Summary
Imaging-avledet gjennomsnittlig kvadratisk forskyvning (iMSD) analyse brukes på makropinosomer for å markere sin iboende tidsutvikling natur når det gjelder strukturelle og dynamiske egenskaper. Makropinosomer sammenlignes deretter med insulin sekretoriske granulater (ISG) som referanse for subcellulære strukturer med tidsinvariante gjennomsnittlige strukturelle / dynamiske egenskaper.
Abstract
Imaging-avledede gjennomsnittlige firkantede forskyvninger (iMSD) brukes til å adressere strukturelle og dynamiske egenskaper til subcellulære nanostrukturer, for eksempel vesicles involvert i endo / eksocytotisk smugling av solutes og biomolekyler. iMSD er avhengig av standard tidsforløpavbildning, er kompatibel med ethvert optisk oppsett, og trenger ikke å dvele ved enkeltobjekter for å trekke ut baner. Fra hvert iMSD-spor beregnes og kombineres en unik trilling av gjennomsnittlige strukturelle og dynamiske parametere (dvs. størrelse, lokal diffusitet, uregelmessig koeffisient) for å bygge "iMSD-signaturen" til nanostrukturen som studeres.
Styrken til denne tilnærmingen er bevist her med det eksemplariske tilfellet av makropinosomer. Disse vesiklene utvikler seg i tid, og endrer gjennomsnittlig størrelse, antall og dynamiske egenskaper som går fra tidlig til sen fase av intracellulær menneskehandel. Som en kontroll brukes insulinsekretoriske granulater (ISG) som referanse for subcellulære strukturer som lever i en stasjonær tilstand der de gjennomsnittlige strukturelle og dynamiske egenskapene til hele populasjonen av objekter er konstante i tide. IMSD-analysen fremhever disse særegne egenskapene kvantitativt og baner vei for lignende applikasjoner på sub-cellulært nivå, både i fysiologiske og patologiske tilstander.
Introduction
Subcellulære nanostrukturer (f.eks. endokytiske/sekretoriske vesikler, organeller) spiller en sentral rolle i cellesignalregulering1. Riktig justering av deres strukturelle (f.eks. størrelse) og/eller dynamiske (f.eks. diffusivitet) bestemmer hvordan cellen reagerer på interne eller eksterne stimuli 2,3,4. Basert på dette beviset er det ikke overraskende at endringer av disse egenskapene finnes i mange patologiske forhold. Eksempler omfatter rollen som feilregulert endokytose hos kreft 2,3, de strukturelle og dynamiske endringene som finnes på nivået av ISG i β-celler utsatt for Type-2 Diabetes forhold5, feilregulering av lysosomale strukturelle og transportegenskaper i globoid-celle leukodystrofi eller galaktosylceramid lipidose6, og dysfunksjonaliteter i endo-lysosomale banen i nevrodegenerative lidelser (f.eks.
I denne sammenhengen har forskere nylig bevist at ytelsen til standard optiske mikroskopimetoder kan forbedres ved å justere romlig og tidsmessig prøvetakingsoppløsning8 på riktig måte. Dette kan igjen gi ytterligere innsikt i biologiske prosesser av relevans. I praksis er dette muliggjort av en algoritme for romlig svingningsanalyse, som samtidig trekker ut de gjennomsnittlige strukturelle og dynamiske egenskapene til diffuserende objekter direkte fra standardstakken av optiske mikroskopibilder uten behov for foreløpig kunnskap om det biologiske objektet av interesse og utvinning av enkeltobjektbaner. All denne informasjonen er vedlagt i en enkelt utgang av metoden: en iMSD-spor9 (detaljer om iMSD-sporavledning og analyse er gitt i Supplemental File 1).
Den resulterende eksperimentelle protokollen består av noen få trinn. For det første utføres avbildning av interesseområdet med høy temporal oppløsning. Deretter beregnes gjennomsnittlige romlige-temporale korrelasjonsfunksjoner fra bildestakken. Til slutt, ved gaussisk tilpasning av serien av korrelasjonsfunksjoner, oppnås den gjennomsnittlige 'diffusjonsloven' direkte fra avbildning og analyseres for å gjenkjenne objektdiffusjonsmodus. Potensialet i metoden var allerede bevist for en rekke biologiske objekter, alt fra molekyler til nanopartikler og til og med hele subcellulære organeller / strukturer 9,10,11,12,13,14,15.
