelde eigenschappen van de hele populatie van waargenomen objecten, geeft ze kwantitatief de 'evoluerende aard' weer door de kwantificering van belangrijke gemiddelde parameters, d.w.z. de lokale diffusiviteit en abnormale coëfficiënt (dynamische eigenschappen) en de gemiddelde grootte van de macropinosomen (structurele eigenschap) in elk stadium van hun intracellulaire handel.
Ter vergelijking werden vergelijkbare metingen uitgevoerd op een bekende intracellulaire membraan-omsloten structuur, de ISG, in een model van β-cellen. Net als macropinosomen is de regulatie van de structurele en dynamische eigenschappen van ISG's, van hun ontstaan bij het Trans Golgi Network (TGN) tot hun exocytose bij het plasmamembraan, cruciaal voor de juiste uitvoering van ISG-functie20. In tegenstelling tot macropinosomen leven ISG's echter in een 'stationaire toestand' waarin op elk moment alle functionele / structurele / moleculaire stadia van isg-levensduur tegelijkertijd in de cel aanwezig zijn en elk wordt vertegenwoordigd door een specifieke subpopulatie van ISG's. Dit betekent dat hoewel elke afzonderlijke korrel onomkeerbaar evolueert van biogenese naar secretie, de gemiddelde structurele / dynamische eigenschappen van de hele populatie van korrels naar verwachting op elk moment constant zullen blijven (tenzij de stationaire toestandsomstandigheden worden veranderd, bijvoorbeeld door externe stimuli zoals glucose, cholesterol en cytokines13). Dit wordt bevestigd door iMSD-analyse.
Protocol
1. Monstervoorbereiding
- Vóór het microscopie-experiment, subcultuur cellen in schotels geschikt voor microscopie toepassingen.
- Was een met weefselkweek behandelde schaal van 10 cm met confluent HeLa of INS 1E (insulinoom β-celachtige) cellen tweemaal met 0,01 M 1x PBS, voeg 1 ml 0,05% trypsine-EDTA (1x) toe en plaats deze gedurende 5 minuten in een bevochtigde, 5% CO2-incubator van 37 °C.
- Resuspend de losgemaakte cellen door 9 ml volledig DMEM (voor HeLa-cellen) of RPMI 1640 (voor INS-1E-cellen) medium toe te voegen en verzamel de laatste 10 ml in centrifugebuizen.
- Zaai ongeveer 2 × 105 cellen in elke schaal van 35 mm x 10 mm in een eindvolume van 1 ml van het medium. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2.
- Als u lysosomen fluorescerend wilt labelen, gebruikt u LysoTracker Red DND-99.
- Verdun de stamoplossing in 1 ml voorgewarmd medium tot een eindkleurstofconcentratie van 70 nM.
- Vervang het medium uit het gerecht door vers medium met LysoTracker. Incubeer de cellen in LysoTracker-bevattend medium gedurende 20 minuten bij 37 °C in een 5% CO2-atmosfeer en was ze tweemaal met vers medium vóór het experiment.
- Om macropinosomen fluorescerend te labelen, gebruikt u 70-kDa fluoresceïne isothiocyanaat-dextran. Was de gesubcultureerde cellen driemaal met 0,01 M 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), vervang door dextran-bevattend medium (1 mg/ml) en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten. Voordat u verder gaat met het microscopie-experiment, wast u de cellen drie keer met vers medium.
- Om ISG's in INS-1E-cellen fluorescerend te labelen, transfecteren de cellen met behulp van transfectiereagens (zie de tabel met materialen) en C-peptide-enhanced green fluorescent protein (EGFP) plasmide13 volgens het protocol van de fabrikant en incuberen bij 37 °C gedurende 24 uur in een 5% CO2-atmosfeer vóór het experiment.
2. Data-acquisitie
- Om de microscoop te laten balanceren bij de gewenste temperatuur en atmosfeer, schakelt u het microscoopincubatorregelsysteem ten minste 2 uur voor het experiment in.
OPMERKING: Elke overname is een time-lapse-serie. - Verkrijg de beelden met behulp van een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met een 60x, 1.2 Numerical Aperture (NA) water-immersie objectief.
