इमेजिंग-व्युत्पन्न माध्य वर्ग विस्थापन (iMSD) विश्लेषण संरचनात्मक और गतिशील गुणों के संदर्भ में उनके आंतरिक समय-विकसित प्रकृति को उजागर करने के लिए मैक्रोपिनोसोम पर लागू किया जाता है। मैक्रोपिनोसोम की तुलना इंसुलिन स्रावी कणिकाओं (आईएसजी) से की जाती है, जो समय-अपरिवर्तनीय औसत संरचनात्मक / गतिशील गुणों के साथ उपकोशिकीय संरचनाओं के लिए एक संदर्भ के रूप में होती है।
इमेजिंग-व्युत्पन्न माध्य वर्ग विस्थापन (आईएमएसडी) का उपयोग उपकोशिकीय नैनोस्ट्रक्चर के संरचनात्मक और गतिशील गुणों को संबोधित करने के लिए किया जाता है, जैसे कि विलेय और बायोमोलेक्यूल्स के एंडो / एक्सोसाइटोटिक तस्करी में शामिल पुटिकाएं। iMSD मानक समय-चूक इमेजिंग पर निर्भर करता है, किसी भी ऑप्टिकल सेटअप के साथ संगत है, और प्रक्षेपवक्र निकालने के लिए एकल वस्तुओं पर ध्यान देने की आवश्यकता नहीं है। प्रत्येक iMSD ट्रेस से, औसत संरचनात्मक और गतिशील मापदंडों (यानी, आकार, स्थानीय विसरणशीलता, असंगत गुणांक) का एक अद्वितीय त्रिक गणना की जाती है और अध्ययन के तहत नैनोस्ट्रक्चर के “आईएमएसडी हस्ताक्षर” का निर्माण करने के लिए संयुक्त किया जाता है।
इस दृष्टिकोण की शक्ति यहां मैक्रोपिनोसोम के अनुकरणीय मामले के साथ साबित हुई है। ये पुटिकाएं समय में विकसित होती हैं, उनके औसत आकार, संख्या और गतिशील गुणों को बदलते हैं जो इंट्रासेल्युलर तस्करी के शुरुआती से देर से चरणों तक गुजरती हैं। एक नियंत्रण के रूप में, इंसुलिन स्रावी कणिकाओं (आईएसजी) का उपयोग उपकोशिकीय संरचनाओं के लिए एक संदर्भ के रूप में किया जाता है जो एक स्थिर स्थिति में रहते हैं जिसमें वस्तुओं की पूरी आबादी के औसत संरचनात्मक और गतिशील गुण समय में अपरिवर्तनीय होते हैं। आईएमएसडी विश्लेषण इन अजीब विशेषताओं को मात्रात्मक रूप से उजागर करता है और उप-सेलुलर स्तर पर समान अनुप्रयोगों का मार्ग प्रशस्त करता है, दोनों शारीरिक और रोग संबंधी राज्यों में।
उपकोशिकीय nanostructures (जैसे, एंडोसाइटिक / स्रावी पुटिकाओं, ऑर्गेनेल) सेल-सिग्नलिंग विनियमन1 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। उनके संरचनात्मक (जैसे, आकार) और / या गतिशील (जैसे, विसरणशीलता) विशेषताओं की उचित ट्यूनिंग यह निर्धारित करती है कि सेल आंतरिक या बाहरी उत्तेजनाओं के लिए कैसे प्रतिक्रिया करता है 2,3,4। इस सबूत के आधार पर, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि इन विशेषताओं के परिवर्तन कई रोग स्थितियों में पाए जाते हैं। उदाहरणों में कैंसर 2,3 में गलत तरीके से एंडोसाइटोसिस की भूमिका शामिल है, टाइप -2 मधुमेह की स्थिति के संपर्क में आने वाली β-कोशिकाओं में आईएसजी के स्तर पर पाए जाने वाले संरचनात्मक और गतिशील परिवर्तन, ग्लोबोइड-सेल ल्यूकोडिस्ट्रोफी या गैलेक्टोसिलसेरामाइड लिपिडोसिस6 में लाइसोसोमल संरचनात्मक और परिवहन गुणों का गलत विनियमन, और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों (जैसे, अल्जाइमर रोग) में एंडो-लाइसोसोमल मार्ग में शिथिलताएं (जैसे, अल्जाइमर रोग)7।
