Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام نظام زراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC) لإجراء الزراعة الميكروبية الآلية والتطور التكيفي. يمكن ل MMC زراعة الكائنات الحية الدقيقة وزراعتها بشكل تلقائي ومستمر ومراقبة نموها عبر الإنترنت بإنتاجية عالية نسبيا وتوازي جيد ، مما يقلل من استهلاك العمالة والكواشف.
Abstract
عادة ما يكون لطرق زراعة الميكروبات التقليدية عمليات مرهقة ، وإنتاجية منخفضة ، وكفاءة منخفضة ، واستهلاك كبير للعمالة والكواشف. وعلاوة على ذلك، فإن طرق الزراعة عالية الإنتاجية القائمة على الصفائح الدقيقة التي تم تطويرها في السنوات الأخيرة لها حالة نمو ميكروبية ضعيفة وتوازي تجريبي بسبب انخفاض الأكسجين المذاب، وضعف الخليط، والتبخر الشديد والتأثير الحراري. نظرا للعديد من مزايا القطرات الدقيقة ، مثل الحجم الصغير ، والإنتاجية العالية ، والقدرة القوية على التحكم ، يمكن لتقنية الموائع الدقيقة القائمة على القطرات التغلب على هذه المشكلات ، والتي تم استخدامها في العديد من أنواع الأبحاث حول زراعة الميكروبات عالية الإنتاجية وفحصها وتطورها. ومع ذلك ، لا تزال معظم الدراسات السابقة في مرحلة بناء المختبرات وتطبيقها. بعض القضايا الرئيسية ، مثل المتطلبات التشغيلية العالية ، وصعوبة البناء العالية ، ونقص تكنولوجيا التكامل الآلي ، تحد من التطبيق الواسع لتكنولوجيا الموائع الدقيقة بالقطرات في البحوث الميكروبية. هنا ، تم تطوير نظام آلي لزراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC) بنجاح استنادا إلى تقنية الموائع الدقيقة للقطرات ، مما يحقق تكامل وظائف مثل التلقيح والزراعة والمراقبة عبر الإنترنت والزراعة الفرعية والفرز وأخذ العينات التي تتطلبها عملية زراعة القطرات الميكروبية. في هذا البروتوكول ، تم أخذ الإشريكية القولونية من النوع البري (E. coli) MG1655 وسلالة E. coli الأساسية للميثانول (MeSV2.2) كأمثلة لتقديم كيفية استخدام MMC لإجراء الزراعة الميكروبية الآلية وعالية الإنتاجية نسبيا والتطور التكيفي بالتفصيل. هذه الطريقة سهلة التشغيل ، وتستهلك كمية أقل من العمالة والكواشف ، ولها إنتاجية تجريبية عالية وتوازي جيد للبيانات ، والتي تتمتع بمزايا كبيرة مقارنة بطرق الزراعة التقليدية. ويوفر منصة تجريبية منخفضة التكلفة وصديقة للعمليات وموثوقة النتائج للباحثين العلميين لإجراء البحوث الميكروبية ذات الصلة.
Introduction
تعد الزراعة الميكروبية أساسا مهما للبحث العلمي الميكروبيولوجي والتطبيقات الصناعية ، والتي تستخدم على نطاق واسع في عزل وتحديد وإعادة بناء وفحص وتطور الكائنات الحية الدقيقة1،2،3. تستخدم طرق الزراعة الميكروبية التقليدية بشكل أساسي أنابيب الاختبار ، وقوارير الاهتزاز ، والألواح الصلبة كحاويات زراعة ، إلى جانب حاضنات الاهتزاز ، وأجهزة قياس الطيف الضوئي ، وقارئات الصفائح الدقيقة ، وغيرها من المعدات للزراعة الميكروبية والكشف عنها وفحصها. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب لديها العديد من المشاكل ، مثل العمليات المرهقة ، والإنتاجية المنخفضة ، والكفاءة المنخفضة ، والاستهلاك الكبير للعمالة والكواشف. تعتمد طرق الزراعة عالية الإنتاجية التي تم تطويرها في السنوات الأخيرة بشكل أساسي على الصفائح الدقيقة. لكن الصفيحة الدقيقة لديها مستوى منخفض من الأكسجين المذاب ، وخاصية خلط ضعيفة ، وتبخر شديد وتأثير حراري ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى ضعف حالة النمو وتجربة توازي الكائنات الحية الدقيقة4،5،6،7 ؛ من ناحية أخرى ، يجب أن تكون مجهزة بمعدات باهظة الثمن ، مثل محطات العمل التي تتعامل مع السوائل وأجهزة قراءة الصفائح الدقيقة ، لتحقيق الزراعة الآلية والكشف عن العملية 8,9.
كفرع مهم من تكنولوجيا الموائع الدقيقة ، تم تطوير الموائع الدقيقة بالقطيرات في السنوات الأخيرة بناء على أنظمة الموائع الدقيقة التقليدية ذات التدفق المستمر. إنها تقنية ميكروفلويديك منفصلة التدفق تستخدم مرحلتين سائلتين غير قابلتين للامتزاج (عادة ما يكون الزيت والماء) لتوليد قطرات صغيرة مشتتة والعمل عليها10. نظرا لأن القطرات الدقيقة لها خصائص الحجم الصغير ، ومساحة السطح المحددة الكبيرة ، وارتفاع معدل نقل الكتلة الداخلية ، وعدم وجود تلوث متقاطع ناتج عن التقسيم ، ومزايا التحكم القوي والإنتاجية العالية للقطرات ، فقد كانت هناك أنواع كثيرة من الأبحاث التي تطبق تقنية الموائع الدقيقة للقطرات في زراعة الكائنات الحية الدقيقة وفحصها وتطورهاعالية الإنتاجية 11 . ومع ذلك ، لا تزال هناك سلسلة من القضايا الرئيسية لجعل تكنولوجيا الموائع الدقيقة القطيرات شائعة وتطبق على نطاق واسع. أولا ، يعد تشغيل الموائع الدقيقة بالرذاذ مرهقا ومعقدا ، مما يؤدي إلى متطلبات تقنية عالية للمشغلين. ثانيا ، تجمع تقنية الموائع الدقيقة بالقطرات بين المكونات البصرية والميكانيكية والكهربائية ويجب أن ترتبط بسيناريوهات تطبيق التكنولوجيا الحيوية. من الصعب على مختبر واحد أو فريق واحد بناء أنظمة فعالة للتحكم في الموائع الدقيقة بالقطرات إذا لم يكن هناك تعاون متعدد التخصصات. ثالثا ، نظرا لصغر حجم القطرات الدقيقة (من بيكوليتر (pL) إلى ميكرولتر (μL)) ، يتطلب الأمر صعوبة كبيرة لتحقيق التحكم الآلي الدقيق والكشف الفوري عبر الإنترنت عن القطرات لبعض العمليات الميكروبية الأساسية مثل الزراعة الفرعية والفرز وأخذ العينات ، ومن الصعب أيضا بناء نظام معدات متكامل12.
