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Biology

Spatiotemporal उतार-चढ़ाव स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा तस्करी उपकोशिकीय Nanostructures के संरचनात्मक और गतिशील गुणों की जांच

Published: August 16, 2021 doi: 10.3791/62790
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1NEST Laboratory, Scuola Normale Superiore, 2Center for Nanotechnology Innovation@NEST CNI@NEST

Summary

इमेजिंग-व्युत्पन्न माध्य वर्ग विस्थापन (iMSD) विश्लेषण संरचनात्मक और गतिशील गुणों के संदर्भ में उनके आंतरिक समय-विकसित प्रकृति को उजागर करने के लिए मैक्रोपिनोसोम पर लागू किया जाता है। मैक्रोपिनोसोम की तुलना इंसुलिन स्रावी कणिकाओं (आईएसजी) से की जाती है, जो समय-अपरिवर्तनीय औसत संरचनात्मक / गतिशील गुणों के साथ उपकोशिकीय संरचनाओं के लिए एक संदर्भ के रूप में होती है।

Abstract

इमेजिंग-व्युत्पन्न माध्य वर्ग विस्थापन (आईएमएसडी) का उपयोग उपकोशिकीय नैनोस्ट्रक्चर के संरचनात्मक और गतिशील गुणों को संबोधित करने के लिए किया जाता है, जैसे कि विलेय और बायोमोलेक्यूल्स के एंडो / एक्सोसाइटोटिक तस्करी में शामिल पुटिकाएं। iMSD मानक समय-चूक इमेजिंग पर निर्भर करता है, किसी भी ऑप्टिकल सेटअप के साथ संगत है, और प्रक्षेपवक्र निकालने के लिए एकल वस्तुओं पर ध्यान देने की आवश्यकता नहीं है। प्रत्येक iMSD ट्रेस से, औसत संरचनात्मक और गतिशील मापदंडों (यानी, आकार, स्थानीय विसरणशीलता, असंगत गुणांक) का एक अद्वितीय त्रिक गणना की जाती है और अध्ययन के तहत नैनोस्ट्रक्चर के "आईएमएसडी हस्ताक्षर" का निर्माण करने के लिए संयुक्त किया जाता है।

इस दृष्टिकोण की शक्ति यहां मैक्रोपिनोसोम के अनुकरणीय मामले के साथ साबित हुई है। ये पुटिकाएं समय में विकसित होती हैं, उनके औसत आकार, संख्या और गतिशील गुणों को बदलते हैं जो इंट्रासेल्युलर तस्करी के शुरुआती से देर से चरणों तक गुजरती हैं। एक नियंत्रण के रूप में, इंसुलिन स्रावी कणिकाओं (आईएसजी) का उपयोग उपकोशिकीय संरचनाओं के लिए एक संदर्भ के रूप में किया जाता है जो एक स्थिर स्थिति में रहते हैं जिसमें वस्तुओं की पूरी आबादी के औसत संरचनात्मक और गतिशील गुण समय में अपरिवर्तनीय होते हैं। आईएमएसडी विश्लेषण इन अजीब विशेषताओं को मात्रात्मक रूप से उजागर करता है और उप-सेलुलर स्तर पर समान अनुप्रयोगों का मार्ग प्रशस्त करता है, दोनों शारीरिक और रोग संबंधी राज्यों में।

Introduction

उपकोशिकीय nanostructures (जैसे, एंडोसाइटिक / स्रावी पुटिकाओं, ऑर्गेनेल) सेल-सिग्नलिंग विनियमन1 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। उनके संरचनात्मक (जैसे, आकार) और / या गतिशील (जैसे, विसरणशीलता) विशेषताओं की उचित ट्यूनिंग यह निर्धारित करती है कि सेल आंतरिक या बाहरी उत्तेजनाओं के लिए कैसे प्रतिक्रिया करता है 2,3,4। इस सबूत के आधार पर, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि इन विशेषताओं के परिवर्तन कई रोग स्थितियों में पाए जाते हैं। उदाहरणों में कैंसर 2,3 में गलत तरीके से एंडोसाइटोसिस की भूमिका शामिल है, टाइप -2 मधुमेह की स्थिति के संपर्क में आने वाली β-कोशिकाओं में आईएसजी के स्तर पर पाए जाने वाले संरचनात्मक और गतिशील परिवर्तन, ग्लोबोइड-सेल ल्यूकोडिस्ट्रोफी या गैलेक्टोसिलसेरामाइड लिपिडोसिस6 में लाइसोसोमल संरचनात्मक और परिवहन गुणों का गलत विनियमन, और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों (जैसे, अल्जाइमर रोग) में एंडो-लाइसोसोमल मार्ग में शिथिलताएं (जैसे, अल्जाइमर रोग)7।

इस संदर्भ में, शोधकर्ताओं ने हाल ही में साबित किया है कि मानक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी विधियों के प्रदर्शन को स्थानिक और अस्थायी नमूना संकल्प 8 को ठीक से ट्यून करके बढ़ाया जा सकताहै। यह, बदले में, प्रासंगिकता की जैविक प्रक्रियाओं में और अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। व्यवहार में, यह spatiotemporal उतार-चढ़ाव विश्लेषण के एक एल्गोरिथ्म द्वारा संभव बनाया गया है, जो एक साथ ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी छवियों के मानक स्टैक से सीधे वस्तुओं को अलग करने के औसत संरचनात्मक और गतिशील गुणों को निकालता है, बिना ब्याज की जैविक वस्तु पर प्रारंभिक ज्ञान की आवश्यकता के बिना और एकल-वस्तु प्रक्षेपवक्र के निष्कर्षण। यह सभी जानकारी विधि के एक एकल आउटपुट में संलग्न है: एक iMSD ट्रेस9 (iMSD ट्रेस व्युत्पत्ति और विश्लेषण पर विवरण पूरक फ़ाइल 1 में दिए गए हैं)।

