Summary
Этот протокол описывает, как использовать систему микробной микробной культуры (MMC) для проведения автоматизированного культивирования микробов и адаптивной эволюции. MMC может культивировать и субкультурировать микроорганизмы автоматически и непрерывно и отслеживать их рост в режиме онлайн с относительно высокой пропускной способностью и хорошим распараллеливанием, снижая потребление труда и реагентов.
Abstract
Обычные методы культивирования микробов обычно имеют громоздкие операции, низкую пропускную способность, низкую эффективность и большое потребление труда и реагентов. Кроме того, высокопроизводительные методы культивирования на основе микропластин, разработанные в последние годы, имеют плохой статус роста микробов и распараллеливание эксперимента из-за их низкого содержания растворенного кислорода, плохой смеси и сильного испарения и теплового эффекта. Благодаря многим преимуществам микрокапелей, таким как небольшой объем, высокая пропускная способность и сильная управляемость, микрофлюидная технология на основе капель может преодолеть эти проблемы, которая использовалась во многих видах исследований высокопроизводительного микробного культивирования, скрининга и эволюции. Однако большинство предшествующих исследований остаются на стадии лабораторного строительства и применения. Некоторые ключевые проблемы, такие как высокие эксплуатационные требования, высокая сложность строительства и отсутствие технологии автоматизированной интеграции, ограничивают широкое применение капельной микрофлюидной технологии в микробных исследованиях. Здесь была успешно разработана автоматизированная система микробной микробной культуры (MMC) на основе капельной микрофлюидной технологии, обеспечивающая интеграцию таких функций, как посев, культивирование, онлайн-мониторинг, субкультурирование, сортировка и отбор проб, необходимые для процесса культивирования микробных капель. В этом протоколе в качестве примеров были взяты Escherichia coli дикого типа (E. coli) MG1655 и метанол-эссенциальный штамм E. coli (MeSV2.2), чтобы представить, как использовать MMC для проведения автоматизированного и относительно высокопроизводительного микробного культивирования и адаптивной эволюции в деталях. Этот метод прост в эксплуатации, потребляет меньше труда и реагентов, а также имеет высокую экспериментальную пропускную способность и хорошую параллельность данных, что имеет большие преимущества по сравнению с обычными методами культивирования. Он обеспечивает недорогую, удобную в эксплуатации и надежную экспериментальную платформу для научных исследователей для проведения соответствующих микробных исследований.
Introduction
Культивирование микроорганизмов является важной основой для микробиологических научных исследований и промышленного применения, которое широко используется в выделении, идентификации, реконструкции, скрининге и эволюции микроорганизмов 1,2,3. Обычные методы культивирования микробов в основном используют пробирки, колбы для встряхивания и твердые пластины в качестве контейнеров для культивирования в сочетании с встряхивающими инкубаторами, спектрофотометрами, считывателями микропластин и другим оборудованием для культивирования, обнаружения и скрининга микробов. Однако эти методы имеют много проблем, таких как громоздкие операции, низкая пропускная способность, низкая эффективность и большое потребление труда и реагентов. Высокопроизводительные методы культивирования, разработанные в последние годы, в основном основаны на микропластине. Но микропластина имеет низкий уровень растворенного кислорода, плохие перемешивающие свойства, а также сильное испарение и тепловое воздействие, которые часто приводят к плохому состоянию роста и экспериментальному распараллеливанию микроорганизмов 4,5,6,7; с другой стороны, он должен быть оснащен дорогостоящим оборудованием, таким как рабочие станции для обработки жидкостей и считыватели микропластин, для достижения автоматизированного выращивания и обнаружения процессов 8,9.
Как важная отрасль микрофлюидной технологии, капельная микрофлюидика была разработана в последние годы на основе традиционных микрофлюидных систем непрерывного потока. Это дискретная проточная микрофлюидная технология, которая использует две несмешивающиеся жидкие фазы (обычно масло-вода) для генерации дисперсных микрокапелей и работы на них10. Поскольку микрокапли имеют характеристики малого объема, большой удельной площади поверхности, высокой внутренней скорости массопереноса и отсутствия перекрестного загрязнения, вызванного компартментализацией, а также преимущества сильной управляемости и высокой пропускной способности капель, было проведено много видов исследований с применением микрофлюидной технологии капель в высокопроизводительном культивировании, скрининге и эволюции микроорганизмов11 . Тем не менее, все еще существует ряд ключевых проблем, чтобы сделать микрофлюидную технологию капель популяризированной и широко применяемой. Во-первых, работа капельной микрофлюидики громоздка и сложна, что приводит к высоким техническим требованиям к операторам. Во-вторых, капельная микрофлюидная технология сочетает в себе оптические, механические и электрические компоненты и должна быть связана со сценариями применения биотехнологии. Одной лаборатории или команде трудно построить эффективные системы микрофлюидного контроля капель, если нет междисциплинарного сотрудничества. В-третьих, из-за небольшого объема микрокапли (от пиколитра (pL) до микролитра (μL)) требуется много трудностей для реализации точного автоматизированного управления и онлайн-обнаружения капель в режиме реального времени для некоторых основных микробных операций, таких как субкультуризация, сортировка и отбор проб, а также трудно построить интегрированную систему оборудования12.