इस संदर्भ में, शोधकर्ताओं ने हाल ही में साबित किया है कि मानक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी विधियों के प्रदर्शन को स्थानिक और अस्थायी नमूना संकल्प 8 को ठीक से ट्यून करके बढ़ाया जा सकताहै। यह, बदले में, प्रासंगिकता की जैविक प्रक्रियाओं में और अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। व्यवहार में, यह spatiotemporal उतार-चढ़ाव विश्लेषण के एक एल्गोरिथ्म द्वारा संभव बनाया गया है, जो एक साथ ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी छवियों के मानक स्टैक से सीधे वस्तुओं को अलग करने के औसत संरचनात्मक और गतिशील गुणों को निकालता है, बिना ब्याज की जैविक वस्तु पर प्रारंभिक ज्ञान की आवश्यकता के बिना और एकल-वस्तु प्रक्षेपवक्र के निष्कर्षण। यह सभी जानकारी विधि के एक एकल आउटपुट में संलग्न है: एक iMSD ट्रेस9 (iMSD ट्रेस व्युत्पत्ति और विश्लेषण पर विवरण पूरक फ़ाइल 1 में दिए गए हैं)।
परिणामी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में कुछ चरण होते हैं। सबसे पहले, ब्याज के क्षेत्र की इमेजिंग उच्च अस्थायी संकल्प पर की जाती है। फिर, औसत स्थानिक-अस्थायी सहसंबंध कार्यों की गणना छवियों के ढेर से की जाती है। अंत में, सहसंबंध कार्यों की श्रृंखला के गाऊसी फिटिंग द्वारा, औसत ‘प्रसार कानून’ सीधे इमेजिंग से प्राप्त किया जाता है और ऑब्जेक्ट प्रसार मोड को पहचानने के लिए विश्लेषण किया जाता है। विधि की क्षमता पहले से ही विभिन्न प्रकार की जैविक वस्तुओं के लिए साबित हो चुकी थी, जिसमें अणुओं से लेकर नैनोकणों और यहां तक कि पूरे उपकोशिकीय ऑर्गेनेल / संरचनाएं 9,10,11,12,13,14,15 शामिल थीं।
यह पेपर अपने औसत (यानी, पूरी आबादी के स्तर पर) संरचनात्मक और गतिशील गुणों के संदर्भ में अपने आंतरिक, अपरिवर्तनीय समय-विकसित प्रकृति को उजागर करने के लिए मैक्रोपिनोसोम के लिए आईएमएसडी एप्लिकेशन की रिपोर्ट करता है। इसके अलावा, इन एंडोसाइटिक पुटिकाओं की तुलना आईएसजी से एक ‘स्थिर राज्य’ में उपकोशिकीय संरचनाओं के संदर्भ के रूप में की जाती है, यानी, एक ऐसी स्थिति जिसमें दानों की पूरी आबादी के औसत संरचनात्मक / गतिशील गुण किसी भी समय स्थिर रहते हैं। Macropinocytosis प्लाज्मा झिल्ली के व्यापक पुनर्गठन (या ruffling) द्वारा शुरू की गई घटनाओं की एक श्रृंखला को परिभाषित करता है ताकि एक बाहरी मैक्रोपिनोसाइटिक संरचना बनाई जा सके जो तब आंतरिक16 होती है। गठित प्रारंभिक चरण मैक्रोपिनोसोम फागोसोम के समान हैं। उसी समय, उन्हें एंडोसाइटिक पुटिकाओं के अन्य रूपों से उनके विशेषता बड़े आकार, रूपात्मक विषमता और प्रोटीन-कोट संरचनाओं की कमी के कारण अलग किया जा सकता है।