परिणामी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में कुछ चरण होते हैं। सबसे पहले, ब्याज के क्षेत्र की इमेजिंग उच्च अस्थायी संकल्प पर की जाती है। फिर, औसत स्थानिक-अस्थायी सहसंबंध कार्यों की गणना छवियों के ढेर से की जाती है। अंत में, सहसंबंध कार्यों की श्रृंखला के गाऊसी फिटिंग द्वारा, औसत 'प्रसार कानून' सीधे इमेजिंग से प्राप्त किया जाता है और ऑब्जेक्ट प्रसार मोड को पहचानने के लिए विश्लेषण किया जाता है। विधि की क्षमता पहले से ही विभिन्न प्रकार की जैविक वस्तुओं के लिए साबित हो चुकी थी, जिसमें अणुओं से लेकर नैनोकणों और यहां तक कि पूरे उपकोशिकीय ऑर्गेनेल / संरचनाएं 9,10,11,12,13,14,15 शामिल थीं।

यह पेपर अपने औसत (यानी, पूरी आबादी के स्तर पर) संरचनात्मक और गतिशील गुणों के संदर्भ में अपने आंतरिक, अपरिवर्तनीय समय-विकसित प्रकृति को उजागर करने के लिए मैक्रोपिनोसोम के लिए आईएमएसडी एप्लिकेशन की रिपोर्ट करता है। इसके अलावा, इन एंडोसाइटिक पुटिकाओं की तुलना आईएसजी से एक 'स्थिर राज्य' में उपकोशिकीय संरचनाओं के संदर्भ के रूप में की जाती है, यानी, एक ऐसी स्थिति जिसमें दानों की पूरी आबादी के औसत संरचनात्मक / गतिशील गुण किसी भी समय स्थिर रहते हैं। Macropinocytosis प्लाज्मा झिल्ली के व्यापक पुनर्गठन (या ruffling) द्वारा शुरू की गई घटनाओं की एक श्रृंखला को परिभाषित करता है ताकि एक बाहरी मैक्रोपिनोसाइटिक संरचना बनाई जा सके जो तब आंतरिक16 होती है। गठित प्रारंभिक चरण मैक्रोपिनोसोम फागोसोम के समान हैं। उसी समय, उन्हें एंडोसाइटिक पुटिकाओं के अन्य रूपों से उनके विशेषता बड़े आकार, रूपात्मक विषमता और प्रोटीन-कोट संरचनाओं की कमी के कारण अलग किया जा सकता है।

जैव रासायनिक assays से पता चला है कि, internalization पर, macropinosomes उत्तरोत्तर अन्य एंडोसाइटिक मार्गों के प्रोटीन मार्करों के साथ समृद्ध हो जाते हैं, बदले में, यह सुझाव देते हुए कि तस्करी के दौरान उनकी पहचान लगातार बदल रही है17. एंडोसोमल मार्ग के ज्ञात मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए, यह प्रदर्शित किया गया था कि मैक्रोपिनोसोम उत्तरोत्तर शास्त्रीय एंडोसोमल विशेषताओं को अपनाते हैं: वे आकार में कम हो जाते हैं, देर से एंडोसाइटिक संरचनाओं (जैसे, लाइसोसोम) में विकसित होते हैं, या अंततः विशिष्ट आणविक मार्करों की झिल्ली-मध्यस्थता पुनर्प्राप्ति के माध्यम से अपनी पहचान खो देते हैं (उदाहरण के लिए, नेक्सिन को छँटाई करना)18,19 . समग्र परिदृश्य यह है कि सेल के भीतर हर एक मैक्रोपिनोसोम अपरिवर्तनीय रूप से प्लाज्मा झिल्ली से अपने अंतिम इंट्रासेल्युलर भाग्य तक तस्करी के दौरान अपनी संरचनात्मक और गतिशील (साथ ही आणविक) पहचान को बदलता है। नतीजतन, मैक्रोपिनोसोम की पूरी आबादी के संरचनात्मक / गतिशील / आणविक गुण भी एक ही अस्थायी पथ के साथ बदल रहे हैं। मनाया वस्तुओं की पूरी आबादी के औसत गुणों के लिए आंतरिक रूप से संवेदनशील होने के नाते, iMSD विधि मात्रात्मक रूप से प्रमुख औसत मापदंडों के परिमाणीकरण द्वारा 'विकसित प्रकृति' को दर्शाती है, यानी, स्थानीय विसरणशीलता और असंगत गुणांक (गतिशील गुण) और उनके इंट्रासेल्युलर तस्करी के किसी भी चरण में मैक्रोपिनोसोम (संरचनात्मक संपत्ति) का औसत आकार।

तुलना के लिए, इसी तरह के माप एक प्रसिद्ध इंट्रासेल्युलर झिल्ली-संलग्न संरचना, आईएसजी पर β-कोशिकाओं के एक मॉडल में किए गए थे। मैक्रोपिनोसोम की तरह, आईएसजी के संरचनात्मक और गतिशील गुणों का विनियमन, ट्रांस गोल्गी नेटवर्क (टीजीएन) में उनकी उत्पत्ति से प्लाज्मा झिल्ली पर उनके एक्सोसाइटोसिस तक, आईएसजी फ़ंक्शन20 के उचित निष्पादन के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, मैक्रोपिनोसोम के विपरीत, आईएसजी एक 'स्थिर राज्य' में रहते हैं, जिसमें किसी भी समय, आईएसजी जीवनकाल के सभी कार्यात्मक / संरचनात्मक / आणविक चरण एक साथ सेल के भीतर मौजूद होते हैं, और प्रत्येक को आईएसजी की एक विशिष्ट उप-आबादी द्वारा दर्शाया जाता है। इसका मतलब यह है कि हालांकि हर एक ग्रेन्युल अपरिवर्तनीय रूप से बायोजेनेसिस से स्राव तक विकसित होता है, दानों की पूरी आबादी के औसत संरचनात्मक / गतिशील गुणों को किसी भी समय स्थिर रहने की उम्मीद है (जब तक कि स्थिर राज्य की स्थिति को नहीं बदला जाता है, उदाहरण के लिए, बाहरी उत्तेजनाओं जैसे ग्लूकोज, कोलेस्ट्रॉल और साइटोकिन्स13)। यह आईएमएसडी विश्लेषण द्वारा पुष्टि की जाती है।