من أجل معالجة المشاكل المذكورة أعلاه ، تم تطوير نظام تلقائي لزراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC) بنجاح استنادا إلى تقنية الموائع الدقيقةللقطرات 13. يتكون MMC من أربع وحدات وظيفية: وحدة التعرف على القطرات ، ووحدة الكشف عن طيف القطرات ، ووحدة رقاقة الموائع الدقيقة ، ووحدة أخذ العينات. من خلال تكامل النظام والتحكم في جميع الوحدات ، يتم إنشاء نظام التشغيل الآلي بما في ذلك التوليد والزراعة والقياس (الكثافة البصرية (OD) والتألق) ، والانقسام ، والانصهار ، وفرز القطرات بدقة ، وتحقيق تكامل وظائف مثل التلقيح والزراعة والرصد والزراعة الفرعية والفرز وأخذ العينات التي تتطلبها عملية زراعة القطرات الميكروبية. يمكن أن تستوعب MMC ما يصل إلى 200 وحدة زراعة قطرات مكررة بحجم 2-3 ميكرولتر ، وهو ما يعادل 200 وحدة زراعة قارورة اهتزاز. يمكن لنظام زراعة القطرات الدقيقة تلبية متطلبات عدم التلوث والأكسجين المذاب والخلط وتبادل الطاقة الكتلية أثناء نمو الكائنات الحية الدقيقة ، وتلبية الاحتياجات المختلفة للبحوث الميكروبية من خلال وظائف متكاملة متعددة ، على سبيل المثال ، قياس منحنى النمو ، والتطور التكيفي ، والتحليل متعدد المستويات أحادي العامل ، وأبحاث وتحليل الأيض (استنادا إلى الكشف عن التألق)13،14.
هنا ، يقدم البروتوكول كيفية استخدام MMC لإجراء الزراعة الآلية والميكروبية والتطور التكيفي بالتفصيل (الشكل 1). أخذنا الإشريكية القولونية من النوع البري (E. coli) MG1655 كمثال لإثبات قياس منحنى النمو وسلالة E. coli الأساسية للميثانول MeSV2.215 لإثبات التطور التكيفي في MMC. تم تطوير برنامج تشغيل ل MMC ، مما يجعل العملية بسيطة وواضحة للغاية. في العملية برمتها ، يحتاج المستخدم إلى إعداد محلول البكتيريا الأولي ، وتعيين شروط MMC ، ثم حقن محلول البكتيريا والكواشف ذات الصلة في MMC. في وقت لاحق ، ستقوم MMC تلقائيا بتنفيذ عمليات مثل توليد القطرات ، والتعرف عليها وترقيمها ، والزراعة ، والتطور التكيفي. كما سيقوم بإجراء الكشف عبر الإنترنت (OD والتألق) للقطرات بدقة زمنية عالية وعرض البيانات ذات الصلة (التي يمكن تصديرها) في البرنامج. يمكن للمشغل إيقاف عملية الزراعة في أي وقت وفقا للنتائج واستخراج القطرات المستهدفة للتجارب اللاحقة. إن MMC سهل التشغيل ، ويستهلك كمية أقل من العمالة والكواشف ، ولديه إنتاجية تجريبية عالية نسبيا وتوازي جيد للبيانات ، مما يتمتع بمزايا كبيرة مقارنة بطرق الزراعة التقليدية. ويوفر منصة تجريبية منخفضة التكلفة وسهلة التشغيل وقوية للباحثين لإجراء البحوث الميكروبية ذات الصلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تركيب الأدوات والبرامج
- اختر بيئة نظيفة ومعقمة (مثل مقعد نظيف) كمساحة دائمة مخصصة ل MMC. تثبيت MMC بثبات في الفضاء.
ملاحظة: حافظ على MMC بعيدا عن تداخل المجالات الكهربائية القوية والمجالات المغناطيسية ومصادر الإشعاع الحراري القوية. تجنب الاهتزاز الشديد من التأثير على مكونات الكشف البصري. توفير مصدر الطاقة AC220 فولت ، 50 هرتز إلى MMC. للحصول على تفاصيل حول MMC ، راجع جدول المواد والموقع الإلكتروني الخاص ب MMC16. - تثبيت برنامج التشغيل من ملف MMC.zip
ملاحظة: اتصل بالمؤلفين للحصول على ملف MMC.zip.- قم بإنشاء مجلد مخصص واحفظ الملف المضغوط فيه.
- قم بإنشاء مجلد مخصص آخر باسم "دليل التثبيت". قم بفك ضغط MMC .zip واحفظ الملفات في المجلد الجديد.
ملاحظة: تكوين الكمبيوتر هو الأفضل لتلبية ما يلي: (1) نظام التشغيل Windows 7 64 بت أو أعلى; (2) وحدة المعالجة المركزية: i5 أو أعلى؛ (3) الذاكرة: 4 غيغابايت أو أعلى؛ (4) القرص الثابت: 300 غيغابايت أو أعلى (سرعة دوران أكبر من 7200 دورة في الدقيقة أو قرص الحالة الصلبة).
2. التحضيرات
- قم بتوصيل إبرة المحقنة (القطر الداخلي 0.41 مم والقطر الخارجي 0.71 مم) ، الموصل السريع A ، وزجاجة الكاشف (الشكل 2C) ، وأوتوكلافها عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: قم بفك غطاء زجاجة الكاشف قليلا أثناء التعقيم. يمكن تحضير عدد قليل من زجاجات الكاشف في كل مرة للاستخدام. - استخدم مرشح فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) 0.22 ميكرومتر لتصفية زيت MMC. ضع رقاقة الموائع الدقيقة (الشكل 2B) وزيت MMC في المقعد النظيف مقدما وقم بتعقيمهما عن طريق التشعيع فوق البنفسجي لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
ملاحظة: للحصول على تفاصيل الموصل السريع A وزجاجة الكاشف وزيت MMC وشريحة الموائع الدقيقة ، راجع جدول المواد. - تثبيت رقاقة الموائع الدقيقة
- افتح باب غرفة العمليات (الشكل 2A) وارفع مسبار الألياف البصرية.
- قم بمحاذاة ثقوب المجال الكهربائي مع إبر المجال الكهربائي ووضع الشريحة برفق على قاعدة الرقاقة. ثم أدخل عمودي تحديد المواقع في فتحات تحديد المواقع ووضع مسبار الألياف البصرية (الشكل 2D).
- قم بتوصيل الموصل السريع A الموجود على الشريحة بالمنفذ المقابل ل MMC وفقا لرقم الموضع (C5-O5 و C4-O4 و C6-O6 و C2-O2 و CF-OF و C1-O1 و C3-O3). ثم أغلق باب غرفة العمليات.
- قم بتجديد زيت MMC (إلى حوالي 80 مل) في زجاجة الزيت وقم بإفراغ سائل النفايات في زجاجة النفايات قبل الاستخدام.
ملاحظة: عادة ما يكون سائل النفايات نفايات عضوية. يرجى الرجوع إلى القانون واللوائح الإقليمية عند التخلص منها ، رهنا بالتغيير بناء على الإعداد التجريبي.