- Gebruik een Argon-laser van 488 nm voor excitatie van EGFP (getransfecteerde cellen) en macropinosomen met fluoresceïnelabel. Verzamel de fluorescentie-emissie tussen 500 en 600 nm met behulp van een standaard fotomultiplicatorbuisdetector.
- Gebruik een HeNe-laser van 543 nm om de Lysotracker te prikkelen en de fluorescentie-emissie tussen 555 en 655 nm te verzamelen.
- Stel de diameter van het detectietangje in op de grootte van 1 Airy. Verzamel voor elke acquisitie een reeks van 1000 opeenvolgende frames. Stel de pixel-dwell-tijd in op 2 μs/pixel voor een frametijd van 129 ms.
OPMERKING: Elk frame bestond uit 256 x 256 pixels (16 bit/pixel) met een fysieke afmeting van 69 nm/pixel, wat ongeveer overeenkomt met een oppervlakte van 17 μm x 17 μm.
3. i MSD-berekening
OPMERKING: Om de berekening correct uit te voeren, gebruikt u software die in staat is tot numerieke berekening en scriptprogrammering. Het specifieke script (d.w.z. voor het scriptbestand 'iMSD.m', zie Ondersteunend bestand 1) moet aanwezig zijn in dezelfde map met de te verwerken afbeeldingsreeks. Elke afbeelding van de serie moet worden opgeslagen als een afzonderlijk '.tif'-bestand.
- Om de instrumentele parameters die voor de acquisities worden gebruikt correct te initialiseren, opent u iMSD.m met de softwareteksteditor en wijzigt u de eerste sectie als volgt.
- Stel N in als het aantal frames in de tijdreeks (bijvoorbeeld 1000 in dit protocol).
- Stel px_size in: pixelgrootte, uitgedrukt in μm (bijvoorbeeld 0,069 in dit protocol).
- Set f: temporele resolutie van elk frame, uitgedrukt in seconden (bijvoorbeeld 0,129 in dit protocol).
- Filter instellen: binaire invoer voor achtergrondcorrectie, stel de waarde in op '0' om onbewerkte afbeeldingen te verwerken of stel de waarde in op '1' om een op drempelwaarde gebaseerde achtergrondaftrek uit te voeren.
- Stel av_toll in: drempel voor achtergrondcorrectie; elke pixel met een intensiteit lager dan deze waarde wordt ingesteld op 0 als Filter=1.
- Stel bit in als het gehele getal dat de intensiteitsbemonstering bepaalt (bijvoorbeeld 8 bit, 16 bit).
- Sla het bewerkte scriptbestand iMSD.m op en voer het uit.
- Controleer de uitvoering van het script.
OPMERKING: De verwerkingsstatus van de berekening kan worden gecontroleerd in het opdrachtvenster; als er een fataal probleem optreedt, wordt het proces onderbroken en wordt een waarschuwingsbericht weergegeven om het fouttype en de bijbehorende regelcode weer te geven. Volg anders de stappen 3.3.1-3.3.3.- Importeer de afbeeldingsstapel en trek de achtergrond af (indien nodig).
- Bereken de spatiotemporale correlatiefunctie G(ξ,η,τ) met behulp van de Fouriermethode.
- Pas de spatiotemporale correlatiefunctie aan met een 2D Gaussiaanse functie.
OPMERKING: Aan het einde van het proces worden de uitvoerwaarden van de σ2 (τ) montageprocedures weergegeven in het opdrachtvenster: gemiddelden, fouten en bijbehorende goedheid (R2) van de montage worden gerapporteerd.
- Controleer de grafische uitvoer.
OPMERKING: De iMSD-curve en de bijbehorende fittingcurven worden weergegeven in drie afzonderlijke panelen, elk voor een ander type fittingvergelijking die wordt gebruikt: Brownse diffusie, abnormale diffusie of beperkte diffusie. Voor elke curve wordt de R2-waarde gerapporteerd in de grafieklegende. - Controleer de tekstuitvoer.