Protocol

1. नमूना तैयारी

  1. माइक्रोस्कोपी प्रयोग से पहले, माइक्रोस्कोपी अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त व्यंजनों में उपसंस्कृति कोशिकाएं।
    1. 0.01 एम 1x पीबीएस के साथ दो बार कन्फ्लुएंट हेला या आईएनएस 1ई (इंसुलिनोमा β सेल-जैसे) कोशिकाओं के 10 सेमी ऊतक-संस्कृति-उपचारित पकवान को धोएं, 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए (1x) के 1 एमएल जोड़ें, और इसे 37 डिग्री सेल्सियस, ह्यूमिडिफाइड, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए रखें।
    2. पूर्ण DMEM (HeLa कोशिकाओं के लिए) या RPMI 1640 (INS-1E कोशिकाओं के लिए) माध्यम के 9 mL जोड़कर अलग कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में अंतिम 10 मिलीलीटर एकत्र करें।
    3. प्रत्येक35 मिमी x 10 मिमी डिश में लगभग 2 × 10 5 कोशिकाओं को माध्यम के 1 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में बीज दें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  2. लाइसोसोम को फ्लोरोसेंटली लेबल करने के लिए, लाइसोट्रैकर रेड डीएनडी -99 का उपयोग करें।
    1. 70 एनएम की अंतिम डाई एकाग्रता के लिए पूर्व-सशस्त्र माध्यम के 1 मिलीलीटर में स्टॉक समाधान को पतला करें।
    2. ताजा LysoTracker युक्त माध्यम के साथ पकवान से माध्यम को बदलें. 5% सीओ 2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए लाइसोट्रैकर-युक्त माध्यम में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, और प्रयोग से पहले उन्हें दो बार ताजा माध्यम से धोएं।
    3. मैक्रोपिनोसोम को फ्लोरोसेंटली लेबल करने के लिए, 70-केडीए फ्लोरोसीन आइसोथियोसाइनेट-डेक्सट्रान का उपयोग करें। उपसंस्कृत कोशिकाओं को 0.01 एम 1x फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के साथ तीन बार धोएं, डेक्सट्रान युक्त माध्यम (1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ बदलें, और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। माइक्रोस्कोपी प्रयोग के साथ आगे बढ़ने से पहले, कोशिकाओं को ताजा माध्यम से तीन बार धोएं।
    4. INS-1E कोशिकाओं में ISGs को फ्लोरोसेंटली लेबल करने के लिए, अभिकर्मक अभिकर्मक ( सामग्री की तालिका देखें) और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार सी-पेप्टाइड-एन्हांस्ड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) प्लास्मिड13 का उपयोग करके कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करें, और प्रयोग से पहले 5% सीओ 2 वातावरण में 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

2. डेटा अधिग्रहण

  1. माइक्रोस्कोप को वांछित तापमान और वायुमंडल में संतुलित करने के लिए, प्रयोग से कम से कम 2 घंटे पहले माइक्रोस्कोप इनक्यूबेटर-कंट्रोलिंग सिस्टम को चालू करें।
    नोट: प्रत्येक अधिग्रहण एक समय-चूक श्रृंखला है।
  2. एक 60x, 1.2 संख्यात्मक एपर्चर (एनए) जल विसर्जन उद्देश्य से सुसज्जित एक उलटा confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों का अधिग्रहण।
  3. ईजीएफपी (संक्रमित कोशिकाओं) और फ्लोरोसीन-लेबल वाले मैक्रोपिनोसोम के उत्तेजना के लिए 488 एनएम आर्गन लेजर का उपयोग करें। एक मानक photomultiplier ट्यूब डिटेक्टर का उपयोग कर 500 और 600 एनएम के बीच प्रतिदीप्ति उत्सर्जन ले लीजिए।
  4. लाइसोट्रैकर को उत्तेजित करने और 555 और 655 एनएम के बीच इसके प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को इकट्ठा करने के लिए 543 एनएम हेन लेजर का उपयोग करें।
  5. डिटेक्शन पिनहोल का व्यास 1 एयरी के आकार में सेट करें। प्रत्येक अधिग्रहण के लिए, 1000 अनुक्रमिक फ्रेम की एक श्रृंखला एकत्र करें। पिक्सेल-रहने का समय 129 ms के फ़्रेम समय के लिए 2 μs/पिक्सेल पर सेट करें.
    नोट: प्रत्येक फ्रेम में 69 एनएम / पिक्सेल के भौतिक आयाम के साथ 256 x 256 पिक्सेल (16 बिट / पिक्सेल) शामिल थे, जो लगभग 17 μm x 17 μm के क्षेत्र के अनुरूप थे।

3. मैंएमएसडी गणना

नोट:: परिकलन ठीक से निष्पादित करने के लिए, सांख्यिक परिकलन और स्क्रिप्ट प्रोग्रामिंग में सक्षम सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। विशिष्ट स्क्रिप्ट (यानी, 'iMSD.m' स्क्रिप्ट फ़ाइल के लिए, सहायक फ़ाइल 1 देखें) उसी निर्देशिका में मौजूद होना चाहिए जिसमें संसाधित की जाने वाली छवि श्रृंखला शामिल है। श्रृंखला की प्रत्येक छवि को एक अलग '.tif' फ़ाइल के रूप में सहेजा जाना चाहिए।

