Summary
Dit protocol beschrijft hoe het Microbial Microdroplet Culture-systeem (MMC) kan worden gebruikt om geautomatiseerde microbiële teelt en adaptieve evolutie uit te voeren. MMC kan micro-organismen automatisch en continu cultiveren en subcultureren en online hun groei volgen met een relatief hoge doorvoer en goede parallellisatie, waardoor het arbeids- en reagensverbruik wordt verminderd.
Abstract
Conventionele microbiële teeltmethoden hebben meestal omslachtige bewerkingen, lage doorvoer, lage efficiëntie en groot verbruik van arbeid en reagentia. Bovendien hebben microplaatgebaseerde teeltmethoden met hoge doorvoer die in de afgelopen jaren zijn ontwikkeld, een slechte microbiële groeistatus en experimentparallellisatie vanwege hun lage opgeloste zuurstof, slechte mengsel en ernstige verdamping en thermisch effect. Vanwege de vele voordelen van microdruppels, zoals een klein volume, een hoge doorvoer en een sterke controleerbaarheid, kan de op druppels gebaseerde microfluïdische technologie deze problemen overwinnen, die is gebruikt in vele soorten onderzoek naar microbiële teelt, screening en evolutie met hoge doorvoer. De meeste eerdere studies bevinden zich echter nog in het stadium van laboratoriumconstructie en -toepassing. Enkele belangrijke kwesties, zoals hoge operationele vereisten, hoge constructiemoeilijkheden en gebrek aan geautomatiseerde integratietechnologie, beperken de brede toepassing van druppelmicrofluïdische technologie in microbieel onderzoek. Hier werd met succes een geautomatiseerd microbieel microdruppelcultuursysteem (MMC) ontwikkeld op basis van druppelmicrofluïdische technologie, waarmee de integratie van functies zoals inenting, teelt, online monitoring, subteelt, sortering en bemonstering werd bereikt die vereist zijn voor het proces van microbiële druppelteelt. In dit protocol werden wild-type Escherichia coli (E. coli) MG1655 en een methanol-essentiële E. coli-stam (MeSV2.2) als voorbeelden genomen om te introduceren hoe de MMC kan worden gebruikt om geautomatiseerde en relatief hoge doorvoer microbiële teelt en adaptieve evolutie in detail uit te voeren. Deze methode is eenvoudig te bedienen, verbruikt minder arbeid en reagentia en heeft een hoge experimentele doorvoer en een goede gegevensparallelliteit, wat grote voordelen heeft in vergelijking met conventionele teeltmethoden. Het biedt een goedkoop, bedrijfsvriendelijk en resultaatbetrouwbaar experimenteel platform voor wetenschappelijke onderzoekers om gerelateerd microbieel onderzoek uit te voeren.
Introduction
Microbiële teelt is een belangrijke basis voor microbiologisch wetenschappelijk onderzoek en industriële toepassingen, die veel wordt gebruikt bij de isolatie, identificatie, reconstructie, screening en evolutie van micro-organismen 1,2,3. Conventionele microbiële teeltmethoden gebruiken voornamelijk reageerbuizen, schudkolven en vaste platen als teeltcontainers, gecombineerd met schudincubators, spectrofotometers, microplaatlezers en andere apparatuur voor microbiële teelt, detectie en screening. Deze methoden hebben echter veel problemen, zoals omslachtige bewerkingen, lage doorvoer, lage efficiëntie en groot verbruik van arbeid en reagentia. De teeltmethoden met hoge doorvoer die de afgelopen jaren zijn ontwikkeld, zijn voornamelijk gebaseerd op de microplaat. Maar de microplaat heeft een laag niveau van opgeloste zuurstof, slechte mengeigenschappen en ernstige verdamping en thermisch effect, wat vaak leidt tot een slechte groeistatus en experimentlillaatologie van micro-organismen 4,5,6,7; aan de andere kant moet het worden uitgerust met dure apparatuur, zoals vloeistofbehandelingswerkstations en microplaatlezers, om geautomatiseerde teelt- en procesdetectiete bereiken 8,9.
Als een belangrijke tak van microfluïdische technologie is de afgelopen jaren druppelmicrofluïdica ontwikkeld op basis van traditionele continustromende microfluïdische systemen. Het is een discrete flow microfluïdische technologie die twee onmengbare vloeibare fasen (meestal olie-water) gebruikt om gedispergeerde microdruppels te genereren en erop te werken10. Omdat microdruppels de kenmerken hebben van een klein volume, een groot specifiek oppervlak, een hoge interne massaoverdrachtsnelheid en geen kruisbesmetting veroorzaakt door compartimentering, en de voordelen van sterke controleerbaarheid en hoge doorvoer van druppels, zijn er vele soorten onderzoek geweest waarbij druppelmicrofluïdische technologie wordt toegepast in de teelt, screening en evolutie van micro-organismen met hoge doorvoer11 . Er zijn echter nog steeds een aantal belangrijke problemen om druppelmicrofluïdische technologie populair te maken en op grote schaal toe te passen. Ten eerste is de werking van druppelmicrofluïdica omslachtig en ingewikkeld, wat resulteert in hoge technische vereisten voor operators. Ten tweede combineert druppelmicrofluïdische technologie optische, mechanische en elektrische componenten en moet deze worden geassocieerd met biotechnologische toepassingsscenario's. Het is moeilijk voor een enkel laboratorium of team om efficiënte druppelmicrofluïdische controlesystemen te bouwen als er geen multidisciplinaire samenwerking is. Ten derde kost het vanwege het kleine volume microdruppels (van picoliter (pL) tot microliter (μL)) veel moeite om de nauwkeurige geautomatiseerde controle en real-time online detectie van druppels te realiseren voor enkele elementaire microbiële bewerkingen zoals subteelt, sortering en bemonstering, en het is ook moeilijk om een geïntegreerd apparatuursysteem te bouwen12.
