Summary
Imaging-derived mean square displacement (iMSD) analys tillämpas på makropinosomer för att belysa deras inneboende tidsutveckling natur när det gäller strukturella och dynamiska egenskaper. Makropinosomer jämförs sedan med insulinsekretoriska granuler (ISG) som referens för subcellulära strukturer med tidsinvarianta genomsnittliga strukturella/dynamiska egenskaper.
Abstract
Imaging-derived mean square displacement (iMSD) används för att ta itu med de strukturella och dynamiska egenskaperna hos subcellulära nanostrukturer, såsom vesiklar som är involverade i endo/exocytotisk handel med lösta ämnen och biomolekyler. iMSD förlitar sig på standard time-lapse-avbildning, är kompatibel med alla optiska inställningar och behöver inte bo på enskilda objekt för att extrahera banor. Från varje iMSD-spår beräknas och kombineras en unik triplett av genomsnittliga strukturella och dynamiska parametrar (dvs. storlek, lokal diffusivitet, avvikande koefficient) för att bygga "iMSD-signaturen" för den nanostruktur som studeras.
Styrkan i detta tillvägagångssätt bevisas här med det exemplifierande fallet med makropinosomer. Dessa vesiklar utvecklas i tid och ändrar deras genomsnittliga storlek, antal och dynamiska egenskaper som passerar från tidiga till sena stadier av intracellulär handel. Som en kontroll används insulinsekretoriska granuler (ISG) som referens för subcellulära strukturer som lever i ett stationärt tillstånd där de genomsnittliga strukturella och dynamiska egenskaperna hos hela populationen av objekt är invarianta i tid. iMSD-analysen belyser dessa särdrag kvantitativt och banar väg för liknande applikationer på subcellulär nivå, både i fysiologiska och patologiska tillstånd.
Introduction
Subcellulära nanostrukturer (t.ex. endocytiska/sekretoriska vesiklar, organeller) spelar en central roll i cellsignalreglering1. Korrekt inställning av deras strukturella (t.ex. storlek) och / eller dynamiska (t.ex. diffusivitet) egenskaper bestämmer hur cellen svarar på inre eller yttre stimuli 2,3,4. Baserat på detta bevis är det inte förvånande att förändringar av dessa egenskaper finns i många patologiska tillstånd. Exempel omfattar rollen av felreglerad endocytos i cancer 2,3, de strukturella och dynamiska förändringar som finns på nivån av ISG i β-celler som utsätts för typ 2-diabetestillstånd5, felreglering av lysosomala strukturella och transportegenskaper i globoidcellleukodystrofi eller galaktosylceramidlipidos6 och dysfunktionaliteter i endo-lysosomal väg vid neurodegenerativa störningar (t.ex. Alzheimers sjukdom)7.
I detta sammanhang har forskare nyligen bevisat att prestandan hos vanliga optiska mikroskopimetoder kan förbättras genom korrekt inställning av rumslig och tidsmässig samplingsupplösning8. Detta kan i sin tur ge ytterligare insikt i biologiska processer av relevans. I praktiken möjliggörs detta av en algoritm för spatiotemporal fluktuationsanalys, som samtidigt extraherar de genomsnittliga strukturella och dynamiska egenskaperna hos diffusa objekt direkt från standardstacken av optiska mikroskopibilder utan behov av preliminär kunskap om det biologiska objektet av intresse och extraktion av enobjektbanor. All denna information bifogas i en enda utgång från metoden: ett iMSD-spår9 (detaljer om iMSD-spårhärledning och analys ges i tilläggsfil 1).
Det resulterande experimentella protokollet består av några steg. För det första utförs avbildning av den intressanta regionen med hög tidsupplösning. Därefter beräknas genomsnittliga rumsliga-temporala korrelationsfunktioner från stapeln med bilder. Slutligen, genom Gaussisk anpassning av serien av korrelationsfunktioner, erhålls den genomsnittliga "diffusionslagen" direkt från avbildning och analyseras för att känna igen objektdiffusionsläget. Metodens potential var redan bevisad för en mängd olika biologiska föremål, allt från molekyler till nanopartiklar och till och med hela subcellulära organeller / strukturer 9,10,11,12,13,14,15.