  1. अधिग्रहण के लिए उपयोग किए जाने वाले वाद्य मापदंडों को ठीक से प्रारंभ करने के लिए, सॉफ़्टवेयर टेक्स्ट एडिटर के साथ iMSD.m खोलें और अपने पहले अनुभाग को निम्नानुसार संशोधित करें।
    1. N को समय श्रृंखला में फ़्रेमों की संख्या के रूप में सेट करें (उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में 1000).
    2. px_size सेट करें: पिक्सेल आकार, μm में व्यक्त किया गया (उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में 0,069).
    3. सेट एफ: प्रत्येक फ्रेम का अस्थायी रिज़ॉल्यूशन, सेकंड में व्यक्त किया गया (उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में 0,129)।
    4. फ़िल्टर सेट करें: पृष्ठभूमि सुधार के लिए बाइनरी इनपुट, कच्चे चित्रों को संसाधित करने के लिए मान को '0' पर सेट करें, या थ्रेशोल्ड-आधारित पृष्ठभूमि घटाव करने के लिए मान को '1' पर सेट करें।
    5. av_toll सेट करें: पृष्ठभूमि सुधार के लिए थ्रेशोल्ड; इस मान से कम तीव्रता वाले किसी भी पिक्सेल को 0 के रूप में सेट किया जाएगा यदि फ़िल्टर = 1।
    6. तीव्रता नमूनाकरण (जैसे, 8 बिट , 16 बिट) का निर्धारण करने वाली पूर्णांक संख्या के रूप में बिट सेट करें।
  2. सहेजें और संपादित iMSD.m स्क्रिप्ट फ़ाइल चलाएँ।
  3. स्क्रिप्ट निष्पादन की जाँच करें।
    नोट:: परिकलन संसाधन स्थिति आदेश विंडो पर जाँच की जा सकती है; यदि कोई भी घातक समस्या होती है, तो प्रक्रिया बाधित हो जाएगी, और त्रुटि प्रकार और संबंधित पंक्ति कोड दिखाने के लिए एक चेतावनी संदेश प्रदर्शित किया जाएगा। अन्यथा, चरणों 3.3.1-3.3.3 का पालन करें।
    1. छवि स्टैक आयात करें और पृष्ठभूमि घटाएँ (यदि आवश्यक हो).
    2. फूरियर विधि का उपयोग कर spatiotemporal सहसंबंध समारोह G(π,η,π) की गणना करें।
    3. एक 2 डी गाऊसी समारोह के साथ spatiotemporal सहसंबंध समारोह फिट करें।
      नोट:: प्रक्रिया के अंत में, σ2(π) फिटिंग प्रक्रियाओं के आउटपुट मान कमांड विंडो में दिखाए जाएँगे: औसत, त्रुटि, और फिटिंग की संगत अच्छाई (R2) रिपोर्ट किए गए हैं।
  4. ग्राफ़िकल आउटपुट की जाँच करें.
    नोट: iMSD वक्र और संबंधित फिटिंग वक्र तीन अलग-अलग पैनलों में दिखाए गए हैं, प्रत्येक एक अलग प्रकार के फिटिंग समीकरण के लिए उपयोग किया जाता है: ब्राउनियन प्रसार, असंगत प्रसार, या सीमित प्रसार। प्रत्येक वक्र के लिए, R2 मान ग्राफ़ किंवदंती में रिपोर्ट किया गया है।
  5. पाठ आउटपुट की जाँच करें.
    नोट:: प्रक्रिया के अंत में, मूल समय-अंतराल '.tif' फ़ाइल के समान नाम के साथ एक '.xls' फ़ाइल बनाई गई है। पहली शीट में प्रत्येक समय-विलंब के लिए गणना की गई π, η, π, और σ2 के मान होते हैं. इनपुट पैरामीटर और प्रिंसिपल परिकलित आउटपुट मानों को दूसरी शीट में रिपोर्ट किया गया है, अर्थात्, प्रसार गुणांक, असंगत गुणांक, और y-अक्ष σ20 इंटरसेप्ट।

Representative Results

विधि का सामान्य वर्कफ़्लो चित्र 1 में प्रस्तुत किया गया है. यह प्रोटोकॉल अनुभाग में प्रस्तुत मुख्य चरणों को दोहराता है, नमूना तैयारी (चित्रा 1 ए) से इंट्रासेल्युलर नैनोस्ट्रक्चर (चित्रा 1 बी) के समय-अंतराल इमेजिंग तक, स्पैटिओटेम्पोरल सहसंबंध कार्यों (चित्रा 1 सी) की श्रृंखला की गणना के लिए उतार-चढ़ाव विश्लेषण, और अध्ययन के तहत वस्तु के औसत संरचनात्मक / गतिशील गुणों की व्युत्पत्ति के लिए फिटिंग (चित्रा 1 डी)।

एक महत्वपूर्ण पैरामीटर ब्याज की उपकोशिकीय वस्तु को इमेजिंग करने के लिए अपनाया गया समय संकल्प है। यह प्रयोगात्मक मान उस समय सीमा को निर्धारित करेगा जिस पर ब्याज की वस्तुओं के न्यूनतम औसत विस्थापन को मापा जाएगा। हालांकि, पसंदीदा स्थिति इमेजिंग का एक समय रिज़ॉल्यूशन सेट कर रही है जिस पर ब्याज की वस्तु कैप्चर किए गए फ्रेम के भीतर 'अचल' दिखाई देती है, यानी, यह एक विशेषता आकार प्रदर्शित करती है जो औसतन, इमेजिंग गति के कारण विकृत नहीं होती है। यह तकनीकी रूप से संभव है यदि ब्याज की वस्तु एक झिल्ली-संलग्न उपकोशिकीय संरचना या ऑर्गेनेल है (जैसा कि इस मामले में)। आमतौर पर, उपकोशिकीय संरचनाएं स्थानीय प्रसार गुणांक (डी, μm2 /s, तालिका 1 देखें) प्रदर्शित करती हैं जो साइटोप्लाज्म में अलग-थलग एकल अणुओं की तुलना में कम परिमाण के कई आदेश हैं (उदाहरण के लिए, जीएफपी21)। सत्यापन कृत्रिम रूप से ब्याज के ऑर्गेनेल को स्थिर करके किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, रासायनिक निर्धारण द्वारा)। दरअसल, यह स्थिति उपयोग की जाने वाली प्रयोगात्मक परिस्थितियों के तहत वास्तविक ऑर्गेनेल आकार को निर्धारित करने के लिए एक संदर्भ के रूप में काम कर सकती है (उदाहरण के लिए, उत्तेजना तरंग दैर्ध्य, पिक्सेल आकार, उद्देश्य)।