Om de bovenstaande problemen aan te pakken, werd met succes een automatisch microbieel microdruppelcultuursysteem (MMC) ontwikkeld op basis van druppelmicrofluïdische technologie13. Het MMC bestaat uit vier functionele modules: een druppelherkenningsmodule, een druppelspectrumdetectiemodule, een microfluïdische chipmodule en een bemonsteringsmodule. Door de systeemintegratie en -controle van alle modules wordt het geautomatiseerde besturingssysteem inclusief de generatie, teelt, meting (optische dichtheid (OD) en fluorescentie), splitsen, fusie, sortering van druppels nauwkeurig vastgesteld, waardoor de integratie van functies zoals inenting, teelt, monitoring, subteelt, sortering en bemonstering die nodig is voor het proces van microbiële druppelteelt wordt bereikt. MMC kan tot 200 replicerende druppelteelteenheden van 2-3 μL volume bevatten, wat overeenkomt met 200 schudkolf teelteenheden. Het microdruppelteeltsysteem kan voldoen aan de vereisten van niet-contaminatie, opgeloste zuurstof, mengen en massa-energie-uitwisseling tijdens de groei van micro-organismen, en voldoen aan de verschillende behoeften van microbieel onderzoek door middel van meerdere geïntegreerde functies, bijvoorbeeld groeicurvemeting, adaptieve evolutie, single factor multi-level analyse en metabolietonderzoek en -analyse (gebaseerd op fluorescentiedetectie)13,14.
Hier introduceert het protocol hoe de MMC te gebruiken om geautomatiseerde en microbiële teelt en adaptieve evolutie in detail uit te voeren (figuur 1). We namen wild-type Escherichia coli (E. coli) MG1655 als voorbeeld om de groeicurvemeting en een methanol-essentiële E. coli-stam MeSV2.215 aan te tonen om de adaptieve evolutie in MMC aan te tonen. Er is een bedieningssoftware voor MMC ontwikkeld, die de bediening zeer eenvoudig en duidelijk maakt. In het hele proces moet de gebruiker de initiële bacterieoplossing bereiden, de voorwaarden van de MMC instellen en vervolgens de bacterieoplossing en gerelateerde reagentia in de MMC injecteren. Vervolgens zal de MMC automatisch bewerkingen uitvoeren zoals druppelgeneratie, herkenning en nummering, teelt en adaptieve evolutie. Het zal ook online detectie (OD en fluorescentie) van de druppels met een hoge tijdresolutie uitvoeren en de gerelateerde gegevens (die kunnen worden geëxporteerd) in de software weergeven. De operator kan het teeltproces op elk moment stoppen op basis van de resultaten en de doeldruppels extraheren voor volgende experimenten. De MMC is eenvoudig te bedienen, verbruikt minder arbeid en reagentia en heeft een relatief hoge experimentele doorvoer en een goede gegevensparallelliteit, wat aanzienlijke voordelen heeft in vergelijking met conventionele teeltmethoden. Het biedt een goedkoop, bedrijfsvriendelijk en robuust experimenteel platform voor onderzoekers om gerelateerd microbieel onderzoek uit te voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Installatie van instrumenten en software
- Kies een schone en steriele omgeving (zoals een schone bank) als speciale permanente ruimte voor MMC. Installeer de MMC gestaag in de ruimte.
OPMERKING: Houd de MMC uit de buurt van de interferentie van sterke elektrische velden, magnetische velden en sterke warmtestralingsbronnen. Voorkom dat ernstige trillingen de optische detectiecomponenten aantasten. Zorg voor de voeding van AC220 V, 50 HZ naar de MMC. Voor meer informatie over MMC verwijzen wij u naar de Tabel met Materialen en de website voor MMC16. - Installeer de bewerkingssoftware vanuit het bestand MMC.zip
OPMERKING: Neem contact op met de auteurs voor het MMC.zip bestand.- Maak een speciale map en sla het zip-bestand daarin op.
- Maak een andere speciale map aan als de "Installation Directory". Pak de MMC uit.zip en sla de bestanden op in de nieuwe map.
OPMERKING: De computerconfiguratie is het beste om te voldoen aan: (1) Windows 7 64-bits besturingssysteem of hoger; (2) CPU: i5 of hoger; (3) geheugen: 4 GB of meer; (4) harde schijf: 300 GB of meer (rotatiesnelheid groter dan 7200 rpm of solid-state disk).
2. Voorbereidingen
- Sluit de naald van de spuit (binnendiameter is 0,41 mm en de buitendiameter is 0,71 mm), snelkoppeling A en reagensfles (figuur 2C) aan en autoclaaf ze gedurende 15 minuten bij 121 °C.
OPMERKING: Schroef de dop van de reagensfles iets los tijdens het steriliseren. Elke keer kunnen er nog een paar reagensflessen worden klaargemaakt voor gebruik. - Gebruik een 0,22 μm polyvinylideenfluoride (PVDF) filter om MMC-olie te filteren. Plaats de microfluïdische chip (figuur 2B) en MMC-olie van tevoren in de schone bank en steriliseer ze door ultraviolette bestraling gedurende 30 minuten voor gebruik.
OPMERKING: Voor de details van Quick connector A, reagensfles, MMC-olie en microfluïdische chip raadpleegt u de tabel met materialen. - Installeer de microfluïdische chip
- Open de deur van de operatiekamer (figuur 2A) en til de optische vezelsonde op.
- Lijn de elektrische veldgaten uit met de elektrische veldnaalden en plaats de chip voorzichtig op het spaanonderstel. Steek vervolgens de twee positioneringskolommen in de positioneringsgaten en plaats de optische vezelsonde (figuur 2D).
- Sluit de snelkoppeling A op de chip aan op de overeenkomstige poort van de MMC volgens het positienummer (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Sluit vervolgens de deur van de operatiekamer.
- Vul de MMC-olie (tot ongeveer 80 ml) in de oliefles en leeg de afvalvloeistof in de afvalfles voor gebruik.
OPMERKING: De afvalvloeistof is meestal organisch afval. Raadpleeg de regionale wet- en regelgeving bij verwijdering, onder voorbehoud van wijzigingen op basis van experimentele opstelling.
3. Groeicurve meting in MMC
- Bereiding voor initiële bacteriële oplossing
- Volg de bijbehorende standaardvoorschriften om Luria-Bertani (LB) medium en autoclaaf te bereiden bij 121°C gedurende 15 minuten.