3. قياس منحنى النمو في MMC
- التحضير للمحلول البكتيري الأولي
- اتبع اللوائح القياسية ذات الصلة لإعداد لوريا بيرتاني (LB) المتوسطة والأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: مكونات وسط LB: كلوريد الصوديوم (10 جم / لتر) ، مستخلص الخميرة (5 جم / لتر) والتريبتون (10 جم / لتر). - أخرج سلالة E. coli MG1655 من مخزون الجلسرين وقم بزراعتها في قارورة اهتزاز سعة 50 مل مع 10 مل من وسط LB في حاضنة تهتز (200 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 5-8 ساعات.
ملاحظة: يعتمد وقت الزراعة على السلالات المحددة. من الأفضل زراعة السلالة إلى الفترة / المرحلة اللوغاريتمية. - قم بتخفيف محلول E. coli MG1655 المستزرع بوسط طازج إلى OD600 من 0.05-0.1 للحصول على محلول بكتيريا أولي (تحضير حوالي 10 مل).
- اتبع اللوائح القياسية ذات الصلة لإعداد لوريا بيرتاني (LB) المتوسطة والأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- انقر فوق تهيئة لتهيئة MMC. بعد ظهور واجهة التهيئة ، اضبط درجة حرارة الزراعة على 37 درجة مئوية وقيمة الإشارة الكهروضوئية على 0.6 (الشكل 3A). ستستغرق التهيئة حوالي 20 دقيقة.
- قم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي 254 نانومتر) أثناء التهيئة.
- حقن محلول البكتيريا الأولي وزيت MMC في زجاجة الكاشف.
- أخرج زجاجة كاشف معقمة على المقعد النظيف وشد الغطاء.
- استخدم حقنة معقمة سعة 10 مل لحقن 3-5 مل من زيت MMC من إبرة المحقنة في الأنبوب الجانبي. قم بإمالة وتدوير زجاجة الكاشف ببطء لجعل الزيت يتسلل بالكامل إلى الجدار الداخلي.
- حقن حوالي 5 مل من محلول البكتيريا الأولي ، ثم املأ زجاجة الكاشف عن طريق حقن 5-7 مل من الزيت مرة أخرى.
- اسحب الموصل السريع المستقل A للخارج، وأدخل الموصل السريع A من زجاجة الكاشف في الموصل السريع B لإكمال عملية حقن العينة (الشكل 4A).
- انتظر حتى تنتهي التهيئة ثم قم بإيقاف تشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي 254 نانومتر).
- افتح باب غرفة العمليات ، وضع زجاجة الكاشف في الحمام المعدني.
- اسحب موصل C2 الخاص بالشريحة والموصل السريع A لزجاجة الكاشف. قم بتوصيل موصل الأنبوب الجانبي لزجاجة الكاشف بموصل C2 وموصل الأنبوب العلوي بموصل O2. ثم أغلق باب غرفة العمليات.
- انقر على منحنى النمو لاختيار وظيفة قياس منحنى النمو (الشكل 3A). في واجهة إعداد المعلمة ، أدخل الرقم على أنه 15 ، وقم بتشغيل مفتاح اكتشاف OD واضبط الطول الموجي على 600 نانومتر. انقر فوق ابدأ لبدء توليد القطيرات. سوف يستغرق حوالي 10 دقائق.
ملاحظة: هنا ، يشير الرقم إلى عدد القطرات التي سيتم إنشاؤها. يشير الطول الموجي إلى الطول الموجي ل OD المراد اكتشافه. اضبط الرقم (الحد الأقصى 200) والطول الموجي (350-800 نانومتر) وفقا لمتطلبات التجربة. - عندما تظهر نافذة منبثقة على الواجهة الرئيسية تطالب "بإزالة زجاجة الكاشف بين C2 و O2 ، فيرجى النقر فوق الزر موافق ( OK) بعد الانتهاء" ، افتح باب غرفة التشغيل لإخراج زجاجة الكاشف وتوصيل موصلات C2 و O2.
- أغلق الباب، وانقر فوق الزر موافق ( OK ) في النافذة المنبثقة لزراعة القطرات تلقائيا واكتشاف قيم OD.
ملاحظة: يكتشف MMC قيمة OD عندما تمر القطرة بمسبار الألياف البصرية. لذلك ، تعتمد فترة الكشف على عدد القطرات التي تم إنشاؤها. - عندما يصل منحنى النمو إلى المرحلة الثابتة، انقر فوق الزر تصدير البيانات لتصدير بيانات OD. حدد مسار حفظ البيانات وقم بتصدير قيمة OD المسجلة خلال فترة الزراعة بتنسيق .csv ، والتي يمكن فتحها بواسطة برنامج مناسب (على سبيل المثال ، Microsoft Excel). ثم استخدم برنامج تعيين (على سبيل المثال ، EXCEL و Origin 9.0) لرسم منحنى النمو.
ملاحظة: أثناء عملية الزراعة ، من الممكن النقر فوق تصدير البيانات في أي وقت لتصدير بيانات OD لجميع القطرات الحالية.
4. التطور التكيفي في MMC
- التحضير للمحلول البكتيري الأولي
- اتبع اللوائح القياسية ذات الصلة لإعداد الألواح المتوسطة والصلبة السائلة الخاصة ل MeSV2.2 والأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: للاطلاع على مكونات الوسيط الخاص، يرجى الرجوع إلى الجدول 1 وجدول المواد. - قم بزراعة MeSV2.2 باستخدام اللوحة الصلبة (قطرها = 90 مم) في حاضنة درجة حرارة ثابتة 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. ثم اختر مستعمرة مستقلة وقم بزراعتها في قارورة اهتزاز سعة 50 مل مع 10 مل من الوسط السائل الخاص في حاضنة اهتزاز (200 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
- قم بتخفيف محلول MeSV2.2 المستزرع بمتوسط OD600 من 0.1-0.2 (تأكد من أن الحجم الإجمالي لا يقل عن 10 مل) واستمر في زراعته في قارورة الاهتزاز لمدة 5 ساعات للحصول على محلول البكتيريا الأولي.
ملاحظة: MeSV2.2 هي سلالة E. coli أساسية من الميثانول. يحتوي الوسط السائل الخاص على 500 مليمول / لتر من الميثانول ، وهو إجهاد قوي ل MeSV2.2 ، مما يؤدي إلى نمو بطيء للغاية. لاحظ أن الحصول على محلول البكتيريا الأولي هنا يختلف عن ذلك الموضح في الخطوة 3.1.
- اتبع اللوائح القياسية ذات الصلة لإعداد الألواح المتوسطة والصلبة السائلة الخاصة ل MeSV2.2 والأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- تهيئة MMC كما هو موضح في الخطوات 3.2 و 3.3 و 3.5.