Detta dokument rapporterar iMSD-tillämpning på makropinosomer för att belysa deras inneboende, irreversibla tidsutvecklingskaraktär när det gäller deras genomsnittliga (dvs. på hela befolkningsnivå) strukturella och dynamiska egenskaper. Vidare jämförs dessa endocytiska vesiklar med ISG som referens för subcellulära strukturer i ett "stationärt tillstånd", dvs ett tillstånd där de genomsnittliga strukturella/dynamiska egenskaperna hos hela populationen av granulat förblir konstanta när som helst. Makropinocytos definierar en serie händelser initierade av den omfattande omorganisationen (eller ruffling) av plasmamembranet för att bilda en extern makropinocytisk struktur som sedan internaliseras16. De bildade makropinosomerna i tidigt stadium liknar fagosomer. Samtidigt kan de särskiljas från andra former av endocytiska vesiklar på grund av deras karakteristiska stora storlek, morfologiska heterogenitet och brist på proteinbeläggningsstrukturer.
Biokemiska analyser avslöjade att makropinosomer vid internalisering gradvis berikas med proteinmarkörer för andra endocytiska vägar, vilket i sin tur tyder på att deras identiteter kontinuerligt förändras under människohandel17. Med hjälp av antikroppar mot kända markörer i den endosomala vägen visades att makropinosomer gradvis antar klassiska endosomala egenskaper: de minskar i storlek, utvecklas till sena endocytiska strukturer (t.ex. lysosomer) eller så småningom förlorar sin identitet via membranmedierad hämtning av specifika molekylära markörer (t.ex. sortering av nexiner)18,19 . Det övergripande scenariot är att varje enskild makropinosom i cellen irreversibelt ändrar sin strukturella och dynamiska (såväl som molekylära) identitet under smuggling från plasmamembranet till dess slutliga intracellulära öde. Som ett resultat förändras också de strukturella/ dynamiska / molekylära egenskaperna hos hela populationen av makropinosomer längs samma tidsmässiga väg. Eftersom iMSD-metoden i sig är känslig för de genomsnittliga egenskaperna hos hela populationen av observerade objekt, visar den kvantitativt den "föränderliga naturen" genom kvantifiering av viktiga genomsnittliga parametrar, dvs. den lokala diffusiviteten och avvikande koefficienten (dynamiska egenskaper) och makropinosomernas genomsnittliga storlek (strukturell egenskap) i något skede av deras intracellulära handel.
Som jämförelse utfördes liknande mätningar på en välkänd intracellulär membransluten struktur, ISG, i en modell av β-celler. Liksom makropinosomer är regleringen av ISG: s strukturella och dynamiska egenskaper, från deras uppkomst vid Trans Golgi Network (TGN) till deras exocytos vid plasmamembranet, avgörande för korrekt utförande av ISG-funktion20. Till skillnad från makropinosomer lever EME-er i ett "stationärt tillstånd" där alla funktionella/strukturella/molekylära stadier av ISG-livslängden när som helst samtidigt finns i cellen, och var och en representeras av en specifik delpopulation av ISG. Detta innebär att även om varje enskild granulat irreversibelt utvecklas från biogenes till utsöndring, förväntas de genomsnittliga strukturella/dynamiska egenskaperna hos hela populationen av granulat förbli konstanta när som helst (såvida inte de stationära tillståndsförhållandena ändras, till exempel av yttre stimuli som glukos, kolesterol och cytokiner13). Detta bekräftas av iMSD-analys.
Protocol
1. Provberedning
- Före mikroskopiexperimentet, subkulturceller i rätter lämpade för mikroskopiapplikationer.
- Tvätta en 10 cm vävnadsodlingsbehandlad skål med sammanflytande HeLa- eller INS 1E-celler (insulinom β cellliknande) två gånger med 0,01 M 1x PBS, tillsätt 1 ml 0,05% trypsin-EDTA (1x) och placera den i en 37 ° C, fuktad, 5% CO2-inkubator i 5 min.
- Resuspendera de fristående cellerna genom att tillsätta 9 ml komplett DMEM (för HeLa-celler) eller RPMI 1640 (för INS-1E-celler) medium och samla in de sista 10 ml i centrifugrör.
- Frö ca 2 × 105 celler i varje 35 mm x 10 mm skål i en slutlig volym av 1 ml av mediet. Inkubera cellerna i 24 timmar vid 37 °C och 5 % CO2.
- För att fluorescerande märka lysosomer, använd LysoTracker Red DND-99.
- Späd stamlösningen i 1 ml förvärmt medium till en slutlig färgkoncentration på 70 nM.
- Byt ut mediet från skålen med färskt LysoTracker-innehållande medium. Inkubera cellerna i LysoTracker-innehållande medium i 20 minuter vid 37 ° C i en 5% CO2-atmosfär och tvätta dem två gånger med nytt medium före experimentet.