OPMERKING: Aan het einde van het proces wordt een '.xls'-bestand gemaakt met dezelfde naam als het oorspronkelijke time-lapse '.tif'-bestand. Het eerste blad bevat de waarden ξ, η, τ en σ2 berekend voor elke tijdsvertraging. De inputparameters en de belangrijkste berekende outputwaarden worden gerapporteerd in het tweede blad, d.w.z. diffusiecoëfficiënt, abnormale coëfficiënt en y-as σ20 intercept.
Representative Results
De algemene workflow van de methode is weergegeven in figuur 1. Het geeft een samenvatting van de belangrijkste stappen die in de protocolsectie worden gepresenteerd, van monstervoorbereiding (figuur 1A) tot time-lapse beeldvorming van intracellulaire nanostructuren (figuur 1B), fluctuatieanalyse voor de berekening van de reeks spatiotemporale correlatiefuncties (figuur 1C) en aanpassing voor de afleiding van de gemiddelde structurele / dynamische eigenschappen van het bestudeerde object (figuur 1D).
Een kritische parameter is de tijdresolutie die wordt aangenomen voor het afbeelden van het subcellulaire object van belang. Deze experimentele waarde bepaalt de tijdsdrempel waarop de minimale gemiddelde verplaatsing van de objecten van belang zal worden gemeten. De voorkeursvoorwaarde is echter het instellen van een tijdresolutie van beeldvorming waarbij het object van belang 'onbeweeglijk' lijkt binnen het vastgelegde frame, d.w.z. het vertoont een karakteristieke grootte die gemiddeld niet wordt vervormd als gevolg van de beeldvormingssnelheid. Dit is technisch mogelijk als het object van belang een met membraan omsloten subcellulaire structuur of organel is (zoals in dit geval). Doorgaans vertonen subcellulaire structuren lokale diffusiecoëfficiënten (D, μm2/s, zie tabel 1) die enkele ordes van grootte lager zijn dan die van geïsoleerde afzonderlijke moleculen in het cytoplasma (bijv. GFP21). Validatie kan worden uitgevoerd door het organel van belang kunstmatig te immobiliseren (bijvoorbeeld door chemische fixatie). Inderdaad, deze voorwaarde kan dienen als referentie om de werkelijke organelgrootte te bepalen onder de gebruikte experimentele omstandigheden (bijv. Excitatiegolflengte, pixelgrootte, objectief).
Hier, hoewel lysosomen werden gebruikt als testorganellen voor deze procedure, zijn de resultaten onafhankelijk van de doelstructuur geldig. Figuur 2A toont een afbeelding van een vast (d.w.z. onbeweeglijk) lysosoom samen met een acquisitie uitgevoerd op levende cellen met de juiste temporele resolutie (d.w.z. typisch minder dan 100 ms/frame; bijv. 65 ms/frame in het voorbeeld in figuur 2B) en een acquisitie die opzettelijk is uitgevoerd met een zeer lage temporele resolutie (bijv. 10 s/frame in het voorbeeld in figuur 2C ). Voor elke toestand wordt de grootte van het diffuserende object als volgt geëxtraheerd: i) een intensiteitsprofiel van de plek wordt afgeleid door het lijngereedschap in ImageJ-software; ii) het intensiteitsprofiel wordt uitgezet en geïnterpoleerd door een Gauss-functie om de volledige breedte bij half maximum (FWHM) te berekenen die op zijn beurt wordt gebruikt als schatting van de spotdiameter (figuur 2D). Zoals verwacht en weergegeven in de grafiek van figuur 2E, levert de acquisitie met een zeer hoge temporele resolutie (d.w.z. 65 ms/frame) een gemiddelde grootte van de structuur op die dicht bij die in het vaste monster ligt, hetzij met behulp van het hierboven beschreven standaardgereedschap, hetzij door de iMSD y-as interceptie te extraheren. In plaats daarvan levert de verwerving met lage snelheid een toename van de schijnbare grootte van de structuur op, vanwege de natuurlijke structuurdynamiek tijdens beeldvorming. Onder suboptimale experimentele omstandigheden weerspiegelt de geëxtraheerde structurele/dynamische informatie niet getrouw de intrinsieke eigenschappen van het bestudeerde object.