Для решения вышеуказанных проблем была успешно разработана автоматическая система микробной микрокапельной культуры (MMC) на основе капельной микрофлюидной технологии13. MMC состоит из четырех функциональных модулей: модуля распознавания капель, модуля обнаружения спектра капель, модуля микрофлюидного чипа и модуля выборки. Благодаря системной интеграции и управлению всеми модулями точно устанавливается автоматизированная система управления, включая генерацию, культивирование, измерение (оптическая плотность (OD) и флуоресценция), расщепление, слияние, сортировку капель, достигая интеграции таких функций, как посев, культивирование, мониторинг, субкультурирование, сортировка и отбор проб, необходимые для процесса выращивания микробных капель. MMC может вмещать до 200 реплицированных единиц выращивания капель объемом 2-3 мкл, что эквивалентно 200 единицам культивирования колбы. Система культивирования микрокаплет может удовлетворять требованиям к незагрязнению, растворенному кислороду, смешиванию и массо-энергетическому обмену во время роста микроорганизмов и удовлетворять различные потребности микробных исследований с помощью многочисленных интегрированных функций, например, измерения кривой роста, адаптивной эволюции, однофакторного многоуровневого анализа и исследования и анализа метаболитов (на основе обнаружения флуоресценции)13,14.
Здесь протокол подробно описывает, как использовать MMC для проведения автоматизированного и микробного культивирования и адаптивной эволюции (рисунок 1). Мы взяли кишечную палочку дикого типа (E. coli) MG1655 в качестве примера, чтобы продемонстрировать измерение кривой роста и метанол-эссенциальный штамм E. coli MeSV2.215, чтобы продемонстрировать адаптивную эволюцию в MMC. Было разработано операционное программное обеспечение для MMC, которое делает операцию очень простой и понятной. Во всем процессе пользователю необходимо приготовить исходный раствор бактерий, установить условия MMC, а затем ввести раствор бактерий и связанные с ним реагенты в MMC. Впоследствии MMC будет автоматически выполнять такие операции, как генерация капель, распознавание и нумерация, культивирование и адаптивная эволюция. Он также будет выполнять онлайн-обнаружение (OD и флуоресценция) капель с высоким временным разрешением и отображать соответствующие данные (которые могут быть экспортированы) в программном обеспечении. Оператор может остановить процесс культивирования в любое время в соответствии с результатами и извлечь целевые капли для последующих экспериментов. MMC прост в эксплуатации, потребляет меньше труда и реагентов, а также имеет относительно высокую экспериментальную пропускную способность и хорошую параллель данных, что имеет значительные преимущества по сравнению с обычными методами культивирования. Он обеспечивает недорогую, удобную в эксплуатации и надежную экспериментальную платформу для исследователей для проведения соответствующих микробных исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Установка приборов и программного обеспечения
- Выберите чистую и стерильную среду (например, чистую скамейку) в качестве выделенного постоянного пространства для MMC. Установите MMC стабильно в пространстве.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите MMC подальше от помех сильных электрических полей, магнитных полей и источников сильного теплового излучения. Избегайте сильной вибрации, влияющей на оптические компоненты обнаружения. Обеспечьте питание переменного тока AC220 В, 50 Гц для MMC. Для получения подробной информации о MMC обратитесь к Таблице материалов и веб-сайту MMC16. - Установите операционное программное обеспечение из файла MMC.zip
ПРИМЕЧАНИЕ: Свяжитесь с авторами для получения файла MMC.zip.- Создайте выделенную папку и сохраните в ней zip-файл.
- Создайте еще одну выделенную папку в виде "Каталог установки". Распакуйте консоль MMC.zip и сохраните файлы в новой папке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конфигурация компьютера лучше всего подходит: (1) 64-разрядная операционная система Windows 7 или выше; (2) Процессор: i5 или выше; (3) память: 4 ГБ или выше; (4) жесткий диск: 300 ГБ или выше (скорость вращения более 7200 об/мин или твердотельный диск).
2. Препараты
- Соедините шприцевую иглу (внутренний диаметр 0,41 мм, наружный диаметр 0,71 мм), быстрый соединитель А и флакон с реагентом (рисунок 2С) и автоклавируйте их при 121 °C в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слегка открутите крышку флакона с реагентом во время стерилизации. Каждый раз можно готовить еще несколько бутылок с реагентами для использования. - Используйте фильтр 0,22 мкм поливинилиденфторида (PVDF) для фильтрации масла MMC. Поместите микрофлюидный чип (рисунок 2B) и масло MMC в чистую скамью заранее и стерилизуйте их ультрафиолетовым облучением в течение 30 минут перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о быстром разъеме А, бутылке с реагентом, масле MMC и микрофлюидном чипе приведена в Таблице материалов. - Установка микрофлюидного чипа
- Откройте дверцу операционной камеры (рисунок 2А) и поднимите оптоволоконный зонд.
- Выровняйте отверстия электрического поля с помощью игл электрического поля и аккуратно поместите чип на пьедестал чипа. Затем вставьте две позиционирующие колонны в позиционирующие отверстия и положите оптический волоконный зонд (рисунок 2D).
- Подключите быстрый разъем A на микросхеме к соответствующему порту MMC согласно номеру положения (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Затем закройте дверцу операционной камеры.
- Пополните масло MMC (примерно до 80 мл) в бутылке с маслом и опорожните отработанную жидкость в бутылке для отходов перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жидкость для отходов обычно представляет собой органические отходы. Пожалуйста, обратитесь к региональному законодательству и нормативным актам при утилизации, которые могут быть изменены на основе экспериментальной установки.