- För att fluorescerande märka makropinosomer, använd 70-kDa fluorescein isotiocyanat-dextran. Tvätta de subkultiverade cellerna tre gånger med 0,01 M 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), ersätt med dextraninnehållande medium (1 mg/ml) och inkubera vid 37 °C i 30 min. Innan du fortsätter med mikroskopiexperimentet, tvätta cellerna tre gånger med nytt medium.
- För att fluorescerande märka ISG i INS-1E-celler, transfektera cellerna med hjälp av transfektionsreagens (se materialförteckningen) och C-peptidförstärkt grönt fluorescerande protein (EGFP) plasmid13 enligt tillverkarens protokoll och inkubera vid 37 ° C i 24 timmar i en 5% CO2-atmosfär före experimentet.
2. Datainsamling
- För att låta mikroskopet jämvikt vid önskad temperatur och atmosfär, slå på mikroskopinkubatorns styrsystem minst 2 timmar före experimentet.
OBS: Varje förvärv är en time-lapse-serie. - Skaffa bilderna med hjälp av ett inverterat konfokalmikroskop utrustat med ett 60x, 1.2 Numerisk bländare (NA) vattennedsänkningsmål.
- Använd en 488 nm Argonlaser för excitation av EGFP (transfekterade celler) och fluoresceinmärkta makropinosomer. Samla fluorescensutsläppet mellan 500 och 600 nm med hjälp av en standard fotomultiplikorrördetektor.
- Använd en 543 nm HeNe-laser för att excitera Lysotracker och samla in dess fluorescensutsläpp mellan 555 och 655 nm.
- Ställ in detekteringshålets diameter på storleken 1 Airy. För varje förvärv, samla en serie med 1000 sekventiella ramar. Ställ in pixeluppehållstiden på 2 μs/pixel för en bildtid på 129 ms.
OBS: Varje bildruta bestod av 256 x 256 pixlar (16 bitar/pixel) med en fysisk dimension på 69 nm/pixel, vilket motsvarar ungefär en yta på 17 μm x 17 μm.
3. Beräkning av msd-driftoch i
OBS: För att korrekt utföra beräkningen, använd programvara som kan numerisk beräkning och skriptprogrammering. Det specifika skriptet (dvs. för skriptfilen "iMSD.m", se Stödfil 1) måste finnas i samma katalog som innehåller den bildserie som ska bearbetas. Varje bild i serien måste sparas som en distinkt ".tif"-fil.
- För att korrekt initiera de instrumentella parametrarna som används för förvärven, öppna iMSD.m med programvarans textredigerare och ändra dess första avsnitt enligt följande.
- Ange N som antalet bildrutor i tidsserien (t.ex. 1 000 i det här protokollet).
- Ställ in px_size: pixelstorlek, uttryckt i μm (t.ex. 0,069 i detta protokoll).
- Ställ in f: temporal upplösning för varje bildruta, uttryckt i sekunder (t.ex. 0,129 i detta protokoll).
- Ställ in filter: binär inmatning för bakgrundskorrigering, ställ in värdet på '0' för att bearbeta råa bilder eller ställ in värdet på '1' för att utföra en tröskelbaserad bakgrundssubtraktion.
- Ställ in av_toll: tröskelvärde för bakgrundskorrigering; alla pixlar med lägre intensitet än detta värde ställs in som 0 om Filter=1.
- Ställ in bit som heltal som bestämmer intensitetssamplingen (t.ex. 8 bitar, 16 bitar).
- Spara och kör den redigerade iMSD.m-skriptfilen.
- Kontrollera skriptkörningen.
OBS: Beräkningsbearbetningsstatusen kan kontrolleras i kommandofönstret; Om något allvarligt problem uppstår avbryts processen och ett varningsmeddelande visas för att visa feltypen och den relaterade radkoden. Annars följer du steg 3.3.1-3.3.3.- Importera bildstacken och subtrahera bakgrunden (om det behövs).
- Beräkna den spatiotemporala korrelationsfunktionen G(ξ,η,τ) med Fouriermetoden.
- Montera den spatiotemporala korrelationsfunktionen med en 2D Gaussisk funktion.
OBS: I slutet av processen kommer utgångsvärdena för σ2 (τ) monteringsprocedurer att visas i kommandofönstret: medelvärden, fel och motsvarande godhet (R2) för montering rapporteras.
- Kontrollera den grafiska utgången.
OBS: iMSD-kurvan och motsvarande anpassningskurvor visas i tre separata paneler, var och en för en annan typ av passande ekvation som används: Brunisk diffusion, avvikande diffusion eller begränsad diffusion. För varje kurva rapporterasR2-värdet i diagramförklaringen. - Kontrollera textutmatningen.