जैव रासायनिक assays से पता चला है कि, internalization पर, macropinosomes उत्तरोत्तर अन्य एंडोसाइटिक मार्गों के प्रोटीन मार्करों के साथ समृद्ध हो जाते हैं, बदले में, यह सुझाव देते हुए कि तस्करी के दौरान उनकी पहचान लगातार बदल रही है17. एंडोसोमल मार्ग के ज्ञात मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए, यह प्रदर्शित किया गया था कि मैक्रोपिनोसोम उत्तरोत्तर शास्त्रीय एंडोसोमल विशेषताओं को अपनाते हैं: वे आकार में कम हो जाते हैं, देर से एंडोसाइटिक संरचनाओं (जैसे, लाइसोसोम) में विकसित होते हैं, या अंततः विशिष्ट आणविक मार्करों की झिल्ली-मध्यस्थता पुनर्प्राप्ति के माध्यम से अपनी पहचान खो देते हैं (उदाहरण के लिए, नेक्सिन को छँटाई करना)18,19 . समग्र परिदृश्य यह है कि सेल के भीतर हर एक मैक्रोपिनोसोम अपरिवर्तनीय रूप से प्लाज्मा झिल्ली से अपने अंतिम इंट्रासेल्युलर भाग्य तक तस्करी के दौरान अपनी संरचनात्मक और गतिशील (साथ ही आणविक) पहचान को बदलता है। नतीजतन, मैक्रोपिनोसोम की पूरी आबादी के संरचनात्मक / गतिशील / आणविक गुण भी एक ही अस्थायी पथ के साथ बदल रहे हैं। मनाया वस्तुओं की पूरी आबादी के औसत गुणों के लिए आंतरिक रूप से संवेदनशील होने के नाते, iMSD विधि मात्रात्मक रूप से प्रमुख औसत मापदंडों के परिमाणीकरण द्वारा ‘विकसित प्रकृति’ को दर्शाती है, यानी, स्थानीय विसरणशीलता और असंगत गुणांक (गतिशील गुण) और उनके इंट्रासेल्युलर तस्करी के किसी भी चरण में मैक्रोपिनोसोम (संरचनात्मक संपत्ति) का औसत आकार।
तुलना के लिए, इसी तरह के माप एक प्रसिद्ध इंट्रासेल्युलर झिल्ली-संलग्न संरचना, आईएसजी पर β-कोशिकाओं के एक मॉडल में किए गए थे। मैक्रोपिनोसोम की तरह, आईएसजी के संरचनात्मक और गतिशील गुणों का विनियमन, ट्रांस गोल्गी नेटवर्क (टीजीएन) में उनकी उत्पत्ति से प्लाज्मा झिल्ली पर उनके एक्सोसाइटोसिस तक, आईएसजी फ़ंक्शन20 के उचित निष्पादन के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, मैक्रोपिनोसोम के विपरीत, आईएसजी एक ‘स्थिर राज्य’ में रहते हैं, जिसमें किसी भी समय, आईएसजी जीवनकाल के सभी कार्यात्मक / संरचनात्मक / आणविक चरण एक साथ सेल के भीतर मौजूद होते हैं, और प्रत्येक को आईएसजी की एक विशिष्ट उप-आबादी द्वारा दर्शाया जाता है। इसका मतलब यह है कि हालांकि हर एक ग्रेन्युल अपरिवर्तनीय रूप से बायोजेनेसिस से स्राव तक विकसित होता है, दानों की पूरी आबादी के औसत संरचनात्मक / गतिशील गुणों को किसी भी समय स्थिर रहने की उम्मीद है (जब तक कि स्थिर राज्य की स्थिति को नहीं बदला जाता है, उदाहरण के लिए, बाहरी उत्तेजनाओं जैसे ग्लूकोज, कोलेस्ट्रॉल और साइटोकिन्स13)। यह आईएमएसडी विश्लेषण द्वारा पुष्टि की जाती है।
समान जानकारी को पुनः प्राप्त करने के लिए उपलब्ध तकनीकों की तुलना में आईएमएसडी के गुण और फायदे स्पष्ट हैं। संरचनात्मक जानकारी के लिए, पसंदीदा विकल्प संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) विश्लेषण है। इस विधि द्वारा, आणविक संकल्प और उससे परे भी अल्ट्रास्ट्रक्चरल विवरणों को पुनः प्राप्त किया जा सकता है, यहां तक कि उपकोशिकीय नैनोस्ट्रक्चर के लिए भी। फिर भी, टीईएम का अजीब स्थानिक संकल्प अस्थायी आयाम में जानकारी की कीमत पर प्राप्त किया जाता है, जो यहां ब्याज का है। इसकी भरपाई करने के लिए, लाइव-सेल इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में