Zodra de belangrijkste experimentele parameters zijn geselecteerd, kunnen datasets worden geproduceerd voor de intracellulaire doelstructuren. Voor macropinosomen werden na 20 minuten incubatie van de cellen met 70 kDa dextrans tijdreeksen van de gelabelde intracellulaire structuren verkregen op verschillende tijdstippen na de behandeling, van 30 minuten tot ongeveer 180 minuten. Interessant is dat een geleidelijke verandering in de structurele en dynamische eigenschappen van macropinosomen wordt gedetecteerd tijdens de handel (figuur 3; verdelingen van σ02, Dm, α en N voor macropinosomen worden gerapporteerd in de plots aan de linkerkant). Hoewel er tijdens de handel geen duidelijke veranderingen in de lokale diffusiviteit (Dm) van macropinosomen worden gedetecteerd, evolueren zowel de karakteristieke grootte (σ02) als de algehele bewegingsmodus (α) in de tijd.
Van bijzonder belang is dat een afname van de gemiddelde grootte van de macropinosomen wordt waargenomen tijdens de handel (figuur 3A, links), samen met een gelijktijdige toename van het subdiffusieve karakter van hun beweging (d.w.z. aangeduid als een afname van α waarden, figuur 3C, linkerpaneel). Bovendien werd het aantal macropinosomen uit elke acquisitie geëxtraheerd: de resultaten, gerapporteerd in figuur 3D, linkerpaneel, laten duidelijk een toename van het aantal macropinosomen in de tijd zien. Al deze resultaten komen goed overeen met de verwachtingen, omdat dextran-gelabelde macropinosomen verondersteld worden te ontstaan als geïsoleerde, grote membraan-ingesloten blaasjes bij het plasmamembraan (die ook bekwaam zijn voor beweging langs cytoskeletcomponenten), maar worden verondersteld geleidelijk te communiceren met de endo-lysosomale route bestaande uit een grote populatie van kleinere en willekeurig diffuserende structuren.
Zoals hierboven verwacht, staan de resultaten voor macropinosomen in contrast met vergelijkbare metingen uitgevoerd op ISG's (figuur 3, rechterkolom). Insulinekorrels vertonen geen tijdsveranderende trend van de van iMSD afgeleide structurele/dynamische parameters (en hun gemiddelde aantal in de cel) in hetzelfde tijdvenster dat wordt waargenomen voor macropinosomen. Bovendien zijn de karakteristieke waarden van σ02, Dm en α heel anders dan die van lysosomen, die opnieuw als referentie worden gebruikt. Dit resultaat bevestigt het idee, zoals hierboven verwacht, dat korrels worden onderzocht in een 'stationaire toestand' waarin op elk moment de gemiddelde structurele / dynamische eigenschappen van de hele populatie isg's ongewijzigd zijn (d.w.z. ze blijven constant, tenzij de stationaire toestandsomstandigheden veranderen, bijvoorbeeld als gevolg van externe stimuli).