OBS: I slutet av processen skapas en ".xls" -fil med samma namn som den ursprungliga time-lapse ".tif" -filen. Det första arket innehåller värdena för ξ, η, τ och σ2 beräknade för varje tidsfördröjning. Ingångsparametrarna och de huvudsakliga beräknade utgångsvärdena rapporteras i det andra arket, dvs. diffusionskoefficient, avvikande koefficient och y-axel σ20 avlyssning.
Representative Results
Metodens allmänna arbetsflöde presenteras i figur 1. Den sammanfattar de viktigaste stegen som presenteras i protokollavsnittet, från provberedning (figur 1A) till time-lapse-avbildning av intracellulära nanostrukturer (figur 1B), fluktuationsanalys för beräkning av serien av spatiotemporala korrelationsfunktioner (figur 1C) och anpassning för härledning av de genomsnittliga strukturella/dynamiska egenskaperna hos objektet som studeras (figur 1D).
En kritisk parameter är den tidsupplösning som antagits för avbildning av det subcellulära objektet av intresse. Detta experimentella värde kommer att ställa in tidsgränsen vid vilken den minsta genomsnittliga förskjutningen av objekten av intresse kommer att mätas. Det föredragna villkoret är emellertid att ställa in en tidsupplösning för avbildning vid vilken objektet av intresse verkar "orörligt" inom den fångade ramen, dvs. det visar en karakteristisk storlek som i genomsnitt inte deformeras på grund av bildhastigheten. Detta är tekniskt möjligt om föremålet av intresse är en membransluten subcellulär struktur eller organell (som i detta fall). Typiskt uppvisar subcellulära strukturer lokala diffusionskoefficienter (D, μm2/s, se tabell 1) som är flera storleksordningar lägre än för isolerade enskilda molekyler i cytoplasman (t.ex. GFP21). Validering kan utföras genom artificiell immobilisering av organellen av intresse (t.ex. genom kemisk fixering). Faktum är att detta villkor kan tjäna som en referens för att bestämma den faktiska organellstorleken under de experimentella förhållanden som används (t.ex. excitationsvåglängd, pixelstorlek, objektiv).
Här, även om lysosomer användes som testorganeller för denna procedur, är resultaten giltiga oberoende av målstrukturen. Figur 2A visar en bild av en fast (dvs. orörlig) lysosom tillsammans med ett förvärv som utförts på levande celler med lämplig tidsupplösning (dvs. vanligtvis under 100 ms/ram, t.ex. 65 ms/ram i exemplet i figur 2B) och ett förvärv som utförts avsiktligt med mycket låg tidsupplösning (t.ex. 10 s/ram i exemplet i figur 2C ). För varje tillstånd extraheras storleken på det diffuserande objektet enligt följande: i) en intensitetsprofil för platsen härleds av linjeverktyget i ImageJ-programvaran; ii) intensitetsprofilen ritas och interpoleras av en Gaussisk funktion för att beräkna hela bredden vid halv maximalt (FWHM) värde som i sin tur används som en uppskattning av spotdiametern (figur 2D). Som förväntat och visas i diagrammet i figur 2E ger förvärvet med mycket hög tidsmässig upplösning (dvs. 65 ms/ram) en genomsnittlig storlek på strukturen som ligger nära den som erhålls i det fasta provet, antingen genom att använda det standardverktyg som beskrivs ovan eller genom att extrahera y-axelavlyssningen iMSD. Istället ger förvärvet med långsam hastighet en ökning av strukturens uppenbara storlek på grund av den naturliga strukturdynamiken under avbildning. Under suboptimala experimentella förhållanden återspeglar den strukturella/dynamiska informationen som extraheras inte troget de inneboende egenskaperna hos objektet som studeras.
När de viktigaste experimentella parametrarna har valts kan dataset produceras för de intracellulära målstrukturerna. För makropinosomer, efter 20 minuters inkubation av cellerna med 70 kDa dextrans, förvärvades tidsserier för de märkta intracellulära strukturerna vid olika tidpunkter efter behandling, från 30 min upp till cirka 180 min. Intressant nog detekteras en gradvis förändring av makropinosomernas strukturella och dynamiska egenskaper under människohandel (figur 3; fördelningar av σ02, Dm, α och N för makropinosomer rapporteras i tomterna till vänster). Även om inga uppenbara förändringar i makropinosomernas lokala diffusivitet (Dm) upptäcks under människohandel, utvecklas både den karakteristiska storleken (σ02) och det övergripande rörelsesättet (α) med tiden.