यहां, हालांकि लाइसोसोम का उपयोग इस प्रक्रिया के लिए परीक्षण ऑर्गेनेल के रूप में किया गया था, परिणाम लक्ष्य संरचना से स्वतंत्र रूप से मान्य हैं। चित्रा 2A एक निश्चित (यानी, स्थिर) लाइसोसोम की एक छवि को दर्शाता है, साथ ही उपयुक्त अस्थायी रिज़ॉल्यूशन पर लाइव कोशिकाओं पर किए गए अधिग्रहण के साथ (यानी, आमतौर पर 100 एमएस / फ्रेम से नीचे; उदाहरण के लिए, चित्रा 2 बी में उदाहरण में 65 एमएस / फ्रेम) और बहुत कम अस्थायी रिज़ॉल्यूशन पर जानबूझकर किया गया अधिग्रहण (उदाहरण के लिए, चित्र 2 सी में उदाहरण में 10 एस / फ्रेम) ). प्रत्येक स्थिति के लिए, diffusing वस्तु का आकार निम्नानुसार निकाला जाता है: i) स्पॉट की एक तीव्रता प्रोफ़ाइल ImageJ सॉफ़्टवेयर में लाइन टूल द्वारा व्युत्पन्न होती है; ii) तीव्रता प्रोफ़ाइल को आधे अधिकतम (FWHM) मान पर पूर्ण चौड़ाई की गणना करने के लिए एक गाऊसी फ़ंक्शन द्वारा प्लॉट और इंटरपोलेट किया जाता है, जो बदले में, स्पॉट व्यास (चित्रा 2 डी) के अनुमान के रूप में उपयोग किया जाता है। जैसा कि उम्मीद की गई थी और चित्रा 2E के प्लॉट में दिखाया गया है, बहुत उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन (यानी, 65 एमएस / फ्रेम) पर अधिग्रहण निश्चित नमूने में प्राप्त संरचना के करीब संरचना का औसत आकार देता है, या तो ऊपर वर्णित मानक उपकरण का उपयोग करके या आईएमएसडी वाई-अक्ष इंटरसेप्ट को निकालकर। इसके बजाय, धीमी गति से अधिग्रहण इमेजिंग के दौरान प्राकृतिक संरचना की गतिशीलता के कारण संरचना के स्पष्ट आकार में वृद्धि करता है। सबऑप्टिमल प्रयोगात्मक परिस्थितियों के तहत, निकाली गई संरचनात्मक / गतिशील जानकारी अध्ययन के तहत वस्तु के आंतरिक गुणों को ईमानदारी से प्रतिबिंबित नहीं करती है।

एक बार मुख्य प्रयोगात्मक मापदंडों का चयन करने के बाद, लक्ष्य इंट्रासेल्युलर संरचनाओं के लिए डेटासेट का उत्पादन किया जा सकता है। मैक्रोपिनोसोम के लिए, 70 केडीए डेक्सट्रांस के साथ कोशिकाओं के इनक्यूबेशन के 20 मिनट के बाद, लेबल किए गए इंट्रासेल्युलर संरचनाओं की समय श्रृंखला को उपचार के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं पर अधिग्रहित किया गया था, 30 मिनट से लगभग 180 मिनट तक। दिलचस्प बात यह है कि तस्करी के दौरान मैक्रोपिनोसोम के संरचनात्मक और गतिशील गुणों में क्रमिक परिवर्तन का पता लगाया जाता है (चित्रा 3; मैक्रोपिनोसोम के लिए σ02, डीएम, α और एन के वितरण बाईं ओर के भूखंडों में रिपोर्ट किए गए हैं)। जबकि तस्करी के दौरान मैक्रोपिनोसोम के स्थानीय विसरणशीलता (डीएम) में कोई स्पष्ट परिवर्तन नहीं पाया जाता है, दोनों विशेषता आकार (σ02) और गति के समग्र मोड (α) समय में विकसित होते हैं।

विशेष रूप से ध्यान दें, मैक्रोपिनोसोम के औसत आकार में कमी तस्करी के दौरान देखी जाती है (चित्रा 3 ए, बाएं), साथ ही साथ उनकी गति की उप-विसर्पण प्रकृति में एक सहवर्ती वृद्धि के साथ (यानी, α मूल्यों में कमी के रूप में दर्शाया गया है, चित्रा 3 सी, बाएं पैनल)। इसके अतिरिक्त, मैक्रोपिनोसोम की संख्या प्रत्येक अधिग्रहण से निकाली गई थी: परिणाम, चित्रा 3 डी, बाएं पैनल में रिपोर्ट किए गए, स्पष्ट रूप से समय में मैक्रोपिनोसोम की संख्या में वृद्धि को प्रकट करते हैं। ये सभी परिणाम अपेक्षाओं के साथ अच्छे समझौते में हैं क्योंकि डेक्सट्रान-लेबल वाले मैक्रोपिनोसोम को प्लाज्मा झिल्ली पर अलग-थलग, बड़े झिल्ली-संलग्न पुटिकाओं के रूप में उत्पन्न होना चाहिए (जो साइटोस्केलेटल घटकों के साथ आंदोलन के लिए भी सक्षम हैं) लेकिन धीरे-धीरे एंडो-लाइसोसोमल मार्ग के साथ संवाद करने के लिए माना जाता है जो छोटे और बेतरतीब ढंग से अलग-अलग संरचनाओं की एक बड़ी आबादी से बना होता है।