OPMERKING: Componenten van LB-medium: NaCl (10 g/L), gistextract (5 g/L) en trypton (10 g/L). - Haal de E. coli MG1655-stam uit de glycerolbouillon en kweek deze in een schudkolf van 50 ml met 10 ml LB-medium in een schudincubator (200 tpm) bij 37 °C gedurende 5-8 uur.
LET OP: De teelttijd is afhankelijk van de specifieke soorten. Het is optimaal om de soort te kweken tot de logaritmische periode/fase. - Verdun de gekweekte E. coli MG1655-oplossing met vers medium tot een OD600 van 0,05-0,1 om een eerste bacterieoplossing te verkrijgen (bereid ongeveer 10 ml).
- Volg de bijbehorende standaardvoorschriften om Luria-Bertani (LB) medium en autoclaaf te bereiden bij 121°C gedurende 15 minuten.
- Klik op Initialisatie om de MMC te initialiseren. Nadat de initialisatie-interface verschijnt, stelt u de teelttemperatuur in op 37 °C en de foto-elektrische signaalwaarde op 0,6 (figuur 3A). De initialisatie duurt ongeveer 20 minuten.
- Schakel de UV-lamp (golflengte 254 nm) in tijdens de initialisatie.
- Injecteer de initiële bacterieoplossing en MMC-olie in de reagensfles.
- Haal een gesteriliseerde reagensfles op de schone bank en draai de dop vast.
- Gebruik een steriele spuit van 10 ml om 3-5 ml MMC-olie uit de naald van de spuit van de zijbuis te injecteren. Kantel en draai de reagensfles langzaam om de olie volledig in de binnenwand te laten infiltreren.
- Injecteer ongeveer 5 ml initiële bacterie-oplossing en vul vervolgens de reagensfles door opnieuw 5-7 ml van de olie te injecteren.
- Trek de onafhankelijke snelkoppeling A eruit en steek de snelkoppeling A van de reagensfles in de snelkoppeling B om de monsterinjectie te voltooien (figuur 4A).
- Wacht tot de initialisatie is voltooid en schakel vervolgens de UV-lamp uit (golflengte 254 nm).
- Open de deur van de operatiekamer en plaats de reagensfles in het metalen bad.
- Trek de C2-connector van de chip en de snelkoppeling A van de reagensfles eruit. Sluit de zijbuisconnector van de reagensfles aan op de C2-connector en de bovenbuisconnector op de O2-connector. Sluit vervolgens de deur van de operatiekamer.
- Klik op Groeicurve om de functie van het meten van de groeicurve te kiezen (figuur 3A). Voer in de interface voor parameterinstellingen het getal in als 15, schakel de OD-detectieschakelaar in en stel de golflengte in op 600 nm. Klik op Start om het genereren van druppels te starten. Het duurt ongeveer 10 minuten.
OPMERKING: Hier verwijst Nummer naar het aantal druppels dat moet worden gegenereerd. Golflengte verwijst naar de golflengte van de te detecteren OD. Stel het getal (maximaal 200) en de golflengte (350-800 nm) in volgens de experimentvereisten. - Wanneer er een pop-upvenster verschijnt op de hoofdinterface met de vraag "Verwijder de reagensfles tussen C2 en O2, klik vervolgens op de knop OK na voltooiing", opent u de deur van de operatiekamer om de reagensfles eruit te halen en de C2- en O2-connectoren aan te sluiten.
- Sluit de deur en klik op de knop OK in het pop-upvenster om de druppels automatisch te cultiveren en de OD-waarden te detecteren.
OPMERKING: De MMC detecteert de OD-waarde wanneer de druppel de optische vezelsonde passeert. Daarom is de detectieperiode afhankelijk van het aantal gegenereerde druppels. - Wanneer de groeicurve de stationaire fase bereikt, klikt u op de knop Gegevensexport om de OD-gegevens te exporteren. Selecteer het gegevensopslagpad en exporteer de OD-waarde die tijdens de teeltperiode is geregistreerd in het .csv-formaat, dat kan worden geopend door de juiste software (bijvoorbeeld Microsoft Excel). Gebruik vervolgens een kaartsoftware (bijvoorbeeld EXCEL en Origin 9.0) om de groeicurve te plotten.
OPMERKING: Tijdens het teeltproces is het mogelijk om op elk gewenst moment op de gegevensexport te klikken om de OD-gegevens van alle huidige druppels te exporteren.
4. Adaptieve evolutie in MMC
- Bereiding voor initiële bacteriële oplossing
- Volg de bijbehorende standaardvoorschriften om het speciale vloeibare medium en de vaste platen voor de MeSV2.2 en autoclaaf gedurende 15 minuten bij 121 °C te bereiden.
OPMERKING: Voor de componenten van het speciale medium verwijzen wij u naar tabel 1 en de tabel met materialen. - Kweek de MeSV2.2 met behulp van de massieve plaat (diameter = 90 mm) in een incubator met constante temperatuur van 37 °C gedurende 72 uur. Kies vervolgens een onafhankelijke kolonie en kweek deze in een schudkolf van 50 ml met 10 ml van het speciale vloeibare medium in een schudincubator (200 rpm) bij 37 °C gedurende 72 uur.
- Verdun de gekweekte MeSV2.2-oplossing met het medium tot een OD600 van 0,1-0,2 (zorg ervoor dat het totale volume niet minder dan 10 ml is) en blijf het gedurende 5 uur in de schudfles kweken om de initiële bacterieoplossing te verkrijgen.
OPMERKING: De MeSV2.2 is een methanol-essentiële E. coli stam. Het speciale vloeibare medium bevat 500 mmol/L methanol, wat een sterke belasting is voor MeSV2.2, wat resulteert in een zeer langzame groei. Merk op dat het verkrijgen van de initiële bacterieoplossing hier verschilt van die beschreven in stap 3.1.
- Volg de bijbehorende standaardvoorschriften om het speciale vloeibare medium en de vaste platen voor de MeSV2.2 en autoclaaf gedurende 15 minuten bij 121 °C te bereiden.
- Initialiseer de MMC zoals uitgelegd in stap 3.2, 3.3 en 3.5.