Av särskild anmärkning observeras en minskning av makropinosomernas genomsnittliga storlek under människohandel (figur 3A, vänster), tillsammans med en samtidig ökning av den subdiffusiva karaktären av deras rörelse (dvs. betecknad som en minskning av α värden, figur 3C, vänster panel). Dessutom extraherades antalet makropinosomer från varje förvärv: resultaten, rapporterade i figur 3D, vänster panel, avslöjar tydligt en ökning av antalet makropinosomer i tid. Alla dessa resultat är i god överensstämmelse med förväntningarna eftersom dextran-märkta makropinosomer antas härröra som isolerade, stora membranslutna vesiklar vid plasmamembranet (som också är kompetenta för rörelse längs cytoskelettkomponenter) men antas gradvis kommunicera med den endo-lysosomala vägen som består av en stor population av mindre och slumpmässigt diffusa strukturer.
Som förväntat ovan står resultaten för makropinosomer i kontrast till liknande mätningar utförda på ISG (figur 3, höger kolumn). Insulingranulat visar inte en tidsutvecklig trend för de iMSD-härledda strukturella/dynamiska parametrarna (och deras genomsnittliga antal i cellen) under samma tidsperiod som observerats för makropinosomer. Dessutom är de karakteristiska värdena för σ02, Dm och α helt annorlunda än för lysosomer, som används igen som referens. Detta resultat bekräftar idén, som förväntat ovan, att granulat undersöks i ett "stationärt tillstånd" där de genomsnittliga strukturella/dynamiska egenskaperna hos hela populationen av ISG när som helst är oförändrade (dvs. de förblir konstanta, såvida inte de stationära tillståndsförhållandena förändras, till exempel på grund av yttre stimuli).
Figur 1: Experimentellt arbetsflöde. (A) Celler pläterades 24 timmar (48 timmar för transfektionsexperiment) före konfokala experiment på cellskålar lämpade för mikroskopiska applikationer. Cellerna behandlades sedan på lämpligt sätt enligt märkningsmetoden (se protokollet) för att färga den cytoplasmatiska organellen av intresse. (B) Ett typiskt konfokalt förvärv består av en stapel bilder (time-lapse) av en cytoplasmatisk del av en levande cell, som beskriver tidsutvecklingen av märkt organelldynamik. (C) Time-lapse-film analyseras med ett skräddarsytt Matlab-skript, som först beräknar spatiotemporal bildkorrelationsfunktion och Gaussian-anpassning till plottning av iMSD-kurvor (D) och relaterade extraherade monteringsparametrar som beskriver strukturella dynamikparametrar för avbildade organeller. Förkortningar: iMSD = bildhärledd genomsnittlig kvadratförskjutning; STICS = spatiotemporal bildkorrelationsspektroskopi; α = avvikande diffusionskoefficient; Dm = lokal diffusivitet; σ2(τ) = varians. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Korrekta experimentella parametrar. (A) Exemplifierande bild av färgade lysosomer i ett fast prov. Skala bar = 2 μm. (B) Den första ramen i en stapel bilder av färgade lysosomer i en levande cell, förvärvad med lämpliga parametrar. Tidsmässig upplösning: 65 ms/ram. Skala bar = 2 μm. (C) Den första ramen i en stapel bilder av färgade lysosomer i en levande cell, förvärvad med låg hastighet: artifakteell deformation av den uppenbara lysosomstorleken på grund av organellrörelse under avbildning är synlig. Tidsmässig upplösning: 10 s/ram. Skalstång = 2 μm. (D) Exempel på storleksberäkning för avbildade lysosomer i en blå avkastning på (A), (B) och (C). Intensitetsprofilen längs den blå linjen var utrustad med en Gaussisk funktion för att hämta FWHM, dvs en uppskattning av fläckstorleken. FWHM-värden rapporteras för varje montering. (E) Grafisk representation av storleksvärden erhållna genom bildanalys som beskrivs i panel (D) för alla avbildade lysosomer (svart kvadrat, medelvärde och standardavvikelse), för lysosomer inneslutna i den blå ROI (blå triangeln) och hämtas genom iMSD-analys (röd cirkel). Denna siffra är från 22. Förkortningar: ROI = region av intresse; FWHM = full bredd vid halv max; iMSD = bildhärledd genomsnittlig kvadratförskjutning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Tidsmässig utveckling av märkta organeller. (A) Diagram över iMSD-extraherade storleksvärden kontra tidsprogression för efterföljande förvärv representerade