जैसा कि ऊपर प्रत्याशित है, मैक्रोपिनोसोम के लिए परिणाम ISGs (चित्रा 3, दाएं कॉलम) पर किए गए समान मापों के विपरीत हैं। इंसुलिन granules iMSD-व्युत्पन्न संरचनात्मक / गतिशील मापदंडों (और सेल के भीतर उनकी औसत संख्या) के एक समय-विकसित प्रवृत्ति को मैक्रोपिनोसोम के लिए मनाया एक ही समय विंडो में नहीं दिखाते हैं। इसके अलावा, σ02, डीएम, और α के विशिष्ट मूल्य लाइसोसोम से काफी अलग हैं, जो फिर से संदर्भ के रूप में उपयोग किए जाते हैं। यह परिणाम इस विचार की पुष्टि करता है, जैसा कि ऊपर प्रत्याशित है, कि दानों की जांच एक 'स्थिर राज्य' में की जाती है, जिसमें किसी भी समय, आईएसजी की पूरी आबादी के औसत संरचनात्मक / गतिशील गुण अपरिवर्तित होते हैं (यानी, वे स्थिर रहते हैं, जब तक कि स्थिर-राज्य की स्थिति नहीं बदलती है, उदाहरण के लिए, बाहरी उत्तेजनाओं के कारण)।

Figure 1
चित्र1: प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो. (A) सूक्ष्म अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त सेल व्यंजनों पर कन्फॉकल प्रयोगों से पहले कोशिकाओं को 24 घंटे (अभिकर्मक प्रयोगों के लिए 48 घंटे) मढ़वाया गया था। तब कोशिकाओं को ब्याज के साइटोप्लाज्मिक ऑर्गेनेल को दागने के लिए लेबलिंग विधि (प्रोटोकॉल देखें) के अनुसार उपयुक्त रूप से इलाज किया गया था। (बी) एक विशिष्ट कॉन्फोकल अधिग्रहण में एक जीवित कोशिका के साइटोप्लाज्मिक हिस्से की छवियों (समय-अंतराल) का एक ढेर होता है, जो लेबल किए गए ऑर्गेनेल गतिशीलता के समय-विकास का वर्णन करता है। (सी) टाइम-लैप्स फिल्म का विश्लेषण एक कस्टम-मेड मैटलैब स्क्रिप्ट के साथ किया जाता है, पहले आईएमएसडी वक्र (डी) को प्लॉट करने के लिए स्पैटिओटेम्पोरल छवि सहसंबंध फ़ंक्शन और गाऊसी फिटिंग की गणना की जाती है और संबंधित निकाले गए फिटिंग पैरामीटर जो प्रतिबिंबित ऑर्गेनेल के संरचनात्मक गतिशीलता मापदंडों का वर्णन करते हैं। संक्षेप: iMSD = इमेजिंग-व्युत्पन्न माध्य वर्ग विस्थापन; STICS = spatiotemporal छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी; α = असंगत प्रसार गुणांक; Dm = स्थानीय विसरणशीलता; σ2(π) = प्रसरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: उचित प्रयोगात्मक पैरामीटर। (ए) एक निश्चित नमूने में दाग लाइसोसोम की अनुकरणीय छवि। स्केल बार = 2 μm. (B) एक जीवित सेल में दाग लाइसोसोम की छवियों के ढेर का पहला फ्रेम, उपयुक्त मापदंडों के साथ अधिग्रहित किया जाता है। अस्थायी संकल्प: 65 एमएस / फ्रेम। स्केल बार = 2 μm. (C) एक जीवित सेल में दाग लाइसोसोम की छवियों के ढेर का पहला फ्रेम, कम गति से अधिग्रहित किया जाता है: इमेजिंग के दौरान ऑर्गेनेल गति के कारण स्पष्ट लाइसोसोम आकार का आर्टिफैक्टुअल विरूपण दिखाई देता है। अस्थायी संकल्प: 10 एस / फ्रेम। स्केल बार = 2 μm. (D) (A), (B), और (C) के नीले ROI में इमेज्ड लाइसोसोम के लिए आकार गणना का उदाहरण। नीली रेखा के साथ तीव्रता प्रोफ़ाइल को एफडब्ल्यूएचएम को पुनः प्राप्त करने के लिए एक गाऊसी फ़ंक्शन के साथ फिट किया गया था, यानी, स्पॉट आकार का अनुमान। FWHM मान प्रत्येक फिटिंग के लिए रिपोर्ट किए जाते हैं। (ई) सभी छविवाले लाइसोसोम (काला वर्ग, माध्य मान, और मानक विचलन) के लिए पैनल (डी) में वर्णित छवि विश्लेषण द्वारा प्राप्त आकार मूल्यों का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व, नीले आरओआई (नीले त्रिभुज) के भीतर संलग्न लाइसोसोम के लिए, और आईएमएसडी विश्लेषण (लाल सर्कल) द्वारा पुनर्प्राप्त किया गया। यह आंकड़ा 22 का है। संक्षेप: ROI = ब्याज का क्षेत्र; FWHM = आधा अधिकतम पर पूर्ण चौड़ाई; iMSD = इमेजिंग-व्युत्पन्न माध्य वर्ग विस्थापन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: लेबल किए गए ऑर्गेनेल का अस्थायी विकास(ए) आईएमएसडी-निकाले गए आकार के मूल्यों के भूखंड बनाम बाद के अधिग्रहणों की समय प्रगति को 10-मिनट की समय खिड़की पर किए गए अधिग्रहणों में मापा मूल्यों के माध्य के रूप में दर्शाया गया है। बाईं ओर, मैक्रोपिनोसोम (काले हलकों) के औसत आकार में प्रगतिशील कमी और दाईं ओर, लाइसोसोम की तुलना में इंसुलिन स्रावी कणिकाओं (काले वर्गों) के समय-अपरिवर्तनीय आकार, मानक विचलन (धराशायी लाल रेखा) ± औसत आकार मूल्य (मोटी लाल रेखा) के रूप में दर्शाया गया है। (बी) और (सी) डीएमएसडी विश्लेषण द्वारा निकाले गए मैक्रोपिनोसोम (बाएं) और इंसुलिन ग्रैन्यूल्स (दाएं) के लिए डीएम और α गुणांक की समय प्रगति। (घ) प्रत्येक अधिग्रहित समय-अंतराल फिल्म के पहले फ्रेम में मापे गए लेबल वाले मैक्रोपिनोसोम और इंसुलिन ग्रैन्यूल्स की संख्या का समय-विकास। संक्षेप: iMSD = इमेजिंग-व्युत्पन्न माध्य वर्ग विस्थापन; α = असंगत प्रसार गुणांक; Dm = स्थानीय विसरणशीलता, N = संख्या। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ऑर्गेनेल लेबलिंग कक्ष रेखा आकार (nm) Dm (× 10-3 μm2/s) α N रेफरी।
प्रारंभिक एंडोसोम (ईई) CellLight प्रारंभिक एंडोसोम GFP HeLa 395±74 3.0±2.4 1.02±0.20 40 10
देर एंडोसोम (एलई) CellLight देर एंडोसोम GFP HeLa 693±102 15.4±10.6 0.57±0.16 58 10
लाइसोसोम (LY) LysoTracker DND-99 HeLa 471±76 15.3±9.0 0.49±0.13 143 10, 14
Caveola (CAV) Caveolin-EGFP HeLa 405±49 3.1±1.8 1.00±0.22 15 10
क्लैथ्रिन लेपित Vescicle (CCV) Transferrin-Alexa 488 HeLa 513±62 16.2±9.9 0.48±0.17 33 10
इंसुलिन ग्रेन्युल (आईजी) सी-पेप्टाइड-ईजीएफपी INS-1E 335±56 3.0±1.7 0.70±0.14 107 11
प्रारंभिक मैक्रोपिनोसोम (EMCR) फ्लोरोसीन-डेक्सट्रान 70 केडीए HeLa 979±423 8.3±9 0.79±0.27 36 10
इंटरमीडिएट मैक्रोपिनोसोम (IMCR) फ्लोरोसीन-डेक्सट्रान 70 केडीए HeLa 702±180 13.7±19.9 0.60±0.38 29 10
देर से मैक्रोपिनोसोम (LMCR) फ्लोरोसीन-डेक्सट्रान 70 केडीए HeLa 592±127 5.8±4.7 0.39±0.21 21 10