हाल ही में हुई प्रगति विशेष रुचि की है। इनमें बढ़े हुए प्रदर्शन (जैसे, चमक और फोटोस्टेबिलिटी), अनुकूलित लेबलिंग प्रक्रियाओं और अधिक संवेदनशील डिटेक्टरों के साथ नए फ्लोरोसेंट मार्कर शामिल हैं। इसके अलावा, विश्लेषणात्मक उपकरण दोनों संरचनात्मक (उदाहरण के लिए, स्थानीय छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी के फैसर-आधारित विश्लेषण द्वारा ‘आकार’, PLICS23, संख्या और चमक विश्लेषण24 द्वारा एकत्रीकरण / oligomerization) और गतिशील (उदाहरण के लिए, एकल-कण ट्रैकिंग द्वारा प्रसार कानून, यानी, (एसपीटी) 25,26,27,28 को संबोधित करने के लिए उपलब्ध हैं ) उपकोशिकीय पैमाने पर पैरामीटर। एसपीटी विधि ऑब्जेक्ट प्रक्षेपवक्र और इसके एमएसडी तक सीधी पहुंच प्रदान करती है। हालांकि, नुकसान जांच के कम घनत्व और बहुत उज्ज्वल लेबल और कई एकल-वस्तु प्रक्षेपवक्रों की आवश्यकता है जिन्हें सांख्यिकीय मानदंडों को पूरा करने के लिए मापा जाना चाहिए। माप के अस्थायी संकल्प के संबंध में, अकार्बनिक, फोटोटेबल जांच (जैसे, क्वांटम डॉट्स या धातु नैनोकणों) एसपीटी प्रदर्शन को बढ़ा सकते हैं, लेकिन जटिल उत्पादन और लेबलिंग प्रक्रियाओं की कीमत पर।
इन मानकों की तुलना में, यहां वर्णित iMSD विधि कुछ प्रमुख फायदे दिखाती है। सबसे पहले, इस दृष्टिकोण का उपयोग अपेक्षाकृत मंद फ्लोरोसेंट टैग के साथ संयोजन के रूप में किया जा सकता है, जैसे कि आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन (उदाहरण के लिए, आईएसजी के लिए आवेदन)। इस प्रकार, एसपीटी की तुलना में, आवश्यक फोटॉनों की कम मात्रा के कारण एक उच्च अस्थायी संकल्प (एक ही लेबल का उपयोग करके) प्राप्त किया जाताहै। दूसरा, आईएमएसडी विधि केवल अस्थायी संकल्प द्वारा सीमित है लेकिन विवर्तन नहीं है। वास्तव में, उपयोग किए गए विवर्तन-सीमित ऑप्टिकल सेटअप के बावजूद, विवर्तन सीमा से नीचे भी औसत आणविक विस्थापन को मापा जा सकता है, जैसा कि पहले से ही एसटीआईसीएस29 का उपयोग करके आणविक प्रवाह के लिए प्रदर्शित किया गया है। विस्थापन के मापन में वास्तविक संकल्प इस बात पर निर्भर करता है कि सहसंबंध फ़ंक्शन को कितनी सटीकता से (शोर के संकेत के संदर्भ में) मापा जा सकता है, इस प्रकार यह समझाते हुए कि यह विवर्तन द्वारा सीमित क्यों नहीं है। इस प्रकार, यह स्पष्ट प्रतीत होता है कि न्यूनतम विस्थापन जिसे मापा जा सकता है, ब्याज की वस्तु की विसरणशीलता और इमेजिंग सेटअप के अस्थायी संकल्प पर निर्भर करता है।
इस संबंध में, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के साथ मैक्रोपिनोसोम या इंसुलिन ग्रैन्यूल्स जैसे उपकोशिकीय नैनोस्ट्रक्चर के लिए आवेदन इष्टतम है: उपलब्ध स्कैनिंग गति ब्याज की वस्तु की गतिशीलता की तुलना में काफी अधिक है। ऐसे मामले में, अधिग्रहण के दौरान वस्तुओं का आंदोलन नगण्य है, और सहसंबंध फ़ंक्शन को गॉसियन फ़ंक्शन द्वारा अनुमानित किया जा सकता है। अंत में, आईएमएसडी दृष्टिकोण को आसानी से रैस्टर स्कैन या वाइड-फील्ड कैमरा-आधारित इमेजिंग के आधार पर