- أخرج زجاجتين من الكاشف المعقم ، أحدهما لمحلول البكتيريا الأولي والآخر للوسط الطازج. حقن محلول البكتيريا الأولي (5 مل) ، والوسط الطازج (12-15 مل) ، وزيت MMC في زجاجات الكاشف كما هو موضح في الخطوة 3.4.
ملاحظة: بما أن التطور التكيفي هو عملية طويلة الأجل تنطوي على زراعة فرعية متعددة ، قم بتخزين أكبر قدر ممكن من الوسائط الطازجة في MMC. لا يمكن تجديد الوسيط أثناء تشغيل التجربة. - قم بتثبيت زجاجتي الكاشف في MMC كما هو موضح في الخطوة 3.6. قم بتثبيت واحد لمحلول البكتيريا الأولي بين موصل C2 و O2 والآخر للوسط الطازج بين موصل C4 و O4.
- انقر على ALE لاختيار وظيفة التطور التكيفي (الشكل 3B). في واجهة إعداد المعلمة، قم بتشغيل مفتاح اكتشاف OD .
- اضبط الرقم على أنه 50، والطول الموجي على أنه 600 نانومتر، والتركيز على أنه 0٪، واكتب كوقت، والمعلمة على أنها 30 ساعة، والتكرار على أنه 99. انقر فوق ابدأ لبدء توليد القطيرات. سوف يستغرق حوالي 25 دقيقة.
ملاحظة: هنا ، يشير "التركيز" إلى الحد الأقصى لتركيز العوامل الكيميائية للتطور التكيفي. بالنسبة للقطرات المختلفة ، يمكن تحقيقها في MMC لإدخال تركيزات مختلفة من العوامل الكيميائية لتوفير ظروف نمو مختلفة. احسب التركيزات المقدمة باستخدام المعادلة التالية:
هنا يشير "C" إلى تركيز العوامل الكيميائية التي يتم إدخالها في القطرات. تشير "أ" إلى تركيز العوامل الكيميائية في زجاجات الكواشف بين الموصل C4 و O4 ؛ يشير الحرف "ب" إلى تركيز العوامل الكيميائية في زجاجات الكواشف بين الموصل C6 و O6 ؛ ويشير "i" إلى التركيز المتاح. هناك ثمانية تركيزات متاحة في MMC. نظرا لأن العامل الكيميائي هنا يحتوي على تركيز واحد (500 مليمول / لتر ميثانول) وهو أحد مكونات الوسط ، يتم تثبيت زجاجة كاشف واحدة فقط تحتوي على العامل الكيميائي هنا ، ويتم تعيين التركيز على 0٪. يشير النوع إلى وضع الزراعة الفرعية ، والذي ينقسم إلى ثلاثة أنواع: الوضع الزمني ، ووضع قيمة OD ، ووضع التألق. الأول يعني زراعة القطرات لفترة محددة ثم زراعتها دون المستوى ، في حين أن الأخيرين يعنيان زراعة القطرات لقيمة OD المحددة مسبقا / كثافة التألق ثم زراعتها الفرعية. تشير المعلمة إلى المعلمة ذات الصلة المطلوبة عند اختيار وضع الزراعة الفرعية. يشير التكرار إلى عدد الزراعات الفرعية. - قم بإزالة زجاجة الكاشف الموضوعة بين موصل C2 و O2 كما هو موضح في الخطوة 3.8.
- لاحظ ما إذا كانت القيم القصوى ل OD للقطرات خلال كل فترة زراعة فرعية قد زادت بشكل كبير. في حالة حدوث الزيادة وتلبية متطلبات التجربة ، انقر فوق الزر تصدير البيانات لتصدير بيانات OD كما هو موضح في الخطوة 3.9.
ملاحظة: هنا ، تعتمد فترة الزراعة الفرعية على المعلمة. على سبيل المثال ، عند تعيين النوع كوقت والمعلمة على أنها 30 ساعة ، تكون فترة الزراعة الفرعية 30 ساعة. خلال كل فترة زراعة فرعية ، هناك الحد الأقصى لقيم OD للقطرات. تقدير ما إذا كان التطور التكيفي يفي بمتطلبات التجربة من خلال زيادة الحد الأقصى لقيم OD (تعتمد الزيادة على عملية الزراعة الفعلية للسلالة ، على سبيل المثال ، زادت بأكثر من 20٪).
تنبيه: انتبه إلى ما إذا كان الوسط الطازج المخزن قد استنفد. إذا لم تحدث الزيادة الكبيرة حتى بعد استنفاد الوسط ، فاستخرج القطرات الأفضل نموا وقم بإجراء جولة جديدة من التطور التكيفي. - استخراج قطرات الهدف من MMC.
- انقر على زر الفحص لاختيار وظيفة استخراج القطيرات (الشكل 3C). اختر خيار التجميع ، وانقر فوق عدد القطرات المستهدفة ، ثم انقر فوق موافق.
ملاحظة: يشمل فحص القطرات "جمع" و "تجاهل" و "استخراج محلول البذور". "استخراج محلول البذور" يعني جمع القطرات المتبقية13 بعد عملية الزراعة الفرعية. - انتظر حتى تطالب النافذة المنبثقة ، "يرجى سحب الموصل السريع CF ووضعه في أنبوب EP". ضع الموصل السريع CF في أنبوب الطرد المركزي الدقيق للجمع وفقا لموجه البرنامج ثم انقر فوق OK (الشكل 4D).
- بعد 1-2 دقيقة ، ستظهر واجهة البرنامج نافذة جديدة تطالب ، "يرجى إدخال الموصل مرة أخرى والنقر فوق موافق إذا انتهى". ثم أدخل موصل CF السريع مرة أخرى وانقر فوق موافق لجعل MMC يستمر في التشغيل (الشكل 4D). عندما تصل القطرة المستهدفة التالية إلى موقع التعرف على القطرات ، كرر 4.9.2-4.9.3 لجمعها.
ملاحظة: بعد جمع جميع القطرات المستهدفة ، ستواصل MMC زراعة القطرات المتبقية. إذا لم تكن الزراعة ضرورية ، فانقر فوق إيقاف لإنهاء العملية مباشرة. - استخرج القطيرة باستخدام ماصة 2.5 ميكرولتر ، وأسقطها على لوحة الأغاروز مقاس 90 مم ، وانشرها بالتساوي باستخدام قضيب نشر زجاجي مثلث بطول ضلع يبلغ 3 سم. ثم قم بزراعته في حاضنة درجة حرارة ثابتة 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
- اختر 3-5 مستعمرات مستقلة وقم بزراعتها بشكل منفصل في قوارير الاهتزاز سعة 50 مل مع 10 مل من الوسط الطازج في حاضنة تهتز (200 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 48-72 ساعة. اتبع اللوائح القياسية ذات الصلة لتخزين محلول البكتيريا المستزرعة في أنبوب الجلسرين للتجارب اللاحقة.
- انقر على زر الفحص لاختيار وظيفة استخراج القطيرات (الشكل 3C). اختر خيار التجميع ، وانقر فوق عدد القطرات المستهدفة ، ثم انقر فوق موافق.