som ett medelvärde av uppmätta värden i förvärv utförda under ett 10-minuters tidsfönster. Till vänster, progressiv minskning av den genomsnittliga storleken på makropinosomer (svarta cirklar) och till höger, den tidsinvarianta storleken på insulinsekretoriska granuler (svarta rutor) jämfört med lysosomer, representerad som medelvärde (tjockare röd linje) ± standardavvikelse (streckade röda linjer). (B) och (C) Tidsprogression av Dm och α koefficienter för makropinosomer (vänster) och insulingranulat (höger) extraherade genom iMSD-analys. (D) Tidsutveckling av antalet märkta makropinosomer och insulingranulat mätt i den första bilden av varje förvärvad timelapse-film. Förkortningar: iMSD = bildhärledd genomsnittlig kvadratförskjutning; α = avvikande diffusionskoefficient; Dm = lokal diffusivitet, N = tal. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Organell | Etikettering | Cellinje | Storlek (nm) | Dm ( × 10-3 μm2/s) | α | N | Ref. | ||
| Tidig endosomer (EE) | CellLight Tidig endosom GFP | HeLa | 395±74 | 3.0±2.4 | 1.02±0.20 | 40 | 10 | ||
| Sen endosomer (LE) | CellLight Sen Endosot GFP | HeLa | 693±102 | 15.4±10.6 | 0.57±0.16 | 58 | 10 | ||
| Lysosom (LY) | LysoTracker DND-99 | HeLa | 471±76 | 15.3±9.0 | 0.49±0.13 | 143 | 10, 14 | ||
| Caveola (CAV) | Caveolin-EGFP | HeLa | 405±49 | 3.1±1.8 | 1.00±0.22 | 15 | 10 | ||
| Clathrin coated Vescicle (CCV) | Transferrin-Alexa 488 | HeLa | 513±62 | 16.2±9.9 | 0.48±0.17 | 33 | 10 | ||
| Insulingranulat (IG) | C-peptid-EGFP | INS-1E | 335±56 | 3.0±1.7 | 0.70±0.14 | 107 | 11 | ||
| Tidig makropinosom (EMCR) | Fluorescein-Dextran 70 kDa | HeLa | 979±423 | 8.3±9 | 0,79±0,27 | 36 | 10 | ||
| Mellanliggande makropinosom (IMCR) | Fluorescein-Dextran 70 kDa | HeLa | 702±180 | 13.7±19.9 | 0.60±0.38 | 29 | 10 | ||
| Sen makropinosom (LMCR) | Fluorescein-Dextran 70 kDa | HeLa | 592±127 | 5.8±4.7 | 0.39±0.21 | 21 | 10 | ||
Tabell 1: Strukturella och dynamiska iMSD-extraherade parametrar. Tabellen visar värdena för storlek, Dm och α koefficient uppmätt för olika organeller, specificerar märkningsstrategier, den använda cellinjen och antalet analyserade förvärv. Värden rapporteras som medelvärde ± standardavvikelse. Förkortningar: iMSD = bildhärledd genomsnittlig kvadratförskjutning; α = avvikande diffusionskoefficient; Dm = lokal diffusivitet, N = tal; GFP = grönt fluorescerande protein; EGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein.
Kompletterande fil 1: Detaljer om iMSD-spårhärledning och analys. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Stödfil 1: Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Egenskaperna och fördelarna med iMSD är uppenbara jämfört med de tekniker som finns tillgängliga för att hämta analog information. För strukturell information är det föredragna valet överföringselektronmikroskopi (TEM) analys. Med denna metod kan ultrastrukturella detaljer vid molekylär upplösning och till och med bortom hämtas, även för subcellulära nanostrukturer. Ändå uppnås den speciella rumsliga upplösningen av TEM på bekostnad av informationen i den tidsmässiga dimensionen, vilket är av intresse här. För att kompensera för detta är de senaste framstegen inom levande cellavbildningsteknik av särskilt intresse. Dessa inkluderar nya fluorescerande markörer med ökad prestanda (t.ex. ljusstyrka och fotostabilitet), optimerade märkningsprocedurer och känsligare detektorer. Dessutom finns analysverktyg tillgängliga för att hantera både strukturell (t.ex. "storlek" genom fasorbaserad analys av lokal bildkorrelationsspektroskopi, PLICS23, aggregering/oligomerisering genom tal- och ljusstyrkeanalys24) och dynamisk (t.ex. diffusionslag genom enpartikelspårning, dvs. (SPT)25,26,27,28 ) parametrar på den subcellulära skalan. SPT-metoden ger direkt tillgång till objektets bana och dess MSD. Nackdelen är emellertid behovet av en låg densitet hos sonden och mycket ljusa etiketter och många enobjektbanor som ska mätas för att uppfylla statistiska kriterier. När det gäller mätningens tidsmässiga upplösning kan oorganiska, fotosterbara sonder (t.ex. kvantprickar eller metallnanopartiklar) öka SPT-prestandan men på bekostnad av komplexa produktions- och märkningsförfaranden.