Figuur 1: Experimentele workflow. (A) Cellen werden 24 uur (48 uur voor transfectie-experimenten) vóór confocale experimenten op celschalen die geschikt waren voor microscopische toepassingen verguld. Cellen werden vervolgens geschikt behandeld volgens de etiketteringsmethode (zie protocol) om het cytoplasmatisch organel van belang te kleuren. (B) Een typische confocale acquisitie bestaat uit een stapel afbeeldingen (time-lapse) van een cytoplasmatisch deel van een levende cel, die de tijdsevolutie van gelabelde organeldynamica beschrijft. (C) Time-lapse film wordt geanalyseerd met een op maat gemaakt Matlab-script, waarbij eerst de spatiotemporale beeldcorrelatiefunctie wordt berekend en Gaussiaanse aanpassing om iMSD-curven (D) en gerelateerde geëxtraheerde aanpassingsparameters te plotten die structurele dynamische parameters van afgebeelde organellen beschrijven. Afkortingen: iMSD = imaging-derived mean square displacement; STICS = spatiotemporale beeldcorrelatiespectroscopie; α = abnormale diffusiecoëfficiënt; Dm = lokale diffusiviteit; σ2(τ) = variantie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Juiste experimentele parameters. (A) Voorbeeldbeeld van gekleurde lysosomen in een vast monster. Schaalbalk = 2 μm. (B) Het eerste frame van een stapel afbeeldingen van gekleurde lysosomen in een levende cel, verkregen met de juiste parameters. Temporele resolutie: 65 ms/frame. Schaalbalk = 2 μm. (C) Het eerste frame van een stapel afbeeldingen van gekleurde lysosomen in een levende cel, verkregen met lage snelheid: artefactuele vervorming van de schijnbare lysosoomgrootte als gevolg van organelbeweging tijdens beeldvorming is zichtbaar. Temporele resolutie: 10 s/frame. Schaalbalk = 2 μm. (D) Voorbeeld van grootteberekening voor afgebeelde lysosomen in een blauwe ROI van (A), (B) en (C). Het intensiteitsprofiel langs de blauwe lijn werd uitgerust met een Gaussische functie om de FWHM op te halen, d.w.z. een schatting van de spotgrootte. FWHM-waarden worden gerapporteerd voor elke fitting. (E) Grafische weergave van groottewaarden verkregen door beeldanalyse beschreven in paneel (D) voor alle afgebeelde lysosomen (zwart vierkant, gemiddelde waarde en standaarddeviatie), voor lysosomen ingesloten in de blauwe ROI (blauwe driehoek) en opgehaald door iMSD-analyse (rode cirkel). Dit cijfer is van 22. Afkortingen: ROI = regio van belang; FWHM = volledige breedte bij halfmaximum; iMSD = van beeldvorming afgeleide gemiddelde vierkante verplaatsing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Temporele evolutie van gelabelde organellen. (A) Plots van iMSD-geëxtraheerde groottewaarden versus tijdsprogressie van daaropvolgende acquisities weergegeven als een gemiddelde van gemeten waarden in acquisities uitgevoerd op een tijdvenster van 10 minuten. Aan de linkerkant, progressieve vermindering van de gemiddelde grootte van macropinosomen (zwarte cirkels) en aan de rechterkant, de tijd-invariante grootte van insuline secretoire korrels (zwarte vierkanten) in vergelijking met lysosomen, weergegeven als gemiddelde groottewaarde (dikkere rode lijn) ± standaarddeviatie (onderbroken rode lijnen). (B) en (C) Tijdsprogressie van Dm en α coëfficiënten voor macropinosomen (links) en insulinekorrels (rechts) geëxtraheerd door iMSD-analyse. (D) Tijdsevolutie van aantallen gelabelde macropinosomen en insulinekorrels gemeten in het eerste frame van elke verworven time-lapse film. Afkortingen: iMSD = imaging-derived mean square displacement; α = abnormale diffusiecoëfficiënt; Dm = lokale diffusiviteit, N = getal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Organel | Etikettering | Cellijn | Grootte (nm) | Dm ( × 10-3 μm2/s) | α | N | Ref. | ||
| Vroeg-endosoom (EE) | CellLight Vroege Endosome GFP | Hela | 395±74. | 3.0±2.4. | 1.02±0.20 uur | 40 | 10 | ||
| Late Endosome (LE) | CellLight Late Endosome GFP | Hela | 693±102 | 15.4±10.6 uur | 0.57±0.16 uur | 58 | 10 | ||
| Lysosoom (LY) | LysoTracker DND-99 | Hela | 471±76. | 15.3±9.0 uur | 0.49±0.13 uur | 143 | 10, 14 | ||
| Caveola (CAV) | Caveolin-EGFP | Hela | 405±49. | 3.1±1.8. | 1.00±0.22 uur | 15 | 10 | ||
| Clathrin Gecoate Vescicle (CCV) | Transferrin-Alexa 488 | Hela | 513±62. | 16.2±9.9 uur | 0.48±0.17 uur | 33 | 10 | ||
| Insuline granulaat (IG) | C-peptide-EGFP | Ins-1e | ±335 | 3.0±1.7. | 0,70±0,14 | 107 | 11 | ||
| Vroeg macropinosoom (EMCR) | Fluoresceïne-Dextran 70 kDa | Hela | 979±423 | 8,3±9 | 0.79±0.27 uur | 36 | 10 | ||
| Intermediair macropinosoom (IMCR) | Fluoresceïne-Dextran 70 kDa | Hela | 702±180 | 13.7±19.9 uur | 0,60±0,38 | 29 | 10 | ||
| Laat Macropinosoom (LMCR) | Fluoresceïne-Dextran 70 kDa | Hela | 592±127 | 5.8±4.7. | 0.39±0.21 uur | 21 | 10 | ||
Tabel 1: Structurele en dynamische iMSD-geëxtraheerde parameters. De tabel toont de waarden van grootte, Dm en α coëfficiënt gemeten voor verschillende organellen, met vermelding van etiketteringsstrategieën, de gebruikte cellijn en het aantal geanalyseerde acquisities. Waarden worden gerapporteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie. Afkortingen: iMSD = imaging-derived mean square displacement; α = abnormale diffusiecoëfficiënt; Dm = lokale diffusiviteit, N = getal; GFP = groen fluorescerend eiwit; EGFP = versterkt groen fluorescerend eiwit.