5. نظيفة من MMC
- بعد الانتهاء من التجربة ، انقر فوق إيقاف لإيقاف جميع العمليات. ثم انقر فوق تنظيف لتنظيف الشريحة والأنابيب. سوف يستغرق حوالي 15 دقيقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يستخدم هذا البروتوكول E. coli MG1655 وسلالة MeSV2.2 كأمثلة لإثبات الزراعة الميكروبية والتطور التكيفي الأساسي للميثانول مع استراتيجية آلية وعالية الإنتاجية نسبيا في MMC. تم استخدام قياس منحنى النمو بشكل رئيسي لتوصيف الزراعة الميكروبية. تم إجراء التطور التكيفي عن طريق الزراعة الفرعية المستمرة الآلية وإضافة تركيز عال من الميثانول كضغط انتقائي خلال كل زراعة فرعية. وقدر ما إذا كان التطور التكيفي قد تحقق من خلال اتجاه التباين في القيمة القصوى للاستنفاد النمطي للقطرات خلال كل فترة زراعة فرعية. ويبين الجدول 2 المعلمات القابلة للضبط ومعلمات الدقة الخاصة ب MMC.
نتائج قياس منحنى النمو
تم تصدير قيم OD600 من القطرات ال 15 المكتشفة أثناء عملية الزراعة من MMC بعد الزراعة لمدة 20 ساعة تقريبا (الشكل 5A). يمكن ملاحظة أن الكشف تم إجراؤه كل 14 دقيقة تقريبا. تعتمد فترة الكشف هذه على عدد القطرات المتولدة لأن القطرات يتم تدويرها ذهابا وإيابا في الأنابيب للزراعة ، ولا تكتشف وحدة الكشف سوى قيم OD (يتم عرض الكشف عن قيمة OD وحسابها في الشكل التكميلي 1) عندما تمر القطرات بمسبار الألياف البصرية. لذلك ، فإن 14 دقيقة هي فترة اكتشاف قصيرة جدا ، مما يوفر عملية اكتشاف عالية الدقة لتعكس نمو الكائنات الحية الدقيقة بشكل أكثر دقة.
ووفقا للبيانات المصدرة، تم حساب متوسط قيم OD600 والانحراف المعياري (SD) البالغ 15 قطرة في كل نقطة زمنية، وتم رسم منحنى نمو الإشريكية القولونية MG1655 (الشكل 5B). أظهرت النتائج أن منحنى النمو يقدم شكل "S" ، بما في ذلك مرحلة التأخر ، والطور اللوغاريتمي ، والطور الثابت ، وهو ما يتفق تماما مع نموذج النمو الميكروبي الكلاسيكي. في الوقت نفسه ، فإن الانحرافات المعيارية ل 15 قطرة صغيرة جدا ، مما يشير إلى اتساق النمو الجيد والتوازي. وبالتالي ، فإنه يوضح تماما أداء الزراعة والكشف الميكروبي الجيد ل MMC. وعلاوة على ذلك، تم التحقق أيضا من وجود القليل من الأحاديث المتبادلة بين القطرات أثناء الزراعة (الشكل التكميلي 2 والجدول التكميلي 1).
نتائج التطور التكيفي
لقد أجرينا تطورا تكيفيا طويل الأجل ل MeSV2.2 في MMC. فياليوم 18 ، وفقا للاتجاه المتزايد للحد الأقصى لقيم OD600 للقطرات خلال كل فترة زراعة فرعية من منحنيات النمو المعروضة على واجهة البرنامج ، اعتقدنا أنه تم تحقيق تطور تكيفي جيد في 50 قطرة. تم تصدير بيانات OD600 وتم استخراج 8 قطرات (بما في ذلك قطرات 6) ذات أداء نمو جيد نسبيا13. يوضح الشكل 6A منحنيات نمو 50 قطرة في عملية التطور التكيفي بأكملها. في غضون 18 يوما ، نفذت MMC تلقائيا 13 عملية زراعة فرعية. يمكن ملاحظة الشكل 6A أن MeSV2.2 ينمو ببطء أولا وبسرعة بعد ذلك ، مما يشير إلى مسار التطور التكيفي في MeSV2.2. لتوفير ضغط الاختيار ، تمت إضافة الميثانول إلى وسط MeSV2.2. في البداية ، منع الميثانول نمو الخلايا. بعد التطور التكيفي ، كان للخلايا المخصبة المتكيفة مع الميثانول معدل نمو أعلى. تم رسم منحنى نمو القطيرة 6 في عملية التطور التكيفي بأكملها بشكل منفصل (الشكل 6B). وكان الحد الأقصى لقيم OD600 في الجيل الأول وفترة الزراعة الفرعية الأخيرة 0.37 و 0.58 ، على التوالي ، بزيادة قدرها 56.8 ٪. يشير إلى أن السلالة في القطرة 6 قد حققت تطورا تكيفيا واضحا.
في وقت لاحق ، تم زراعة سلالة قطرة 6 وسلالة أولية في قوارير الاهتزاز ، وتمت مقارنة منحنيات نموها (الشكل 6C). وفقا للطرق الواردة في الأدبيات17,18 ، تم حساب الحد الأقصى لمعدلات النمو المحددة (μكحد أقصى) لسلالة قطرة 6 والسلالة الأولية ، والتي كانت 0.096 h-1 و 0.072 h-1 ، على التوالي. يكشف الشكل 6C أن سلالة القطيرات 6 أظهرت معدل نمو محدد أقصى أعلى (زيادة بنسبة 54.8٪) وكان لها تركيز خلايا أعلى في المرحلة الثابتة (زيادة بنسبة 20.0٪) من السلالة الأولية عند زراعتها في قوارير الاهتزاز ، مما يشير أيضا إلى أن التطور التكيفي في MeSV2.2 قد تحقق.
الشكل 1: سير العمل الكلي لقياس منحنى النمو والتطور التكيفي في MMC. (أ) قياس منحنى النمو في MMC. أولا ، قم بزراعة السلالة في قارورة الاهتزاز لإعداد المحلول البكتيري الأولي. ثم ، حقن محلول البكتيريا الأولي في زجاجة الكاشف. بعد ذلك ، قم بإنشاء قطرات في MMC. MMC يجعل القطرات تدور ذهابا وإيابا في رقاقة الموائع الدقيقة والأنابيب لزراعتها. عندما تمر القطرات عبر موقع الكشف ، سيتم اكتشاف بيانات OD وتسجيلها. أخيرا ، قم بتصدير البيانات لتحليلها. (ب) التطور التكيفي في MMC. اختر مستعمرة واحدة من صفيحة الأغاروز وزرعها في قارورة هز لإعداد المحلول البكتيري الأولي. بعد حقن محلول البكتيريا الأولي في زجاجة الكاشف ، قم بإجراء التطور التكيفي في MMC. يتضمن التطور التكيفي زراعة فرعية مستمرة ، والتي يمكن تشغيلها تلقائيا من خلال تقسيم القطيرات والانصهار. بعد التطور التكيفي ، قم بتصدير البيانات للتحليل. يمكن استخراج القطرات المستهدفة ثم نشرها على اللوحة للحصول على مستعمرات واحدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: هيكل MMC وأدواته الأساسية. (أ) الغرفة الخارجية وغرفة العمليات التابعة لشركة MMC. (ب) رقاقة الموائع الدقيقة ل MMC. تحتوي الشريحة على سبع قنوات (C1-C6 و CF). (ج) زجاجة كاشف. لديها أنبوب علوي وأنبوب جانبي. قبل حقن العينة في زجاجة الكاشف ، تحتاج إلى توصيل إبرة حقنة بموصل سريع A أولا ثم توصيل الموصل السريع A بالأنبوب الجانبي. (د) تركيب رقاقة الموائع الدقيقة. يتم تثبيت رقاقة الموائع الدقيقة على قاعدة التمثال. ثم يتم توصيل القنوات السبع (C1-C6 و CF) على التوالي بالمنافذ المقابلة ل MMC (O1-O6 و OF).