Jämfört med dessa standarder visar iMSD-metoden som beskrivs här några viktiga fördelar. För det första kan detta tillvägagångssätt användas tillsammans med relativt svaga fluorescerande taggar, såsom genetiskt kodade fluorescerande proteiner (t.ex. tillämpningen på ISG). Således, jämfört med SPT, uppnås en högre tidsmässig upplösning (med samma etikett) på grund av den lägre mängden fotoner som krävs8. För det andra begränsas iMSD-metoden endast av den tidsmässiga upplösningen men inte av diffraktionen. Faktum är att trots den diffraktionsbegränsade optiska inställningen som används kan genomsnittliga molekylära förskjutningar även under diffraktionsgränsen mätas, vilket redan visats för molekylära flöden med hjälp av STICS29. Den faktiska upplösningen vid mätning av förskjutningar beror på hur exakt (när det gäller signal till brus) korrelationsfunktionen kan mätas, vilket förklarar varför den inte begränsas av diffraktion. Således verkar det klart att den minsta förskjutningen som kan mätas beror på diffusiviteten hos objektet av intresse och den tidsmässiga upplösningen av bildinställningen.
I detta avseende är det viktigt att överväga att applicering på subcellulära nanostrukturer, såsom makropinosomer eller insulingranuler, med ett laserskanningsmikroskop är optimalt: den tillgängliga skanningshastigheten är signifikant högre än dynamiken hos objektet av intresse. I ett sådant fall är objektens rörelse under förvärvet försumbar, och korrelationsfunktionen kan approximeras med en Gaussisk funktion. Slutligen kan iMSD-metoden enkelt tillämpas på ett brett spektrum av kommersiella optiska mikroskopiinställningar baserade på rasterskanning eller kamerabaserad avbildning med brett fält, utan behov av systemkalibrering (krävs endast om en exakt uppskattning av partikelstorleken behöver uppnås). En viktig parameter för att metoden ska fungera är korrekt rumslig provtagning. För att uppnå en tillfredsställande konvergens av anpassningsalgoritmen bör den minsta storleken på det område som är av intresse för avbildning som en allmän regel vara minst tre gånger större än den maximala förskjutningen av intresse.
Sammanfattningsvis kräver iMSD-metoden endast ett mikroskop utrustat för snabb förvärv. Strukturen av intresse kan märkas till någon genetiskt kodad eller organisk fluorofor, vilket möjliggör flerkanalig avbildning. Det är tänkt att cross-iMSD-analys kommer att användas inom en snar framtid för att välja subpopulationer av subcellulära nanostrukturer och avslöja deras interaktioner och samdiffusion inom cellen, den senare är ett hett ämne inom cellulär biofysik. Om någon detalj går förlorad genom iMSD-analys är detta verkligen relaterat till den stora mängden molekylär information inom dynamiska subcellulära nanostrukturer. Sådan information beräknas oundvikligen i genomsnitt under mätningen på grund av dålig tidsupplösning. Teoretiskt sett finns det dock ingen teknisk gräns på grund av möjligheten att hämta molekylär information, förutsatt att tillräckliga förvärvshastigheter kan uppnås8. På grund av de kontinuerliga förbättringarna av detektorns hastighet / känslighet och bildteknik är det tänkt att information om hela det subcellulära facket och dess molekylära beståndsdelar kommer att extraheras från en enda dataset.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete har fått finansiering från Europeiska forskningsrådet (ERC) inom ramen för EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 (bidragsavtal nr 866127, projekt CAPTUR3D).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Cell medium supplement |
| C-peptide-EGFP | Plasmid | ||
| DMEM High Glucose | Gibco | 31053028 | Cell medium (HeLa) |
| FBS | Gibco | 10082147 | Cell medium supplement |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma Aldrich | 46945-100MG-F | Reagent |
| HeLa | ATCC | CCL-61 | Cell Line |
| Lipofectamine 2000 | TermoFisher | 11668019 | Trasfection reagent |
| Lysotracker Red DND-99 | Gibco | L7528 | Reagent |
| Matlab | MathWork | Software | |
| Microscope-suitable cell dishes | Willco | GWSt-3522 | Petri dishes |
| Olympus FV1000 | Olympus Japan | Confocal microscope | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11835063 | Cell medium (INS-1E) |
References
- Murphy, J. E., Padilla, B. E., Hasdemir, B., Cottrell, G. S., Bunnett, N. W. Endosomes: a legitimate platform for the signaling train. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17615-17622 (2009).