Dette dokumentet rapporterer iMSD-applikasjon til makropinosomer for å markere deres iboende, irreversible tidsutviklingsnatur når det gjelder deres gjennomsnittlige (dvs. på hele befolkningsnivå) strukturelle og dynamiske egenskaper. Videre sammenlignes disse endokytiske vesiklene med ISG-er som en referanse for subcellulære strukturer i en "stasjonær tilstand", det vil si en tilstand der de gjennomsnittlige strukturelle / dynamiske egenskapene til hele populasjonen av granulater forblir konstante når som helst. Makropinocytose definerer en rekke hendelser initiert av den omfattende omorganiseringen (eller ruffling) av plasmamembranen for å danne en ekstern makropinocytisk struktur som deretter internaliseres16. De dannede tidlige makropinosomene ligner veldig på fagosomer. Samtidig kan de skille seg fra andre former for endokytiske vesicles på grunn av deres karakteristiske store størrelse, morfologisk heterogenitet og mangel på protein-frakkstrukturer.
Biokjemiske analyser avslørte at makropinosomer ved internalisering gradvis blir beriket med proteinmarkører fra andre endokytiske veier, noe som igjen tyder på at identiteten deres kontinuerlig endres under menneskehandel17. Ved hjelp av antistoffer mot kjente markører av endosomale banen ble det demonstrert at makropinosomer gradvis vedtar klassiske endosomale egenskaper: de avtar i størrelse, utvikler seg til sen endokytiske strukturer (f.eks. lysosomer), eller til slutt mister sin identitet via membranmediert gjenfinning av spesifikke molekylære markører (f.eks. sortering av nexiner)18,19 . Det overordnede scenariet er at hvert eneste makropinosom i cellen irreversibelt endrer sin strukturelle og dynamiske (så vel som molekylære) identitet under menneskehandel fra plasmamembranen til den endelige intracellulære skjebnen. Som et resultat endres også de strukturelle / dynamiske / molekylære egenskapene til hele befolkningen av makropinosomer langs samme temporale bane. Å være iboende følsom for gjennomsnittsegenskapene til hele befolkningen av observerte objekter, skildrer iMSD-metoden kvantitativt den 'utviklende naturen' ved kvantifisering av viktige gjennomsnittsparametere, det vil si den lokale diffusiviteten og uregelmessige koeffisienten (dynamiske egenskaper) og gjennomsnittsstørrelsen på makropinosomene (strukturell egenskap) i alle stadier av deres intracellulære menneskehandel.
Til sammenligning ble lignende målinger utført på en velkjent intracellulær membran-lukket struktur, ISG, i en modell av β-celler. Som makropinosomer er reguleringen av isgs strukturelle og dynamiske egenskaper, fra deres genesis ved Trans Golgi Network (TGN) til deres eksocytose ved plasmamembranen, avgjørende for riktig utførelse av ISG-funksjon20. Men i motsetning til makropinosomer lever ISG-er i en 'stasjonær tilstand' der alle funksjonelle / strukturelle / molekylære stadier av ISG-levetid samtidig er til stede i cellen, og hver er representert av en bestemt underbefolkning av ISG-er. Dette betyr at selv om hver eneste granulat utvikler seg irreversibelt fra biogenese til sekresjon, forventes de gjennomsnittlige strukturelle / dynamiske egenskapene til hele befolkningen av granulater å forbli konstant når som helst (med mindre de stasjonære tilstandsforholdene endres, for eksempel ved ytre stimuli som glukose, kolesterol og cytokiner13). Dette bekreftes av iMSD-analyse.
Protocol
1. Prøvepreparering
- Før mikroskopieksperimentet var subkulturceller i retter egnet for mikroskopiapplikasjoner.
- Vask en 10 cm vevskulturbehandlet tallerken med konfluent HeLa eller INS 1E (insulinoma β-celle-lignende) celler to ganger med 0,01 M 1x PBS, tilsett 1 ml 0,05% trypsin-EDTA (1x), og legg den i en 37 °C, fuktet, 5 % CO 2-inkubator i 5 minutter.
- Resuspend de frittliggende cellene ved å legge til 9 ml komplett DMEM (for HeLa-celler) eller RPMI 1640 (for INS-1E celler) medium, og samle de endelige 10 ml i sentrifuge rør.
- Frø ca 2 × 105 celler i hver 35 mm x 10 mm tallerken i et sluttvolum på 1 ml av mediet. Inkuber cellene i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
- For å merke lysosomer på en fluor måte, bruk LysoTracker Red DND-99.
- Fortynn lagerløsningen i 1 ml forhåndsvarslet medium til en endelig fargekonsentrasjon på 70 nM.
- Skift ut mediet fra retten med fersk LysoTracker-inneholdende medium. Inkuber cellene i LysoTracker-inneholdende medium i 20 minutter ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære , og vask dem to ganger med friskt medium før eksperimentet.