1- غرفة العمليات ب MMC.
2- زجاجة زيت تحتوي على زيت MMC.
3- زجاجة نفايات لجمع النفايات السائلة.
4- مصباح الأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي 254 نانومتر) للتعقيم. يمكن تشغيل هذا المصباح مسبقا لتعقيم الشريحة والأنابيب.
5- ليزر (620 نانومتر) للتعرف على القطرات. النقطة التي يتم فيها تشعيع الليزر على الشريحة هي موقع التعرف على القطرات.
6- مسبار درجة الحرارة لقياس درجة الحرارة داخل غرفة العمليات.
7- سخان لغرفة العمليات. يمكن استخدامه للحفاظ على درجة حرارة زراعة الميكروبات. نطاق درجة الحرارة التي يمكن ضبطها هو 25 ± 0.5 درجة مئوية إلى 40 ± 0.5 درجة مئوية.
8- مسبار الألياف البصرية لقياس OD أو تألق القطرات.
9- قاعدة التمثال لتركيب رقاقة الموائع الدقيقة.
10- حمام معدني لإصلاح زجاجات الكاشف وتسخينها لرفع درجة حرارة الكاشف بسرعة إلى درجة حرارة الزراعة الميكروبية.
11- منافذ لرقاقة الموائع الدقيقة (O1-O6، وOF). يتم توصيل شريحة الموائع الدقيقة ب MMC من خلال هذه المنافذ.
12- أنابيب لتخزين وزراعة القطيرات.
13- كتل مغناطيسية لتحديد موقع رقاقة الموائع الدقيقة بسرعة أثناء التثبيت.
14- إبرة حقنة لحقن العينات في زجاجات الكاشف. قطرها الداخلي 0.41 مم ، وقطرها الخارجي 0.71 مم.
15 - الموصل السريع A. الاتصال بالموصل السريع B.
16 - الموصل السريع B. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: واجهة برنامج التشغيلالخاصة ب MMC. (أ) الواجهة الرئيسية للبرنامج. (1) درجة الحرارة في غرفة العمليات. (2) قيمة الإشارة الكهروضوئية للتعرف على القطرات. عندما تمر القطرة ، تكون قيمة الإشارة عالية (>2 فولت). عندما يمر الزيت ، تكون قيمة الإشارة منخفضة (<1 فولت). (3) اختيار الوظيفة. هناك أربع وظائف للاختيار من بينها: قياس منحنى النمو (منحنى النمو) ، وتطور المختبر التكيفي (ALE) ، والتحليل متعدد المستويات أحادي العامل (عامل واحد) وتخصيص العمليات وفقا للاحتياجات التجريبية (التخصيص). (4) واجهة إعداد المعلمة. قم بتعيين المعلمات التجريبية المقابلة هنا بعد اختيار وظيفة واحدة. (5) منطقة تشغيل الأوامر. (6) تبديل الكاميرا. يتم تثبيت الكاميرا مباشرة فوق الشريحة ، والتي يمكن استخدامها لمراقبة القطرات الموجودة في الشريحة عبر الإنترنت. (7) منطقة عرض العملية. يعرض وقت التشغيل وبيانات المراقبة والعملية قيد التنفيذ. (ب) واجهة إعداد المعلمات للتطور التكيفي. (ج) واجهة فحص القطيرات. يمكن ل MMC ترقيم القطرات تلقائيا. هنا يمكن اختيار القطرات المستهدفة واستخراجها من MMC. (د) واجهة المراقبة بالكاميرا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: حقن العينة، وتوليد القطيرات، واستخراج القطيرات. (أ) زجاجة الكاشف بعد حقن محلول البكتيريا وزيت MMC. يتم حقن كل من محلول البكتيريا وزيت MMC من الأنبوب الجانبي. مرحلة الزيت في الطبقة العليا ومحلول البكتيريا في الطبقة السفلى. بعد الحقن ، قم بتوصيل الموصل السريع A و B ، ثم قم بتثبيته في MMC. (ب) توليد القطيرات في رقاقة الموائع الدقيقة. لتعزيز رؤية القطرات ، تم استخدام محلول صبغة حمراء لإظهار عملية توليد القطرات. (ج) القطيرات المخزنة في الأنبوب الذي يلاحظه المجهر. شريط المقياس: 400 ميكرومتر (D) مطالبات النافذة المنبثقة والعمليات المقابلة. عندما تظهر المطالبة "يرجى سحب موصل CF السريع ووضعه في أنبوب EP" ، اسحب موصل CF وضعه في أنبوب EP لجمع القطرة المستهدفة ؛ عند ظهور المطالبة "الرجاء إدخال الموصل مرة أخرى" ، تكون مجموعة القطرات كاملة ، أدخل موصل CF مرة أخرى في منفذ OF. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تصدير البيانات ورسم منحنى النمو. (أ) لقطة شاشة لجزء من البيانات المصدرة. تتضمن البيانات المصدرة كل نقطة زمنية للكشف عن القطرات ال 15 التي تم إنشاؤها وقيم OD600 المقابلة. (ب) منحنى نمو الإشريكية القولونية MG1655 المرسومة استنادا إلى البيانات المصدرة. احسب متوسط قيم OD600 والانحراف المعياري (SD) ل 15 قطرة في كل نقطة زمنية وارسم منحنى النمو. من الواضح أن منحنى النمو هذا يتضمن مرحلة التأخر والطور اللوغاريتمي والطور الثابت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: نتائج التطور التكيفي ل MeSV2.2 في MMC. (أ) منحنيات نمو 50 قطرة في عملية التطور التكيفي بأكملها. تم تصدير بيانات الكشف OD600 ل 50 قطرة خلال عملية التطور التكيفي التي استمرت 18 يوما من MMC وتم رسمها. في اليوم الثامن عشر ، تم استخراج 8 قطرات ، بما في ذلك قطرات 6. (ب) منحنى نمو القطرة 6 في عملية التطور التكيفي بأكملها. وكان الحد الأقصى لقيم OD600 في الجيل الأول وفترة الزراعة الفرعية الأخيرة 0.37 و 0.58 ، على التوالي ، بزيادة قدرها 56.8 ٪. (ج) مقارنة بين سلالة القطيرة 6 والانفعال الأولي في قارورة الاهتزاز. تم زراعة سلالة القطيرة 6 والسلالة الأولية في قوارير الاهتزاز ، وتم قياس منحنيات النمو (بما في ذلك SD ، n = 3). وقد عدل هذا الرقم من جيان س. ج. وآخرون 13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مكونات | تركيز |
| Na2HPO4·12H2O | 6.78 جم/لتر |
| KH2PO4 | 3 جم/لتر |
| كلوريد الصوديوم | 0.5 جم/لتر |
| NH4Cl | 1 جم/لتر |
| فيتامين B1 (معقم عن طريق الترشيح) | 0.34 جم/لتر |
| MgSO4·7H2O | 0.049 غ/س |
| كاكل 2·2H2O | 1.5 ملغم/لتر |
| العناصر الدقيقة: | |
| FeCl3·6H2O | 0.5 ملغم/لتر |
| ZnSO4·7H2O | 0.09 ملغم/لتر |
| CuSO4·5H2O | 0.088 ملغم/لتر |
| MnCl2 | 0.045 ملغم/لتر |
| CoCl2·6H2O | 0.09 ملغم/لتر |
| غلوكونات | 1.09 غ/ل |
| ميثانول | 500 ملليمول/لتر |
| الأيزوبروبيل-β-د-ثيوغالاكتوبيرانوسيد | 0.1 ملليمول/لتر |
| كبريتات الستربتومايسين | 20 ميكروغرام/مل |
| كبريتات الكاناميسين | 50 ميكروغرام/مل |
| أضف 15 جم/لتر إضافية من الأغاروز لتحضير الوسط الصلب. | |
الجدول 1: مكونات الوسط الخاص ل MeSV2.2.