- Mosesson, Y., Mills, G. B., Yarden, Y. Derailed endocytosis: an emerging feature of cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (11), 835-850 (2008).
- Mellman, I., Yarden, Y.
- Di Fiore, P. P. Endocytosis, signaling and cancer, much more than meets the eye. Preface. Molecular Oncology. 3 (4), 273-279 (2009).
- Bogan, J. S., Xu, Y., Hao, M. Cholesterol accumulation increases insulin granule size and impairs membrane trafficking. Traffic. 13 (11), 1466-1480 (2012).
- Ballabio, A., Gieselmann, V. Lysosomal disorders: From storage to cellular damage. Biochimica et Biophysica Acta. 1793 (4), 684-696 (2009).
- Hu, Y. -B., Dammer, E. B., Ren, R. -J., Wang, G. The endosomal-lysosomal system: from acidification and cargo sorting to neurodegeneration. Translational Neurodegeneration. 4, 18 (2015).
- Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Spatiotemporal fluctuation analysis: a powerful tool for the future nanoscopy of molecular processes. Biophysical Journal. 111 (4), 679-685 (2016).
- Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Fast spatiotemporal correlation spectroscopy to determine protein lateral diffusion laws in live cell membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12307-12312 (2013).
- Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51994 (2014).
- Digiacomo, L., et al. Dynamic fingerprinting of sub-cellular nanostructures by image mean square displacement analysis. Scientific Reports. 7 (1), 14836 (2017).
- Durso, W., et al. Lysosome dynamic properties during neuronal stem cell differentiation studied by spatiotemporal fluctuation spectroscopy and organelle tracking. International Journal of Molecular Sciences. 21 (9), 3397 (2020).
- Ferri, G., et al. Insulin secretory granules labelled with phogrin-fluorescent proteins show alterations in size, mobility and responsiveness to glucose stimulation in living β-cells. Scientific Reports. 9 (1), 2890 (2019).
- Durso, W., D'Autilia, F., Amodeo, R., Marchetti, L., Cardarelli, F. Probing labeling-induced lysosome alterations in living cells by imaging-derived mean squared displacement analysis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2704-2709 (2018).
- Digiacomo, L., Digman, M. A., Gratton, E., Caracciolo, G. Development of an image Mean Square Displacement (iMSD)-based method as a novel approach to study the intracellular trafficking of nanoparticles. Acta Biomaterialia. 42, 189-198 (2016).
- Swanson, J. A., Watts, C.
- Jones, A. T. Macropinocytosis: searching for an endocytic identity and role in the uptake of cell penetrating peptides. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 670-684 (2007).
- Falcone, S., et al. Macropinocytosis: regulated coordination of endocytic and exocytic membrane traffic events. Journal of Cell Science. 119, Pt 22 4758-4769 (2006).
- Kerr, M. C., et al. Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins. Journal of Cell Science. 119, Pt 19 3967-3980 (2006).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Di Rienzo, C., Piazza, V., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Probing short-range protein Brownian motion in the cytoplasm of living cells. Nature Communications. 5 (1), 5891 (2014).
- Ferri, G., et al. Time-lapse confocal imaging datasets to assess structural and dynamic properties of subcellular nanostructures. Scientific Data. 5 (1), 180191 (2018).
- Scipioni, L., Gratton, E., Diaspro, A., Lanzanò, L. Phasor analysis of local ICS detects heterogeneity in size and number of intracellular vesicles. Biophysical Journal. 111 (3), 619-629 (2016).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
- Li, C. H., Bai, L., Li, D. D., Xia, S., Xu, T. Dynamic tracking and mobility analysis of single GLUT4 storage vesicle in live 3T3-L1 cells. Cell Research. 14 (6), 480-486 (2004).
- Donovan, K. W., Bretscher, A. Tracking individual secretory vesicles during exocytosis reveals an ordered and regulated process. Journal of Cell Biology. 210 (2), 181-189 (2015).
- Westphal, V., et al. Video-rate far-field optical nanoscopy dissects synaptic vesicle movement. Science. 320 (5873), 246-249 (2008).
- Tabei, S. M. A., et al. Intracellular transport of insulin granules is a subordinated random walk. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 4911-4916 (2013).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