- For å fluorescerende merke makropinosomer, bruk 70-kDa fluorescein isothiocyanate-dextran. Vask de subkulturerte cellene tre ganger med 0,01 M 1x fosfatbufret saltvann (PBS), erstatt med dekstranholdig medium (1 mg/ml) og inkuber ved 37 °C i 30 minutter. Før du fortsetter med mikroskopieksperimentet, vask cellene tre ganger med friskt medium.
- For å fluorescerende merke ISG-er i INS-1E-celler, transfekter cellene ved hjelp av transfeksjonsreagens (se materialtabellen) og C-peptidforbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) plasmid13 i henhold til produsentens protokoll, og inkubere ved 37 °C i 24 timer i en 5 % CO2-atmosfære før eksperimentet.
2. Datainnsamling
- For å la mikroskopet likevekte ved ønsket temperatur og atmosfære, slå på mikroskopinkubatorkontrolleringssystemet minst 2 timer før eksperimentet.
MERK: Hvert oppkjøp er en tidsforløpserie. - Skaff bildene ved hjelp av et invertert konfokalt mikroskop utstyrt med et 60x, 1.2 Numerisk blenderåpning (NA) vann-nedsenking mål.
- Bruk en Argon-laser på 488 nm for eksitasjon av EGFP (transfiserte celler) og fluoresceinmerkede makropinosomer. Samle fluorescensutslippet mellom 500 og 600 nm ved hjelp av en standard fotomultiplikatorrørdetektor.
- Bruk en 543 nm HeNe laser for å begeistre Lysotracker og samle fluorescensutslippet mellom 555 og 655 nm.
- Sett diameteren på deteksjonspinnehullet til størrelsen 1 Luftig. For hvert oppkjøp samler du en serie på 1000 sekvensielle rammer. Sett pikselboetiden til 2 μs/pixel for en rammetid på 129 ms.
MERK: Hvert bilde besto av 256 x 256 piksler (16 biter/piksel) med en fysisk dimensjon på 69 nm/piksel, tilsvarende omtrent et areal på 17 μm x 17 μm.
3. iMSD-beregning
MERK: For å utføre beregningen på riktig måte, bruk programvare som er i stand til numerisk beregning og skriptprogrammering. Det spesifikke skriptet (dvs. for iMSD.m'-skriptfilen, se Støttefil 1) må være til stede i samme mappe som inneholder bildeserien som skal behandles. Hvert bilde av serien må lagres som en distinkt ".tif"-fil.
- For å initialisere de instrumentelle parametrene som brukes til oppkjøpene riktig, åpner du iMSD.m med programvaretekstredigereren og endrer den første delen som følger.
- Angi N som antall rammer i tidsserien (f.eks. 1000 i denne protokollen).
- Angi px_size: pikselstørrelse, uttrykt i μm (f.eks. 0 069 i denne protokollen).
- Sett f: temporal oppløsning for hvert bilde, uttrykt i sekunder (f.eks. 0,129 i denne protokollen).
- Angi filter: binære inndata for bakgrunnskorrigering, sett verdien til 0 for å behandle RAW-bilder, eller sett verdien til 1 for å utføre et terskelbasert bakgrunnsdeldetraksjon.
- Angi av_toll: terskel for bakgrunnskorrigering. Alle bildepunkt med lavere intensitet enn denne verdien angis som 0 hvis Filter=1.
- Angi bit som heltall som bestemmer intensitetsprøvetakingen (f.eks. 8 biter, 16 biter).
- Lagre og kjør den redigerte iMSD.m-skriptfilen.
- Kontroller skriptutførelsen.
MERK: Beregningsbehandlingsstatusen kan kontrolleres i kommandovinduet; Hvis det oppstår et kritisk problem, avbrytes prosessen, og det vises en advarsel for å vise feiltypen og den relaterte linjekoden. Ellers følger du trinn 3.3.1-3.3.3.- Importer bildestakken, og trekk fra bakgrunnen (om nødvendig).
- Beregn den romlige korrelasjonsfunksjonen G(ξ,η,τ) ved hjelp av Fourier -metoden.
- Tilpass den romlige korrelasjonsfunksjonen med en 2D Gaussian-funksjon.
MERK: På slutten av prosessen vil utgangsverdiene for σ2(τ) monteringsprosedyrene vises i kommandovinduet: gjennomsnitt, feil og tilsvarende godhet (R2) for montering rapporteres.
- Kontroller den grafiske utdataene.
MERK: iMSD-kurven og de tilsvarende monteringskurvene vises i tre separate paneler, hver for en annen type tilpasningsligning som brukes: Brownian diffusjon, uregelmessig diffusjon eller begrenset diffusjon. For hver kurve rapporteres R2-verdien i diagramforklaringen. - Kontroller tekstutdataene.