- Haal twee gesteriliseerde reagensflessen eruit, waarvan er één voor de initiële bacterieoplossing is en de andere voor het verse medium. Injecteer de initiële bacterieoplossing (5 ml), vers medium (12-15 ml) en MMC-olie in de reagensflessen zoals uitgelegd in stap 3.4.
OPMERKING: Aangezien adaptieve evolutie een langdurig proces is waarbij meerdere subteelten betrokken zijn, moet u zoveel mogelijk vers medium opslaan in MMC. Het medium kan niet worden aangevuld tijdens het uitvoeren van het experiment. - Installeer de twee reagensflessen in MMC zoals uitgelegd in stap 3.6. Installeer de ene voor de initiële bacterieoplossing tussen de C2- en O2-connector en de andere voor het verse medium tussen de C4- en O4-connector.
- Klik op ALE om de functie van adaptieve evolutie te kiezen (Figuur 3B). Schakel in de interface voor parameterinstellingen de schakelaar OD-detectie in.
- Stel het getal in als 50, Golflengte als 600 nm, Concentratie als 0%, Type als Tijd, Parameter als 30 h en Herhalingen als 99. Klik op Start om het genereren van druppels te starten. Het duurt ongeveer 25 minuten.
OPMERKING: Hier verwijst "Concentratie" naar de maximale concentratie van chemische factoren voor adaptieve evolutie. Voor verschillende druppels is het in MMC realiseerbaar om verschillende concentraties van chemische factoren te introduceren om verschillende groeiomstandigheden te bieden. Bereken de geïntroduceerde concentraties met behulp van de volgende vergelijking:
Hier verwijst "C" naar de concentratie van chemische factoren die in druppels worden geïntroduceerd; "a": de concentratie van chemische factoren in de reagensflessen tussen de C4- en O4-connector; "b" verwijst naar de concentratie van chemische factoren in de reagensflessen tussen de C6- en O6-connector; en "i" verwijst naar de beschikbare concentratie. Er zijn acht concentraties beschikbaar in MMC. Aangezien de chemische factor hier een enkele concentratie heeft (500 mmol / L methanol) en het een van de ingrediënten van het medium is, is hier slechts één reagensfles met de chemische factor geïnstalleerd en wordt de concentratie ingesteld op 0%. Type verwijst naar de subkweek, die is onderverdeeld in drie typen: tijdmodus, OD-waardemodus en fluorescentiemodus. De eerste betekent om de druppels voor een vaste tijd te cultiveren en vervolgens te subcultiveren, terwijl de laatste twee middelen om de druppels te cultiveren tot vooraf gedefinieerde OD-waarde / fluorescentie-intensiteit en vervolgens subcultiveren. Parameter verwijst naar de gerelateerde parameter die vereist is bij het kiezen van een subcultuurmodus. Herhalingen verwijst naar het aantal sub-cultivaties. - Verwijder de reagensfles die tussen de C2- en O2-connector is geplaatst, zoals uitgelegd in stap 3.8.
- Let erop of de maximale OD-waarden van de druppels tijdens elke subkweekperiode aanzienlijk zijn toegenomen. Als de toename optreedt en voldoet aan de experimentvereisten, klikt u op de knop Gegevensexport om de OD-gegevens te exporteren zoals uitgelegd in stap 3.9.
OPMERKING: Hier is de subteeltperiode afhankelijk van de parameter. Wanneer u bijvoorbeeld Type instelt als Tijd en Parameter op 30 h, is de subteeltperiode 30 h. Tijdens elke subkweekperiode zijn er de maximale OD-waarden van de druppels. Schat in of de adaptieve evolutie voldoet aan de experimentvereisten door de verhoging van de maximale OD-waarden (de toename hangt af van het daadwerkelijke teeltproces van de stam, bijvoorbeeld verhoogd met meer dan 20%).
LET OP: Let erop of het opgeslagen verse medium uitgeput is. Als de significante toename niet is opgetreden, zelfs niet nadat het medium is uitgeput, extraheer dan de beter groeiende druppels en voer een nieuwe ronde van adaptieve evolutie uit. - Extraheer de doeldruppels uit de MMC.
- Klik op de knop Screening om de functie van druppelextractie te kiezen (figuur 3C). Kies de optie Verzamelen , klik op het aantal doeldruppels en klik vervolgens op OK.
OPMERKING: Druppelscreening omvat "Collect", "Discard" en "Extract seed solution". "Extractzaadoplossing": het verzamelen van de resterende druppels13 na de onderteelt. - Wacht tot het pop-upvenster vraagt: "Trek de CF-snelconnector eruit en plaats deze in de EP-buis". Plaats de CF-snelkoppeling in de microcentrifugebuis voor verzameling volgens de softwareprompt en klik vervolgens op OK (Figuur 4D).
- Na 1-2 minuten verschijnt er een nieuw venster met de vraag: "Plaats de connector terug en klik op OK als u klaar bent". Plaats vervolgens de CF-snelkoppeling terug en klik op OK om MMC te laten blijven werken (Afbeelding 4D). Wanneer de volgende doeldruppel de druppelherkenningsplaats bereikt, herhaalt u 4.9.2-4.9.3 om deze te verzamelen.
OPMERKING: Nadat alle doeldruppels zijn verzameld, zal de MMC doorgaan met het kweken van de resterende druppels. Als de teelt niet nodig is, klikt u op Stoppen om de bewerking direct te beëindigen. - Extraheer de druppel met een pipet van 2,5 μL, laat deze op de 90 mm agaroseplaat vallen en verdeel deze gelijkmatig met een driehoekige glazen spreidstaaf met een zijlengte van 3 cm. Kweek het vervolgens in een incubator met constante temperatuur van 37 °C gedurende 72 uur.
- Pluk 3-5 onafhankelijke kolonies en kweek ze afzonderlijk in de schudkolven van 50 ml met 10 ml vers medium in een schudincubator (200 tpm) bij 37 °C gedurende 48-72 uur. Volg de gerelateerde standaardvoorschriften om de gekweekte bacterie-oplossing in de glycerolbuis op te slaan voor volgende experimenten.
- Klik op de knop Screening om de functie van druppelextractie te kiezen (figuur 3C). Kies de optie Verzamelen , klik op het aantal doeldruppels en klik vervolgens op OK.