तालिका 1: संरचनात्मक और गतिशील मैंMSD-निकाले गए पैरामीटर. तालिका विभिन्न ऑर्गेनेल के लिए मापा गया आकार, डीएम, और α गुणांक के मूल्यों को दिखाती है, लेबलिंग रणनीतियों, उपयोग की जाने वाली सेल लाइन और विश्लेषण किए गए अधिग्रहणों की संख्या को निर्दिष्ट करती है। मानों को माध्य ± मानक विचलन के रूप में रिपोर्ट किया जाता है। संक्षेप: iMSD = इमेजिंग-व्युत्पन्न माध्य वर्ग विस्थापन; α = असंगत प्रसार गुणांक; Dm = स्थानीय विसरणशीलता, N = संख्या; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; EGFP = बढ़ाया हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन।

पूरक फ़ाइल 1: iMSD ट्रेस व्युत्पत्ति और विश्लेषण पर विवरण. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

समर्थन फ़ाइल 1: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

समान जानकारी को पुनः प्राप्त करने के लिए उपलब्ध तकनीकों की तुलना में आईएमएसडी के गुण और फायदे स्पष्ट हैं। संरचनात्मक जानकारी के लिए, पसंदीदा विकल्प संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) विश्लेषण है। इस विधि द्वारा, आणविक संकल्प और उससे परे भी अल्ट्रास्ट्रक्चरल विवरणों को पुनः प्राप्त किया जा सकता है, यहां तक कि उपकोशिकीय नैनोस्ट्रक्चर के लिए भी। फिर भी, टीईएम का अजीब स्थानिक संकल्प अस्थायी आयाम में जानकारी की कीमत पर प्राप्त किया जाता है, जो यहां ब्याज का है। इसकी भरपाई करने के लिए, लाइव-सेल इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में हाल ही में हुई प्रगति विशेष रुचि की है। इनमें बढ़े हुए प्रदर्शन (जैसे, चमक और फोटोस्टेबिलिटी), अनुकूलित लेबलिंग प्रक्रियाओं और अधिक संवेदनशील डिटेक्टरों के साथ नए फ्लोरोसेंट मार्कर शामिल हैं। इसके अलावा, विश्लेषणात्मक उपकरण दोनों संरचनात्मक (उदाहरण के लिए, स्थानीय छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी के फैसर-आधारित विश्लेषण द्वारा 'आकार', PLICS23, संख्या और चमक विश्लेषण24 द्वारा एकत्रीकरण / oligomerization) और गतिशील (उदाहरण के लिए, एकल-कण ट्रैकिंग द्वारा प्रसार कानून, यानी, (एसपीटी) 25,26,27,28 को संबोधित करने के लिए उपलब्ध हैं ) उपकोशिकीय पैमाने पर पैरामीटर। एसपीटी विधि ऑब्जेक्ट प्रक्षेपवक्र और इसके एमएसडी तक सीधी पहुंच प्रदान करती है। हालांकि, नुकसान जांच के कम घनत्व और बहुत उज्ज्वल लेबल और कई एकल-वस्तु प्रक्षेपवक्रों की आवश्यकता है जिन्हें सांख्यिकीय मानदंडों को पूरा करने के लिए मापा जाना चाहिए। माप के अस्थायी संकल्प के संबंध में, अकार्बनिक, फोटोटेबल जांच (जैसे, क्वांटम डॉट्स या धातु नैनोकणों) एसपीटी प्रदर्शन को बढ़ा सकते हैं, लेकिन जटिल उत्पादन और लेबलिंग प्रक्रियाओं की कीमत पर।