MERK: På slutten av prosessen opprettes en ".xls" -fil med samme navn på den opprinnelige tidsforløpfilen ".tif". Det første arket inneholder verdiene for ξ, η, τ og σ2 beregnet for hver tidsforsinkelse. Inndataparameterne og de viktigste beregnede utdataverdiene rapporteres i det andre arket, det vil si diffusjonskoeffisient, uregelmessig koeffisient og y-akse σ20 skjæringspunkt .
Representative Results
Den generelle arbeidsflyten for metoden presenteres i figur 1. Den rekapitulerer hovedtrinnene som presenteres i protokolldelen, fra prøvepreparering (figur 1A) til tidsforløpavbildning av intracellulære nanostrukturer (figur 1B), svingningsanalyse for beregning av serien av romlige korrelasjonsfunksjoner (figur 1C), og montering for avledning av de gjennomsnittlige strukturelle/dynamiske egenskapene til objektet som studeres (figur 1D).
En kritisk parameter er tidsoppløsningen som er vedtatt for avbildning av det subcellulære objektet av interesse. Denne eksperimentelle verdien vil angi tidsterskelen for når den minste gjennomsnittlige forskyvningen av gjenstandene av interesse skal måles. Den foretrukne betingelsen er imidlertid å angi en tidsoppløsning for avbildning der gjenstanden for interesse fremstår som "immobil" innenfor den fangede rammen, det vil si at den viser en karakteristisk størrelse som i gjennomsnitt ikke deformeres på grunn av bildehastigheten. Dette er teknisk mulig hvis gjenstanden av interesse er en membran-lukket subcellulær struktur eller organelle (som i dette tilfellet). Vanligvis viser subcellulære strukturer lokale diffusjonskoeffisienter (D, μm2/s, se tabell 1) som er flere størrelsesordener lavere enn for isolerte enkeltmolekyler i cytoplasma (f.eks. GFP21). Validering kan utføres ved kunstig immobilisering av organellet av interesse (f.eks. ved kjemisk fiksering). Faktisk kan denne tilstanden tjene som en referanse for å bestemme den faktiske organellstørrelsen under de eksperimentelle forholdene som brukes (f.eks. eksitasjonsbølgelengde, pikselstørrelse, mål).
Her, selv om lysosomer ble brukt som testorganeller for denne prosedyren, er resultatene gyldige uavhengig av målstrukturen. Figur 2A viser et bilde av en fast (dvs. immobil) lysosom sammen med et oppkjøp utført på levende celler med riktig tidsoppløsning (dvs. vanligvis under 100 ms/ramme; f.eks. 65 ms/ramme i eksemplet i figur 2B) og et oppkjøp utført med vilje ved svært lav tidsoppløsning (f.eks. 10 s/ramme i eksemplet i figur 2C ). For hver betingelse trekkes størrelsen på det diffuserende objektet ut på følgende måte: i) en intensitetsprofil for stedet avledes av linjeverktøyet i ImageJ-programvaren; ii) intensitetsprofilen plottes og interpoleres av en gaussisk funksjon for å beregne hele bredden ved halv maksimumsverdi (FWHM) som igjen brukes som et estimat av spotdiameteren (figur 2D). Som forventet og vist i plottet i figur 2E, gir oppkjøpet med svært høy temporal oppløsning (dvs. 65 ms / ramme) en gjennomsnittlig størrelse på strukturen nær den som er oppnådd i den faste prøven, enten ved å bruke standardverktøyet beskrevet ovenfor eller ved å trekke ut iMSD y-akseskjæringspunktet. I stedet gir oppkjøpet med lav hastighet en økning i den tilsynelatende størrelsen på strukturen, på grunn av den naturlige strukturdynamikken under avbildning. Under suboptimale eksperimentelle forhold gjenspeiler den strukturelle / dynamiske informasjonen som ekstraheres ikke trofast de iboende egenskapene til objektet som studeres.
Når de viktigste eksperimentelle parametrene er valgt, kan datasett produseres for mål intracellulære strukturer. For makropinosomer, etter 20 min inkubasjon av cellene med 70 kDa dextrans, ble tidsserier av de merkede intracellulære strukturene anskaffet på forskjellige tidspunkter etter behandling, fra 30 minutter opp til ca. 180 min. Interessant nok oppdages en gradvis endring i de strukturelle og dynamiske egenskapene til makropinosomer under menneskehandel (figur 3; distribusjoner på σ02, Dm, α og N for makropinosomer rapporteres i plottene til venstre). Selv om det ikke oppdages noen åpenbare endringer i den lokale diffusiviteten (Dm) av makropinosomer under menneskehandel, utvikler både den karakteristiske størrelsen (σ02) og den generelle bevegelsesmodusen (α) seg i tide.