5. Schoon van de MMC
- Klik na voltooiing van het experiment op Stoppen om alle bewerkingen te stoppen. Klik vervolgens op Reinigen om de chip en buizen schoon te maken. Het duurt ongeveer 15 minuten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol gebruikt E. coli MG1655 en een MeSV2.2-stam als voorbeelden om de microbiële teelt en methanol-essentiële adaptieve evolutie aan te tonen met een geautomatiseerde en relatief hoge doorvoerstrategie in MMC. De groeicurvemeting werd vooral gebruikt om microbiële teelt te karakteriseren. De adaptieve evolutie werd uitgevoerd door geautomatiseerde continue subteelt en het toevoegen van een hoge concentratie methanol als de selectieve druk tijdens elke subteelt. Of adaptieve evolutie was gerealiseerd, werd geschat aan de hand van de variatietrend van de maximale OD-waarde van de druppels tijdens elke subkweekperiode. De instelbare parameters en nauwkeurigheidsparameters van MMC zijn weergegeven in tabel 2.
Resultaten van de meting van de groeicurve
De OD600-waarden van de 15 druppels die tijdens het teeltproces werden gedetecteerd, werden na ongeveer 20 uur telen uit het MMC geëxporteerd (figuur 5A). Er kan worden waargenomen dat de detectie ongeveer elke 14 minuten werd uitgevoerd. Deze detectieperiode is afhankelijk van het aantal gegenereerde druppels omdat de druppels heen en weer worden gefietst in de buizen voor de teelt, en de detectiemodule detecteert alleen de OD-waarden (de detectie en berekening van OD-waarde worden weergegeven in aanvullende figuur 1) wanneer de druppels de optische vezelsonde passeren. Daarom is de 14 min een zeer korte detectieperiode, die een detectieproces met hoge tijdresolutie biedt om de groei van micro-organismen nauwkeuriger weer te geven.
Volgens de geëxporteerde gegevens werden de gemiddelde OD600-waarden en standaarddeviatie (SD) van 15 druppels op elk tijdstip berekend en werd de groeicurve van E. coli MG1655 uitgezet (figuur 5B). De resultaten laten zien dat de groeicurve een "S" -vorm vertoont, inclusief lagfase, logaritmische fase en stationaire fase, wat zeer consistent is met het klassieke microbiële groeimodel. Tegelijkertijd zijn de standaarddeviaties van 15 druppels erg klein, wat wijst op een goede groeiconsistentie en parallelliteit. Het toont dus volledig de goede microbiële teelt- en detectieprestaties van MMC. Bovendien werd ook vastgesteld dat er tijdens de teelt weinig overspraak is tussen druppels (aanvullende figuur 2 en aanvullende tabel 1).
Resultaten van adaptieve evolutie
We hebben een adaptieve evolutie op lange termijn van MeSV2.2 in MMC uitgevoerd. Op de 18e dag, volgens destijgende trend van de maximale OD600-waarden van de druppels tijdens elke subteeltperiode van de groeicurven die op de software-interface worden weergegeven, geloofden we dat een goede adaptieve evolutie werd bereikt in de 50 druppels. De OD600-gegevens werden geëxporteerd en 8 druppels (inclusief druppel 6) met relatief goede groeiprestaties werden geëxtraheerd13. Figuur 6A toont de groeicurves van 50 druppels in het hele adaptieve evolutieproces. In 18 dagen heeft MMC automatisch 13 subteeltbewerkingen uitgevoerd. Uit figuur 6A is te zien dat MeSV2.2 eerst langzaam groeit en daarna snel, wat het spoor van adaptieve evolutie in MeSV2.2 aangeeft. Om een selectiedruk te leveren, werd de methanol toegevoegd aan het MeSV2.2 medium. Aanvankelijk remde methanol de celgroei. Na de adaptieve evolutie hadden de verrijkte cellen aangepast aan methanol een hogere groeisnelheid. De groeicurve van druppel 6 in het hele adaptieve evolutieproces werd afzonderlijk uitgezet (figuur 6B). De maximale OD600-waarden in de eerste generatie en de laatste subkweekperiode waren respectievelijk 0,37 en 0,58, verhoogd met 56,8%. Het geeft aan dat de spanning in druppel 6 een duidelijke adaptieve evolutie heeft gerealiseerd.
Vervolgens werden druppel 6-stam en de initiële stam in schudfles gekweekt en hun groeicurven vergeleken (figuur 6C). Volgens de methoden in de literatuur17,18 werden de maximale specifieke groeisnelheden (μmax) van de druppel 6-stam en de initiële stam berekend, die respectievelijk 0,096 h-1 en 0,072 h-1 waren. Figuur 6C laat zien dat de druppel 6-stam een hogere maximale specifieke groeisnelheid vertoonde (toenemend met 54,8%) en een hogere celconcentratie had in de stationaire fase (toenemend met 20,0%) dan de initiële stam bij kweek in schudkolven, wat verder suggereerde dat de adaptieve evolutie in MeSV2.2 is gerealiseerd.
Figuur 1: Algemene workflow van groeicurvemeting en adaptieve evolutie in MMC. (A) Meting van de groeicurve in MMC. Kweek eerst de stam in een schudkolf om de eerste bacteriële oplossing te bereiden. Injecteer vervolgens de initiële bacterie-oplossing in de reagensfles. Genereer vervolgens de druppels in MMC. MMC laat de druppels heen en weer lopen in de microfluïdische chip en buizen om ze te cultiveren. Wanneer druppels de detectieplaats passeren, worden de OD-gegevens gedetecteerd en geregistreerd. Exporteer ten slotte de gegevens voor analyse. (B) Adaptieve evolutie in MMC. Pluk een enkele kolonie van de agaroseplaat en kweek deze in een schudkolf om de eerste bacteriële oplossing te bereiden. Na het injecteren van de initiële bacterie-oplossing in de reagensfles, voert u de adaptieve evolutie in MMC uit. Adaptieve evolutie omvat continue sub-cultivatie, die automatisch kan worden bediend door druppelsplitsing en fusie. Exporteer na de adaptieve evolutie de gegevens voor analyse. Doeldruppels kunnen worden geëxtraheerd en vervolgens op de plaat worden verspreid om enkele kolonies te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Structuur en essentiële hulpmiddelen van MMC. (A) Externe en operatiekamer van MMC. (B) De microfluïdische chip van MMC. De chip heeft zeven kanalen (C1-C6 en CF). (C) Reagensfles. Het heeft een bovenbuis en een zijbuis. Voordat het monster in de reagensfles wordt geïnjecteerd, moet het eerst een spuitnaald aansluiten op een snelkoppeling A en vervolgens de snelkoppeling A aansluiten op de zijbuis. (D) Installatie van de microfluïdische chip. De microfluïdische chip is op het voetstuk geïnstalleerd. Vervolgens worden de zeven kanalen (C1-C6 en CF) respectievelijk aangesloten op de overeenkomstige poorten van MMC (O1-O6 en OF).