वाणिज्यिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी सेटअप की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है, जिसमें सिस्टम अंशांकन की कोई आवश्यकता नहीं है (केवल तभी आवश्यक है जब कण आकार का सटीक अनुमान प्राप्त करने की आवश्यकता हो)। काम करने के लिए विधि के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर उचित स्थानिक नमूनाकरण है। एक सामान्य नियम के रूप में, फिटिंग एल्गोरिथ्म के संतोषजनक अभिसरण तक पहुंचने के लिए, इमेजिंग के लिए ब्याज के क्षेत्र का न्यूनतम आकार ब्याज के अधिकतम विस्थापन से कम से कम 3 गुना बड़ा होना चाहिए।
अंत में, iMSD विधि को केवल तेजी से अधिग्रहण के लिए सुसज्जित माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है। ब्याज की संरचना को किसी भी आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड या कार्बनिक फ्लोरोफोर को टैग किया जा सकता है, इस प्रकार मल्टीचैनल इमेजिंग को सक्षम किया जा सकता है। यह कल्पना की गई है कि क्रॉस-आईएमएसडी विश्लेषण का उपयोग निकट भविष्य में उपकोशिकीय नैनोस्ट्रक्चर की उप-आबादी का चयन करने और सेल के भीतर उनकी बातचीत और सह-प्रसार को प्रकट करने के लिए किया जाएगा, बाद में सेलुलर बायोफिज़िक्स में एक गर्म विषय है। यदि कोई विवरण आईएमएसडी विश्लेषण द्वारा खो जाता है, तो यह निश्चित रूप से गतिशील उपकोशिकीय नैनोस्ट्रक्चर के भीतर आणविक जानकारी की बड़ी मात्रा से संबंधित है। इस तरह की जानकारी अनिवार्य रूप से खराब अस्थायी संकल्प के कारण माप के दौरान औसत है। सैद्धांतिक रूप से, हालांकि, आणविक जानकारी को पुनः प्राप्त करने की संभावना के कारण कोई तकनीकी सीमा नहीं है, बशर्ते कि पर्याप्त अधिग्रहणगति प्राप्त की जा सके। डिटेक्टर गति / संवेदनशीलता और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में निरंतर सुधार के कारण, यह कल्पना की जाती है कि पूरे उपकोशिकीय डिब्बे और इसके आणविक घटकों के बारे में जानकारी एक ही डेटासेट से निकाली जाएगी।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (अनुदान समझौता नहीं 866127, परियोजना CAPTURE3D) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ERC) से धन प्राप्त हुआ है।
100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Cell medium supplement |
C-peptide-EGFP | Plasmid | ||
DMEM High Glucose | Gibco | 31053028 | Cell medium (HeLa) |
FBS | Gibco | 10082147 | Cell medium supplement |
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma Aldrich | 46945-100MG-F | Reagent |
HeLa | ATCC | CCL-61 | Cell Line |
Lipofectamine 2000 | TermoFisher | 11668019 | Trasfection reagent |
Lysotracker Red DND-99 | Gibco | L7528 | Reagent |
Matlab | MathWork | Software | |
Microscope-suitable cell dishes | Willco | GWSt-3522 | Petri dishes |
Olympus FV1000 | Olympus Japan | Confocal microscope | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835063 | Cell medium (INS-1E) |