Spesielt observeres en reduksjon i gjennomsnittsstørrelsen på makropinosomene under menneskehandel (figur 3A, venstre), sammen med en samtidig økning i bevegelsens subdiffusive natur (dvs. betegnet som en nedgang i α verdier, figur 3C, venstre panel). I tillegg ble antall makropinosomer hentet fra hvert oppkjøp: resultatene, rapportert i figur 3D, venstre panel, avslører tydelig en økning i antall makropinosomer i tide. Alle disse resultatene er i god enighet med forventningene fordi dextran-merkede makropinosomer skal stamme fra isolerte, store membran-lukkede vesikler ved plasmamembranen (som også er kompetente for bevegelse langs cytoskeletale komponenter), men skal gradvis kommunisere med den endo-lysosomale banen som består av en stor befolkning av mindre og tilfeldig diffuserende strukturer.
Som forventet ovenfor står resultatene for makropinosomer i kontrast til lignende målinger utført på ISG-er (figur 3, høyre kolonne). Insulingranulat viser ikke en tidsutviklingstrend for de iMSD-avledede strukturelle/dynamiske parametrene (og deres gjennomsnittlige tall i cellen) i samme tidsvindu observert for makropinosomer. Videre er de karakteristiske verdiene til σ02, Dm og α ganske forskjellige fra lysosomer, brukt igjen som referanse. Dette resultatet bekrefter ideen, som forventet ovenfor, at granulater er undersøkt i en "stasjonær tilstand" der de gjennomsnittlige strukturelle / dynamiske egenskapene til hele befolkningen av ISG-er er uendret (dvs. de forblir konstante, med mindre de stasjonære tilstandsbetingelsene endres, for eksempel på grunn av ytre stimuli).
Figur 1: Eksperimentell arbeidsflyt. (A) Celler ble belagt 24 timer (48 timer for transfeksjonsforsøk) før konfokale eksperimenter på celleretter egnet for mikroskopiske applikasjoner. Celler ble deretter passende behandlet i henhold til merkingsmetoden (se protokoll) for å flekke den cytoplasmatiske organellen av interesse. (B) Et typisk konfokalt oppkjøp består av en stabel med bilder (tidsforløp) av en cytoplasmatisk del av en levende celle, som beskriver tidsutviklingen av merket organelledynamikk. (C) Tidsforløpfilm analyseres med et skreddersydd Matlab-skript, som først beregner romlig bildekorrelasjonsfunksjon og gaussisk tilpasning for å plotte iMSD-kurver (D) og relaterte ekstraherte tilpasningsparametere som beskriver strukturelle dynamikkparametere for avbildet organeller. Forkortelser: iMSD = bildebehandling-avledet gjennomsnittlig kvadratisk forskyvning; STICS = romlig bildekorrelasjonsspektroskopi; α = uregelmessig diffusjonskoeffisient; Dm = lokal diffusivitet; σ2(τ) = varians. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Riktige eksperimentelle parametere. (A) Eksemplarisk bilde av fargede lysosomer i en fast prøve. Skalalinje = 2 μm. (B) Den første rammen i en stabel med bilder av fargede lysosomer i en levende celle, ervervet med de riktige parametrene. Temporal oppløsning: 65 ms/ramme. Skalastang = 2 μm. (C) Den første rammen av en stabel med bilder av fargede lysosomer i en levende celle, anskaffet ved lav hastighet: artefaktuell deformasjon av den tilsynelatende lysosomestørrelsen på grunn av organellebevegelse under avbildning er synlig. Temporal oppløsning: 10 s/ramme. Skalalinje = 2 μm. (D) Eksempel på størrelsesberegning for avbildet lysosomer i en blå avkastning på (A), (B) og (C). Intensitetsprofilen langs den blå linjen var utstyrt med en gaussisk funksjon for å hente FWHM, det vil si et estimat av spotstørrelse. FWHM-verdier rapporteres for hver tilpasning. (E) Grafisk fremstilling av størrelsesverdier oppnådd ved bildeanalyse beskrevet i panel (D) for alle avbildet lysosomer (svart firkant, gjennomsnittsverdi og standardavvik), for lysosomer innelukket i den blå avkastningen (blå trekant), og hentet av iMSD-analyse (rød sirkel). Dette tallet er fra 22. Forkortelser: AVKASTNING = interesseområde; FWHM = full bredde ved halv maksimum; iMSD = avbildningsavledet gjennomsnittlig kvadratisk forskyvning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Tidsutvikling av merkede organeller. (A) Plott av iMSD-utvunnet størrelsesverdier vs. tidsprogresjon av etterfølgende oppkjøp representert som et gjennomsnitt av