3. Измерение кривой роста в MMC
- Подготовка к исходному бактериальному раствору
- Следуйте соответствующим стандартным правилам для подготовки среды Luria-Bertani (LB) и автоклава при 121°C в течение 15 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Компоненты среды LB: NaCl (10 г/л), дрожжевой экстракт (5 г/л) и триптон (10 г/л). - Извлеките штамм E. coli MG1655 из глицеринового бульона и культивируйте его в колбе 50 мл с 10 мл среды LB в встряхивающем инкубаторе (200 об/мин) при 37 °C в течение 5-8 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время культивирования зависит от конкретных штаммов. Оптимально культивировать штамм до логарифмического периода/фазы. - Культивируют культивируемым раствором E. coli MG1655 со свежей средой до OD600 0,05-0,1 для получения исходного раствора бактерий (готовят около 10 мл).
- Следуйте соответствующим стандартным правилам для подготовки среды Luria-Bertani (LB) и автоклава при 121°C в течение 15 минут.
- Щелкните Инициализация , чтобы инициализировать консоль MMC. После появления интерфейса инициализации установите температуру культивирования на уровне 37 °C и значение фотоэлектрического сигнала на 0,6 (рисунок 3A). Инициализация займет около 20 минут.
- Включите УФ-лампу (длина волны 254 нм) во время инициализации.
- Введите исходный раствор бактерий и масло MMC во флакон с реагентом.
- Выньте стерилизованную бутылку реагента на чистую скамейку и затяните крышку.
- Используйте стерильный шприц объемом 10 мл для введения 3-5 мл масла MMC из шприцевой иглы боковой трубки. Наклоните и медленно вращайте бутылку с реагентом, чтобы масло полностью проникло во внутреннюю стенку.
- Введите около 5 мл исходного раствора бактерий, а затем заполните флакон с реагентом, снова введя 5-7 мл масла.
- Вытащите независимый быстрый разъем A и вставьте быстрый разъем A бутылки с реагентом в его быстрый разъем B для завершения операции впрыска образца (рисунок 4A).
- Дождитесь окончания инициализации, а затем выключите ультрафиолетовую лампу (длина волны 254 нм).
- Откройте дверцу операционной камеры и поместите бутылку с реагентом в металлическую ванну.
- Вытащите разъем C2 чипа и быстрый разъем A бутылки с реагентом. Подключите разъем боковой трубки бутылки реагента к разъему C2, а соединитель верхней трубки к разъему O2. Затем закройте дверцу операционной камеры.
- Нажмите на кривую роста , чтобы выбрать функцию измерения кривой роста (рисунок 3A). В интерфейсе настройки параметров введите число как 15, включите переключатель обнаружения OD и установите длину волны как 600 нм. Нажмите кнопку Пуск , чтобы начать генерацию дроплетов. Это займет около 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь Number относится к количеству капель, которые должны быть сгенерированы. Длина волны относится к длине волны OD, которая должна быть обнаружена. Установите число (максимум 200) и длину волны (350-800 нм) в соответствии с требованиями эксперимента. - Когда на главном интерфейсе появится всплывающее окно с запросом «Извлеките бутылку реагента между C2 и O2, затем, пожалуйста, нажмите кнопку OK после завершения», откройте дверцу операционной камеры, чтобы вынуть бутылку реагента и подключите разъемы C2 и O2.
- Закройте дверь и нажмите кнопку OK во всплывающем окне, чтобы автоматически культивировать капли и определить значения OD.
ПРИМЕЧАНИЕ: MMC обнаруживает значение OD, когда капля проходит через датчик оптического волокна. Поэтому период обнаружения зависит от количества генерируемых капель. - Когда кривая роста достигнет стационарной фазы, нажмите кнопку «Экспорт данных», чтобы экспортировать данные OD. Выберите путь сохранения данных и экспортируйте значение OD, записанное в течение периода культивирования, в формате .csv, который может быть открыт соответствующим программным обеспечением (например, Microsoft Excel). Затем используйте картографическое программное обеспечение (например, EXCEL и Origin 9.0) для построения кривой роста.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процесса культивирования можно в любое время нажать на Экспорт данных , чтобы экспортировать данные OD всех текущих капель.
4. Адаптивная эволюция в MMC
- Подготовка к исходному бактериальному раствору
- Следуйте соответствующим стандартным правилам для подготовки специальной жидкой среды и твердых пластин для MeSV2.2 и автоклава при 121 °C в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для компонентов специальной среды обратитесь к Таблице 1 и Таблице материалов. - Культивируйте MeSV2.2 с помощью твердой пластины (диаметр = 90 мм) в инкубаторе с постоянной температурой 37 °C в течение 72 ч. Затем соберите самостоятельную колонию и культивируйте ее в колбе для встряхивания 50 мл с 10 мл специальной жидкой среды в встряхивающем инкубаторе (200 об/мин) при 37 °C в течение 72 ч.
- Культивируемый раствор MeSV2.2 разводят средой до OD600 0,1-0,2 (убедитесь, что общий объем составляет не менее 10 мл) и продолжают культивировать его в колбе для встряхивания в течение 5 ч для получения исходного раствора бактерий.
ПРИМЕЧАНИЕ: MeSV2.2 является метаноло-незаменимым штаммом E. coli . Специальная жидкая среда содержит 500 ммоль/л метанола, что является сильным стрессом для MeSV2.2, что приводит к очень медленному росту. Обратите внимание, что получение исходного раствора бактерий здесь отличается от того, что описано в шаге 3.1.
- Следуйте соответствующим стандартным правилам для подготовки специальной жидкой среды и твердых пластин для MeSV2.2 и автоклава при 121 °C в течение 15 мин.
- Инициализируйте консоль MMC, как описано в шагах 3.2, 3.3 и 3.5.