| معلمات قابلة للضبط | |
| البارامتر | نطاق |
| درجة حرارة الزراعة | 25-40 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية |
| عدد القطرات | 0–200 |
| تركيز التلقيح | 13.3–86.7 % |
| تركيز العامل الكيميائي | 8 تركيزات مختلفة ، حتى الحد الأقصى لتركيز العامل الكيميائي المخزن |
| وقت الزراعة الفرعية | متروك للمستخدم |
| عدد الزراعات الفرعية | متروك للمستخدم |
| الطول الموجي للكشف عن OD | 350–800 نانومتر |
| الطول الموجي للكشف عن التألق | الإثارة: 470, 528 نانومتر الانبعاثات: 350–800 نانومتر |
| معلمات الدقة | |
| البارامتر | السيرة الذاتية |
| حجم القطرات | 1.88% |
| تركيز التلقيح | <5.0٪ |
الجدول 2: المعلمات القابلة للضبط ومعلمات دقة MMC. تشير المعلمات القابلة للضبط إلى المعلمات التي يمكن تعديلها وفقا للمتطلبات المحددة للمستخدمين ؛ تشير معلمات الدقة إلى المعلمات التي تعكس دقة وقابلية تكرار عمليات الموائع المختلفة.
الشكل التكميلي 1: التعرف على القطرات واكتشافها في MMC. (أ) الشكل الموجي لقطرة في MMC. يأتي هذا الشكل الموجي من البيانات الطيفية الخام لمطياف MMC. بعد معالجة البيانات الطيفية الخام في الخلفية ، ستعطي MMC قيمة OD المقاسة. (ب) حساب OD للقطرات في MMC. في الشكل الموجي للقطرة ، يمثل "a" الحد الأقصى لطول القطرة ، ويمثل "c" الواجهة على شكل قوس التي تشكلها مرحلة الزيت ومرحلة الماء ، ويمثل "b" الجزء الرئيسي من القطرة. استنادا إلى قانون لامبرت-بير ، يتم حساب قيمة OD للقطرة باستخدام الصيغة التالية: قيمة OD = lg (E / D) × 10. تشير "E" إلى متوسط قيمة الإشارة الطيفية لمرحلة النفط؛ يشير الحرف "D" إلى متوسط قيمة الإشارة الطيفية للجزء الرئيسي b من القطرة. وتجدر الإشارة إلى أن قيمة OD المقاسة بواسطة MMC تختلف عن القيمة المقاسة بواسطة مقياس الطيف الضوئي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: اختبار الحديث المتبادل بين القطرات. للتحقق مما إذا كان هناك حديث متقاطع بين القطرات أثناء الزراعة طويلة الأجل ، تم تخفيف محلول E. coli MG1655 إلى تركيز منخفض للغاية (وفقا لتوزيع Poisson ، λ = 0.1) ، ثم تم إنشاء 200 قطرة وزراعتها لمدة 5 أيام. بعد قياس OD ، وجد أن E. coli MG1655 نمت في عدد صغير من القطرات. ولم يكن هناك أي نمو بكتيري تقريبا في القطرات حول هذه القطرات. تظهر النتيجة أيضا مبدئيا أن هناك القليل من الأحاديث المتبادلة بين القطرات. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 1: استقرار توليد القطيرات في MMC. كما هو موضح في الشكل التكميلي 1 ، فإن القطرة لها شكل موجي ثابت. يولد مطياف MMC عددا معينا من نقاط البيانات في الثانية الواحدة ، وبالتالي فإن عدد نقاط البيانات للشكل الموجي للقطرات يمكن أن يعكس حجم القطرة. تم استخدام محلول الصبغة الحمراء لتوليد 397 قطرة في MMC ، وتم قياس قيمة OD. تم تصدير البيانات الطيفية الخام ، وتم حساب نقاط البيانات لكل شكل موجي قطرة ، وتم حساب معامل التباين (C.V) لنقاط بيانات القطرات. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول التكميلي 2: تبخر القطيرات في MMC. هنا تم استخدام محلول الصبغة الحمراء لتوليد قطرات في MMC وتم تخزين القطرات في أنبوب الزراعة. ثم تم وضع الأنبوب في حاضنة درجة حرارة ثابتة 37 درجة مئوية لمدة 30 يوما ، وتم قياس طول القطيرات بانتظام (التقط صورا تحت المجهر وقياس الطول باستخدام شريط مقياس). يظهر أن حجم القطرة انخفض بحوالي 12.3٪ بعد 30 يوما ، مما يشير إلى أن تبخر القطرة صغير جدا في MMC. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يقدم هذا البروتوكول كيفية استخدام نظام زراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC) لإجراء الزراعة الميكروبية الآلية والتطور التكيفي طويل الأجل. MMC هو نظام زراعة ميكروبية مصغر وآلي وعالي الإنتاجية. بالمقارنة مع طرق وأدوات الزراعة الميكروبية التقليدية عالية الإنتاجية ، تتمتع MMC بالعديد من المزايا مثل انخفاض استهلاك العمالة والكواشف ، والتشغيل البسيط ، والكشف عبر الإنترنت (OD والتألق) ، وجمع البيانات عالية الدقة في الوقت المناسب ، والتوازي الفائق. تتمتع MMC أيضا ببعض المزايا الخاصة المختلفة عن تقنية الموائع الدقيقة التقليدية ، والتي تستخدم عادة قطرات pL و nL. معظم الأنظمة التي تم الإبلاغ عنها سابقا والتي استخدمت قطرات pL و nL لديها أداء زراعة ضعيف وعدد قليل من المعلمات التي يمكن اكتشافها (عادة ما تكون مضيئة فقط) 18،19،20،21. على الرغم من وجود بعض المنصات التي يمكنها تحقيق أداء أفضل للزراعة واكتشاف معلمات متعددة ، إلا أنها صعبة وتتطلب الكثير من الجهد. على سبيل المثال ، أبلغ بعض الباحثين عن اكتشاف OD لقطرات pL. يعتمد على التعرف على الصور ، والذي لا يحتوي على إيجابيات خاطئة فحسب ، بل يحتاج أيضا إلى مزيد من التحقق من الدقة22. ومع ذلك ، يمكن ل MMC تحقيق ذلك بطريقة بسيطة نسبيا. يستخدم MMC قطرات ميكرولتر (μL) نادرا ما يتم الإبلاغ عنها. تم التحقق من الأداء المتفوق للزراعة الميكروبية ل MMC ، ويمكنه أيضا الكشف مباشرة عن OD والتألق. نظرا للحجم الكبير لقطرات μL ، فإن توليد القطرات أقل عرضة للتداخل ، والذي يتمتع باستقرار أعلى. وفي الوقت نفسه ، يمكن إجراء عمليات أكثر تنوعا في قطرات الميكرولتر ، مما يفضي إلى تحقيق العمليات الآلية. وعلاوة على ذلك، ولأن القطرات عبارة عن مساحات مغلقة، يمكن قمع تقلب المحتويات (الجدول التكميلي 2)، مما يفضي إلى إجراء الزراعة الميكروبية الطويلة الأجل والتطور التكيفي عند وجود مواد متطايرة في الوسط14. من الصعب تحقيق ذلك في قوارير الاهتزاز والألواح الدقيقة.