målte verdier i oppkjøp utført på et 10-minutters tidsvindu. Til venstre, progressiv reduksjon i gjennomsnittlig størrelse på makropinosomer (svarte sirkler) og til høyre, den tidsinvariante størrelsen på insulin sekretoriske granulater (svarte firkanter) sammenlignet med lysosomer, representert som gjennomsnittlig størrelsesverdi (tykkere rød linje) ± standardavvik (stiplede røde linjer). (B) og (C) Tidsprogresjon av Dm og α koeffisienter for makropinosomer (venstre) og insulingranulat (høyre) ekstrahert ved iMSD-analyse. (D) Tidsutvikling av antall merkede makropinosomer og insulingranulat målt i den første rammen av hver ervervet tidsforløpfilm. Forkortelser: iMSD = bildebehandling-avledet gjennomsnittlig kvadratisk forskyvning; α = uregelmessig diffusjonskoeffisient; Dm = lokal diffusivitet, N = tall. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Organelle | Merking | Cellelinje | Størrelse (nm) | Dm ( × 10-3 μm2/s) | α | N | Ref. | ||
| Tidlig endosome (EE) | CellLight Tidlig Endosome GFP | Hela | 395±74 | 3.0±2.4 | 1.02±0.20 | 40 | 10 | ||
| Sen endosome (LE) | CellLight sen endosome GFP | Hela | 693±102 | 15.4±10.6 | 0.57±0.16 | 58 | 10 | ||
| Lysosom (LY) | LysoTracker DND-99 | Hela | 471±76 | 15.3±9.0 | 0.49±0.13 | 143 | 10, 14 | ||
| Caveola (CAV) | Caveolin-EGFP | Hela | 405±49 | 3.1±1.8 | 1.00±0.22 | 15 | 10 | ||
| Klarinbelagt vescicle (CCV) | Transferrin-Alexa 488 | Hela | 513±62 | 16.2±9.9 | 0.48±0.17 | 33 | 10 | ||
| Insulingranulat (IG) | C-peptid-EGFP | INS-1E | 335±56 | 3.0±1.7 | 0.70±0.14 | 107 | 11 | ||
| Tidlig makropinosom (EMCR) | Fluorescein-Dextran 70 kDa | Hela | 979±423 | 8.3±9 | 0.79±0.27 | 36 | 10 | ||
| Mellomliggende makropinosom (IMCR) | Fluorescein-Dextran 70 kDa | Hela | 702±180 | 13.7±19.9 | 0.60±0.38 | 29 | 10 | ||
| Sen makropinosom (LMCR) | Fluorescein-Dextran 70 kDa | Hela | 592±127 | 5.8±4.7 | 0.39±0.21 | 21 | 10 | ||
Tabell 1: Strukturelle og dynamiske iMSD-utpakkede parametere. Tabellen viser verdiene for størrelse, Dm og α koeffisient målt for ulike organeller, angivelse av merkingsstrategier, cellelinjen som brukes, og antall analyserte anskaffelser. Verdier rapporteres som gjennomsnittlig ± standardavvik. Forkortelser: iMSD = bildebehandling-avledet gjennomsnittlig kvadratisk forskyvning; α = uregelmessig diffusjonskoeffisient; Dm = lokal diffusivitet, N = tall; GFP = grønt fluorescerende protein; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein.
Tilleggsfil 1: Detaljer om iMSD-sporavledning og analyse. Klikk her for å laste ned denne filen.
Støttefil 1: Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Egenskapene og fordelene ved iMSD er tydelige sammenlignet med teknikkene som er tilgjengelige for å hente analog informasjon. For strukturell informasjon er det foretrukne valget transmisjonselektronmikroskopianalyse (TEM). Ved denne metoden kan ultrastrukturelle detaljer ved molekylær oppløsning og til og med utover hentes, selv for subcellulære nanostrukturer. Likevel oppnås den særegne romlige oppløsningen av TEM på bekostning av informasjonen i den tidsmessige dimensjonen, som er av interesse her. For å kompensere for dette er de siste fremskrittene innen live-celle bildeteknologier av spesiell interesse. Disse inkluderer nye fluorescerende markører med økt ytelse (f.eks. lysstyrke og fotostabilitet), optimaliserte merkingsprosedyrer og mer følsomme detektorer. I tillegg er analytiske verktøy tilgjengelige for å adressere både strukturelle (f.eks. "størrelse" ved fasorbasert analyse av lokal bildekorrelasjonsspektroskopi, PLICS23, aggregering/oligomerisering etter tall-/lysstyrkeanalyse24) og dynamisk (f.eks. diffusjonslov ved enkeltpartikkelsporing, dvs. ) parametere på den subcellulære skalaen. SPT-metoden gir direkte tilgang til objektbanen og dens MSD. Ulempen er imidlertid behovet for en lav tetthet av sonden og svært lyse etiketter og mange enkeltobjektbaner som skal måles for å tilfredsstille statistiske kriterier. Med hensyn til den tidsmessige oppløsningen til målingen, kan uorganiske, fotostable sonder (f.eks. kvanteprikker eller metallnanopartikler) øke SPT-ytelsen, men på bekostning av komplekse produksjons- og merkingsprosedyrer.