- Достаньте две стерилизованные бутылки с реагентами, одна из которых предназначена для исходного раствора бактерий, а другая - для свежей среды. Вводят исходный раствор бактерий (5 мл), свежую среду (12-15 мл) и масло MMC во флаконы с реагентами, как описано на этапе 3.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку адаптивная эволюция является долгосрочным процессом, включающим несколько субкультур, храните как можно больше свежей среды в MMC. Среда не может быть пополнена во время эксперимента. - Установите две бутылки с реагентами в MMC, как описано в шаге 3.6. Установите один для исходного раствора бактерий между разъемами C2 и O2, а другой для свежей среды между разъемами C4 и O4.
- Нажмите на ALE , чтобы выбрать функцию адаптивной эволюции (рисунок 3B). В интерфейсе настройки параметров включите переключатель OD Detection .
- Установите число 50, длину волны 600 нм, концентрацию как 0%, введите как время, параметр как 30 ч и повторения как 99. Нажмите кнопку Пуск , чтобы начать генерацию дроплетов. Это займет около 25 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь «концентрация» относится к максимальной концентрации химических факторов для адаптивной эволюции. Для различных капель в MMC возможно введение различных концентраций химических факторов для обеспечения различных условий роста. Рассчитайте введенные концентрации, используя следующее уравнение:
Здесь «С» относится к концентрации химических факторов, вводимых в капли; "а" означает концентрацию химических факторов в бутылках с реагентами между разъемами С4 и О4; "b" означает концентрацию химических факторов в бутылках с реагентами между разъемами C6 и O6; а "i" означает имеющуюся концентрацию. Существует восемь концентраций, доступных в MMC. Поскольку химический фактор здесь имеет единую концентрацию (500 ммоль/л метанола) и является одним из ингредиентов среды, здесь устанавливается только одна бутылка с реагентом, содержащая химический фактор, а концентрация устанавливается как 0%. Тип относится к режиму субкультуры, который делится на три типа: режим времени, режим значения OD и режим флуоресценции. Первый означает культивирование капель в течение фиксированного времени, а затем субкультурацию, в то время как последние два средства культивируют капли до заранее определенного значения OD / интенсивности флуоресценции, а затем субкультурируют. Параметр относится к соответствующему параметру, необходимому при выборе режима субкультуры. Повторения относятся к количеству субкультур. - Извлеките флакон с реагентом, помещенный между разъемами C2 и O2, как описано в шаге 3.8.
- Обратите внимание, значительно ли увеличились максимальные значения ОД капель в течение каждого периода субкультуры. Если увеличение происходит и соответствует требованиям эксперимента, нажмите кнопку «Экспорт данных», чтобы экспортировать данные OD, как описано в шаге 3.9.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь период субкультуры зависит от параметра. Например, при установке параметра Тип как Время и Параметр как 30 ч, период субкультуры равен 30 ч. В течение каждого периода субкультуры существуют максимальные значения OD капель. Оценить, соответствует ли адаптивная эволюция требованиям эксперимента за счет увеличения максимальных значений ОД (Увеличение зависит от фактического процесса культивирования штамма, например, увеличенного более чем на 20%).
ВНИМАНИЕ: Обратите внимание на то, исчерпана ли хранящаяся свежая среда. Если значительное увеличение не произошло даже после истощения среды, извлеките более быстрорастущие капли и проведите новый виток адаптивной эволюции. - Извлеките целевые капли из MMC.
- Нажмите на кнопку Скрининг , чтобы выбрать функцию извлечения капель (рисунок 3C). Выберите опцию Собирать , нажмите на количество целевых дроплетов, а затем нажмите кнопку ОК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Капельный скрининг включает в себя "Сбор", "Выброс" и "Извлечение семенного раствора". "Экстракционный семенной раствор" означает сбор оставшихся капель13 после операции субкультуры. - Подождите, пока всплывающее окно предложит: «Пожалуйста, вытащите быстрый разъем CF и поместите его в трубку EP». Вставьте быстрый разъем CF в трубку микроцентрифуги для сбора в соответствии с подсказкой программного обеспечения, а затем нажмите OK (рисунок 4D).
- Через 1-2 минуты в программном интерфейсе появится новое окно с подсказкой: «Пожалуйста, вставьте разъем обратно и нажмите OK , если закончите». Затем вставьте быстрый разъем CF обратно и нажмите OK , чтобы MMC продолжала работать (рисунок 4D). Когда следующая целевая капля достигнет сайта распознавания капель, повторите 4.9.2-4.9.3, чтобы собрать ее.
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как все целевые капли будут собраны, MMC продолжит культивирование оставшихся капель. Если культивация не нужна, нажмите «Стоп», чтобы напрямую завершить операцию. - Извлеките каплю с помощью пипетки объемом 2,5 мкл, опустите ее на агарозную пластину толщиной 90 мм и равномерно распределите треугольным стеклянным разбрасывающим стержнем с длиной стороны 3 см. Затем культивируйте его в инкубаторе с постоянной температурой 37 °C в течение 72 ч.
- Соберите 3-5 самостоятельных колоний и отдельно культивируйте их в колбах по 50 мл с 10 мл свежей среды в встряхивающем инкубаторе (200 об/мин) при 37 °C в течение 48-72 ч. Следуйте соответствующим стандартным правилам для хранения раствора культивируемых бактерий в глицериновой трубке для последующих экспериментов.