Aanvullend bestand 1: Details over de afleiding en analyse van iMSD-sporen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Ondersteunend bestand 1: Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
De eigenschappen en voordelen van iMSD zijn duidelijk in vergelijking met de beschikbare technieken om analoge informatie op te halen. Voor structurele informatie heeft de voorkeur transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) analyse. Met deze methode kunnen ultrastructurele details met moleculaire resolutie en zelfs daarbuiten worden opgehaald, zelfs voor subcellulaire nanostructuren. Niettemin wordt de eigenaardige ruimtelijke resolutie van TEM bereikt ten koste van de informatie in de temporele dimensie, die hier van belang is. Om dit te compenseren, zijn de recente ontwikkelingen in live-cell imaging-technologieën van bijzonder belang. Deze omvatten nieuwe fluorescerende markers met verhoogde prestaties (bijv. Helderheid en fotostabiliteit), geoptimaliseerde etiketteringsprocedures en gevoeligere detectoren. Daarnaast zijn er analytische instrumenten beschikbaar om zowel structurele (bijv. 'grootte' door phasor-gebaseerde analyse van lokale beeldcorrelatiespectroscopie, PLICS23, aggregatie/oligomerisatie door nummer- en helderheidsanalyse24) als dynamische (bijv. diffusiewetgeving door single-particle tracking, d.w.z. (SPT)25,26,27,28 aan te pakken ) parameters op de subcellulaire schaal. De SPT-methode biedt directe toegang tot het objecttraject en de bijbehorende MSD. Het nadeel is echter de noodzaak van een lage dichtheid van de sonde en zeer heldere labels en veel trajecten van één object die moeten worden gemeten om aan statistische criteria te voldoen. Met betrekking tot de temporele resolutie van de meting kunnen anorganische, fotostabiele sondes (bijv. Quantum Dots of metalen nanodeeltjes) de SPT-prestaties verhogen, maar ten koste van complexe productie- en etiketteringsprocedures.
In vergelijking met deze standaarden laat de hier beschreven iMSD-methode enkele belangrijke voordelen zien. Ten eerste kan deze aanpak worden gebruikt in combinatie met relatief zwakke fluorescerende tags, zoals genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeld de toepassing op ISG's). In vergelijking met SPT wordt dus een hogere temporele resolutie bereikt (met hetzelfde label) vanwege de lagere hoeveelheid fotonen die nodig is8. Ten tweede wordt de iMSD-methode alleen beperkt door de temporele resolutie, maar niet door diffractie. In feite kunnen, ondanks de gebruikte diffractie-beperkte optische opstelling, gemiddelde moleculaire verplaatsingen zelfs onder de diffractielimiet worden gemeten, zoals al is aangetoond voor moleculaire stromen met behulp van STICS29. De werkelijke resolutie bij het meten van verplaatsingen hangt af van hoe nauwkeurig (in termen van signaal-ruis) de correlatiefunctie kan worden gemeten, wat verklaart waarom deze niet wordt beperkt door diffractie. Het lijkt dus duidelijk dat de minimale verplaatsing die kan worden gemeten afhankelijk is van de diffusiviteit van het object van belang en de temporele resolutie van de beeldvormingsopstelling.