ومع ذلك ، فإن بعض النقاط الحرجة في البروتوكول تستحق التأكيد. أولا، تجدر الإشارة إلى أن قيمة OD المقاسة بواسطة MMC تختلف عن قيمة مقياس الطيف الضوئي لأن أطوال مسارها البصري لقياس OD مختلفة (1 مم و 10 مم على التوالي). لذلك ، عند مقارنة قيمة OD ل MMC مع قيمة قارورة الاهتزاز ، من الضروري قياس منحنى المعايرة13. لحسن الحظ ، لا تتطلب عملية التطور التكيفي منحنيات معايرة لأننا نركز على الاتجاهات النسبية بين منحنيات النمو. بعد ذلك ، بعض الكائنات الحية الدقيقة غير مزروعة في MMC. تعتمد القطرات على التوتر السطحي لواجهة الزيت والماء للحفاظ على الاستقرار23. إذا أنتجت الكائنات الحية الدقيقة مواد معينة تعطل التوتر السطحي للواجهة بين النفط والماء ، مثل بعض سلالات Bacillus subtilis التي تنتج المواد الخافضة للتوتر السطحي24 ، فلن تتمكن القطرات من الحفاظ على الاستقرار. علاوة على ذلك ، إذا كان الوسط نفسه عقبة أمام توليد القطرات ، فمن غير القابل للتطبيق استخدامه في MMC ، على سبيل المثال ، وسط أو وسط لزج للغاية يحتوي على جزيئات كبيرة. في الوقت الحاضر ، تشمل الأنواع التي قمنا بزراعتها بنجاح في MMC الإشريكية القولونية ، Lactobacillus plantarum ، Corynebacterium glutamicum ، الخمائر ، Methylobacterium extorquens ، Aspergillus oryzae ، الطحالب الدقيقة وهلم جرا. يوصى بزراعة السلالة في MMC للتجربة الأولية. أخيرا ، يجب توصيل الموصلات والمنافذ بين الشريحة وزجاجة الكاشف و MMC بما يتفق بدقة مع البروتوكول. خلاف ذلك ، قد يتدفق محلول البكتيريا إلى MMC ويلوث المناطق الداخلية. بالإضافة إلى ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن الإنتاجية الحالية ل MMC محدودة (0-200) ، بسبب الوقت المستغرق لعمليات الزراعة الفرعية. في المستقبل ، سنقوم بتحسين برنامج التحكم وحجم الشريحة لتقصير الوقت وتحسين الإنتاجية. نظرا لأن MMC هو نظام معياري ، يجب استبدال الأجزاء أو البرامج ذات الصلة فقط دون الحاجة إلى معدات جديدة.
في الوقت الحاضر ، لا يمكن ل MMC إجراء قياس منحنى النمو ، والتطور المختبري التكيفي ، والتحليل متعدد المستويات أحادي العامل فحسب ، بل يمكن استخدامه أيضا لتخصيص إجراءات تشغيل القطرات المختلفة لتلبية الاحتياجات التجريبية. في المستقبل ، من الضروري زيادة إثراء وظائف تطبيق نظام MMC استجابة للاحتياجات المختلفة للبحوث الميكروبية ، مثل إجراء تجارب متعامدة متعددة العوامل متعددة المستويات ، وتكنولوجيا أخذ العينات التلقائية متعددة العينات لقياس منحنيات نمو الأنواع البكتيرية المتعددة في وقت واحد ، والكشف بدقة عن المزيد من المعلمات والتحكم فيها (على سبيل المثال ، الأكسجين المذاب (DO) والرقم الهيدروجيني). في الوقت نفسه ، من الضروري أيضا تطوير المزيد من الوظائف في مجال علم الأحياء الدقيقة لتطبيق MMC على سيناريوهات أكثر عملية ، مثل تحسين التراكيب المتوسطة ، وتحديد الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC) ، والزراعة المشتركة للكائنات الحية الدقيقة25 ، إلخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من قبل البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2018YFA0901500) ، والمشروع الوطني الرئيسي للأدوات والمعدات العلمية التابعة للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (21627812) ، وبرنامج البحث العلمي لمبادرة جامعة تسينغهوا (20161080108). كما نشكر البروفيسورة جوليا أ. فورهولت (معهد علم الأحياء الدقيقة، قسم علم الأحياء، ETH زيورخ، زيوريخ 8093، سويسرا) على توفير النسخة 2.2 من سلالة الإشريكية القولونية الأساسية من الميثانول (MeSV2.2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
| 4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
| Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
| EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
| FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
| Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
| High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
| isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
| Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
| Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
| Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
| Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
| Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
| Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
| Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
| Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
| UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
| Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
References
- Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
- Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O.
- Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
- Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).
- Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
- Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
- Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
- Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
- Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P.
- Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
- Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
- Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
- Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).
- Meyer, F., et al.
- Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. The introduction of MMC. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. , Available from: http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 (2021).
- Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
- Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
- Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
- Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
- Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
- Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998 (2020).
- Baret, J. C.
- Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
- Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).