- Нажмите на кнопку Скрининг , чтобы выбрать функцию извлечения капель (рисунок 3C). Выберите опцию Собирать , нажмите на количество целевых дроплетов, а затем нажмите кнопку ОК.
5. Очистка MMC
- После завершения эксперимента нажмите кнопку Стоп , чтобы остановить все операции. Затем нажмите « Очистить», чтобы очистить чип и трубки. Это займет около 15 минут.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол использует E. coli MG1655 и штамм MeSV2.2 в качестве примеров для демонстрации культивирования микробов и адаптивной эволюции, необходимой для метанола, с автоматизированной и относительно высокой пропускной способностью в MMC. Измерение кривой роста в основном использовалось для характеристики культивирования микробов. Адаптивная эволюция проводилась путем автоматизированного непрерывного субкультурирования и добавления высокой концентрации метанола в качестве селективного давления во время каждой субкультуры. Вопрос о том, была ли осуществлена адаптивная эволюция, оценивался на основе тенденции изменения максимального значения ОД капель в течение каждого периода субкультуры. Настраиваемые параметры и параметры точности MMC приведены в таблице 2.
Результаты измерения кривой роста
Значения OD600 из 15 капель, обнаруженных в процессе культивирования, были экспортированы из MMC после культивирования в течение примерно 20 ч (рисунок 5A). Можно заметить, что обнаружение проводилось примерно каждые 14 мин. Этот период обнаружения зависит от количества образующихся капель, поскольку капли циклически перемещаются взад и вперед в трубках для культивирования, а модуль обнаружения обнаруживает значения OD только (обнаружение и расчет значения OD показаны на дополнительном рисунке 1), когда капли проходят зонд оптического волокна. Таким образом, 14 минут - это очень короткий период обнаружения, обеспечивающий процесс обнаружения с высоким временным разрешением, чтобы более точно отражать рост микроорганизмов.
По экспортированным данным были рассчитаны средние значения OD600 и стандартное отклонение (SD) 15 капель в каждый момент времени, а также построена кривая роста E. coli MG1655 (рисунок 5B). Результаты показывают, что кривая роста представляет собой форму «S», включая фазу задержки, логарифмическую фазу и стационарную фазу, что очень соответствует классической модели роста микробов. При этом стандартные отклонения 15 капель очень малы, что свидетельствует о хорошей консистенции роста и параллельности. Таким образом, он в полной мере демонстрирует хорошую эффективность культивирования и обнаружения микробов MMC. Кроме того, было также подтверждено, что во время культивирования между каплями мало перекрестных помех (дополнительный рисунок 2 и дополнительная таблица 1).
Результаты адаптивной эволюции
Мы выполнили долгосрочную адаптивную эволюцию MeSV2.2 в MMC. На18-й день, в соответствии с тенденцией увеличения максимальных значений КАПЕЛЬ OD600 в течение каждого периода субкультуры от кривых роста, отображаемых на программном интерфейсе, мы полагали, что в 50 каплях была достигнута хорошая адаптивная эволюция. Данные OD600 были экспортированы, и было извлечено 8 капель (включая каплю 6) с относительно хорошими показателями роста13. На рисунке 6А показаны кривые роста 50 капель во всем процессе адаптивной эволюции. За 18 дней MMC автоматически выполнила 13 операций по субкультуре. Из рисунка 6A видно, что MeSV2.2 сначала медленно растет, а затем быстро, что указывает на траекторию адаптивной эволюции в MeSV2.2. Для обеспечения давления отбора метанол добавляли в среду MeSV2.2. Первоначально метанол ингибировал рост клеток. После адаптивной эволюции обогащенные клетки, адаптированные к метанолу, имели более высокую скорость роста. Кривая роста капли 6 во всем процессе адаптивной эволюции была построена отдельно (рисунок 6B). Максимальные значения OD600 в первом поколении и последнем периоде субкультуры составили 0,37 и 0,58, соответственно, увеличившись на 56,8%. Это указывает на то, что штамм в капле 6 реализовал очевидную адаптивную эволюцию.
Впоследствии культивировали штамм капельки 6 и исходный штамм в колбах для коктейлей и сравнивали кривые их роста (рисунок 6С). По методам, приведенным в литературе17,18, были рассчитаны максимальные удельные темпы роста (μmax) штамма капли 6 и исходного штамма, которые составляли 0,096 ч-1 и 0,072 ч-1 соответственно. Рисунок 6C показывает, что штамм капли 6 демонстрировал более высокую максимальную удельную скорость роста (увеличиваясь на 54,8%) и имел более высокую концентрацию клеток в стационарной фазе (увеличивающуюся на 20,0%), чем исходный штамм при культивировании в колбах для коктейлей, что еще больше предполагало, что адаптивная эволюция в MeSV2.2 была реализована.