In dit verband is het belangrijk om te overwegen dat toepassing op subcellulaire nanostructuren, zoals macropinosomen of insulinekorrels, met een laserscanmicroscoop optimaal is: de beschikbare scansnelheid is aanzienlijk hoger dan de dynamiek van het object van belang. In een dergelijk geval is de beweging van de objecten tijdens de verwerving verwaarloosbaar en kan de correlatiefunctie worden benaderd door een Gaussiaanse functie. Ten slotte kan de iMSD-benadering eenvoudig worden toegepast op een breed scala aan commerciële optische microscopie-opstellingen op basis van rasterscan of op wide-field camera's gebaseerde beeldvorming, zonder dat systeemkalibratie nodig is (alleen vereist als een nauwkeurige schatting van de deeltjesgrootte moet worden bereikt). Een belangrijke parameter voor de werkwijze is een goede ruimtelijke bemonstering. Als algemene regel geldt dat, om een bevredigende convergentie van het aanpassingsalgoritme te bereiken, de minimumgrootte van het gebied dat van belang is voor beeldvorming ten minste 3 keer groter moet zijn dan de maximale verplaatsing van belang.
Kortom, de iMSD-methode vereist alleen een microscoop die is uitgerust voor snelle acquisitie. De structuur van belang kan worden getagd aan elke genetisch gecodeerde of organische fluorofoor, waardoor meerkanaals beeldvorming mogelijk is. Het is de bedoeling dat cross-iMSD-analyse in de nabije toekomst zal worden gebruikt om subpopulaties van subcellulaire nanostructuren te selecteren en hun interacties en co-diffusie in de cel te onthullen, waarbij de laatste een hot topic is in de cellulaire biofysica. Als er enig detail verloren gaat door iMSD-analyse, heeft dit zeker te maken met de grote hoeveelheid moleculaire informatie binnen dynamische subcellulaire nanostructuren. Dergelijke informatie wordt onvermijdelijk gemiddeld tijdens de meting als gevolg van een slechte temporele resolutie. Theoretisch is er echter geen technische limiet vanwege de mogelijkheid om moleculaire informatie op te halen, op voorwaarde dat voldoende acquisitiesnelheden kunnen worden bereikt8. Vanwege de voortdurende verbeteringen in detectorsnelheid / gevoeligheid en beeldvormingstechnologieën, is het de bedoeling dat informatie over het hele subcellulaire compartiment en de moleculaire bestanddelen ervan uit een enkele dataset zal worden geëxtraheerd.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling te melden.
Acknowledgments
Dit werk heeft financiering ontvangen van de Europese Onderzoeksraad (ERC) in het kader van het Horizon 2020 Onderzoeks- en Innovatieprogramma van de Europese Unie (subsidieovereenkomst nr. 866127, project CAPTUR3D).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Cell medium supplement |
| C-peptide-EGFP | Plasmid | ||
| DMEM High Glucose | Gibco | 31053028 | Cell medium (HeLa) |
| FBS | Gibco | 10082147 | Cell medium supplement |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma Aldrich | 46945-100MG-F | Reagent |
| HeLa | ATCC | CCL-61 | Cell Line |
| Lipofectamine 2000 | TermoFisher | 11668019 | Trasfection reagent |
| Lysotracker Red DND-99 | Gibco | L7528 | Reagent |
| Matlab | MathWork | Software | |
| Microscope-suitable cell dishes | Willco | GWSt-3522 | Petri dishes |
| Olympus FV1000 | Olympus Japan | Confocal microscope | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11835063 | Cell medium (INS-1E) |
References
- Murphy, J. E., Padilla, B. E., Hasdemir, B., Cottrell, G. S., Bunnett, N. W. Endosomes: a legitimate platform for the signaling train. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17615-17622 (2009).
- Mosesson, Y., Mills, G. B., Yarden, Y. Derailed endocytosis: an emerging feature of cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (11), 835-850 (2008).