1 - Operatiekamer van MMC.
2 - Oliefles met de MMC-olie.
3 - Afvalfles voor het verzamelen van afvalvloeistof.
4 - UV-lamp (golflengte 254 nm) voor sterilisatie. Deze lamp kan van tevoren worden ingeschakeld om de chip en buizen te steriliseren.
5 - Laser (620 nm) voor druppelherkenning. Het punt waar de laser op de chip wordt bestraald, is de druppelherkenningsplaats.
6 - Temperatuurvoeler om de temperatuur in de operatiekamer te meten.
7 - Verwarming voor de operatiekamer. Het kan worden gebruikt om de temperatuur van microbiële teelt te handhaven. Het in te stellen temperatuurbereik is 25 ± 0,5 °C tot 40 ± 0,5 °C.
8 - Optische vezelsonde om de OD of fluorescentie van druppels te meten.
9 - Chipvoetstuk om de Microfluïdische chip te installeren.
10 - Metalen bad om de reagensflessen te bevestigen en te verwarmen om de temperatuur van een reagens snel te verhogen tot de temperatuur van microbiële teelt.
11 - Poorten voor de microfluïdische chip (O1-O6 en OF). De microfluïdische chip is via deze poorten verbonden met de MMC.
12 - Buizen voor druppelopslag en -teelt.
13 - Magneetblokken om de microfluïdische chip snel te lokaliseren tijdens de installatie.
14 - Spuitnaald om de monsters in de reagensflessen te injecteren. De binnendiameter is 0, 41 mm en de buitendiameter is 0, 71 mm.
15 - Snelkoppeling A. Sluit aan met snelkoppeling B.
16 - Snelkoppeling B. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Bedieningssoftware-interface van MMC. (A) De hoofdinterface van de software. (1) Temperatuur in de operatiekamer. (2) Foto-elektrische signaalwaarde van druppelherkenning. Wanneer de druppel passeert, is de signaalwaarde hoog (>2 V). Wanneer de olie passeert, is de signaalwaarde laag (<1 V). (3) Functie selectie. Er zijn vier functies om uit te kiezen: groeicurvemeting (Growth Curve), adaptieve laboratoriumevolutie (ALE), single factor multi-level analyse (One-factor) en het aanpassen van de bewerkingen volgens experimentele behoeften (Customization). (4) Interface voor het instellen van parameters. Stel hier de bijbehorende experimentele parameters in na het kiezen van één functie. (5) Command run gebied. (6) Schakelaar van de camera. De camera is direct boven de chip geïnstalleerd, die kan worden gebruikt om de druppels in de chip online te observeren. (7) Procesweergavegebied. Toont de looptijd, bewakingsgegevens en de bewerking die wordt uitgevoerd. (B) De parameterinstellingsinterface van adaptieve evolutie. (C) De interface voor het screenen van druppels. De MMC kan de druppels automatisch nummeren. Hier kunnen de doeldruppels worden geselecteerd en uit de MMC worden geëxtraheerd. (D) Camera-observatie-interface. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Monsterinjectie, druppelgeneratie en druppelextractie. (A) De reagensfles na de injectie van bacterieoplossing en MMC-olie. Zowel de bacterie-oplossing als MMC-olie worden vanuit de zijbuis geïnjecteerd. De oliefase bevindt zich in de bovenste laag en de bacterie-oplossing bevindt zich in de onderste laag. Sluit na de injectie de snelkoppeling A en B aan en installeer deze vervolgens in de MMC. (B) Druppelgeneratie in de microfluïdische chip. Om de zichtbaarheid van druppels te verbeteren, werd een rode pigmentoplossing gebruikt om het proces van druppelgeneratie te demonstreren. (C) Druppel opgeslagen in de buis waargenomen door microscoop. Schaalbalk: 400 μm. (D) Pop-upvensterprompts en de bijbehorende bewerkingen. Wanneer de prompt "Trek de CF-snelkoppeling eruit en plaats deze in de EP-buis" verschijnt, trekt u de CF-connector eruit en plaatst u deze in de EP-buis om de doeldruppel te verzamelen; wanneer de prompt "Please insert the connector back" verschijnt, is de druppelverzameling voltooid, steekt u de CF-connector terug in de OF-poort. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Gegevensexport en figuuruitzetting van de groeicurve. (A) Schermafbeelding van een deel van de geëxporteerde gegevens. De geëxporteerde gegevens omvatten elk detectietijdpunt van de 15 gegenereerde druppels en de bijbehorende OD600-waarden. (B) Groeicurve van E. coli MG1655 uitgezet op basis van de uitgevoerde gegevens. Bereken de gemiddelde OD600-waarden en standaarddeviatie (SD) van 15 druppels op elk tijdstip en zet de groeicurve uit. Het is duidelijk te zien dat deze groeicurve de vertragingsfase, logaritmische fase en stationaire fase omvat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Resultaten van de adaptieve evolutie van MeSV2.2 in MMC. (A) Groeicurven van 50 druppels in het hele adaptieve evolutieproces. De OD600-detectiegegevens van 50 druppels tijdens het 18-daagse adaptieve evolutieproces werden geëxporteerd uit de MMC en uitgezet. Op de 18e dag werden 8 druppels, waaronder druppel 6, geëxtraheerd. (B) Groeicurve van de druppel 6 in het hele adaptieve evolutieproces. De maximale OD600-waarden in de eerste generatie en de laatste subkweekperiode waren respectievelijk 0,37 en 0,58, verhoogd met 56,8%. (C) Vergelijking van de stam van druppel 6 en de initiële spanning in de schudkolf. De stam van druppel 6 en de initiële stam werden gekweekt in schudkolven en de groeicurven (inclusief SD, n = 3) werden gemeten. Dit cijfer is aangepast van Jian X. J. et al.13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Onderdelen | Concentratie |
| Na2HPO4·12H2O | 6,78 g/l |
| KH2PO4 | 3 g/L |
| NaCl | 0,5 g/l |
| NH4Cl | 1 g/l |
| vitamine B1 (gesteriliseerd door filtratie) | 0,34 g/l |
| MgSO4·7H2O | 0,049 g/L |
| CaCl2·2H2O | 1,5 mg/l |
| Micro-elementen: | |
| FeCl3·6H2O | 0,5 mg/l |
| ZnSO4·7H2O | 0,09 mg/l |
| CuSO4·5H2O | 0,088 mg/l |
| MnCl2 Zoekertjes | 0,045 mg/l |
| CoCl2·6H2O | 0,09 mg/l |
| gluconaat | 1,09 g/l |
| methanol | 500 mmol/l |
| isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside | 0,1 mmol/L |
| streptomycinesulfaat | 20 μg/ml |
| kanamycinesulfaat | 50 μg/ml |
| Voeg extra 15 g/L agarose toe om vast medium te bereiden. | |
Tabel 1: Componenten van het speciale medium voor MeSV2.2.