Рисунок 1: Общий рабочий процесс измерения кривой роста и адаптивной эволюции в MMC. (A) Измерение кривой роста в MMC. Во-первых, культивируйте штамм в колбе для встряхивания, чтобы приготовить исходный бактериальный раствор. Затем введите исходный раствор бактерий во флакон с реагентом. Затем сгенерируйте капли в MMC. MMC заставляет капли циклически перемещаться вперед и назад в микрофлюидном чипе и трубках для их культивирования. Когда капли проходят через сайт обнаружения, данные OD будут обнаружены и записаны. Наконец, экспортируйте данные для анализа. (B) Адаптивная эволюция в MMC. Выберите одну колонию из пластины агарозы и культивируйте ее в колбе для коктейля, чтобы приготовить исходный бактериальный раствор. После введения исходного раствора бактерий в флакон с реагентом проведите адаптивную эволюцию в MMC. Адаптивная эволюция включает в себя непрерывную субкультуру, которая может автоматически управляться путем расщепления и слияния капель. После адаптивной эволюции экспортируйте данные для анализа. Целевые капли могут быть извлечены, а затем распределены по пластине для получения отдельных колоний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Структура и основные инструменты MMC. (A) Внешняя и эксплуатационная камера ГМК. (B) Микрофлюидный чип MMC. Чип имеет семь каналов (C1-C6 и CF). (C) Бутылка с реагентами. Он имеет верхнюю трубку и боковую трубку. Перед введением образца в бутылку с реагентом необходимо сначала подключить иглу шприца к быстрому соединителю А, а затем подключить быстрый разъем А к боковой трубке. (D) Установка микрофлюидного чипа. Микрофлюидный чип устанавливается на пьедестал. Затем семь каналов (C1-C6 и CF) подключаются соответственно к соответствующим портам MMC (O1-O6 и OF).
1 - Эксплуатационная камера ГМК.
2 - Бутылка с маслом, содержащая масло MMC.
3 - Бутылка для отходов для сбора отработанной жидкости.
4 - УФ-лампа (длина волны 254 нм) для стерилизации. Эту лампу можно включить заранее, чтобы стерилизовать чип и трубки.
5 - Лазер (620 нм) для распознавания капель. Точкой, где лазер облучается на чипе, является сайт распознавания капель.
6 - Датчик температуры для измерения температуры внутри рабочей камеры.
7 - Нагреватель для операционной камеры. Его можно использовать для поддержания температуры культивирования микробов. Диапазон температур, которые могут быть установлены, составляет от 25 ± 0,5 ° C до 40 ± 0,5 ° C.
8 - Волоконно-оптический зонд для измерения OD или флуоресценции капель.
9 - Пьедестал чипа для установки микрофлюидного чипа.
10 - Металлическая ванна для фиксации бутылок с реагентами и нагрева их для быстрого повышения температуры реагента до температуры культивирования микробов.
11 - Порты для микрофлюидного чипа (O1-O6 и OF). Микрофлюидный чип подключается к MMC через эти порты.
12 - Трубки для хранения и выращивания капель.
13 - Магнитные блоки для быстрого обнаружения микрофлюидного чипа во время установки.
14 - Игла шприца для введения образцов в бутылки с реагентами. Его внутренний диаметр составляет 0,41 мм, а наружный диаметр - 0,71 мм.
15 - Быстрый разъем A. Подключите с помощью быстрого разъема B.
16 - Быстрый разъем B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Управлениепрограммным интерфейсом MMC. (A) Основной интерфейс программного обеспечения. (1) Температура в рабочей камере. (2) Значение фотоэлектрического сигнала распознавания капель. Когда капля проходит, значение сигнала является высоким (>2 В). Когда масло проходит, значение сигнала низкое (<1 В). (3) Выбор функции. Есть четыре функции на выбор: измерение кривой роста (Growth Curve), адаптивная лабораторная эволюция (ALE), однофакторный многоуровневый анализ (One-factor) и настройка операций в соответствии с экспериментальными потребностями (Customization). (4) Интерфейс настройки параметров. Задайте здесь соответствующие экспериментальные параметры после выбора одной функции. (5) Область выполнения команд. (6) Переключатель камеры. Камера устанавливается непосредственно над чипом, который можно использовать для онлайн-наблюдения за каплями в чипе. (7) Область отображения процесса. Показывает время выполнения, данные мониторинга и выполняемую операцию. (B) Интерфейс настройки параметров адаптивной эволюции. (C) Интерфейс капельного скрининга. MMC может автоматически нумеровать капли. Здесь целевые капли могут быть выбраны и извлечены из MMC. (D) Интерфейс наблюдения с камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Инъекция образца, генерация капель и извлечение капель. (А) Флакон с реагентом после инъекции раствора бактерий и масла MMC. Как раствор бактерий, так и масло MMC вводятся из боковой трубки. Масляная фаза находится в верхнем слое, а раствор бактерий находится в нижнем слое. После инъекции подключите быстрый разъем A и B, а затем установите его в MMC. (B) Генерация капель в микрофлюидном чипе. Для улучшения видимости капель был использован раствор красного пигмента для демонстрации процесса генерации капель. (C) Капля, хранящаяся в пробирке, наблюдаемой под микроскопом. Шкала: 400 мкм. (D) Подсказки всплывающего окна и соответствующие операции. Когда появится подсказка «Пожалуйста, вытащите быстрый разъем CF и поместите его в трубку EP», вытащите разъем CF и поместите его в трубку EP, чтобы собрать целевую каплю; когда появится запрос «Пожалуйста, вставьте разъем обратно», сбор капель завершен, вставьте разъем CF обратно в порт OF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Экспорт данных и построение графика роста. (A) Снимок экрана части экспортированных данных. Экспортируемые данные включают каждую точку времени обнаружения 15 сгенерированных капель и соответствующие значения OD600. (B) Кривая роста E. coli MG1655, построенная на основе экспортированных данных. Рассчитайте средние значения OD600 и стандартное отклонение (SD) 15 капель в каждой точке времени и постройте кривую роста. Ясно, что эта кривая роста включает в себя фазу задержки, логарифмическую фазу и стационарную фазу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Результаты адаптивной эволюции MeSV2.2 в MMC. (A) Кривые роста 50 капель во всем процессе адаптивной эволюции. Данные обнаружения OD600 50 капель в течение 18-дневного процесса адаптивной эволюции были экспортированы из MMC и построены на графике. На 18-й день было извлечено 8 капель, в том числе капелька 6. (B) Кривая роста капли 6 во всем процессе адаптивной эволюции. Максимальные значения OD600 в первом поколении и последнем периоде субкультуры составили 0,37 и 0,58, соответственно, увеличившись на 56,8%. (C) Сравнение штамма капли 6 и исходного штамма в колбе для встряхивания. Штамм капли 6 и исходный штамм культивировали в колбах для встряхивания, а кривые роста (включая SD, n = 3) измеряли. Эта цифра была изменена по сравнению с Jian X. J. et al.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Компоненты | Концентрация |