- Mellman, I., Yarden, Y.
- Di Fiore, P. P. Endocytosis, signaling and cancer, much more than meets the eye. Preface. Molecular Oncology. 3 (4), 273-279 (2009).
- Bogan, J. S., Xu, Y., Hao, M. Cholesterol accumulation increases insulin granule size and impairs membrane trafficking. Traffic. 13 (11), 1466-1480 (2012).
- Ballabio, A., Gieselmann, V. Lysosomal disorders: From storage to cellular damage. Biochimica et Biophysica Acta. 1793 (4), 684-696 (2009).
- Hu, Y. -B., Dammer, E. B., Ren, R. -J., Wang, G. The endosomal-lysosomal system: from acidification and cargo sorting to neurodegeneration. Translational Neurodegeneration. 4, 18 (2015).
- Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Spatiotemporal fluctuation analysis: a powerful tool for the future nanoscopy of molecular processes. Biophysical Journal. 111 (4), 679-685 (2016).
- Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Fast spatiotemporal correlation spectroscopy to determine protein lateral diffusion laws in live cell membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12307-12312 (2013).
- Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51994 (2014).
- Digiacomo, L., et al. Dynamic fingerprinting of sub-cellular nanostructures by image mean square displacement analysis. Scientific Reports. 7 (1), 14836 (2017).
- Durso, W., et al. Lysosome dynamic properties during neuronal stem cell differentiation studied by spatiotemporal fluctuation spectroscopy and organelle tracking. International Journal of Molecular Sciences. 21 (9), 3397 (2020).
- Ferri, G., et al. Insulin secretory granules labelled with phogrin-fluorescent proteins show alterations in size, mobility and responsiveness to glucose stimulation in living β-cells. Scientific Reports. 9 (1), 2890 (2019).
- Durso, W., D'Autilia, F., Amodeo, R., Marchetti, L., Cardarelli, F. Probing labeling-induced lysosome alterations in living cells by imaging-derived mean squared displacement analysis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2704-2709 (2018).
- Digiacomo, L., Digman, M. A., Gratton, E., Caracciolo, G. Development of an image Mean Square Displacement (iMSD)-based method as a novel approach to study the intracellular trafficking of nanoparticles. Acta Biomaterialia. 42, 189-198 (2016).
- Swanson, J. A., Watts, C.
- Jones, A. T. Macropinocytosis: searching for an endocytic identity and role in the uptake of cell penetrating peptides. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 670-684 (2007).
- Falcone, S., et al. Macropinocytosis: regulated coordination of endocytic and exocytic membrane traffic events. Journal of Cell Science. 119, Pt 22 4758-4769 (2006).
- Kerr, M. C., et al. Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins. Journal of Cell Science. 119, Pt 19 3967-3980 (2006).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Di Rienzo, C., Piazza, V., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Probing short-range protein Brownian motion in the cytoplasm of living cells. Nature Communications. 5 (1), 5891 (2014).
- Ferri, G., et al. Time-lapse confocal imaging datasets to assess structural and dynamic properties of subcellular nanostructures. Scientific Data. 5 (1), 180191 (2018).
- Scipioni, L., Gratton, E., Diaspro, A., Lanzanò, L. Phasor analysis of local ICS detects heterogeneity in size and number of intracellular vesicles. Biophysical Journal. 111 (3), 619-629 (2016).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
- Li, C. H., Bai, L., Li, D. D., Xia, S., Xu, T. Dynamic tracking and mobility analysis of single GLUT4 storage vesicle in live 3T3-L1 cells. Cell Research. 14 (6), 480-486 (2004).
- Donovan, K. W., Bretscher, A. Tracking individual secretory vesicles during exocytosis reveals an ordered and regulated process. Journal of Cell Biology. 210 (2), 181-189 (2015).
- Westphal, V., et al. Video-rate far-field optical nanoscopy dissects synaptic vesicle movement. Science. 320 (5873), 246-249 (2008).
- Tabei, S. M. A., et al. Intracellular transport of insulin granules is a subordinated random walk. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 4911-4916 (2013).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