इन मानकों की तुलना में, यहां वर्णित iMSD विधि कुछ प्रमुख फायदे दिखाती है। सबसे पहले, इस दृष्टिकोण का उपयोग अपेक्षाकृत मंद फ्लोरोसेंट टैग के साथ संयोजन के रूप में किया जा सकता है, जैसे कि आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन (उदाहरण के लिए, आईएसजी के लिए आवेदन)। इस प्रकार, एसपीटी की तुलना में, आवश्यक फोटॉनों की कम मात्रा के कारण एक उच्च अस्थायी संकल्प (एक ही लेबल का उपयोग करके) प्राप्त किया जाताहै। दूसरा, आईएमएसडी विधि केवल अस्थायी संकल्प द्वारा सीमित है लेकिन विवर्तन नहीं है। वास्तव में, उपयोग किए गए विवर्तन-सीमित ऑप्टिकल सेटअप के बावजूद, विवर्तन सीमा से नीचे भी औसत आणविक विस्थापन को मापा जा सकता है, जैसा कि पहले से ही एसटीआईसीएस29 का उपयोग करके आणविक प्रवाह के लिए प्रदर्शित किया गया है। विस्थापन के मापन में वास्तविक संकल्प इस बात पर निर्भर करता है कि सहसंबंध फ़ंक्शन को कितनी सटीकता से (शोर के संकेत के संदर्भ में) मापा जा सकता है, इस प्रकार यह समझाते हुए कि यह विवर्तन द्वारा सीमित क्यों नहीं है। इस प्रकार, यह स्पष्ट प्रतीत होता है कि न्यूनतम विस्थापन जिसे मापा जा सकता है, ब्याज की वस्तु की विसरणशीलता और इमेजिंग सेटअप के अस्थायी संकल्प पर निर्भर करता है।

इस संबंध में, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के साथ मैक्रोपिनोसोम या इंसुलिन ग्रैन्यूल्स जैसे उपकोशिकीय नैनोस्ट्रक्चर के लिए आवेदन इष्टतम है: उपलब्ध स्कैनिंग गति ब्याज की वस्तु की गतिशीलता की तुलना में काफी अधिक है। ऐसे मामले में, अधिग्रहण के दौरान वस्तुओं का आंदोलन नगण्य है, और सहसंबंध फ़ंक्शन को गॉसियन फ़ंक्शन द्वारा अनुमानित किया जा सकता है। अंत में, आईएमएसडी दृष्टिकोण को आसानी से रैस्टर स्कैन या वाइड-फील्ड कैमरा-आधारित इमेजिंग के आधार पर वाणिज्यिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी सेटअप की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है, जिसमें सिस्टम अंशांकन की कोई आवश्यकता नहीं है (केवल तभी आवश्यक है जब कण आकार का सटीक अनुमान प्राप्त करने की आवश्यकता हो)। काम करने के लिए विधि के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर उचित स्थानिक नमूनाकरण है। एक सामान्य नियम के रूप में, फिटिंग एल्गोरिथ्म के संतोषजनक अभिसरण तक पहुंचने के लिए, इमेजिंग के लिए ब्याज के क्षेत्र का न्यूनतम आकार ब्याज के अधिकतम विस्थापन से कम से कम 3 गुना बड़ा होना चाहिए।

अंत में, iMSD विधि को केवल तेजी से अधिग्रहण के लिए सुसज्जित माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है। ब्याज की संरचना को किसी भी आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड या कार्बनिक फ्लोरोफोर को टैग किया जा सकता है, इस प्रकार मल्टीचैनल इमेजिंग को सक्षम किया जा सकता है। यह कल्पना की गई है कि क्रॉस-आईएमएसडी विश्लेषण का उपयोग निकट भविष्य में उपकोशिकीय नैनोस्ट्रक्चर की उप-आबादी का चयन करने और सेल के भीतर उनकी बातचीत और सह-प्रसार को प्रकट करने के लिए किया जाएगा, बाद में सेलुलर बायोफिज़िक्स में एक गर्म विषय है। यदि कोई विवरण आईएमएसडी विश्लेषण द्वारा खो जाता है, तो यह निश्चित रूप से गतिशील उपकोशिकीय नैनोस्ट्रक्चर के भीतर आणविक जानकारी की बड़ी मात्रा से संबंधित है। इस तरह की जानकारी अनिवार्य रूप से खराब अस्थायी संकल्प के कारण माप के दौरान औसत है। सैद्धांतिक रूप से, हालांकि, आणविक जानकारी को पुनः प्राप्त करने की संभावना के कारण कोई तकनीकी सीमा नहीं है, बशर्ते कि पर्याप्त अधिग्रहणगति प्राप्त की जा सके। डिटेक्टर गति / संवेदनशीलता और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में निरंतर सुधार के कारण, यह कल्पना की जाती है कि पूरे उपकोशिकीय डिब्बे और इसके आणविक घटकों के बारे में जानकारी एक ही डेटासेट से निकाली जाएगी।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (अनुदान समझौता नहीं 866127, परियोजना CAPTURE3D) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ERC) से धन प्राप्त हुआ है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine Gibco 10378-016 Cell medium supplement
C-peptide-EGFP Plasmid
DMEM High Glucose Gibco 31053028 Cell medium (HeLa)
FBS Gibco 10082147 Cell medium supplement
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa Sigma Aldrich 46945-100MG-F Reagent
HeLa ATCC CCL-61 Cell Line
Lipofectamine 2000 TermoFisher 11668019 Trasfection reagent
Lysotracker Red DND-99 Gibco L7528 Reagent
Matlab MathWork Software
Microscope-suitable cell dishes Willco GWSt-3522 Petri dishes
Olympus FV1000 Olympus Japan Confocal microscope
RPMI 1640 Gibco 11835063 Cell medium (INS-1E)

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References

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जीव विज्ञान अंक 174
Spatiotemporal उतार-चढ़ाव स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा तस्करी उपकोशिकीय Nanostructures के संरचनात्मक और गतिशील गुणों की जांच
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Ferri, G., Azzarello, F., D'Autilia, F., Cardarelli, F. Probing Structural and Dynamic Properties of Trafficking Subcellular Nanostructures by Spatiotemporal Fluctuation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (174), e62790, doi:10.3791/62790 (2021).

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