| Na2HPO4·12H2O | 6,78 г/л |
| KH2PO4 | 3 г/л |
| НаКл | 0,5 г/л |
| NH4Cl | 1 г/л |
| витамин B1 (стерилизуется фильтрацией) | 0,34 г/л |
| МгСО4·7Н2О | 0,049 г/л |
| CaCl2·2H2O | 1,5 мг/л |
| Микроэлементы: | |
| FeCl3·6H2O | 0,5 мг/л |
| ZnSO4·7H2O | 0,09 мг/л |
| CuSO4·5H2O | 0,088 мг/л |
| MnCl2 | 0,045 мг/л |
| CoCl2·6H2O | 0,09 мг/л |
| Глюконат | 1,09 г/л |
| метанол | 500 ммоль/л |
| изопропил-β-d-тиогалактопиранозид | 0,1 ммоль/л |
| стрептомицина сульфат | 20 мкг/мл |
| канамицина сульфат | 50 мкг/мл |
| Добавьте дополнительно 15 г/л агарозы для приготовления твердой среды. | |
Таблица 1: Компоненты специальной среды для MeSV2.2.
| Настраиваемые параметры | |
| Параметр | Диапазон |
| Температура выращивания | 25–40 °C ± 0,5 °C |
| Количество капель | 0–200 |
| Концентрация инокулята | 13.3–86.7 % |
| Концентрация химического фактора | 8 различных концентраций, вплоть до максимальной концентрации хранимого химического фактора |
| Время субкультурации | Вплоть до пользователя |
| Количество субкультур | Вплоть до пользователя |
| Длина волны обнаружения OD | 350–800 нм |
| Длина волны флуоресцентного детектирования | Возбуждение: 470, 528 нм Эмиссия: 350–800 нм |
| Параметры точности | |
| Параметр | С.В. |
| Объем капель | 1.88% |
| Концентрация инокулята | <5.0% |
Таблица 2: Настраиваемые параметры и параметры точности ГМК. Настраиваемые параметры относятся к параметрам, которые могут быть скорректированы в соответствии с конкретными требованиями пользователей; параметры точности относятся к параметрам, которые отражают точность и воспроизводимость различных жидкостных операций.
Дополнительный рисунок 1: Распознавание и обнаружение капель в MMC. (A) Форма волны капли в MMC. Эта форма сигнала исходит из необработанных спектральных данных спектрометра MMC. После обработки необработанных спектральных данных в фоновом режиме MMC выдаст измеренное значение OD. (B) Расчет ОД капель в MMC. В форме волны капли 'a' представляет максимальную длину капли, 'c' представляет дугообразную границу раздела, образованную масляной фазой и водной фазой, а 'b' представляет основную часть капли. Основываясь на законе Ламберта-Бира, значение OD капли вычисляется по следующей формуле: значение OD = lg(E/D) × 10. 'E' относится к среднему значению спектрального сигнала масляной фазы; 'D' относится к среднему значению спектрального сигнала основной части b капли. Следует отметить, что значение ОД, измеренное MMC, отличается от значения, измеренного спектрофотометром. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Испытание перекрестных помех между каплями. Чтобы проверить, есть ли перекрестные помехи между каплями во время длительного культивирования, раствор E. coli MG1655 разбавляли до очень низкой концентрации (согласно распределению Пуассона, λ = 0,1), а затем генерировали и культивировали 200 капель в течение 5 дней. После измерения ОД было обнаружено, что E. coli MG1655 росла в небольшом количестве капель. И почти не было бактериального роста в каплях вокруг этих капель. Результат также предварительно показывает, что между каплями мало перекрестных помех. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 1: Стабильность образования капель в MMC. Как показано на дополнительном рисунке 1, капля имеет фиксированную форму сигнала. Спектрометр MMC генерирует определенное количество точек данных в секунду, поэтому количество точек данных формы капельного сигнала может отражать размер капли. Раствор красного красителя использовался для генерации 397 капель в MMC, и было измерено значение OD. Были экспортированы необработанные спектральные данные, подсчитаны точки данных каждой формы сигнала капли и рассчитан коэффициент вариации (C.V) точек данных капель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Дополнительная таблица 2: Капельное испарение в ГМК. Здесь раствор красного красителя использовался для генерации капель в MMC, а капли хранились в культуральной трубке. Затем трубку помещали в инкубатор с постоянной температурой 37 °C в течение 30 дней, а длину капель регулярно измеряли (фотографировали под микроскопом и измеряли длину с помощью шкалы). Он показывает, что объем капли был уменьшен примерно на 12,3% через 30 дней, что указывает на то, что испарение капли очень мало в MMC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе представлено, как использовать систему микробной микробной культуры (MMC) для выполнения автоматизированного культивирования микробов и долгосрочной адаптивной эволюции. MMC представляет собой миниатюрную, автоматизированную и высокопроизводительную систему культивирования микробов. По сравнению с обычными методами и инструментами культивирования микробов с высокой пропускной способностью, MMC имеет много преимуществ, таких как низкое потребление труда и реагентов, простота эксплуатации, онлайн-обнаружение (OD и флуоресценция), сбор данных с высоким временным разрешением и превосходное распараллеливание. MMC также имеет некоторые особые преимущества, отличающиеся от обычной микрофлюидной технологии капель, которая обычно использует капли pL и nL. Большинство ранее зарегистрированных систем, в которых использовались капли pL и nL, имеют плохую производительность культивирования и мало обнаруживаемых параметров (обычно только флуоресценцию)18,19,20,21. Хотя были некоторые платформы, которые могут достичь лучшей производительности культивирования и обнаружения нескольких параметров, это сложно и требует больших усилий. Например, некоторые исследователи сообщили об обнаружении капель pL. Он основан на распознавании изображений, которое имеет не только ложные срабатывания, но и нуждается в дальнейшей проверке точности22. Однако MMC может выполнить это относительно простым способом. MMC использует микролитровые (мкл) капли, о которых редко сообщается. Была проверена превосходная производительность микробного культивирования MMC, и она также может непосредственно обнаруживать OD и флуоресценцию. Из-за большого объема капель мкл генерация капель менее восприимчива к помехам, что имеет более высокую стабильность. Между тем, более разнообразные операции могут быть выполнены в микролитрах капель, способствующих реализации автоматизированных операций. Кроме того, поскольку капли являются ограждающими пространствами, летучесть содержимого может быть подавлена (дополнительная таблица 2), что способствует долгосрочному культивированию микробов и адаптивной эволюции, когда летучие вещества существуют в среде14. Этого трудно добиться в трясущихся колбах и микропластинках.