| Instelbare parameters | |
| Parameter | Bereik |
| Temperatuur van de teelt | 25–40 °C ± 0,5 °C |
| Aantal druppels | 0–200 |
| Concentratie van entmateriaal | 13.3–86.7 % |
| Concentratie van chemische factor | 8 verschillende concentraties, tot de maximale concentratie van de opgeslagen chemische factor |
| De tijd van onderbouw | Aan de gebruiker |
| Het aantal onderteelten | Aan de gebruiker |
| Golflengte van OD-detectie | 350-800 nm |
| Golflengte van fluorescentiedetectie | Excitatie: 470, 528 nm Emissie: 350–800 nm |
| Nauwkeurigheidsparameters | |
| Parameter | C.V. |
| Volume druppels | 1.88% |
| Concentratie van entmateriaal | <5,0% |
Tabel 2: Instelbare parameters en nauwkeurigheidsparameters van MMC. Instelbare parameters verwijzen naar de parameters die kunnen worden aangepast aan de specifieke vereisten van gebruikers; nauwkeurigheidsparameters verwijzen naar de parameters die de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de verschillende vloeistofbewerkingen weerspiegelen.
Aanvullende figuur 1: Herkenning en detectie van druppels in MMC. (A) De golfvorm van een druppel in MMC. Deze golfvorm is afkomstig van de ruwe spectrale gegevens van de MMC-spectrometer. Na verwerking van de ruwe spectrale gegevens op de achtergrond geeft MMC de gemeten OD-waarde. (B) OD-berekening van druppels in MMC. In de golfvorm van de druppel vertegenwoordigt 'a' de maximale lengte van de druppel, 'c' vertegenwoordigt het boogvormige raakvlak gevormd door oliefase en waterfase en 'b' vertegenwoordigt het grootste deel van de druppel. Op basis van de wet Lambert-Beer wordt de OD-waarde van de druppel berekend met behulp van de volgende formule: OD-waarde = lg(E/D) × 10. 'E' verwijst naar de gemiddelde spectrale signaalwaarde van de oliefase; 'D' verwijst naar de gemiddelde spectrale signaalwaarde van het hoofddeel b van de druppel. Opgemerkt moet worden dat de OD-waarde gemeten door MMC verschilt van die gemeten door een spectrofotometer. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Test van overspraak tussen de druppels. Om te controleren of er kruisverwijzing is tussen de druppels tijdens de langdurige teelt, werd de E. coli MG1655-oplossing verdund tot een zeer lage concentratie (volgens poissonverdeling, λ = 0,1), en vervolgens werden 200 druppels gegenereerd en gedurende 5 dagen gekweekt. Na het meten van de OD bleek dat de E. coli MG1655 in een klein aantal druppeltjes groeide. En er was bijna geen bacteriegroei in de druppels rond deze druppels. Het resultaat laat ook voorlopig zien dat er weinig overspraak is tussen druppels. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Stabiliteit van druppelgeneratie in MMC. Zoals weergegeven in aanvullende figuur 1, heeft de druppel een vaste golfvorm. De spectrometer van MMC genereert een bepaald aantal gegevenspunten per seconde, zodat het aantal gegevenspunten van de druppelgolfvorm de grootte van de druppel kan weerspiegelen. De rode kleurstofoplossing werd gebruikt om 397 druppels in de MMC te genereren en de OD-waarde werd gemeten. De ruwe spectrale gegevens werden geëxporteerd, de gegevenspunten van elke druppelgolfvorm werden geteld en de variatiecoëfficiënt (C.V) van de druppelgegevenspunten werd berekend. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 2: Druppelverdamping in MMC. Hier werd de rode kleurstofoplossing gebruikt om druppels in de MMC te genereren en werden de druppels opgeslagen in de teeltbuis. De buis werd vervolgens gedurende 30 dagen in een incubator met constante temperatuur van 37 °C geplaatst en de druppellengte werd regelmatig gemeten (maak foto's onder een microscoop en meet de lengte met een schaalbalk). Het laat zien dat het volume van de druppel na 30 dagen met ongeveer 12,3% was verminderd, wat aangeeft dat de verdamping van de druppel erg klein is in MMC. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol presenteert hoe het microbiële microdruppelcultuursysteem (MMC) kan worden gebruikt om geautomatiseerde microbiële teelt en adaptieve evolutie op lange termijn uit te voeren. MMC is een geminiaturiseerd, geautomatiseerd en high-throughput microbieel teeltsysteem. In vergelijking met conventionele microbiële teeltmethoden en -instrumenten met hoge doorvoer heeft MMC veel voordelen, zoals een laag arbeids- en reagensverbruik, eenvoudige bediening, online detectie (OD en fluorescentie), gegevensverzameling met hoge tijdresolutie en superieure parallellisatie. MMC heeft ook een aantal speciale voordelen die verschillen van de conventionele druppelmicrofluïdische technologie, die meestal de pL- en nL-druppels gebruikt. De meeste eerder gemelde systemen die pL- en nL-druppels gebruikten, hebben slechte teeltprestaties en weinig detecteerbare parameters (meestal alleen fluorescentie)18,19,20,21. Hoewel er enkele platforms zijn geweest die betere teeltprestaties en detectie van meerdere parameters kunnen bereiken, is het moeilijk en vereist het veel inspanning. Sommige onderzoekers rapporteerden bijvoorbeeld de OD-detectie van pL-druppels. Het is gebaseerd op beeldherkenning, die niet alleen valse positieven heeft, maar ook verdere verificatie van nauwkeurigheid nodig heeft22. MMC kan dit echter op een relatief eenvoudige manier bereiken. MMC maakt gebruik van microliter (μL) druppeltjes die zelden worden gemeld. De superieure microbiële teeltprestaties van MMC zijn geverifieerd en het kan ook OD en fluorescentie direct detecteren. Door het grote volume van de μL druppels is de druppelgeneratie minder storingsgevoelig, wat een hogere stabiliteit heeft. Ondertussen kunnen meer diverse bewerkingen worden uitgevoerd in de microliterdruppels, wat bevorderlijk is voor de realisatie van geautomatiseerde bewerkingen. Bovendien, omdat de druppels leefruimten zijn, kan de vluchtigheid van de inhoud worden onderdrukt (aanvullende tabel 2), wat bevorderlijk is voor het uitvoeren van de microbiële teelt op lange termijn en adaptieve evolutie wanneer vluchtige stoffen bestaan in het medium14. Dit is moeilijk te bereiken in schudkolven en microplaten.