Sammenlignet med disse standardene viser iMSD-metoden som er beskrevet her noen viktige fordeler. For det første kan denne tilnærmingen brukes sammen med relativt svake fluorescerende koder, for eksempel genetisk kodede fluorescerende proteiner (f.eks. applikasjonen til ISG). Således, sammenlignet med SPT, oppnås en høyere temporal oppløsning (ved hjelp av samme etikett) på grunn av den lavere mengden fotoner som kreves8. For det andre er iMSD-metoden begrenset bare av temporal oppløsning, men ikke diffraksjon. Faktisk, til tross for diffraksjonsbegrenset optisk oppsett som brukes, kan gjennomsnittlige molekylære forskyvninger selv under diffraksjonsgrensen måles, som allerede demonstrert for molekylære strømmer ved hjelp av STICS29. Den faktiske oppløsningen i måling av forskyvninger avhenger av hvor nøyaktig (når det gjelder signal til støy) korrelasjonsfunksjonen kan måles, og forklarer dermed hvorfor den ikke er begrenset av diffraksjon. Dermed ser det klart at minimumsforskyvningen som kan måles, avhenger av diffusiviteten til gjenstanden av interesse og den tidsmessige oppløsningen til bildeoppsettet.
I denne forbindelse er det viktig å vurdere at anvendelsen på subcellulære nanostrukturer, for eksempel makropinosomer eller insulingranulat, med et laserskanningsmikroskop er optimal: skannehastigheten som er tilgjengelig, er betydelig høyere enn dynamikken i objektet av interesse. I et slikt tilfelle er bevegelsen av objektene under oppkjøpet ubetydelig, og korrelasjonsfunksjonen kan tilnærmes av en gaussisk funksjon. Til slutt kan iMSD-tilnærmingen enkelt brukes på et bredt spekter av kommersielle optiske mikroskopioppsett basert på rasterskanning eller vidfeltkamerabasert bildebehandling, uten behov for systemkalibrering (kreves bare hvis et nøyaktig estimat av partikkelstørrelse må oppnås). En viktig parameter for at metoden skal fungere er riktig romlig prøvetaking. Som en generell regel, for å nå tilfredsstillende konvergens av tilpasningsalgoritmen, bør minimumsstørrelsen på interesseområdet for avbildning være minst 3 ganger større enn maksimal forskyvning av interesse.
Til slutt krever iMSD-metoden bare et mikroskop utstyrt for rask oppkjøp. Strukturen av interesse kan merkes til enhver genetisk kodet eller organisk fluorofor, og dermed muliggjør flerkanalsavbildning. Det er tenkt at kryss-iMSD-analyse vil bli brukt i nær fremtid for å velge subpopulasjoner av subcellulære nanostrukturer og avsløre deres interaksjoner og ko-diffusjon i cellen, sistnevnte er et hett tema i cellulær biofysikk. Hvis noen detaljer går tapt ved iMSD-analyse, er dette absolutt relatert til den store mengden molekylær informasjon innen dynamiske subcellulære nanostrukturer. Slik informasjon er uunngåelig gjennomsnittet ut under målingen på grunn av dårlig temporal oppløsning. Teoretisk sett er det imidlertid ingen teknisk grense på grunn av muligheten til å hente molekylær informasjon, forutsatt at tilstrekkelige anskaffelseshastigheter kan oppnås8. På grunn av de kontinuerlige forbedringene i detektorhastighet / følsomhet og bildeteknologi, er det tenkt at informasjon om hele undercellerommet og dets molekylære bestanddeler vil bli hentet fra et enkelt datasett.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt å erklære.
Acknowledgments
Dette arbeidet har fått støtte fra Det europeiske forskningsrådet (ERC) under EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horisont 2020 (tilskuddsavtale Nr. 866127, prosjekt CAPTUR3D).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Cell medium supplement |
| C-peptide-EGFP | Plasmid | ||
| DMEM High Glucose | Gibco | 31053028 | Cell medium (HeLa) |
| FBS | Gibco | 10082147 | Cell medium supplement |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma Aldrich | 46945-100MG-F | Reagent |
| HeLa | ATCC | CCL-61 | Cell Line |
| Lipofectamine 2000 | TermoFisher | 11668019 | Trasfection reagent |
| Lysotracker Red DND-99 | Gibco | L7528 | Reagent |
| Matlab | MathWork | Software | |
| Microscope-suitable cell dishes | Willco | GWSt-3522 | Petri dishes |
| Olympus FV1000 | Olympus Japan | Confocal microscope | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11835063 | Cell medium (INS-1E) |
References
- Murphy, J. E., Padilla, B. E., Hasdemir, B., Cottrell, G. S., Bunnett, N. W. Endosomes: a legitimate platform for the signaling train. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17615-17622 (2009).