Однако некоторые критические моменты в протоколе заслуживают особого внимания. Во-первых, следует отметить, что значение OD, измеренное MMC, отличается от значения спектрофотометра, поскольку длина оптического пути измерения OD отличается (1 мм и 10 мм соответственно). Поэтому при сравнении значения OD MMC с значением колбы для встряхивания необходимо измерить калибровочную кривую13. К счастью, процесс адаптивной эволюции не требует калибровочных кривых, потому что мы фокусируемся на относительных тенденциях среди кривых роста. Далее некоторые микроорганизмы не культивируются в MMC. Капли полагаются на поверхностное натяжение границы раздела масло-вода для поддержания стабильности23. Если микроорганизмы производят определенные вещества, которые нарушают поверхностное натяжение границы раздела масло-вода, такие как некоторые штаммы Bacillus subtilis , производящие поверхностно-активные вещества24, капли не могут поддерживать стабильность. Кроме того, если среда сама по себе является препятствием для образования капель, ее нецелесообразно использовать в MMC, например, очень вязкой среде или среде, содержащей крупные частицы. В настоящее время виды, которые мы успешно культивируем в MMC, включают E. coli, Lactobacillus plantarum, Corynebacterium glutamicum, дрожжи, Methylobacterium extorquens, Aspergillus oryzae, микроводоросли и так далее. Рекомендуется культивировать штамм в MMC для предварительного эксперимента. Наконец, разъемы и порты между чипом, бутылкой реагента и MMC должны быть подключены в строгом соответствии с протоколом. В противном случае раствор бактерий может потечь в MMC и загрязнить внутреннюю часть. Кроме того, следует отметить, что текущая пропускная способность MMC ограничена (0-200) из-за времени, затрачиваемого на операции субкультуры. В будущем мы оптимизируем управляющее программное обеспечение и размер чипа, чтобы сократить время и повысить пропускную способность. Поскольку MMC является модульной системой, необходимо заменять только смежные детали или программное обеспечение без необходимости нового оборудования.
В настоящее время MMC может не только проводить измерение кривой роста, адаптивную лабораторную эволюцию и однофакторный многоуровневый анализ, но и использоваться для настройки различных процедур работы капель для удовлетворения экспериментальных потребностей. В будущем необходимо еще больше обогатить прикладные функции системы MMC в ответ на различные потребности микробных исследований, такие как проведение многофакторных многоуровневых ортогональных экспериментов, технология автоматического отбора проб с несколькими образцами для одновременного измерения кривых роста нескольких видов бактерий, а также точного обнаружения и контроля большего количества параметров (например, растворенного кислорода (DO) и рН). В то же время необходимо также развивать больше функций в области микробиологии для применения MMC к более практическим сценариям, таким как оптимизация композиций сред, определение минимальной ингибирующей концентрации (MIC), совместное культивирование микроорганизмов25 и т. Д.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2018YFA0901500), Национальным проектом ключевых научных приборов и оборудования Национального фонда естественных наук Китая (21627812) и Программой научных исследований Инициативы Университета Цинхуа (20161080108). Мы также благодарим профессора Юлию А. Ворхольт (Институт микробиологии, департамент биологии, ETH Zurich, Zurich 8093, Швейцария) за предоставление метанол-эссенциального штамма E. coli версии 2.2 (MeSV2.2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
| 4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
| Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
| EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
| FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
| Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
| High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
| isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
| Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
| Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
| Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
| Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
| Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
| Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
| Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
| Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
| UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
| Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
References
- Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
- Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O.
- Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
- Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).
- Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
- Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
- Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
- Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
- Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P.
- Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
- Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
- Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
- Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).
- Meyer, F., et al.
- Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. The introduction of MMC. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. , Available from: http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 (2021).
- Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
- Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
- Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
- Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
- Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
- Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998 (2020).
- Baret, J. C.
- Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
- Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).