Bepaalde kritische punten in het protocol zijn echter de moeite waard om te benadrukken. Ten eerste moet worden opgemerkt dat de OD-waarde gemeten door MMC verschilt van die van een spectrofotometer omdat hun optische padlengtes van OD-meting anders zijn (respectievelijk 1 mm en 10 mm). Daarom is het noodzakelijk om bij het vergelijken van de OD-waarde van MMC met die van schudkolven de kalibratiecurve13 te meten. Gelukkig vereist het adaptieve evolutieproces geen kalibratiecurves omdat we ons richten op de relatieve trends tussen de groeicurves. Vervolgens zijn bepaalde micro-organismen ongecultiveerd in MMC. De druppels vertrouwen op de oppervlaktespanning van de olie-water interface om de stabiliteit te behouden23. Als de micro-organismen bepaalde stoffen produceren die de oppervlaktespanning van het olie-water-interface verstoren, zoals sommige Bacillus subtilis-stammen die oppervlakteactieve stoffen24 produceren, kunnen de druppels de stabiliteit niet handhaven. Bovendien, als het medium zelf een obstakel vormt voor het genereren van druppels, is het niet haalbaar om te worden gebruikt in MMC, bijvoorbeeld zeer viskeus medium of medium met grote deeltjes. Op dit moment omvat de soort die we met succes in MMC hebben gekweekt E. coli, Lactobacillus plantarum, Corynebacterium glutamicum, gisten, Methylobacterium extorquens, Aspergillus oryzae, microalgen enzovoort. Het wordt aanbevolen om de soort in MMC te kweken voor een voorlopig experiment. Ten slotte moeten de connectoren en poorten tussen de chip, de reagensfles en de MMC strikt volgens het protocol worden aangesloten. Anders kan de bacterie-oplossing in de MMC stromen en het interieur besmetten. Bovendien moet erop worden gewezen dat de huidige doorvoer van MMC beperkt is (0-200), vanwege de tijd die nodig is voor de activiteiten van onderteelt. In de toekomst zullen we de besturingssoftware en de grootte van de chip optimaliseren om de tijd te verkorten en de doorvoer te verbeteren. Omdat MMC een modulair systeem is, hoeven alleen gerelateerde onderdelen of software te worden vervangen zonder dat er nieuwe apparatuur nodig is.
Op dit moment kan MMC niet alleen groeicurvemetingen, adaptieve laboratoriumevolutie en single-factor multi-level analyse uitvoeren, maar ook worden gebruikt om verschillende druppelbewerkingsprocedures aan te passen om aan experimentele behoeften te voldoen. In de toekomst is het noodzakelijk om de toepassingsfuncties van het MMC-systeem verder te verrijken als reactie op de verschillende behoeften van microbieel onderzoek, zoals het uitvoeren van de multi-factor multi-level orthogonale experimenten, multi-sample automatische bemonsteringstechnologie om tegelijkertijd de groeicurven van meerdere bacteriesoorten te meten, en nauwkeurig detecteren en controleren van meer parameters (bijv. Opgeloste zuurstof (DO) en pH). Tegelijkertijd is het ook noodzakelijk om meer functies op het gebied van microbiologie te ontwikkelen om MMC toe te passen op meer praktische scenario's, zoals optimalisatie van mediumsamenstellingen, bepaling van minimale remmende concentratie (MIC), co-teelt van micro-organismen25, enz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door het National Key Research and Development Program van China (2018YFA0901500), het National Key Scientific Instrument and Equipment Project van de National Natural Science Foundation of China (21627812) en het Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). We danken ook Prof. Julia A. Vorholt (Instituut voor Microbiologie, Afdeling Biologie, ETH Zürich, Zürich 8093, Zwitserland) voor de levering van de methanol-essentiële E. coli stam versie 2.2 (MeSV2.2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
| 4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
| Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
| EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
| FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
| Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
| High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
| isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
| Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
| Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
| Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
| Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
| Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
| Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
| Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
| Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
| UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
| Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
References
- Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
- Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O.
- Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
- Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).
- Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
- Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
- Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
- Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
- Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P.
- Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
- Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
- Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
- Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).
- Meyer, F., et al.
- Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. The introduction of MMC. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. , Available from: http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 (2021).
- Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
- Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
- Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
- Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
- Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
- Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998 (2020).
- Baret, J. C.
- Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
- Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).