- Mosesson, Y., Mills, G. B., Yarden, Y. Derailed endocytosis: an emerging feature of cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (11), 835-850 (2008).
- Mellman, I., Yarden, Y.
- Di Fiore, P. P. Endocytosis, signaling and cancer, much more than meets the eye. Preface. Molecular Oncology. 3 (4), 273-279 (2009).
- Bogan, J. S., Xu, Y., Hao, M. Cholesterol accumulation increases insulin granule size and impairs membrane trafficking. Traffic. 13 (11), 1466-1480 (2012).
- Ballabio, A., Gieselmann, V. Lysosomal disorders: From storage to cellular damage. Biochimica et Biophysica Acta. 1793 (4), 684-696 (2009).
- Hu, Y. -B., Dammer, E. B., Ren, R. -J., Wang, G. The endosomal-lysosomal system: from acidification and cargo sorting to neurodegeneration. Translational Neurodegeneration. 4, 18 (2015).
- Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Spatiotemporal fluctuation analysis: a powerful tool for the future nanoscopy of molecular processes. Biophysical Journal. 111 (4), 679-685 (2016).
- Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Fast spatiotemporal correlation spectroscopy to determine protein lateral diffusion laws in live cell membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12307-12312 (2013).
- Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51994 (2014).
- Digiacomo, L., et al. Dynamic fingerprinting of sub-cellular nanostructures by image mean square displacement analysis. Scientific Reports. 7 (1), 14836 (2017).
- Durso, W., et al. Lysosome dynamic properties during neuronal stem cell differentiation studied by spatiotemporal fluctuation spectroscopy and organelle tracking. International Journal of Molecular Sciences. 21 (9), 3397 (2020).
- Ferri, G., et al. Insulin secretory granules labelled with phogrin-fluorescent proteins show alterations in size, mobility and responsiveness to glucose stimulation in living β-cells. Scientific Reports. 9 (1), 2890 (2019).
- Durso, W., D'Autilia, F., Amodeo, R., Marchetti, L., Cardarelli, F. Probing labeling-induced lysosome alterations in living cells by imaging-derived mean squared displacement analysis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2704-2709 (2018).
- Digiacomo, L., Digman, M. A., Gratton, E., Caracciolo, G. Development of an image Mean Square Displacement (iMSD)-based method as a novel approach to study the intracellular trafficking of nanoparticles. Acta Biomaterialia. 42, 189-198 (2016).
- Swanson, J. A., Watts, C.
- Jones, A. T. Macropinocytosis: searching for an endocytic identity and role in the uptake of cell penetrating peptides. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 670-684 (2007).
- Falcone, S., et al. Macropinocytosis: regulated coordination of endocytic and exocytic membrane traffic events. Journal of Cell Science. 119, Pt 22 4758-4769 (2006).
- Kerr, M. C., et al. Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins. Journal of Cell Science. 119, Pt 19 3967-3980 (2006).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Di Rienzo, C., Piazza, V., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Probing short-range protein Brownian motion in the cytoplasm of living cells. Nature Communications. 5 (1), 5891 (2014).
- Ferri, G., et al. Time-lapse confocal imaging datasets to assess structural and dynamic properties of subcellular nanostructures. Scientific Data. 5 (1), 180191 (2018).
- Scipioni, L., Gratton, E., Diaspro, A., Lanzanò, L. Phasor analysis of local ICS detects heterogeneity in size and number of intracellular vesicles. Biophysical Journal. 111 (3), 619-629 (2016).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
- Li, C. H., Bai, L., Li, D. D., Xia, S., Xu, T. Dynamic tracking and mobility analysis of single GLUT4 storage vesicle in live 3T3-L1 cells. Cell Research. 14 (6), 480-486 (2004).
- Donovan, K. W., Bretscher, A. Tracking individual secretory vesicles during exocytosis reveals an ordered and regulated process. Journal of Cell Biology. 210 (2), 181-189 (2015).
- Westphal, V., et al. Video-rate far-field optical nanoscopy dissects synaptic vesicle movement. Science. 320 (5873), 246-249 (2008).
- Tabei, S. M. A., et al. Intracellular transport of insulin granules is a subordinated random walk. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 4911-4916 (2013).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
